BƯỚC đấu NGHIÊN cứu GIÁ TRỊ của kỹ THUẬT SÀNG lọc KHỒNG xâm lấn TRONG CHẨN đoán TRƯỚC SINH một số bất THƯỜNG NHIỄM sắc THỂ TẠIBỆNH VIỆN PHỤ sản hà nội năm 2016

Việc phát hiện DNA thai tự do cell-free fetal DNA - cffDNA có nguồngốc từ rau thai lưu hành trong máu mẹ của Denis Lo và cộng sự năm 1997 [6] đã mở ra khả năng thực hiện xét nghiệm sàng

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Duy Ánh

Nhóm nghiên cứu: Ths.Bs Hoàng Hải Yến

Bs Đinh Thúy Linh Ths.Bs Nguyễn Hồng Phượng Ths.CNSH Nguyễn Thị Vân Anh

NĂM 2018

AF Amniotic fluid

AFP Alfa feto-protein

BoBs BACs-on-Beads

cffDNA Cell free fetal DNA

CMA Chromosomal microarray-based analysis

CV Chrionic villus

DNA Deoxyribonucleic acid

DTBS Dị tật bẩm sinh

FISH Fluorescent in situ hybridization

NGS Next generation sequencing

NIPS Noninvasive prenatal testing

SNPs Single nucleotide polymorphisms

MPS Massively parallel sequencing

MPSS Massively parallel shotgun sequencing

NCVs Normalized chromosome values

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Bất thường nhiễm sắc thể ở thai thường gặp trong sàng lọc, chẩn đoán trước sinh 3

1.1.1 Tần suất, các dạng bất thường nhiễm sắc thể thai 3

1.1.2 Hậu quả 9

1.2 Phương pháp sàng lọc, chẩn đoán trước sinh bất thường NST 9

1.2.1 Các phương chẩn đoán trước sinh 9

1.2.2 Các phương pháp sàng lọc truyền thống 10

1.3 Phương pháp sàng lọc trước sinh từ DNA thai tự do trong máu mẹ 13

1.3.1 Đặc điểm DNA thai tự do trong máu mẹ 15

1.3.2 Các phương pháp tiếp cận tin sinh học để xác định hàm lượng cffDNA 15

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phân tích DNA thai tự do 17

1.3.4 Ứng dụng lâm sàng của cffDNA trong huyết tương mẹ 20

1.4 Giải trình tự gen thế hệ mới và xét nghiệm trước sinh không xâm lấn 24

1.4.1 Lịch sử hình thành và phát triển 24

1.4.2 Nguyên lý cơ bản 25

1.4.3 Giải trình tự trên hệ thống Ion Torrent sequencing/ Ion semiconductor sequencing 26

1.4.4 Ứng dụng NGS trong sàng lọc trước sinh 28

1.4.5 Ý nghĩa của việc ứng dụng NGS vào NIPS trong sàng lọc trước sinh 29

1.4.6 Nghiên cứu NIPS tại Việt Nam 36

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 37

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 37

2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 38

2.3.2 Các bước tiến hành nghiên cứu 38

2.3.3 Sơ đồ nghiên cứu 40

2.3.4 Các chỉ số cần xác định trong nghiên cứu 41

2.3.5 Các kỹ thuật xác định các chỉ số trong nghiên cứu 41

2.3.6 Chuẩn bị mẫu giải trình tự và giải trình tự 43

2.3.7 Phân tích kết quả giải trình tự 43

2.4 Kỹ thuật chẩn đoán 44

2.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 44

2.6 Trang thiết bị và máy móc phục vụ nghiên cứu 44

2.6.1 Máy móc và dụng cụ 44

2.6.2 Hóa chất 45

2.7 Phương pháp phân tích số liệu 46

2.8 Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài 46

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47

3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 47

3.1.1 Phân bố theo địa dư của thai phụ tham gia nghiên cứu 47

3.1.2 Phân bố tuổi thai phụ trong nghiên cứu 48

3.1.3 Đặc điểm phân bố nghề nghiệp của thai phụ tham gia nghiên cứu 49

3.1.4 Phân bố tuổi thai tại thời điểm làm xét nghiệm NIPS 49

3.1.5 Đặc điểm yếu tố nguy cơ của thai phụ tham gia nghiên cứu 50

3.1.6 Đặc điểm kết quả sàng lọc thai phụ trước khi làm xét nghiệm NIPS 51

3.1.7 Đặc điểm khoảng sáng sau gáy (NT) của thai phụ tham gia nghiên cứu 52

3.1.8 Đặc điểm nguy cơ combined test của thai phụ tham gia nghiên cứu 53

3.1.9 Đặc điểm nguy cơ tripble test của thai phụ tham gia nghiên cứu 53

3.1.10 Đặc điểm kết quả sàng lọc trước khi làm xét nghiệm NIPS 54

3.2 Kết quả giải trình tự 54

3.2.1 Kết quả tách cfDNA 54

3.2.2 Kết quả chuẩn bị thư viện giải trình tự 56

3.3.1 Tỷ lệ nguy cơ lệch bội của thai sau giải trình tự NGS 63

3.3.2 Tỷ lệ nguy cơ lệch bội NST 21 của thai sau giải trình tự NGS 64

3.3.3 Tỷ lệ nguy cơ lệch bội NST 21 của thai sau giải trình tự NGS trên nhóm NCC với sàng lọc truyền thống 64

3.4 Xác định tỷ lệ bất thường NST thai trong nhóm thai phụ được sàng lọc bằng xét nghiệm NIPS 65

3.4.1 Tỷ lệ bất thường NST thai phát hiện bằng xét nghiệm NIPS 65

3.4.2 Tỷ lệ bất thường NST thai trong sàng lọc truyền thống và NIPS 65

3.4.3 Tỷ lệ lệch bội NST 21 thai theo tuổi phát hiện bằng xét nghiệm NIPS 66

3.5 Giá trị của xét nghiệm NIPS trong sàng lọc các bất thường NST 13, 18, 21 và NST giới tính 67

3.5.1 Đặc điểm của 16 trường hợp NCC bất thường NST 21, 18, 13, X, Y 67

3.5.2 Đánh giá độ chính xác của xét nghiệm NIPS 70

3.5.3 Độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm NIPS 70

KẾT LUẬN 73

KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1: Tỷ lệ phát hiện trisomy 21 và tỷ lệ dương tính giả của các xét

nghiệm sàng lọc 12

Bảng 1.2: Xét nghiệm sàng lọc NST 21 theo tuổi mẹ và yếu tố nguy cơ 31

Bảng 1.3: Xét nghiệm sàng lọc NST 18, 13 32

Bảng 1.4: Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và âm của NIPS trong sàng lọc trước sinh T21, T18 và T13 ở các nhóm thai phụ 35

Bảng 3.1: Phân bố theo địa dư của thai phụ tham gia nghiên cứu 47

Bảng 3.2: Phân bố tuổi thai phụ trong nghiên cứu 48

Bảng 3.3: Đặc điểm phân bố nghề nghiệp của thai phụ tham gia nghiên cứu 49

Bảng 3.4: Phân bố tuổi thai thời điểm làm xét nghiệm NIPS 49

Bảng 3.5: Đặc điểm yếu tố nguy cơ của thai phụ tham gia nghiên cứu 50

Bảng 3.6: Đặc điểm kết quả sàng lọc trước khi làm xét nghiệm NIPS 51

Bảng 3.7: Đặc điểm NT của thai phụ tham gia nghiên cứu 52

Bảng 3.8: Đặc điểm nguy cơ combined test của thai phụ tham gia nghiên cứu 53

Bảng 3.9: Đặc điểm nguy cơ tripble test của thai phụ tham gia nghiên cứu 53

Bảng 3.10: Đặc điểm kết quả sàng lọc trước khi làm xét nghiệm NIPS 54

Bảng 3.11: Kết quả đo nồng độ của cfDNA 55

Bảng 3.12: Kết quả đo nồng độ thư viện giải trình tự bằng Qubit 3.0 56

Bảng 3.13: Kết quả kích thước cfDNA trung bình 57

Bảng 3.14: Dữ liệu đoạn đọc trung bình trên mẫu giải trình tự 60

Bảng 3.15: Hàm lượng cffDNA thấp < 3.5% trên tổng số mẫu 62

Bảng 3.16: Hàm lượng cffDNA<3.5% trên tổng số mẫu lấy máu lại lần 2 .63 Bảng 3.17: Tỷ lệ thai nguy cơ cao lệch bội NST sau giải trình tự NGS 63 Bảng 3.18: Tỷ lệ thai nguy cơ cao lệch bội NST 21 sau giải trình tự NGS .64

Bảng 3.20: Tỉ lệ nguy cơ cao lệch bội NST thai phát hiện bằng xét nghiệm

NIPS 65Bảng 3.21 Tỷ lệ bất thường NST thai trong sàng lọc truyền thống và NIPS 65Bảng 3.22: Tỷ lệ lệch bội NST 21 thai theo tuổi phát hiện bằng xét nghiệm

NIPS 66Bảng 3.23: Đặc điểm của 16 trường hợp NCC bất thường NST 21, 18, 13, X, Y 67Bảng 3.24 Đánh giá độ chính xác của xét nghiệm NIPS 70Bảng 3.25: Tỷ lệ phát hiện trisomy 21, 18, 13 và NST giới tính qua NIPS 71

Biểu đồ 3.1: Phân bố tuổi thai phụ trong nghiên cứu 48

Biểu đồ 3.2: Phân bố tuổi thai thời điểm làm xét nghiệm NIPS 50

Biểu đồ 3.3: Đặc điểm yếu tố nguy cơ của thai phụ tham gia nghiên cứu 51

Biểu đồ 3.4: Kết quả sàng lọc trước khi làm xét nghiệm NIPS 52

Biểu đồ 3.5: Kết quả sàng lọc trước khi làm xét nghiệm NIPS 54

Biểu đồ 3.6: Tương quan giữa hàm lượng cffDNA và cân nặng thai phụ 61

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 40

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ <1 tuổi 4

Hình 1.2: Trẻ mắc hội chứng Down (Trisomy 21) 5

Hình 1.3: DNA tự do lưu hành trong máu mẹ 15

Hình 1.4: Lưu đồ thực hiện giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện T21 25

Hình 1.5: Giải trình tự trên hệ thống giải trình tự Ion Torrent 27

Hình 3.1: Kiểm tra chất lượng thư viện trên LabChip 56

Hình 3.2: Hiệu quả tải nạp mẫu lên chip giải trình tự 58

Hình 3.3: Chất lượng thư viện trên hạt ISP 59

Hình 3.4: Phân bố chiều dài và độ chính xác khi so với trình tự HG19 60

MỞ ĐẦU

Bất thường nhiễm sắc thể (NST) là nguyên nhân của 50% các trườnghợp sảy thai, là một trong số những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong vàtàn tật cho trẻ sơ sinh trên toàn thế giới [1] Chiếm khoảng 83% của nhữngbất thường này là do lệch bội NST 21, 18, 13 và NST giới tính gây ra hộichứng Down, Edwards, Patau, Turner , [2]

Cho đến nay, trên thế giới vẫn chưa có biện pháp nào phòng ngừa tìnhtrạng thai mắc các hội chứng do bất thường NST Chính vì vậy, việc phát hiệnsớm bất thường NST bằng sàng lọc, chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền

là việc làm hết sức cần thiết nhằm giảm tỷ lệ sinh con bất thường NST Cácphương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống cho bất thường lệch bội NSTbao gồm siêu âm hình thái và phân tích huyết thanh từ máu mẹ trong thai kỳ 1

và thai kỳ 2 Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện lệch bội dao động từ 30-94% với tỷ lệdương tính giả trên 5% tùy thuộc vào phương pháp sàng lọc được sử dụng [3]

Để chẩn đoán xác định, các thai phụ có nguy cơ cao sẽ được thực hiện các thủthuật xâm lấn như sinh thiết gai rau hoặc chọc hút dịch ối để phân tích bộNST thai nhi, điều này mang lại nguy cơ mất thai với tỷ lệ 0.11% - 0.22% [4]

Do đó, rất cần có những phương pháp sàng lọc với tỷ lệ dương tính giả thấpđồng thời tỷ lệ phát hiện cao hơn, thai phụ không cần chịu thủ thuật xâm lấn,tránh được nguy cơ ảnh hưởng đến mẹ và thai [5]

Việc phát hiện DNA thai tự do (cell-free fetal DNA - cffDNA) có nguồngốc từ rau thai lưu hành trong máu mẹ của Denis Lo và cộng sự năm 1997 [6]

đã mở ra khả năng thực hiện xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm lấn(NIPS) phát hiện sớm thai lệch bội NST bằng phương pháp giải trình tự thế hệmới [7], [8], [9] Hơn nữa, NIPS có tỷ lệ phát hiện trisomy 21 trên 99% với tỷ

lệ dương tính giả thấp 0.1% [11] Do vậy cffDNA được coi là nguồn mẫu lýtưởng cho xét nghiệm sàng lọc trước sinh phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai.Tại Việt Nam, lĩnh vực sàng lọc và chẩn đoán trước sinh cũng đang ngàymột phát triển với việc triển khai nhiều kỹ thuật mới Bệnh viện Phụ sản HàNội là bệnh viện chuyên khoa hàng đầu của Thủ đô, cùng với việc thành lập

và phát triển Trung tâm sàng lọc, chẩn đoán trước sinh và sơ sinh, việc ứngdụng các kỹ thuật mới nhằm nâng cao chất lượng sàng lọc là một vấn đề cấp

thiết Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Bước đầu nghiên cứu giá trị của kỹ thuật sàng lọc không xâm lấn trong chẩn đoán trước sinh một số bất thường nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội năm 2016 – 2017”

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Bất thường nhiễm sắc thể ở thai thường gặp trong sàng lọc, chẩn đoán trước sinh

1.1.1 Tần suất, các dạng bất thường nhiễm sắc thể thai

1.1.1.1 Tần suất

Bất thường nhiễm sắc thể (NST) là nguyên nhân của 50% các trườnghợp sảy thai, là một trong số những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong vàtàn tật cho trẻ sơ sinh trên toàn thế giới [1] Chiếm khoảng 83% của nhữngbất thường này là do lệch bội NST 21, 18, 13 và NST giới tính gây ra hộichứng Down, Edwards, Patau, Turner , [2]

Tại Trung Quốc, mỗi năm có khoảng 16 triệu trẻ mới sinh, trong đó dịtật bẩm sinh chiếm khoảng 4-6% Bất thường nhiễm sắc thể chiếm tỷ lệ 1:160trẻ sinh sống [12],[13] Thống kê của ngành y tế cho thấy, mỗi năm Việt Nam

có khoảng gần 1.5 triệu trẻ em mới được sinh ra, trong đó tỷ lệ dị tật bẩm sinhchiếm khoảng 1.5-2% trẻ sinh sống Đáng lưu ý, mỗi năm có khoảng 1.400-1.800 trẻ bị mắc bệnh Down, khoảng 250-250 trẻ mắc hội chứng Edwards

Theo nghiên cứu của tác giả Phùng Như Toàn năm 2003 tại Bệnh viện Từ Dũ,

tỷ lệ bất thường NST là 11.2% Năm 2004, tỷ lệ bất thường NST tại Bệnhviện Phụ sản Trung Ương là 17.5% theo nghiên cứu của tác giả Hoàng ThịNgọc Lan và cộng sự, nghiên cứu của tác giả Trần Danh Cường năm 2005 là11.6% trên những thai phụ có nguy cơ cao (tuổi thai phụ >35 tuổi, có tiền sửmang thai hay sinh con bị bất thường số lượng nhiễm sắc thể), trong đó lệchbội NST 21 chiếm 50,79% [14]

1.1.1.2 Các dạng bất thường NST thai thường gặp

Các bất thường NST là nguyên nhân của 50% các trường hợp sảy thai

tự nhiên trong 3 tháng đầu thai kỳ và là nguyên nhân của 7% tử vong sơ sinh

và khoảng 0,6% trẻ lúc sinh phát hiện có bất thường NST Tuy nhiên, chiếmđến 83% các trường hợp bất thường về NST là lệch bội NST 21, 18, 13, X và

Y vẫn có thể sống sót đến khi sinh ra Hội chứng Down chiếm tỷ lệ cao nhất

là 53%, tiếp đến là hội chứng Edwards là 13%, hội chứng Patau chiếm 5%,hội chứng Turner 8%, bất thường NST giới tính XXX, XXY, XYY chiếm4%, còn lại là các bất thường hiếm gặp khác (Hình 1) [2]

Hình 1.1: Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ <1 tuổi

Hội chứng Down (Trisomy 21)

Hội chứng Down là bất thường số lượng NST 21 (47,XX,+21; 47,XY,+21) hay gặp nhất trên lâm sàng Hội chứng Down gây ra chậm phát triển tâmthần không sửa chữa được và tần suất mắc trong quần thể là 1/700 trẻ sinhsống [15]

Hình 1.2: Trẻ mắc hội chứng Down (Trisomy 21)

Hội chứng Down được đặt theo tên của John Landon Down, một bác sỹngười Anh đã mô tả hội chứng này vào năm 1866 Phải đến năm 1959, hộichứng Down mới được xác định là do bất thường về số lượng NST 21 bởi bác

sỹ J Lejeune Các biểu hiện lâm sàng điển hình của hội chứng Down baogồm: trán nhỏ, gáy rộng và dẹt, chỏm đầu dẹt, mặt tròn, khe mắt xếch, lông mingắn và thưa, gốc mũi dẹt vì giảm sản xương sống mũi, môi dày, lưỡi dày, haythè ra, tai nhỏ, tròn, dị tật tim, những thay đổi nếp vân da bàn tay Luôn kèmtheo chậm phát triển tâm thần vận động Chỉ số IQ của người mắc hội chứngDown thường <50 Ở tuổi 21, người mắc hội chứng Down có chỉ số IQ khoảng

42, tương đương với trẻ 5 tuổi [16]

Hội chứng Patau (Trisomy 13) [17],[18]

Hội chứng Patau là bất thường số lượng NST 13 (47,XX,+13; 47,XY,+13) Lần đầu tiên được Patau cùng các cộng sự mô tả đầy đủ vào năm 1960.Bệnh gặp với tần số 1:5000 đến 1:10000 trẻ sống Tỷ lệ bệnh gặp ở nữ nhiềuhơn nam Các trẻ mắc hội chứng Patau có trọng lượng khi sinh thấp hơn mứctrung bình khoảng 900g và thường sinh thiếu tháng Các dấu hiệu lâm sàngbên ngoài của hội chứng này rất điển hình đến mức có thể dựa vào đó để nhậndạng và chẩn đoán bệnh Các bất thường đặc trưng biểu hiện ở sọ và mặt: chu

vi hộp sọ thường bị giảm, đầu bé cùng với trán thấp và nghiêng, khe mắt hẹp,

gốc mũi rộng, tai mọc thấp với vành tai biến dạng, khoảng cách giữa hai mắtgiảm, da đầu thường bị loét, có u mạch máu ở vùng đầu và chẩm.

Một trong những dấu hiệu điển hình nhất của hội chứng Patau là khe hởmôi trên và vòm miệng, các khe hở thường là ở cả hai phía Trong số các bấtthường của hệ thống cơ xương, hay gặp nhất là tật nhiều ngón ở cả hai tay vàhai chân Ngoài ra, các dị tật bẩm sinh ở tim chiếm 80% các trường hợp, ở hệthống bài tiết trên 60%, ở hệ thống cơ quan sinh sản 75%

Do có quá nhiều dị tật nặng nề, nên những trẻ trisomy 13 không sốngđược lâu, 90% bệnh nhân chết trong vòng 1 tuổi, trong đó 40% là chết chusinh [17],[18]

Hội chứng Edwards (Trisomy 18)

Hội chứng Edwards là bất thường số lượng NST 18 (47,XX,+18;47,XY,+18) Lần đầu tiên được một nhóm các nhà di truyền học người Anhđứng đầu là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960 Bệnh xuất hiện với tần suất1:5000 trẻ sinh ra [19] Đây là hội chứng bất thường số lượng NST đứng thứ 2sau hội chứng Down

Trẻ Trisomy 18 được sinh ra thường thiếu cân (trọng lượng trung bìnhkhoảng 2kg), trong khi thai lại thường bị già tháng Các biểu hiện lâm sàng ởhội chứng này cũng đa dạng như ở hội chứng Patau

Các tổn thương cấu tạo của mặt và hệ thống cơ xương là ổn định, ở cáctrường hợp kinh điển, sọ não có dạng kéo dài nghiêng dần từ xương trán tớivùng thóp, hàm dưới và lỗ miệng bé, các khe mắt hẹp và ngắn Vành tai bị biếndạng và trong phần lớn các trường hợp có tai mọc thấp Các tật ở chi trên là sựxếp lộn xộn của xương bàn, bất thường khớp giữa ngón Ι, bất thường ở bàn châncũng có tới 80% các trường hợp Khe hở môi được gặp ở 50% các trường hợp,nhưng khác với hội chứng Patau là chỉ khe hở môi ở một phía [20]

Do có nhiều dị tật ở nhiều hệ thống cơ quan, nên thời gian sống của cáctrẻ Trisomy 18 không được lâu 95% thai có hội chứng Edwards chết trướckhi sinh Khoảng 60% trẻ sinh ra bị chết trước 2 tháng tuổi (trong đó 30% làtrước 1 tháng) Chỉ 5-10% trẻ bị bệnh là sống được đến 1 tuổi [21].

Bất thường số lượng nhiễm sắc thể X, Y

Bất thường NST giới tính X, Y gây nên hội chứng Kilinefelter, Tuner vàtrisomy X

Hội chứng Klinefelter (47,XXY) [22],[23]

Là dạng bệnh NST giới tính hay gặp nhất ở nam giới với tần số khoảng1:500 đến 1:1000 lần trẻ sơ sinh nam và thường gặp trong các trường hợpngười mẹ lớn tuổi, trung bình là 32.3 tuổi Ở tuổi trưởng thành mới thấy rõnhững dấu hiệu phát triển lệch lạc về giới tính đàn ông như tinh hoàn bé, màotinh đôi khi lớn hơn tinh hoàn, mềm, bóp không đau, không thấy tinh trùngtrong tinh dịch nên vô sinh Ngoài ra, còn thấy các bất thường của sự pháttriển các dấu hiệu sinh dục phụ kiểu nữ như tuyến vú phát triển ở 25 - 50%các trường hợp, lớp mỡ dưới da dày, vai hẹp, hông rộng

Hội chứng XYY (47, XYY) [24]

Hội chứng XYY được Evans và cộng sự phát hiện năm 1977 khi phântích định loại NST ở các bé trai sơ sinh Tần số người có 47,XYY trong quầnthể là 1:1000 nam giới nhưng tần số này tăng cao ở nơi giam giữ các phạmnhân, vì vậy thừa NST Y được gắn cho cái tên là NST tội phạm Lúc nhỏ,biểu hiện ngoài bình thường, thường có nhiều mụn trứng cá ở mặt Lúc dậythì hầu hết trẻ lớn nhanh, dậy thì muộn hơn trẻ bình thường khoảng 6 tháng.Răng lớn, gốc mũi nhô cao và không cân xứng, tai thấp Mặc dù người caonhưng có xu hướng kém phát triển cơ ngực, cơ vai và cơ thắt lưng Có trườnghợp sinh dục kém phát triển, tinh hoàn nhỏ, tinh hoàn lạc chỗ và lỗ đái lệchthấp Hầu hết có trí tuệ bình thường, một số chậm phát triển tâm thần

Hội chứng trisomy X (47,XXX)[25],[26]

Hội chứng trisomy X xuất hiện với tần số chung là khoảng 1:1000 trẻgái Những biểu hiện bên ngoài rất khó phân biệt người bệnh với những ngườibình thường do không có những biến đổi rõ ràng về hình thái cũng như trí tuệ

và thể lực Tuy nhiên, một số người bệnh cũng có một số bất thường về chứcnăng sinh sản ở phụ nữ như vô kinh thứ phát, rối loạn kinh nguyệt, mãn kinhsớm, tỷ lệ mắc bệnh tâm thần phân liệt cao Những phụ nữ Trisomy X vẫn cókhả năng sinh đẻ bình thường song nguy cơ các bất thường các NST ở con cáicao hơn những người khác

Hội chứng Monosomy X (Hội chứng Turner)[27]

Hội chứng Turner (45,X) hay gặp ở nữ giới với tần suất xuất hiện là1:2500 trẻ sơ sinh gái Hầu hết các trường hợp thai mắc hội chứng Turnerthường bị sảy thai tự nhiên, chỉ có một số ít sống đến khi sinh Người bệnh cókiểu hình là nữ giới thường đi khám vì các triệu chứng như lùn, vô kinh nguyênphát, các biểu hiện của bệnh khác nhau ở các giai đoạn khác nhau:

- Ở trẻ sơ sinh: trọng lượng khi sinh thấp, phù bạch huyết ở mu bàn tay,bàn chân, phù cứng, không viêm và thường đến tuổi thứ hai thì hết phù, taivểnh ra phía sau

- Ở trẻ em gái và thanh niên: người lùn, chậm lớn và có những biểu hiệnbất thường như khe mắt cụp, sụp mi, mép xệ, khẩu cái hình cung nhọn Taithấp và vểnh ra sau, tóc mọc thấp Cổ ngắn và rộng vì có nếp da hình cánhbướm nối liền từ xương chũm đến mỏm cùng vai Cẳng tay cong ra ngoài,ngắn Lồng ngực hình lá chắn, hai núm vú kém phát triển và xa nhau Cơ quansinh dục có rất ít hoặc không có lông mu, không có lông nách, đôi khi có dấuhiệu nam hóa với âm vật phì đại Tuyến sinh dục không phát triển, soi ổ bụngthấy 1 dải nhỏ màu trắng nhạt, trường hợp điển hình thấy tổ chức xơ Tử cung

nhỏ, có thể chẻ đôi Giới tính thứ cấp không phát triển, tuyến vú không pháttriển, vô kinh nguyên phát.

1.1.2 Hậu quả

Thai nhi có bất thường nhiễm sắc thể thường có nguy cơ sẩy thai sớm,thai lưu hoặc thai chết ngay sau sinh Khoảng 50% các trường hợp sảy thaingẫu nhiên là do bất thường NST thai Mặc dù có rất nhiều loại bất thườngnhiễm sắc thể nhưng hầu hết đều có biểu hiện chung như: Tình trạng pháttriển chậm về tâm thần và vận động, có những biểu hiện bất thường đặc thùtrên khuôn mặt, lùn có thể kèm theo nhẹ cân, gia tăng tần số của các dị tậtbẩm sinh, đặc biệt là các dị tật bẩm sinh gây gánh nặng cho gia đình và xã hội

1.2 Phương pháp sàng lọc, chẩn đoán trước sinh bất thường NST

1.2.1 Các phương chẩn đoán trước sinh

Muốn chẩn đoán xác định thai bất thường số lượng NST phải dựa vàocác xét nghiệm di truyền Các xét nghiệm này có thể phân tích ở mức độ tếbào (phân tích NST), ở mức độ phân tử (phân tích DNA, RNA) hoặc cả ởmức độ tế bào và phân tử (kỹ thuật FISH) Tất cả xét nghiệm này cần phải lấyđược tế bào hoặc DNA có nguồn gốc từ thai NST sử dụng thủ thuật xâm lấnnhư sinh thiết gai rau trong 3 tháng đầu và chọc hút dịch ối trong 3 tháng giữathai kỳ

Việc chẩn đoán trước sinh các bất thường NST bằng kỹ thuật nuôi cấy

tế bào ối và sau đó là tế bào gai rau với mục đích xác lập bộ nhiễm sắc thể đồ(karyotype) của thai đã được thực hiện trên toàn thế giới vào cuối những nămthập niên 60 và đầu thập niên 70, kỹ thuật này thực hiện mất rất nhiều côngsức và thời gian [28] Sau đó khoảng những năm giữa của thập niên 90 thế kỷ

20, kỹ thuật FISH lai huỳnh quang tại chỗ ra đời, giúp khảo sát nhanh NST

13, 18, 21, X, Y từ mẫu máu, gai rau hoặc dịch ối, thường cho kết quả từ

48-72 giờ nhưng độ nhạy tương đối thấp, chi phí tốn kém và mất nhiều công sức

[29],[30] Đến khoảng 2001, kỹ thuật di truyền phân tử QF-PCR (quantitativefluorescent polymerase chain reaction) đã được chấp nhận giúp chẩn đoánnhanh các bất thường NST bằng cách khảo sát và định lượng các trình tự STR(short tandem repeat) đặc trưng của NST bằng các cặp mồi gắn huỳnh quang[31] Phương pháp này cho kết quả nhanh trong vòng 48 giờ, có độ nhạy và

độ đặc hiệu cao, với ưu điểm nổi bật là năng suất cao và giá thành thấp

Để có mẫu nghiệm phẩm phục vụ chẩn đoán xác định cho các trườnghợp thai có nguy cơ cao phát hiện qua sàng lọc, các thai phụ sẽ được thựchiện các thủ thuật xâm lấn như sinh thiết gai nhau, chọc hút dịch ối, hay lấymáu cuống rốn Các thủ thuật này có thể ảnh hưởng đến sự phát triển thaihoặc gây sẩy thai từ 0,5% đến 1 hay 2% tùy phương pháp Tỉ lệ dương tínhgiả 5 - 7% của xét nghiệm sàng lọc có nghĩa là sẽ có 5 đến 7% thai phụ phảilàm xét nghiệm chẩn đoán xâm lấn không cần thiết, dẫn đến tăng số thai phụ

bị sẩy thai do thủ thuật ngoài ý muốn Ngoài ra các hạn chế về tỉ lệ dương tínhgiả cao và tỉ lệ phát hiện thấp gây khó khăn cho bác sĩ khi tư vấn và làm chothai phụ và gia đình lo lắng, hoang mang không cần thiết Do đó, phát triểncác phương pháp sàng lọc không xâm lấn có tỉ lệ phát hiện cao hơn với tỉ lệdương tính giả thấp hơn là hết sức cần thiết và là ưu tiên của lĩnh vực sảnkhoa [5]

lọc tiến thêm một bước quan trọng khi kết hợp siêu âm đo độ mờ da gáy(Nuchal translucency – NT) của thai khi thai từ 11 tuần đến 13 tuần 6 ngàycùng với xét nghiệm double test là PAPP-A (pregnancy-associated plasmaprotein A) và fb-hCG trong máu mẹ, gọi là xét nghiệm kết hợp hay combinedtest [32] Các xét nghiệm này được đưa vào chương trình chăm sóc trước sinhnhằm sàng lọc, phát hiện sớm các thai phụ có nguy cơ cao bị bất thường NST

21, 18, 13, và đặc biệt là NST 21 ngay trong ba tháng đầu thai kỳ Tuy nhiêncác xét nghiệm này chỉ có tỉ lệ phát hiện khoảng 65% (triple test) đến 85%(combined test) với tỉ lệ dương tính giả từ 5 - 7% [3] Trong khi còn có nhiềutranh luận về thời điểm nên sàng lọc ở ba tháng giữa hay ba tháng đầu củathai kỳ, thì năm 1999, chiến lược sàng lọc trước sinh phối hợp các XN cả batháng đầu và ba tháng giữa thai kỳ thành một bộ XN tích hợp (integrated test)

để sàng lọc các tật dị bẩm sinh gồm T21, T18 và khuyết tật ống thần kinh[33] Đây được coi là một giải pháp tối ưu, nâng tỉ lệ phát hiện lên tới 94%với tỉ lệ dương tính giả 5% Nếu giảm tỉ lệ dương tính giả xuống từ 0,8% đến1,5% thì tỉ lệ phát hiện tương ứng sẽ là từ 85% đến 87% Số chênh mang thai

có HC Down ở thai phụ có sàng lọc nguy cơ cao (Odds of being AffectedPositive Result - OAPR) là 1:7, vượt trội so với XN bộ ba sàng lọc triple testOAPR 1:77 và combined test 1:35 [33] Như vậy các XN sàng lọc trước sinhtrên vẫn bị giới hạn bởi độ nhạy và độ đặc hiệu chưa tối ưu, xét nghiệm phảithực hiện nhiều bước kể cả phải siêu âm đo NT mà chỉ được thực hiện bởi cácbác sĩ có chứng nhận đo NT của Hiệp hội Y khoa thai nhi Fetal MedicineFoundation – FMF) Tuy nhiên trong thực tế hiện nay, xét nghiệm sàng lọc vàchẩn đoán trước sinh tập trung chủ yếu ở ba tháng đầu thai kỳ, với hy vọngphát hiện sớm các trường hợp nguy cơ cao để có thể đình chỉ thai nghén cáctrường hợp thai bị khuyết tật nặng nề một cách an toàn

Bảng 1.1 là phân tích tổng hợp tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giảtrisomy 21 của các xét nghiệm sàng lọc bất thường NST 21 của Nicolaidesnăm 2003 [3]

Bảng 1.1: Tỷ lệ phát hiện trisomy 21 và tỷ lệ dương tính giả của các xét

nghiệm sàng lọc

TM + độ mờ da gáy của thai nhi ở tuần

TM + độ mờ da gáy + xương mũi của thai

Combined test + xương mũi của thai 97 (hoặc 95) 5 (hoặc 2)

Siêu âm để phát hiện các khuyết tật và

các dấu ấn chỉ điểm (markers) ở thai nhi

vào tuần thai thứ 16 – 23

DR: Tỷ lệ phát hiện; FPR: tỷ lệ dương tính giả

Sự ra đời của các hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới (NextGeneration Sequencing – NGS) đã giúp việc nghiên cứu các trường hợp bệnh

lý đa gen như ung thư (gan, vú, phổi…) hay các bệnh di truyền ngày càng đơngiản hoá với chi phí tối ưu Nổi bật trong đó phải kể đến là ứng dụng củaNGS trong các xét nghiệm sàng lọc trước sinh, dựa trên các nghiên cứu củaDennis Lo và cộng sự phát hiện được DNA thai tự do (cell free fetal DNA -cffDNA) lưu hành trong máu người mẹ được phát hiện lần đầu vào năm 1997

để từ đó có thể phát hiện các trường hợp thai phụ mang thai lệch bội NST 21,

18 và 13 với chỉ 10 ml máu mẹ

1.3 Phương pháp sàng lọc trước sinh từ DNA thai tự do trong máu mẹ

Năm 1997, Dennis Lo và cộng sự nghiên cứu tìm DNA của NST Ytrong máu của 43 thai phụ (gồm 30 thai nam và 13 thai nữ) và 10 người phụ

nữ không mang thai [34] Kết quả cho thấy các phụ nữ không mang thai vàthai phụ mang thai nữ không có NST Y trong máu Trong khi đó, NST Y lại

có trong 80% các mẫu huyết tương, 70% các mẫu huyết thanh và 17% mẫu tếbào máu có nhân của 30 thai phụ mang thai kỳ nam [35] Đây là phát hiệnmang tính bước ngoặt gợi ý khả năng ứng dụng phát hiện DNA tự do thaitrong máu mẹ (cffDNA) trong việc phát hiện một số bất thường của thai tronglĩnh vực xét nghiệm trước sinh không xâm lấn Phương pháp này trở thành xuhướng tiên tiến, được ủng hộ rộng rãi vì phân lập và phân tích cffDNA khôngcần phải thực hiện các thủ thuật xâm lấn như chọc hút dịch ối, sinh thiết gainhau hoặc lấy máu cuống rốn nên không gây biến chứng trên mẹ và thai [36]

Đã có nhiều xét nghiệm trước sinh không xâm lấn (NIPS) được pháttriển dựa trên cffDNA/RNA nhằm sàng lọc sớm nhiều tình trạng và bệnh lýkhác nhau Ứng dụng cffDNA đầu tiên trong chẩn đoán trước sinh là xétnghiệm kiểu gen RhD trong nhóm máu Rh và giới tính của thai nhằm chẩnđoán nguy cơ mắc các bệnh di truyền liên kết NST X Sau đó, cffDNA tiếptục được nghiên cứu để chẩn đoán xác định các bệnh đơn gen như:Thalassemia, Huntington, xơ nang và loạn dưỡng cơ Duchenne [37] Tuynhiên, ứng dụng mang ý nghĩa lớn nhất của cffDNA chính là việc cho phépsàng lọc các bất thường NST của thai đặc biệt các trường hợp trisomy 21, 18

và 13 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao ở giai đoạn rất sớm (từ tuần thai thứ 10).Điều này mở ra hướng đi mới cho việc xây dựng các phác đồ sàng lọc và chẩnđoán các trường hợp thai bệnh lý cho các thai phụ

Trước khi phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới ra đời, đã có một

vài phương pháp dựa trên PCR sử dụng cffDNA/RNA như (1) phương pháp tính tỉ lệ alen RNA/SNP: dựa trên cffRNA, đây là phương pháp có độ nhạy và

độ đặc hiệu cao trong việc tầm soát lệch bội NST 21 Phương pháp này tính tỉ

số alen cho một SNP trong các phân tử mRNA có nguồn gốc rau thai hiệndiện trong máu mẹ Chiến lược RNA/SNP chỉ phù hợp với các thai phụ cóthai dị hợp tử đối với SNP được nghiên cứu Phương pháp này có thể dựa trênphương pháp phổ khối (MS) hoặc digital PCR giúp tăng cường độ chính xác

(2) Phương pháp dựa trên chỉ thị methyl hóa của thai: dựa trên sự khác biệt

về đặc điểm methyl hoá bộ gen giữa thai nhi và người mẹ để xác định sự lệchbội NST Nhược điểm của phương pháp này là lượng cffDNA chỉ chiếmkhoảng 3-10% lượng cfDNA trong máu mẹ, vì vậy rất khó khăn cho việcphân tích kết quả và làm tăng giá trị dương tính giả Các xét nghiệm dựa trênnguyên lý PCR này có hạn chế về tính đặc hiệu và độ nhạy của các cặp mồiPCR Đồng thời, do đa số cfDNA có nguồn gốc từ mẹ và hơn 90% đồng hợp

tử giữa mẹ và thai dẫn đến khó khăn thường gặp phải là “tín hiệu nền” DNAngười mẹ quá cao làm nhiễu thông tin di truyền của thai và đòi hỏi nhiều thờigian, công sức [38],[39] Đây chính là trở ngại rất lớn khi khảo sát lệch bội ởthai Để nhận diện và xác định số lượng các NST của thai trong máu mẹ cầnphải phân tích hàng loạt các đặc điểm đa hình của NST thai và NST mẹ, sosánh, đối chiếu, thống kê, định lượng tỉ lệ giữa các NST này Việc này yêucầu phải sử dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới với năng suất cao

và công nghệ tin sinh học (bioinformatics) Trong bối cảnh đó, việc áp dụngphương pháp giải trình tự thế hệ mới (next generation sequencing - NGS)nhằm khảo sát bất thường NST thai đã mở ra triển vọng mới cho các nhànghiên cứu di truyền trong lĩnh vực sản và nhi [40],[41]

1.3.1 Đặc điểm DNA thai tự do trong máu mẹ

DNA tự do (cell free DNA - cfDNA) lưu hành trong huyết tương củangười được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1948 [42] Đây là các đoạn DNA

ngắn, đa số có kích thước khoảng 150 - 200bp và có nguồn gốc từ các tế bào

có nhân chết theo chương trình [43] Đến năm 1997, Lo và cộng sự đã pháthiện được cfDNA của thai nhi (cffDNA) trong máu thai phụ Hầu hết cffDNAtrong máu mẹ có nguồn gốc từ tế bào gai rau thai và một phần nhỏ từ hệthống tạo máu của thai [34] Các mảnh cffDNA được tạo thành và giải phóngvào máu mẹ trong quá trình chết tự nhiên của các tế bào có nhân của gai rau

và có thể được phát hiện trong máu mẹ từ tuần thứ 7 của thai kỳ Tỉ lệcffDNA của thai tăng dần theo tuổi thai và thường thay đổi trong khoảng 3 -19% tổng số cffDNA trong máu mẹ, trung bình 10% [39] Thời gian bán hủytrung bình của cff-DNA là 16,3 phút (từ 4 - 30 phút), và mất sau khi sinh 2giờ [44] Đây là đặc tính rất hữu ích trong chẩn đoán thai kỳ hiện tại vì tránhđược nhầm lẫn với các thai kỳ trước

Hình 1.3: DNA tự do lưu hành trong máu mẹ 1.3.2 Các phương pháp tiếp cận tin sinh học để xác định hàm lượng cffDNA

Một loạt các phương pháp tiếp cận NIPS sử dụng giải trình tự thế hệ mới(NGS) đã được phát triển nhanh chóng trong y học lâm sàng hiện nay Trongnhững phương pháp tiếp cận như vậy, hàm lượng cffDNA là một thông sốquan trọng để đảm bảo độ chính xác cho kết quả xét nghiệm Hàm lượngcffDNA có thể xác định bằng phương pháp PCR định lượng hay giải trình tựđồng thời toàn bộ DNA (massive parrallel sequencing - MPS) trong mẫuhuyết tương thai phụ, sau đó hàm lượng cffDNA có thể được xác định bằngcác phương pháp như đếm số lượng đoạn trình tự được đọc (reads), trình tự

khác biệt về trạng thái methyl hoá, hoặc các điểm đa hình đơn nucleotide(SNPs) đặc trưng cho thai nhi.

Trong sàng lọc lệch bội NST thì hàm lượng cffDNA thấp hơn 4% tronghuyết tương thai phụ cần phải được kiểm tra qua các bước kiểm chuẩn chấtlượng, bởi hàm lượng cffDNA quá thấp sẽ gây kết quả âm tính giả trong lúcphát hiện và phân tích NST bất thường [51] Vì vậy, điều quan trọng là phảixác định chính xác hàm lượng cffDNA, đảm bảo hàm lượng cffDNA phải lớnhơn ngưỡng tiêu chuẩn (4%) nhằm đảm bảo số lượng DNA thai cần thiếttrong quá trình giải trình tự Thêm vào đó, cffDNA đã được đưa vào các thuậttoán tin sinh học trong nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [52]

Hiện nay có nhiều thuật toán được nhiều công ty thương mại phát triển

và lượng cffDNA của mỗi thuật toán cũng khác nhau Các thuật toán xác địnhhàm lượng DNA thai tự do phụ thuộc vào phương pháp tiếp cận của từng môhình [49] Phương pháp điển hình dựa vào sự tồn tại của NST Y (Ychromosome-based) để tính toán hàm lượng DNA thai chỉ áp dụng cho nhữngthai phụ mang thai nam Phương pháp dựa vào sự khác biệt về trạng tháimethyl hoá một số vùng trong bộ gen giữa mẹ và thai (methylation-based) vớinhược điểm xử lý bisulfite toàn bộ hệ gen quá tốn kém và không thể áp dụngcho xét nghiệm NIPS thường quy Phương pháp dựa vào sự khác biệt của một

số điểm đa hình giữa thai và mẹ (SNP-based) để ước lượng hàm lượng DNAthai, với nhược điểm cần thông tin về các điểm đa hình khảo sát của cả bố vàmẹ; Phương pháp dựa vào kích thước của cfDNA (size-based) dựa trên líthuyết các phân mảnh DNA thai thường ngắn hơn cfDNA của mẹ, sự phân bổcủa DNA thai thường nằm trong khoảng 100-150bp trong khi đó thì DNA mẹthường nằm trong khoảng 163-169bp Tỉ số giữa 2 phân đoạn này cho mốitương quan với giá trị ước lượng của hàm lượng DNA thai, nhược điểm củaphương pháp phải thực hiện giải trình tự 2 chiều (paired-end sequencing) để

xác định chiều dài của các đoạn DNA [55]; Phương pháp dựa vào đếm sốlượng đoạn đọc (count-based hay SeqFF) là mô hình ước lượng hàm lượngDNA thai dựa trên trực tiếp dữ liệu giải trình tự của mẫu, chỉ cần giải trình tự

1 đầu (single-end sequencing), trình tự bộ gen được chia thành nhiều vùng(bin) có kích thước 50kb, trên mỗi bin cho thấy được tỉ số kích thước củaphân đoạn DNA (tỉ số số reads có kích thước <150bp (thai) và số reads cókích thước <600bp (mẹ)) [19] Sau khi thực hiện một số thuật toán bù trừ chotình trạng GC bias, tỉ số này sẽ đại diện cho hàm lượng cffDNA trong môhình hồi quy được xây dựng với nhóm mẫu đã biết trước hàm lượng cffDNAthai (nhóm mẫu sử dụng để đào tạo mô hình hồi quy)

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả phân tích DNA thai tự do

Tỉ lệ cffDNA càng thấp, mức độ chênh lệch giữa NST quan tâm vàNST tham khảo càng giảm, hay sự khác biệt giữa NST quan tâm và NSTtham khảo (NST thường) là không rõ ràng, làm giảm độ nhạy Tỉ lệ phần trămcffDNA trong huyết tương thai phụ là một giá trị biến động và có thể bị ảnhhưởng bởi rất nhiều yếu tố khác nhau Thao tác kĩ thuật xử lý mẫu và phân lậpDNA có thể ảnh hưởng tới độ biến động của hàm lượng DNA thai tự do Cácyếu tố sinh học từ mẹ hoặc thai cũng có thể ảnh hưởng đáng kể Trong đó cóbốn nguyên nhân chính trực tiếp tác động tới hàm lượng DNA thai tự do gồm

có cân nặng thai phụ, tuổi thai, đa thai và thai bị lệch bội

1.3.3.1 Cân nặng của thai phụ

Cân nặng và/hoặc chỉ số trọng lượng cơ thể (BMI) của thai phụ là yếu

tố ảnh hưởng nhiều nhất tới hàm lượng DNA thai tự do Béo phì trong giaiđoạn thai kì là nguyên nhân dẫn tới hàm lượng DNA thai tự do thấp, rất nhiềunghiên cứu độc lập đã chứng minh điều này [3],[57] Hàm lượng DNA thai tự

do thấp ở thai phụ bị béo phì có thể do bị hiệu ứng pha loãng từ sự tăng hàmlượng cfDNA của thai phụ trong hệ tuần hoàn Hơn nữa, gia tăng lượng

cfDNA của thai phụ được giải phóng từ quá trình apoptosis/necrosis của tếbào thành mạch nền và tế bào mô mỡ ở những thai phụ béo phì [57].

1.3.3.2 Tuổi thai

Tuổi thai cũng là một yếu tố tác động hàm lượng cffDNA Nghiên cứucủa Wang và cộng sự đã ghi nhận mức độ DNA thai tự do tăng trong suốt giaiđoạn thai kì, với mức tăng ban đầu là 0,1% mỗi tuần từ tuần 10 đến tuần 20

và tăng nhanh với mức 1% mỗi tuần kể từ tuần 21 trở đi [57] Nhiều nghiêncứu cho thấy có thể phát hiện cffDNA từ tuần thứ 7 của thai kì, tuy nhiên dohàm lượng cffDNA rất thấp, làm cho kết quả có nguy cơ cao là âm tính giả[48] Chính vì vậy, họ đề nghị chỉ nên thực hiện các xét nghiệm tầm soát liênquan đến cffDNA từ tuần thứ 10 trở đi sẽ cho kết quả đáng tin cậy với độchính xác cao [54]

1.3.3.3 Lệch bội nhiễm sắc thể thai nhi

Lệch bội nhiễm sắc thể của thai nhi cũng ảnh hưởng tới hàm lượngcffDNA, tuỳ thuộc vào bất thường của từng nhiễm sắc thể Trường hợp thainhi bị lệch bội nhiễm sắc thể 21 thường có hàm lượng DNA tự do không thayđổi so với trường hợp thai bình thường Nhưng trong trường hợp lệch bộinhiễm sắc thể 13 và 18 và đơn bội nhiễm sắc thể X thì hàm lượng DNA thai

tự do lại có xu hướng giảm (p=0.004) Nguyên nhân của thay đổi hàm lượngDNA thai với trường hợp T18 và T13 có thể do chu trình tế bào nhau thai dàihơn bình thường [57] Chính vì hàm lượng DNA thai khác nhau giữa cáctrường hợp bất thường lệch bội nên độ chính xác của NIPS trong sàng lọc T21thường chính xác hơn so với T18 và T13 [59]

1.3.3.4 Đa thai

Tỷ lệ cffDNA sẽ cao hơn ở trường hợp đơn thai Ở thai phụ mang thaiđôi, tỷ lệ cfDNA của từng thai thấp hơn khoảng 30-50% so với những trường

hợp mang thai đơn lẻ [94],[95] Gromminger và cộng sự [96] cho rằng tỷ lệcfDNA tối thiểu trong trường hợp thai đôi là 8%, nghĩa là cffDNA/thaithường thấp hơn thai đơn khi đánh giá độ chính xác của NIPS [89] cffDNAcủa mỗi thai là khác nhau, do vậy không nên chia đều cho 2 thai Trongtrường hợp thai phụ mang thai đôi, một thai chết trong tử cung, kết quả là cònmột thai đơn độc gọi là vanishing twin Vanishing Twin xảy ra ở 27-41% thaiphụ DNA rau thai của thai chết có thể tồn tại ít nhất 8 tuần sau đó, tuy nhiênvẫn chưa có nghiên cứu rõ ràng rằng sau bao lâu thì cffDNA này tiêu biếntrong huyết tương mẹ [119] Nếu việc một trong 2 thai chết sẽ gây ra sự mấtcân bằng, điều này có thể gây ra kết quả dương tính giả [119].

1.3.3.5 Hiện tượng khảm ở rau thai (CPM: Confined Placental Mosaicism)

cffDNA có nguồn gốc từ tế bào lá nuôi rau thai, xuất hiện trước khi cótuần hoàn thai [103] Bởi vì nguồn gốc cffDNA là từ rau thai, NIPS có thểđưa ra kết quả dương tính cho hiện tượng khảm ở rau thai (CPM) TrongCPM, một vài hoặc tất cả tế bào nuôi bao gồm trisomy, trong khi thai lại làdisomic CPM được báo cáo vào khoảng 1-2% trong thai kỳ 1 [104] CPMhay gặp trên NST 21, 18, 13, các NST khác ít gặp hơn [105],[106]

Mặc dù đưa ra kết quả sai lệch do hiện tượng khảm ở rau thai và khôngđại diện cho NST thai, tuy nhiên phát hiện này vẫn có ý nghĩa lâm sàng CPM

có thể liên quan đến rối loạn chức năng rau thai (ví dụ, dẫn đến chứng giảmdịch ối) và có thể gây hạn chế phát triển thai trong buồng tử cung (IUGR),tăng huyết áp thai kỳ, sinh non [50],[107],[108]

1.3.3.6 Thai phụ

Thai phụ có bất thường NST như hội chứng siêu nữ (47,XXX), bệnh áctính như ung thư cổ tử cung và ung thư vú, u da ác tính, u lympho [116]

hoặc mức thấp khảm NST [111], đây là nguyên nhân hiếm gặp gây kết quảNIPS dương tính giả.

1.3.4 Ứng dụng lâm sàng của cffDNA trong huyết tương mẹ

Phương pháp định lượng cffDNA trong huyết tương mẹ đã được ứngdụng trong lâm sàng để sàng lọc trước sinh không xâm lấn phát hiện lệch bộiNST thai đặc biệt là hội chứng Down Ngoài ra, cffDNA còn được ứng dụngtrong xác định giới tính thai, chẩn đoán tiền sản giật, chẩn đoán kiểu gen Rhcủa thai và một số bệnh di truyền đơn gen

1.3.4.1 Xác định giới tính thai

Việc xác định giới tính thai được sử dụng để theo dõi quản lý thai phụ

có nguy cơ mang thai mắc các bệnh di truyền liên kết NST giới tính X nhưbệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Sàng lọc trước sinh không xâm lấngiúp xác định giới tính thai có thể thực hiện từ tuần thai thứ 7 [71] Sử dụngcffDNA xác định giới tính thai nhi dựa vào việc phát hiện các trình tự SRYhoặc DYS14 trong huyết tương mẹ từ NST Y có khả năng làm giảm tỷ lệ thaiphụ bị yêu cầu làm thủ thuật xâm lấn, do vậy giảm giá thành khi phải thựchiện thêm thủ thuật xâm lấn [53] Bên cạnh đó, cffDNA xác định giới tính cóthể là một trợ giúp cực kỳ hữu ích cho các chẩn đoán siêu âm của một số hộichứng di truyền có nhiều bất thường, đặc biệt là sự mơ hồ về bộ phận sinhdục [73]

1.3.4.2 Xác định nhóm máu RhD của thai

Phân tích cfDNA trong huyết tương mẹ còn được ứng dụng để xác địnhnhóm máu RhD thai ở những bà mẹ mang thai có RhD (-) Khi người mẹRhD (-) mang thai RhD (+) có nguy cơ tạo ra kháng thể chống lại hồng cầu cóRhD (+) của thai có thể qua rau thai và sẽ hủy hoại các hồng cầu và gây rabệnh tan máu (HD - hemolytic disease) trầm trọng, vàng da nặng cho thai vàtrẻ sơ sinh có thể dẫn đến tử vong Việc phát hiện RhD bằng cffDNA đã được

sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trên toàn thế giới ở những phụ nữ mang thai

có nguy cơ cao về bệnh tan máu giúp cho việc quản lý thai nghén [74]

1.3.4.3 Phát hiện các trường hợp mang thai có nguy cơ tiền sản giật

Tiền sản giật là một hội chứng sản khoa xảy ra từ tuần 20 thai kỳ baogồm các dấu hiệu tăng huyết áp, phù và protein niệu, nếu không phát hiện vàđiều trị kịp thời sẽ gây biến chứng thậm chí tử vong cho cả mẹ và thai Chođến nay, vẫn chưa có một thông số nào đáng tin cậy nào được sử dụng để dựđoán sự phát triển của tiền sản giật, nhiều nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm racác kỹ thuật mới nhằm phát hiện sớm tiền sản giật Sau khi phát hiện racffDNA bởi Lo và cộng sự vào năm 1997, hai năm sau đó, trong một nghiêncứu trên 20 thai phụ bị tiền sản giật, đã chứng minh rằng nồng độ cffDNAtrên thai phụ tiền sản giật tăng cao gấp 5 lần so với thai phụ bình thường [76].Quan trọng hơn, nồng độ cffDNA dường như tăng trước khi xuất hiện cáctriệu chứng lâm sàng của bệnh và có thể được sử dụng như là một dấu hiệu dựbáo tiền sản giật, ít nhất là đối với loại nặng và giai đoạn cấp bệnh tiền sảngiật [68] Có rất nhiều có chế phức tạp gây ra bệnh lý tiền sản giật trong đó có

sự kết hợp của apoptosis, thiếu oxy và các con đường của quá trình viêm

1.3.4.4 cffDNA và hội chứng thai chậm phát triển trong buồng tử cung (intrauterine growth restriction - IUGR)

Hội chứng thai chậm phát triển trong buồng tử cung (IUGR) là một rốiloạn phức tạp của thai kỳ do nhiều nguyên nhân khác nhau IUGR đặc trưngbởi việc chậm phát triển của thai bao gồm trọng lượng thai tại thời điểm thămkhám và sự phát triển của thai và có liên quan đến bệnh suất và tử vong chusinh, cũng như bệnh tim mạch khi trưởng thành [88] Mặc dù có rất nhiềunguyên nhân khác nhau gây ra IUGR, tuy nhiên rối loạn chức năng rau thai làmột trong những nguyên nhân chủ yếu Một nghiên cứu của Smid và cộng sựnăm 2006 cho thấy nồng độ cffDNA tăng cao ở thai IUGR [90] Nồng độ

cffDNA cao hơn rõ rệt ở những phụ nữ mang thai IUGR so với thai phụ bìnhthường [91],[92], có thể liên quan đến sự thiếu dinh dưỡng rau thai [92].

1.3.4.5 cffDNA và sinh non

Sinh non là sinh trước tuần thứ 37 của thai kỳ, là nguyên nhân chính gây

tử vong sơ sinh và những biến chứng lâu dài ở trẻ sơ sinh [93] Một số yếu tốsinh lý đã được cho là liên quan tới sự phát triển của bệnh, chẳng hạn như sựsuy yếu do xâm lấn mạch - lá nuôi phôi và kích thích vật lý [94],[95],[96] Việc phát hiện cffDNA sử dụng như là một chỉ điểm tiên đoán về rốiloạn chức năng giảm ôxy máu rau thai gây sinh non đã được chú ý nhiều nămqua Năm 2005, Farina và cộng sự đã chứng minh rằng nồng độ cffDNA tănglên trong huyết thanh mẹ ở những thai phụ có nguy cơ sinh non tự phát caohơn do sinh non hoặc do vỡ ối sớm [95] Mặt khác, Illanes và cộng sự đãchứng minh không có sự liên quan đáng kể giữa nồng độ cffDNA trong huyếttương ở 22-24 tuần và tuổi thai khi sinh, hỗ trợ cho giả thuyết rằng nồng độcffDNA không dự đoán được tình trạng sinh non ở thai phụ có cổ tử cungngắn [96] Trong một nghiên cứu trên 60 thai phụ, trong đó có 30 thai phụsinh non, nồng độ cffDNA cao gấp 6 lần ở nhóm bệnh lý so với nhóm đốichứng [98] Các nhà nghiên cứu cho rằng giải phóng cffDNA là kết quả của

sự khởi đầu của việc phá vỡ hàng rào rau thai dự đoán về chuyển dạ [95] Tuynhiên, trong hầu hết các trường hợp, tăng nồng độ cffDNA dường như là kếtquả của quá trình khởi phát chuyển dạ và sinh sau đó, chứ không phải là dấuhiệu tiên đoán bệnh lý

1.3.4.6 cffDNA và các bệnh lý liên quan đến quá trình mang thai

cffDNA được coi như là một chỉ điểm sinh học liên quan đến nhiều bệnh

lý trong thời kỳ mang thai ngoài các bệnh như TSG, IUGR hoặc sinh non

Vora và cộng sự cho thấy có sự tương quan giữa chỉ số khối cơ thể (BMI) vànồng độ cffDNA trên 16 thai phụ béo phì (BMI trung bình: 39.2) và 14 thaiphụ nữ gầy (BMI trung bình: 21.8) so với nhóm chứng là 10 thai phụ bìnhthường, tất cả các thai phụ đều mang thai nam từ tuần thai 37-40 tuần, kết quảcho thấy ở thai phụ béo phì có sự tăng cfDNA toàn phần có thể liên quan tớităng sự hủy hoại mô mỡ và apoptosis mạch máu [100] Nồng độ cffDNA tăng

ở thai phụ có chứng nghén nặng (HG - hyperemesis gravidarum), cfDNAtương quan đáng kể so với βhCGhCG huyết tương, gợi ý rằng sinh bệnh học của

HG có thể liên quan đến sự bất thường của tương tác miễn dịch giữa mẹ vàthai, như vậy cffDNA có thể được coi là một dấu hiệu tiên đoán các triệuchứng lâm sàng, Nghiên cứu đã chứng minh nồng độ cffDNA cao hơn đáng kể(gấp 2,5 lần) trong với trường hợp HG nặng so với các trường hợp nhẹ và trungbình (tăng 1,26 và 1,6 lần) [102] Kết quả này có thể giải thích tại sao cffDNA

và HG liên quan và tương quan chặt chẽ, bởi vì cffDNA bắt nguồn từ tế bào lánuôi phôi, tế bào lá nuôi phôi có thể bị tổn thương nhiều hơn trong suốt quátrình hình thành rau thai ở HG nặng so với những trường hợp mang thai khôngbiến chứng hoặc trong trường hợp HG nhẹ

1.3.4.7 cffDNA và bệnh di truyền đơn gen

Chẩn đoán trước sinh hiện nay là một phương pháp thường quy sử dụngcho các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh con mắc bệnh di truyền đơn gen Tuynhiên, nguy cơ mất thai do thủ thuật chọc hút dịch ối hoặc sinh thiết gai rau là0.5-1% khi lấy mẫu Sàng lọc trước sinh không xâm lấn sử dụng cffDNAtrong huyết tương mẹ nhằm mục đích thay thế các phương pháp xâm lấn giúpsàng lọc các bệnh di truyền đơn gen, đặc biệt là bệnh NST liên kết với giớitính X Do đó, các nghiên cứu về NIPS chủ yếu được thực hiện trong ba thángđầu của thai kỳ được coi là một bước sàng lọc quan trọng trước khi tiến hànhchẩn đoán Những trường hợp mang thai do thụ tinh ống nghiệm đã được

chẩn đoán tiền phôi vẫn rất cần thiết phải thực hiện thủ thuật xâm lấn để chẩnđoán bệnh di truyền đơn gen, NIPS được coi là một xét nghiệm có giá trị rấtlớn Mặc dù việc phát hiện các đột biến của thai từ cffDNA là vô cùng khókhăn do sự chiếm ưu thế của trình tự DNA của người mẹ, tuy nhiên cho đếnnay một số bệnh di truyền đơn gen đã được chẩn đoán trong máu mẹ nhưbệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, hemophilia, loạn dưỡng cơ Duchene,thalassemia, bệnh Huntington….

1.4 Giải trình tự gen thế hệ mới và xét nghiệm trước sinh không xâm lấn

1.4.1 Lịch sử hình thành và phát triển

Giải trình tự gen thế hệ mới là phương thức giải trình tự đồng thời hàngtriệu phân mảnh nhỏ DNA Đây là một cuộc cách mạng về công nghệ giảitrình tự vì nếu kỹ thuật Sanger chỉ cho phép giải trình tự không quá 1000 bps,thì giải trình tự thế hệ mới cho phép giải trình tự được từ 8 Gbases cho đến

600 Gbases, có nghĩa là có thể giải trình tự nguyên bộ gen trong một thời gianmột ngày Sự ra đời của NGS (Next Generation Sequencing) đã giúp việcnghiên cứu các trường hợp bệnh lý đa gen như ung thư (gan, vú, phổi…) haycác bệnh di truyền ngày càng đơn giản hoá với chi phí tối ưu Nhưng nổi bậtnhất chính là thành tựu về việc ứng dụng NGS trong các xét nghiệm tầm soáttrước sinh phát hiện một số các lệch bội NST hay gặp như T21, T18, T13 haymonosomy X

Năm 2011, hai hệ thống NGS là Miseq (Illumina) và Ion Torrent (LifeTechnologies) lần đầu tiên được giới thiệu trên toàn thế giới đã đánh dấubước phát triển mạnh mẽ của công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới hay còngọi là giải trình tự song song hàng loạt (massive parallel sequencing - MPS).Đến nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, đã có vô số nhữngứng dụng được cải tiến và rất nhiều các dòng máy NGS được ra đời nhằmphục vụ nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau Hiện nay, có thể kể đến các

công ty tiên phong trong lĩnh vực NGS như: Ion Torrent với hệ thốngPersonal Genome Machine (PGM)/Ion proton/ Ion S5 system; Illumina vớiMiseq/Hiseq/Nextseq hay Roche GS FLX454/Junior

1.4.2 Nguyên lý cơ bản

Nguyên lý cơ bản của phương pháp NGS tương tự như phương phápgiải trình tự DNA của Sanger kinh điển trước đây DNA được phân cắt thànhcác đoạn trình tự mục tiêu ngắn, sau đó máy tiến hành phân giải trình tự(sequencing) các đoạn DNA ngắn này, dữ liệu sau khi giải trình tự được tổnghợp và lắp ghép thành trình tự bộ gen hoàn chỉnh [22],[34] Ưu điểm nổi bậtnhất của NGS chính là cho phép giải trình tự từ 1 triệu đến 43 tỉ đoạn DNAngắn (từ 50 bp cho đến 400bp) trong một lần vận hành so với phương phápSanger chỉ giới hạn trong một trình tự DNA đích khoảng 1000 bp, điều nàygiúp giảm đáng kể thời gian và thao tác kỹ thuật

Hình 1.4: Lưu đồ thực hiện giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện T21.

Gióng hàng

Đếm

Kỹ thuật xác định trình tự các nucleotide trong DNA thông qua việcphát hiện tín hiệu điện do ion H+ được giải phóng ra trong quá trình tổng hợpDNA bằng các máy đo pH siêu nhỏ gắn vào chip cảm ứng bán dẫn.

Bước 1: Tạo thư viện DNA

- Cắt DNA hệ gen bằng enzyme giới hạn đầu tù: Các đoạn cfDNAthông thường ở trạng thái đầu dính, cần phải được sửa đuôi tạo đầu tù, nhằmtạo điều kiện thuận lợi để nối adaptors và barcode

- Gắn 2 đầu adapter A và P1 bằng ligase

- Nhân bản đặc hiệu bằng phản ứng PCR các trình tự có 2 đầu A và P1bằng mồi có trình tự bổ sung với adapter A và P1

- Gắn chọn lọc mạch xuôi và ngược 5’P1-ssDNA-3’A lên cácmicrobead (Ion Sphere) với tỷ lệ gắn là 1 bead: 1 DNA Với việc gắn cả 2đầu, giải trình tự được tiến hành hai chiều, giúp tăng độ chính xác

Bước 2: PCR nhũ dịch và đưa các hạt bead vào các giếng có chip gắn máy

đo pH siêu nhỏ Mỗi đĩa có khoảng 1.2 – 660 triệu giếng tùy theo thế hệ máy

Bước 3: Giải trình tự các đoạn DNA đã gắn trên mỗi bead theo nguyên

lý Ion semiconductor

Đầu tiên một loại dNTP được bơm vào các giếng trên đĩa, DNApolymerase xúc tác cho phản ứng kéo dài chuỗi DNA, tại đó từng dNTP đượcthêm vào chuỗi DNA sẽ giải phóng ra Ppi và H+ Số lượng H+ được giảiphóng sẽ tỷ lệ với số lượng phân tử của 1 loại dNTP được gắn vào chuỗi

H+ được giải phóng sẽ làm giảm pH và tăng điện tích ở khay cảm ứngbán dẫn, dẫn tới chênh lệch điện thế của bộ phận truyền cảm ứng và xuất hiệndòng điện Tín hiệu điện hóa sẽ được ghi nhận bởi phần mềm máy tính

Từng loại dNTP sẽ được bơm vào trong giếng phản ứng luân phiên nốitiếp nhau

Bước 4: Ghép nối các đoạn DNA đã được giải trình tự bằng phần mềm

tin sinh để tạo ra một trình tự đầy đủ genome

Hình 1.5: Giải trình tự trên hệ thống giải trình tự Ion Torrent

Bước 5: Phân tích kết quả mẫu giải trình tự

Dữ liệu thô ban đầu gồm các đoạn đọc có kích thước khác nhau Dữliệu của mỗi mẫu được nhận biết thông qua trình tự barcode Tiếp theo, cácđoạn đọc được cắt gọt dần từ đầu 3’ (nhằm loại bỏ trình tự barcode) tới khiđoạn đoạn đọc đạt chất lượng giải trình tự > Q20 (chính xác 99%), sau đó lọcgiữ lại các đoạn đọc có kích thước < 167 bp Các đoạn đọc còn lại (thoả mãncác điều kiện cắt gọt và lọc) sẽ được sắp gióng cột với trình tự bộ gen ngườichuẩn (hg19) bằng chương trình BWA Các đoạn đoạn không tương đồnghoặc được tương đồng nhiều hơn 1 vị trí trên bộ gen sẽ được lọc bỏ vớichương trình FLAG trong các tập tin được gióng cột Các đoạn đọc nhân bảnđược nhận diện bằng chương trình của hãng Hiện tượng GC bias (hàm lượng

GC ảnh hưởng tới hiệu suất của phản ứng PCR trong các bước chuẩn bị thư

viện, gây ảnh hưởng tới độ chính xác của kết quả phân tích) được chuẩn hoábằng các thuật toán được tích hợp cho GC correction bao gồm 3 bước: Hồiquy LOESS, tự chuẩn hoá (normalization) với các NST thường (trừ NST 13,

18, 21, X, Y) khác và mô hình hoá hồi quy tuyến tính

1.4.4 Ứng dụng NGS trong sàng lọc trước sinh

Năm 1999, nghiên cứu của Lo và cộng sự cho thấy thai phụ mang thaitrisomy 21 có hàm lượng cffDNA cao hơn trong huyết tương hoặc huyếtthanh mẹ [52] và sau đó, một số phương pháp đã được mô tả để xác định hàmlượng NST thai từ huyết tương mẹ Các phương pháp tiếp cận này có liênquan đến nhiều phương pháp như methyl hóa DNA, phân tích RNA thai nhi

và đo tỷ lệ alen [52],[53],[54] Tuy nhiên, vì những phương pháp này thườngđòi hỏi các dấu hiệu đa hình, không có dấu hiệu đơn lẻ hoặc xét nghiệm nào

là thông tin ở tất cả các gia đình; đây chính là hạn chế cho việc áp dụng rộngrãi các phương pháp này trong ứng dụng lâm sàng Năm 2007, Lo, Fan vàQuake đã báo cáo một cách tiếp cận dựa trên phương pháp đếm định lượngcác phân tử DNA bằng PCR kỹ thuật số [55],[56] Khái niệm cốt lõi của cáchtiếp cận này là số lượng DNA càng lớn thì phương pháp càng có độ chính xáccao Hơn nữa, số lượng phân tử DNA trong huyết tương mẹ cần phải đượctính để phát hiện thai hội chứng Down là tương quan nghịch với tỷ lệ phầntrăm DNA thai Điều này có thể giải thích cho sự thành công của phươngpháp bắt nguồn từ việc nhận ra rằng cffDNA cao hơn hẳn tế bào thai [57].Tuy nhiên, tỷ lệ cffDNA trong mẫu có ảnh hưởng rất lớn đến độ tin cậy củaxét nghiệm DNA huyết tương mẹ nói chung [] Năm 2008, Fan và cộng sự lànhóm nghiên cứu đầu tiên công bố phương pháp không xâm lấn định lượng NSTcủa thai để phát hiện lệch bội thông qua lập bản đồ các trình tự DNA được đánhdấu bằng phương pháp MPS sử dụng các cfDNA trong huyết tương mẹ màkhông cần tách riêng và làm giàu DNA thai với DNA mẹ [22] Phương pháp này

tạo ra 10 triệu đoạn trình tự trong toàn bộ genome, gióng hàng và lập bảng đồnhờ vào các đoạn DNA đánh dấu, rồi so sánh với trình tự bộ gen tham chiếu đểxác định nguồn gốc của NST Sau khi dựng nên bản đồ, phần mềm phân tích sẽđếm các đoạn DNA từ đó xác định được số lượng NST (Hình 4) Khả năng đếmhàng triệu các đoạn DNA làm cho độ nhạy phát hiện lệch bội rất cao nếu có tăng(trisomy) hoặc giảm (monosomy) tương đối số lượng các đoạn DNA của NSTkhảo sát so với bộ NST tham chiếu Để dựng bản đồ, đếm và so sánh các đoạnDNA với bộ gen tham chiếu, hệ thống cần sử dụng các thuật toán chuẩn hóa vàđếm NST Các biến đổi về trình tự giữa các mẫu phân tích, hạn chế về kỹ thuật

và thuật toán phân tích không phù hợp sẽ gây khó khăn trong việc phát hiệntrisomy 21 và các lệch bội NST khác [58] Vì MPS cho phép phân tích hầu nhưtất cả các phân tử DNA trong một mẫu huyết tương (thay vì chỉ giới hạn trongcác phân tử DNA có các vị trí liên kết của một cặp mồi trong phản ứng đặc hiệuPCR), MPS được coi là phương pháp hiệu quả hơn PCR kỹ thuật số do tối đahóa số lượng thông tin sàng lọc có thể thu được trong một mẫu huyết tương [58]

1.4.5 Ý nghĩa của việc ứng dụng NGS vào NIPS trong sàng lọc trước sinh

Cho đến nay, phần lớn các dữ liệu đã được chứng minh trên các ứngdụng sàng lọc lệch bội nhiễm sắc thể từ cffDNA được thực hiện bằng kỹ thuậtgiải trình tự MPS Có ba phương pháp giải trình tự MPS đang được sử dụngchính để phát hiện cffDNA trong máu mẹ, giải trình tự Shotgun (s-MPS) làgiải trình tự đồng thời và lượng lớn các đoạn ngắn nucleotide trong bộ gen;giải trình tự mục tiêu Targeted (t-MPS) tập trung vào NST đặc hiệu cần quantâm; và một phương pháp có lợi thế sử dụng đa hình đơn nucleotide (SNP) cóthể phân biệt sự khác nhau giữa DNA mẹ và thai

s-MPS dựa vào phương pháp đếm số lượng lớn các cffDNA, s-MPSđược sử dụng để giải trình tự đồng thời hàng triệu phân mảnh DNA của mẹ và

thai nhi trong bộ gen và so sánh trình tự thu nhận với trình tự tham chiếu đểxác định khả năng đột biến số lượng NST có thể xảy ra [18],[62].

Giải trình t-MPS tương tự như s-MPS nhưng chọn lọc vào vùng NSTcần quan tâm như NST 13, 18, 21, X, Y và đếm tập hợp NST này [63] Thangđiểm để đánh giá nguy cơ của bệnh nhân có thể được điều chỉnh bởi cffDNA

và sau đó kết hợp kết quả với tuổi mẹ và tuổi thai

Phương pháp khuếch đại và giải trình tự những nhiễm sắc thể cần quantâm (13, 18, 21, X và Y) kết hợp với việc phân tích đa hình đơn cácnucleotide (single nucleotide polymorphisms: SNPs) Phương pháp này đưa

ra những dữ liệu lớn về kiểu gen của thai nhi với độ chính xác cao

Shan Dan và CS (2012) trong một thử nghiệm lâm sàng sử dụng MPSsàng lọc trước sinh không xâm lấn trisomy 21 và 18 trên 11105 thai phụ vớicác yếu tố nguy cơ trong 2 năm tại 49 trung tâm tại China, phát hiện 1.17%(190/11105) trường hợp dương tính bao gồm 143 trường hợp trisomy 21, 47trường hợp trisomy 18 Các trường hợp dương tính được chọc hút dịch ối đểlàm karyotype, phát hiện một trường hợp dương tính giả trisomy 21, 1 trườnghợp trisomy 18 và không có trường hợp nào âm tính giả Chỉ có 1.17% thaiphụ có chỉ định chọc hút dịch ối Độ nhạy là 100% và độ đặc hiệu 99.96%

Có thể nói NIPS là xét nghiệm sàng lọc trisomy 21 và 18 có độ nhạy và độđặc hiệu cao, có thể được đưa vào xét nghiệm sàng lọc thường quy, nhờ đó cóthể tránh được 98% các trường hợp phải làm xét nghiệm xâm lấn [64]

Gần đây, một nghiên cứu so sánh hiệu quả của việc sử dụng NIPS vàsàng lọc xét nghiệm kết hợp giữa double test và siêu âm đo độ mờ da gáy(Combined test) thai kỳ 1 trong quần thể dân số chung [78] Về tỷ lệ pháthiện, xét nghiệm cffDNA xác định chính xác 38 thai phụ với T21, có nghĩa là

tỷ lệ phát hiện là 100% (CI: 90,7-100%) Combined test có tỉ lệ phát hiện là78,9% (CI: 62,7-90,4%, P = 0,008), có nghĩa là xác định 30 trong 38 trường

hợp T21 là dương tính Đối với cffDNA, có 9 trường hợp FP trong 15.803thai phụ (FPR: 0,06% [CI: 0,03-0,11%]).

Bảng 1.2: xét nghiệm sàng lọc NST 21 theo tuổi mẹ và yếu tố nguy cơ

Với combined test, có 854 trường hợp FP chiếm tỷ lệ là 5,4% (CI: 5,8%, P <0,001) đã được báo cáo Xét nghiệm cffDNA và Combined test cóPPV là 80,9% (CI: 66,7-90,9%) và 3,4% (CI: 2,3-4,8%), tương ứng (P

5,1-<0,001) Trong nhóm 11.994 thai phụ có nguy cơ thấp về tuổi (<35 tuổi),cffDNA xác định chính xác tất cả 19 trường hợp TP với T21, 6 trường hợp FPvới T21 Đối với nhóm này, PPV là 76,0% (CI: 54,9-90,6%) Trong nhóm14.957 thai phụ được sàng lọc bằng Combined test có nguy cơ T21 thai kỳ 1

<1/270, cffDNA đã xác định 8 thai phụ TP với T21, 8 thai phụ FP với T21.Trong nhóm này, PPV là 50,0% (CI: 24,7-75,3%)

Ngoài ra, trong 10 trường hợp T18 trong 15.841 thai phụ được sàng lọcthì có 9 thai phụ T18 được xác định chính xác bởi cffDNA trong khi đóCombined test xác định được 8 thai phụ T18 Đối với T18, xét nghiệmcffDNA có 1 kết quả FP, với FPR 0,01 (CI: 0-0,04%) và PPV là 90,0% (CI:55,5-99,7%), trong khi combined test có 49 trường hợp FP tương ứng với tỷ

lệ FPR: 0,31% (CI: 0,23-0,41%) và PPV là 14% (CI: 6,3-25,8%) (P <0,001cho cả hai so sánh) [79].

Bảng 1.3: xét nghiệm sàng lọc NST 18, 13

Tổng cộng có 11185 thai phụ nữ xét nghiệm cffDNA và combined test choT13 và có 2 trường hợp được chẩn đoán Cả hai trường hợp được xác định bằngxét nghiệm cffDNA trong khi combined test chỉ xác định 1 trường hợp Với xétnghiệm cffDNA có 1 kết quả FP, trong khi combined test có 28 kết quả FP,tương ứng với FPR 0,02% (CI: 0-0.06%) và 0,25% (CI: 0,17-0,36%), tương ứngvới P <0,001 [79]

Phân tích tổng hợp này cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệmcffDNA cao hơn so với sàng lọc truyền thống trong việc phát hiện T21 trongtổng số thai phụ và FPR thấp hơn gần 100 lần so với combined test, điều nàycũng được khẳng định bởi các phân tích tổng hợp khác Liên quan đến tuổi

mẹ, xét nghiệm cffDNA có độ nhạy cao hơn và FPR thấp hơn so vớicombined test Tuy nhiên phân tích tổng hợp này chỉ là phép so sánh xétnghiệm cffDNA với combined test trong thai kỳ 1, trong khi các phương pháp