Đánh giá hoạt tính sinh học của một số nhóm chất tách chiết từ cây Tô mộc (Caesanpinia sapan L.)

Luận văn đã góp phần nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chiết xuất từ gỗ Tô mộc (Caesanpinia sapan L.). Nghiên cứu đã đánh giá và tìm ra được phân đoạn Ethyl acetat (EAF) chiết xuất từ lõi gỗ cây Tô mộc là phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn và chống oxi hóa tốt. Chiết xuất EAF đã được chứng minh có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của nhiều vi sinh vật, đặc biệt là các chủng vi khuẩn Gram (+) và các chủng Vibrio gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Hồng Điệp

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê

Hồng Điệp - Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Quang Huy - Trưởng khoa Sinh học, TS Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã luôn giúp đỡ và cho em nhiều lời khuyên quý báu trong quá trình thực hiện luận văn Em cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ và anh chị trong bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, các thầy cô của khoa Sinh học trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp đỡ, truyền dạy cho em những kiến thức, kỹ năng và kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học để em có thể hoàn thành luận văn này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, các em sinh viên của phòng thí nghiệm Hóa sinh và Sinh học phân tử Lab 132T1 đã luôn ở bên giúp đỡ, khích lệ và động viên em những lúc khó khăn cũng như đưa ra những góp ý, chia sẻ kinh nghiệm trong học tập và nghiên cứu

Em xin trân trọng cảm ơn dự án Hợp tác Việt Bỉ (Exploring the Medical,

(ECO)-Toxicological and Socio-Economic Potential of Natural Extracts in North Vietnam) đã hỗ trợ kinh phí và nguồn mẫu để tiến hành các thí nghiệm trong quá

trình thực hiện đề tài luận văn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 11 năm 2018

Học viên

Đỗ Thị Huế

DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

EAF Ethyl acetate fraction (Phân đoạn ethyl acetate )

EF Ethanol fraction (Phân đoạn ethanol)

MHB Mueller Hinton Broth

MIC

Minimal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

nHF n-hexan fraction (Phân đoạn n-hexan)

SFE Supercritical fluid extraction

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Độ hấp thụ quang phổ của axit gallic ở bước sóng 765 nm 29

Bảng 3.1 Hiệu suất tách chiết gỗ Tô mộc 40

Bảng 3.2 Kết quả chiết phân đoạn gỗ Tô mộc 42

Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn gỗ Tô mộc trên chủng E coli 44

Bảng 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn gỗ Tô mộc trên chủng B subtilis 44 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn EAF trên chủng S aureus và B cereus 46

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn EAF trên chủng S typhimurium và P aeruginos 47

Bảng 3.7 Kết quả xác định MIC/MBC của cao EAF trên các chủng VSV 49

Bảng 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn của cao EAF trên các chủng Vibrio 51

Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm của cao EAF 55

Bảng 3.10 Hoạt tính chống oxi hóa của axit ascorbic và cao EAF 57

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Tô mộc (Đỗ Xuân Cẩm) 4

Hình 1.2 Một số hợp chất từ cây Tô mộc 6

Hình 1.3 Một số phương pháp tách chiết thông thường [7] 19

Hình 1.4 Sơ đồ phương pháp tách chiết có hỗ trợ vi sóng [71] 20

Hình 1.5 Sơ đồ phương pháp chiết siêu tới hạn [37] 23

Hình 2.1 Mẫu gỗ Tô mộc 27

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn gỗ Tô mộc 28

Hình 2.3 Đường chuẩn axit gallic 30

Hình 2.4 Cách xác định vòng kháng khuẩn 33

Hình 2.5 Sơ đồ phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxi hóa [40] 37

Hình 2.6 Phương trình đường chuẩn axit ascorbic 38

Hình 3.1 Sơ đồ hiệu suất tách chiết phân đoạn gỗ Tô mộc 43

Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn gỗ Tô mộc trên 2 chủng E coli và B subtilis 45

Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn EAF trên chủng S aureus và B cereus 47

Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn EAF trên chủng S typhimurium và P aeruginosa 48

Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EAF trên các chủng Vibrio 52

Hình 3.6 Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio của cao EAF 53

Hình 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm của cao EAF 56

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Tô mộc 3

1.1.1 Sơ lược về phân họ Vang 3

1.1.2 Giới thiệu chung về cây Tô mộc 3

1.2 Tình hình nghiên cứu Tô mộc 5

1.2.1 Các nghiên cứu Tô mộc trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình nghiên cứu Tô mộc ở Việt Nam 15

1.3 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu 16

1.3.1 Tổng quan về chiết xuất dược liệu 16

1.3.2 Các phương pháp chiết xuất dược liệu 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Mẫu thực vật 24

2.1.2 Chủng vi sinh vật 24

2.1.3 Dụng cụ thí nghiệm 26

2.1.4 Thiết bị và hóa chất 26

2.1.5 Môi trường 26

2.2 Phương pháp 27

2.2.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 27

2.2.2 Phương pháp chiết phân đoạn 27

2.2.3 Phương pháp định lượng Phenolic tổng số 28

2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 31

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng nấm 35

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 36

2.2.7 Phương pháp thống kê 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Đánh giá hiệu suất và lựa chọn phương pháp tách chiết 39

3.2 Kết quả tách chiết thu phân đoạn 41

3.3 Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết Tô mộc 43 3.4 Đánh giá hoạt kháng khuẩn của phân đoạn ethyl acetate (EAF) 46

3.4.1 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 46

3.4.2 Kết quả xác định MIC/MBC bằng phương pháp pha loãng 48

3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn ethyl acetate trên các chủng Vibrio 50

3.5 Đánh giá hoạt tính kháng nấm của phân đoạn ethyl acetate 55

3.6 Đánh giá hoạt tính oxi hóa của phân đoạn ethyl acetate 56

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

MỞ ĐẦU

Dược liệu đóng một vai trò quan trọng trong đời sống con người do thuộc tính đặc biệt của chúng như là một nguồn cung cấp vô giá các hoạt chất tự nhiên từ thực vật cho y học Năm 1985 Farnsworth và cộng sự xác định được 119 chất chuyển hóa thực vật được sử dụng làm thuốc Trong số 255 loại thuốc được coi là cơ bản và cần thiết của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 11% trong số đó là các dược chất thu được từ thực vật hoặc được tổng hợp từ các tiền chất tự nhiên Các hợp chất tự nhiên từ thực vật được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư,…[16]

Hiện nay không chỉ ở Việt Nam mà trên thế giới, nguyên liệu sản xuất dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên và chiết xuất từ thực vật đang là xu hướng mới nhằm tạo ra các loại thuốc thân thiện với sức khỏe con người và ít tác dụng phụ hơn Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay vẫn dựa vào các loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là sử dụng các chế phẩm, sản phẩm từ dược liệu, kể cả các nước phát triển và đang phát triển Các loại thuốc được sử dụng trong phòng và chữa bệnh hầu hết được điều chế từ hai nguồn: dược liệu và hóa dược Theo số liệu thống kê của WHO (1985) có tới 20000 loài là thảo dược Không chỉ các nước Á Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng khá lớn dược liệu Người ta thống kê thấy rằng ở các nước có nền công nghiệp phát triển mạnh thì 1/4 số thuốc kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất từ thảo dược Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục quản lý dược - Bộ Y tế, mỗi năm nước ta tiêu thụ khoảng 50 - 60 nghìn tấn các loại dược liệu khác nhau, sử dụng vào việc chế biến các vị thuốc Y học cổ truyền, cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược hoặc xuất khẩu

Ngày nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là một xu thế rất được các nhà khoa học quan tâm Nhiều dược liệu đã được sử dụng để tách chiết các hoạt chất làm thuốc như: chiết berberin từ cây vàng

đắng (Coscinium fenestratum), rutin từ hoa hòe (Shophora japonica), morphin từ

cây thuốc phiện (Papaver somniferum),… Dược liệu còn mở đường cho ngành hóa

dược phát triển, từ việc nghiên cứu các hoạt chất có cấu trúc mới từ dược liệu rồi sau đó bán tổng hợp các dẫn chất có hiệu quả hơn Tuy nhiên nhiều hoạt chất quan trọng như quinin, morphin, strychnin… đều phải chiết xuất từ dược liệu mà chưa thể tổng hợp bằng con đường hóa học

Tô mộc là một loài thực vật thân gỗ nhỏ, được tìm thấy ở khu vực Đông Nam

Á có tên khoa học là Caesalpinia sappan L thuộc họ Vang (Caesalpiniaceae) hay

còn được biết đến với tên cây Vang, Gỗ vang Theo y học cổ truyền, Tô mộc có tác dụng hành huyết, kháng khuẩn, tiêu viêm, cầm máu, chấn thương, đau bụng, lở loét, thiếu máu sau sinh,… Nhiều hoạt động dược lý khác của các chiết xuất và hợp chất tách chiết từ Tô mộc đã được báo cáo như: điều hòa miễn dịch, chống viêm, chống oxi hóa, kháng khuẩn, diệt virus, hỗ trợ điều trị ung thư,… [48] Tô mộc cho thấy tiềm năng rất lớn để trở thành một nguồn dược liệu có giá trị, mang đến nhiều lợi ích trong việc bảo vệ sức khỏe cho con người Vì vậy chúng tôi lựa chọn Tô mộc là đối tượng để thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính sinh học của một số nhóm chất

tách chiết từ cây Tô mộc (Caesalpinia sappan L.)”, hướng tới nghiên cứu tạo ra các

sản phẩm phục vụ trong đời sống của con người với những nội dung chính sau:

- Đánh giá và lựa chọn phương pháp tách chiết phù hợp để nâng cao hiệu quả tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong gỗ cây Tô mộc

- Sàng lọc sơ bộ và lựa chọn các phân đoạn chiết xuất có hoạt tính sinh học tốt

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về cây Tô mộc

1.1.1 Sơ lược về phân họ Vang

Phân họ Vang (danh pháp khoa học: Caesalpinioideae) được tạo thành từ tên của chi Vang (Caesalpinia) thuộc họ Đậu (Fabaceae hay Leguminosae) Phân họ này chủ yếu là cây thân gỗ phân bổ trong vùng ẩm ướt của khu vực nhiệt đới, ngoài

ra còn có các cây bụi Lá kép lông chim 1 - 2 lần có khi chỉ gồm một đôi lá chét dính nhau Hoa của chúng là loại đối xứng hai bên nhưng hay biến đổi Các nốt sần trên rễ của các loài trong phân họ này là rất hiếm và ở những loài có các nốt sần thì chúng cũng có cấu trúc hết sức nguyên thủy [6]

Phân họ Vang được chia thành 4 tông là: Caesalpinieae, Cassieae, Cercideae

và Detarieae với khoảng 150 chi và 2800 loài, phân bố chủ yếu ở các nước nhiệt đới

và cận nhiệt đới Ở Việt Nam đã phát hiện 20 chi với gần 120 loài [4]

1.1.2 Giới thiệu chung về cây Tô mộc

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Tô mộc có tên khoa học là Caesalpinia sappan Linn thuộc phân họ Vang

(Caesalpinioideae) hay còn được biết đến với các tên gọi khác như là Vang, Tô phượng, Vang nhuộm, Co vang, Mạy vang Tô mộc là một loài thực vật thân gỗ nhỏ, cao khoảng 5 - 10 mét, cho gỗ rất rắn, có màu đỏ nâu ở phần lõi và trắng ở phần ngoài, được tìm thấy ở khu vực Đông Nam Á Thân cây có nhiều gai, cành non có lông mịn, sau đó hết lông và nhẵn, có gai ngắn Lá kép lông chim, mọc so le,

có từ 10 - 15 lá chét nhỏ, hình ô van hơi hẹp ở dưới và thuôn tròn ở đầu, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông mịn Hoa 5 cánh màu vàng, mọc thành chùm ở đầu cành Cuống có lông màu nâu gỉ sắt Quả thuôn dẹt hình trứng ngược, vỏ rất cứng, có sừng nhọn ở đầu, trong chứa 3 - 4 hạt màu nâu vàng Kích thước quả: dài 7 - 10 cm, rộng 3-4 cm [2, 36]

Hình 1.1 Cây Tô mộc (Đỗ Xuân Cẩm)

1.1.2.2 Đặc điểm sinh thái

Mùa hoa Tô mộc thường vào tháng 5 - 7, mùa quả tháng 7 - 10 Cây sống ở các tỉnh phía Nam có mùa hoa quả muộn hơn khoảng 4 tháng Cây mọc chồi vào mùa xuân, trồng được bằng hạt vào mùa xuân hoặc đầu mùa mưa (khoảng tháng 5 -

6 đối với các tỉnh phía Nam) Cây mọc rải rác ở ven rừng, rừng thứ sinh, quanh làng bản Cây còn được trồng ở vườn, nương rẫy, hàng rào Cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh, ưa đất tốt, có thể sống được trong điều kiện bán khô hạn [29]

Ở nước ta, cây chủ yếu mọc hoang ở rừng núi nhưng hiện nay được trồng nhiều ở các tỉnh như Hòa Bình, Sơn La, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An,… để dùng làm thuốc và nhuộm gỗ Ngoài ra Tô mộc cũng được trồng làm thuốc ở các nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Lào, Thái Lan, Malaixia, Philippin,… 1.1.2.3 Ứng dụng trong y học và đời sống

Theo y học cổ truyền, Tô mộc là vị thuốc nam quý, được sử dụng rộng rãi, có

vị ngọt, bình, không độc, quy vào ba kinh tâm, can và tì; có tác dụng kháng khuẩn, tiêu viêm, cầm máu, hành huyết, thông lạc, giảm đau, mất máu, kinh nguyệt bế, trĩ, chấn thương,… Bộ phận dùng làm thuốc của cây Tô mộc là gỗ thân và cành, được róc đẽo hết lớp vỏ ngoài và phần lớn gỗ giác, chỉ lấy phần lõi gỗ cưa thành các đoạn nhỏ và phơi khô Mặt ngoài các miếng lớn có màu đỏ vàng đến đỏ nâu, có vết dao

đẽo và vết cành, thường có khe nứt dọc Mặt cắt ngang hơi bóng, vòng tuổi thấy rõ rệt (màu da cam), có thể thấy màu nâu tối, có các lỗ nhỏ (mạch gỗ) Khi dùng được chẻ nhỏ thành các thanh mỏng có màu hồng đỏ hoặc tán thành bột thô, sắc đặc thành thuốc không mùi, vị hơi se [2, 48]

Mặt khác, Tô mộc được coi là một trong những cây thuốc nhuộm tự nhiên có thể trồng trên quy mô lớn ở các vùng nhiệt đới Phần lõi gỗ màu nâu đỏ có chứa các chất nhuộm hòa tan trong nước như brazilein, protosappanin, sappan chalcone và haematoxylin Hiện nay, các chất nhuộm này được sử dụng để nhuộm màu tự nhiên các sản phẩm da, lụa, bông, len và sợi các loại khác nhau, thực phẩm, đồ uống và ứng dụng cả trong dược phẩm Phần lõi gỗ rắn, gần như không bị nứt nẻ còn được

sử dụng để chạm khắc đồ gỗ mỹ nghệ [44]

1.2 Tình hình nghiên cứu Tô mộc

1.2.1 Các nghiên cứu Tô mộc trên thế giới

1.2.1.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học của Tô mộc

Thành phần hóa học của Tô mộc đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ 20 Năm 1977, Nigam và cộng sự phân tích thấy trong gỗ Tô mộc có chứa một glycoside gồm aglicon là β-amirin và phần đường là D-glucose, các axit amin

tự do bao gồm alanine, glicin, prolin, valin, leucin, treonin, norvalin, các đường tự

do là lactose, glactose, socbose và D-glucose Năm 1978, họ đã tiếp tục phân tích thấy trong dịch chiết ete dầu hỏa của gỗ Tô mộc có chứa axit palmitic (27,6%), axit stearic (44,2%), axit linoleic (25,6%) và axit oleic (2,23%) Hai hợp chất vòng thơm

là dẫn xuất của brazilin đã lần đầu tiên được các nhà khoa học Nhật Bản chiết xuất

từ gỗ cây Tô mộc vào năm 1985 [15] Sau đó vào năm 1986, các nhà khoa học nước này tiếp tục phát hiện được protosappanin A - một hợp chất biphenyl, có tác dụng

an thần yếu ở chuột từ lõi gỗ Tô mộc [41] Năm 1987, khi nghiên cứu lõi gỗ Tô mộc các nhà khoa học đã phát hiện một số hợp chất có vòng thơm như brazilin, sappanchalcone, caesalpin J, caesalpin P, protosappanin A, protosappanin B, homoisoflavonoids ß-sitosterol và sự hiện diện của các dẫn xuất

monohydroxybrazilin và benzyl dihydrobenzofuran cũng được tìm thấy Lõi gỗ cũng được chỉ ra là có chứa sappanol, episappanol, 3'-deoxysappanol, 3'-0- methylsappanol, 3'-0-methylepisappanol, 3'-0-methylbrazilin, 4-0-methylepisappanol, sappanon ß, 3-deoxysappanone ß, 3'- deoxysappanone ß và dẫn xuất dibenzoxocin, 10-0-methyl-protosappanion ß Sự hiện diện của 4,4-dihydroxy-2-methoxychalcone, 8-methoxy-bonducellin, quercetin, rhamnetic và ombuin cũng được báo cáo [48] Sau đó rất nhiều các hợp chất khác cũng đã được phát hiện và công bố như sappanin, tannin, axit galic, brazilide A, neosappanone A và tinh dầu Phần lớn các chất được tìm thấy trong lõi gỗ và các bộ phận khác của Tô mộc thuộc nhóm phenol và có hoạt tính sinh học [12, 14, 42, 44, 46, 67, 74, 75]

Hình 1.2 Một số hợp chất từ cây Tô mộc

1.2.1.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây gỗ Tô mộc

Tô mộc là một vị thuốc nam quý, từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học

cổ truyền Ở Trung Quốc, Tô mộc được sử dụng phổ biến với các công dụng như thuốc chống đông máu, chống viêm và thúc đẩy lưu thông máu Ngoài ra, nó còn được sử dụng để điều trị các vết bỏng, vết thương, bệnh phong, bệnh ngoài da, kiết

lỵ, xuất huyết và các biến chứng của bệnh tiểu đường… Nhiều hoạt động dược lý khác của các chiết xuất và hợp chất tách chiết từ Tô mộc đã được báo cáo như: điều hòa miễn dịch, chống viêm, chống oxi hóa, kháng khuẩn, diệt virus, hỗ trợ điều trị ung thư, thuốc chống co giật, chống xơ vữa động mạch và hạ đường huyết [48]

a, Hoạt tính kháng khuẩn

Một trong những hoạt tính được đánh giá cao và ứng dụng nhiều nhất của Tô mộc hiện nay là hoạt tính kháng khuẩn Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn, diệt khuẩn của gỗ cây Tô mộc được công bố

Chiết xuất methanol và ethyl acetate của lõi gỗ Tô mộc đã được báo cáo là có

hiệu quả chống lại một số vi khuẩn gây bệnh trên người như E coli, Staphylococcus

aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeroginosa, Propionibacterium acne, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumonia, Citrobacter divergens Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định đối với chiết

xuất methanol và ethyl acetate trên các chủng vi khuẩn có giá trị từ 50-150 µg/ml

Tuy nhiên khi thử nghiệm hoạt tính ức chế trên ba chủng nấm Aspergillus flavus,

Aspergillus niger và Fusarium sps gây các bệnh ở phổi và tai, cả 2 loại chiết xuất

hầu hết đều không cho thấy hoạt tính kháng nấm [35, 57]

Trong một nghiên cứu của Lim và công sự vào năm 2005, chiết xuất methanol của Tô mộc được thử nghiệm đánh giá các tác động tăng trưởng đối với năm chủng

vi sinh vật đường ruột bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy Thành phần hoạt tính sinh học của chiết xuất Tô mộc được mô tả là 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (C10H6O3) Trong thử nghiệm với Clostridium perfringens, 5-hydroxy-1,4-

naphthoquinone ức chế mạnh ở nồng độ 5 và 2 mg/đĩa và ức chế vừa phải ở mức 1;

0,5 và 0,25 mg/đĩa Hơn nữa, nó còn cho thấy một sự ức chế tăng trưởng yếu đối

với Lactobacillus casei ở 5 và 2 mg/đĩa So sánh các dẫn xuất naphthoquinone, hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone có ức chế tăng trưởng vừa phải đối với C

5-perfringens ở 5 và 2 mg/đĩa, trong khi 1,4-naphthoquinone ở mức 5 mg/đĩa, ức chế

đáng kể sự tăng trưởng của tất cả các vi khuẩn được thử nghiệm Naphthoquinone cho thấy sự ức chế tăng trưởng chống lại tất cả các vi khuẩn được thử nghiệm ở 1 mg/đĩa Vì vậy, so với các chất kháng khuẩn tự nhiên, dược liệu có nguồn gốc từ gỗ Tô mộc được đánh giá là có vai trò hữu ích như một tác nhân

1,2-chống lại các bệnh do C perfringens gây ra [33] Ngoài ra chiết xuất Tô mộc còn

được nghiên cứu ứng dụng tổng hợp hạt nano bạc, được đánh giá là một kháng sinh

tiềm năng chống lại chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin [24]

Hầu hết các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của Tô mộc đều được phát triển hướng tới ứng dụng trong các lĩnh vực như y tế và thực phẩm Chiết xuất ethanol của Tô mộc được báo cáo có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn gây sâu

răng và viêm nướu bao gồm: Streptococcus DMST9567 (Smu9), Streptococcus DMST41283 (Smu4) và Streptococcus intermedius DMST42700 (Si) Trong khi

chiết xuất nước của Tô mộc cũng đã được chứng minh có hoạt tính chống lại năm

loại vi khuẩn gây bệnh đường miệng: Enterococcus faecalis, Actinomyces viscosus,

Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans và Streptococcus sanguis Do đó Tô

mộc được đánh giá là một dược liệu rất thích hợp để phát triển thành các sản phẩm

vệ sinh răng miệng có nguồn gốc tự nhiên [25, 50]

Chiết xuất methanol của Tô mộc cũng được báo cáo chống lại năm tác nhân

gây bệnh trên thực phẩm bao gồm E coli, S aureus, S typhimurium, B cereus và

L monocytogenes Hoạt tính cao nhất của cao methanol được hiển thị đối với L monocytogenes trong khi phân đoạn n-hexan không cho thấy hoạt tính Các phân

đoạn ethylacetate và butanol thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương cao hơn so với vi khuẩn Gram âm Nồng độ ức chế tối thiểu đối với năm tác nhân gây bệnh kể trên là 1,563 mg/ml đối với vi khuẩn Gram dương và 3,125 mg/ml đối với

vi khuẩn Gram âm Chiết xuất methanol cho thấy khả năng ức chế 99,999% sự phát

triển của cả năm chủng vi khuẩn ở nồng độ 3,25 mg/ml, trong đó nồng độ ức chế tối

thiểu đối với chủng L monocytogenes là 0,781 mg/ml Khi đánh giá khả năng ức

chế của cao chiết methanol với các chủng thử nghiệm trong 5 phút cho thấy tốc độ tăng trưởng của năm loại vi khuẩn đã giảm hơn 99,999% ở nồng độ 100 mg/ml Do

đó, chiết xuất methanol của Tô mộc được đánh giá là có tiềm năng phát triển như một chất diệt khuẩn hoặc khử trùng tự nhiên [31]

Ngoài ra, trong một nghiên cứu khác của Kondo và cộng sự, chiết xuất ethanol của Tô mộc thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn đối với cả vi khuẩn Gram dương

và Gram âm Trên cơ sở đó họ đã phát triển một sản phẩm gel rửa tay kết hợp chiết xuất của Tô mộc và các loại thảo dược khác của Thái Lan Nồng độ ức chế tối thiểu của loại gel rửa tay này dao động từ 1,25 đến 20 mg/ml đối với 6 chủng vi khuẩn

Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa và

Acinetobactor baumannii [28]

Trong công nghệ chế biến thực phẩm, ngoài vai trò là một chất nhuộm màu tự nhiên, các chiết xuất từ Tô mộc còn được sử dụng làm phụ gia thức ăn Trong một nghiên cứu phát triển các loại thảo dược có khả năng ứng dụng như một tác nhân kháng khuẩn tự nhiên của các nhà khoa học tới từ đại học Chungbuk (Hàn Quốc),

Tô mộc thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất trong số 13 cây thảo dược được sàng lọc Trong thử nghiệm khuếch tán đĩa giấy, chiết xuất Tô mộc cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh chống lại hầu hết các chủng vi khuẩn Gram âm Nồng độ ức

chế tối thiểu của chiết xuất ethanol là 0,06 mg/ml đối với Clostridium difficile và

Listeria monocytogenes và 0,03 mg/ml đối với Staphylococcus aureus Các hoạt

động ức chế của không bị giảm khi xử lý nhiệt hoặc điều chỉnh pH đối với C

difficile, L monocytogenes và S aureus Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất

ethanol cao hơn so với chiết xuất nước Những kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng chiết xuất ethanol của Tô mộc như một tác nhân kháng khuẩn hoặc một chất phụ gia thực phẩm có khả năng chống lại vi khuẩn Gram dương [27]

Trong một nghiên cứu gần đây Widigdyo và cộng sự (2017) đã khảo sát các ảnh hưởng của chiết xuất Tô mộc đối với hệ vi sinh vật đường ruột của loài chim cút Kết quả cho thấy rằng các hợp chất flavonoid trong chiết xuất Tô mộc có thể

làm giảm số lượng vi khuẩn Salmonella trong ruột của một loài chim cút (Coturnix

coturnix japonica) Do đó chiết xuất ethanol của Tô mộc đã được sử dụng như là

một chất phụ gia thực phẩm trong thức ăn của loài chim này [68]

Chính bởi khả năng kháng được nhiều loại vi sinh vật có hại nên chiết xuất của Tô mộc được ứng dụng nhiều trong đời sống Các nhà khoa học Ấn Độ và Thái Lan đã nghiên cứu ứng dụng chiết xuất methanol trong việc bảo quản sa tế và thịt [54, 65] Bên cạnh việc ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, Tô mộc còn có tác dụng điều trị các bệnh do vi khuẩn đường ruột gây ra Chiết xuất ethanol của Tô mộc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh chống lại sáu loại vi khuẩn gây bệnh đường

tiêu hóa bao gồm: Bacillus cereus TISTR687, Staphylococcus aureus TISTR1466,

Enterococcus faecalis TISTR379, Enterobacter aerogenes TISTR1540, Salmonella typhimurium TISTR292 và Escherichia coli TISTR780 [51]

Ở một nghiên cứu khác, ba phân đoạn chiết xuất từ gỗ Tô mộc là methanol,

ethyl axetate, và n-hexan đều thể hiện hoạt tính kháng lại vi khuẩn E coli và

Staphylococcus aureus Phân tích thành phần hóa học của gỗ Tô mộc người ta đã

chứng minh sự có mặt của các hợp chất phenolic, flavonoid, tannin, một hàm lượng nhỏ terpenoid và saponin nhưng không thấy sự xuất hiện của alkaloid và steroid Trong số ba phân đoạn của gỗ Tô mộc, phân đoạn methanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất với đường kính vòng kháng khuẩn được thử nghiệm bằng

phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên chủng E coli và S aureus lần lượt là 13,7 ±

0,6 mm và 16,3 ± 2,1 mm Do đó phân đoạn này được khuyến cáo sử dụng như là một chất chống lại các chủng vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy [22]

b, Hoạt tính chống oxi hóa

Trong những nghiên cứu đã được công bố, các chiết xuất và hợp chất được phân lập từ Tô mộc đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt Năm 2008, một nhóm

các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã thực hiện các thí nghiệm về khả năng chống oxi hóa, quét gốc tự do của dịch chiết ethanol và các chất phân lập được từ gỗ Tô mộc như protosappanin A, protosappanin B và brazilin Kết quả cho thấy các chất này đều có khả năng chống oxi hóa ở các mức độ khác nhau [20] Các chiết xuất khác từ

Tô mộc như chiết xuất ethyl acetate, methanol, hay từ những bộ phận khác của cây như lá, quả, cũng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh [18, 56, 72]

Brazilin đã được chứng minh là một chất chống oxi hóa mạnh có cấu trúc hóa học catechol Trong một thử nghiệm, các nhà khoa học đã tiến hành ủ tế bào gan chuột với BrCCl3 dẫn đến sự gia tăng đáng kể quá trình peroxy hóa lipit, rò rỉ các enzyme tế bào chất và sự suy giảm glutathione tế bào chất, sau đó điều trị với brazillin ở các nồng độ khác nhau Kết quả cho thấy, brzilin đã làm giảm bớt độc tính BrCCl3 gây ra trên tế bào gan Brazilin cũng đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ các ảnh hưởng BrCCl3 gây ra do hiện tượng hấp thu canxi của microsome Các nhà khoa học cho rằng brazilin ức chế hoạt động độc hại của BrCCl3 trong tế bào gan do có khả năng thu dọn các gốc tự do hình thành trong quá trình chuyển hóa BrCCl3 hoặc bằng cách ức chế các hệ enzyme nội bào kích thích độc tố [38]

c, Hoạt tính kháng viêm

Chiết xuất ethanol của Tô mộc đã được báo cáo có hoạt tính chống viêm trong các tế bào sụn và đại thực bào của con người thông qua việc ức chế quá trình biểu hiện các chất trung gian gây viêm của IL-1 ở mức độ phiên mã [70] Bên cạnh đó, các chiết xuất này còn được chứng minh là có khả năng điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp, bằng cách giảm IL-1β, IL-6, TNF-α và PGE2 trong huyết thanh và sự biểu hiện của COX-2 và yếu tố phiên mã NF-κB p65 (những nhân tố đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh viêm khớp dạng thấp) trong sụn chân của chuột [66] Chiết xuất methanol có khả năng chống viêm bằng cách ức chế sinh tổng hợp prostaglandin và sản xuất nitric oxide [19]

Brazilin - hợp chất chính trong gỗ Tô mộc, có tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương thận do thiếu máu cục bộ và ngăn chặn phản ứng viêm bằng cách ức chế sự

hoạt hóa của đường truyền tín hiệu NF-κB [23] Trong một nghiên cứu khác, brazilein được đánh giá có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh chống thiếu máu cục bộ não ở chuột Kết quả chỉ ra rằng việc sử dụng brazilein sau khi bắt đầu thiếu máu tái tưới cục bộ có thể làm giảm khu vực nhồi máu não và cải thiện các chỉ số thần kinh Khả năng chống viêm của brazilein có thể do tác động làm suy giảm mức độ biểu hiện mRNA của các cytokine gây viêm (yếu tố hoại tử khối u-TNF-alpha) và interleukin-6 (IL-6) được tìm thấy ở động vật thiếu máu cục bộ khi điều trị bằng brazilein [59]

d, Hoạt tính chống ung thư

Các công trình nghiên cứu công bố gần đây đã khẳng định khả năng phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh ung thư của Tô mộc Chiết xuất methanol và nước của Tô mộc được báo cáo chống lại các dòng tế bào ung thư trên người nuôi cấy thực nghiệm, bao gồm HeLa, MDA MB, A 549 và HCT-15 Các nhà khoa học còn chứng minh hoạt tính chống ung thư của Tô mộc trên các tế bào ung thư vú MCF-7

là thông qua hoạt động kích thích quá trình apoptosis [30, 39]

Tác dụng chống ung thư của chiết xuất methanol và các chiết xuất phân đoạn của Tô mộc còn được nghiên cứu trên các tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) và tế bào osteosarcoma (HOS) Kết quả cho thấy giá trị IC50 của chiết xuất methanol đối với với tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) và tế bào ostososarcoma (HOS) lần lượt

là 9,0 và 10,9 µg/ml Nguyên nhân được chỉ ra là do tác dụng ức chế telomerase – một nhân tố cần thiết cho sự bất tử của tế bào ung thư Tác dụng chống ung thư cũng được quan sát thấy trong các phân đoạn n-hexan, dichloromethane và ethylacetate Hiệu quả chống ung thư cao nhất được tìm thấy trong phân đoạn dichloromethane với giá trị IC50 là 4,4 µg/ml đối với tế bào ung thư miệng (KB) và

> 4,0 µg/ml trên tế bào osteosarcoma (HOS) [32]

Brazilin chiết xuất từ gỗ Tô mộc được chứng minh có khả năng ức chế cảm ứng caspase-3, một loại proteinase có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch

và quá trình apoptosis Hoạt chất này còn được báo cáo ức chế sự phosphoryl hóa

BAF (barrier-to-autointegration factor) in vitro và in vivo, dẫn đến tái tạo màng

nhân bất thường và sự chết tế bào, từ đó gợi mở hướng tiếp cận mới trong liệu pháp chống ung thư [26, 62]

e, Các hoạt tính khác

Hoạt tính ức chế miễn dịch: Gỗ Tô mộc từ lâu đã được người Trung Quốc sử dụng trong các loại thuốc để điều trị các bệnh lý miễn dịch và viêm Một nghiên cứu của Min và cộng sự tại đại học Tsinghua, Trung Quốc (2006) đã đánh giá hiệu

ứng ức chế miễn dịch của brazilein trên tế bào lympho chuột trong điều kiện in vitro

và in vivo Kết quả cho thấy rằng brazilein và chiết xuất ethanol của Tô mộc có thể

ức chế sự gia tăng của tế bào lympho T được kích thích bởi concanavalin A (Con A) và sự gia tăng của tế bào lympho B kích thích bởi lipopolysaccharides (LPS) Ngoài ra, các cơ quan miễn dịch (tuyến ức và lách) ở chuột được điều trị bằng brazilein được ghi nhận bị teo và giảm khối lượng Các nhà khoa học cũng đã phát hiện ra brazilein có thể gây ra quá trình apoptosis ở tế bào lympho chuột thông qua phương pháp phân tích dòng chảy tế bào và xét nghiệm phân mảnh ADN, đây có thể là một trong những con đường mà brazilein gây ức chế miễn dịch trên các tế bào lympho [71]

Hoạt tính chống đái tháo đường: brazilin đã được chứng minh có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu ở động vật bị tiểu đường Hợp chất này đã làm tăng sản xuất F-2,6-BP trong tế bào gan bằng cách tăng hàm lượng fructose-6-phosphate trong tế bào (F-6-P) và hexose-6-phosphate (H-6-P) Ngoài ra, brazilin cũng được tìm thấy làm tăng đáng kể hoạt tính của 6-phosphofructo-2-kinase (PFK-2) và pyruvate kinase trong gan được điều trị bằng glucagon Tuy nhiên, hoạt tính glucose-6-phosphatase không bị ảnh hưởng bởi brazilin Dữ liệu này chỉ ra rằng brazilin ức chế sự hình thành glucose trong gan bằng cách nâng mức F-2,6-BP, F-6-P / H-6-P của tế bào và hoạt tính PFK-2 Tăng cường hoạt động của kinase pyruvate cũng có thể đóng một vai trò trong việc ức chế tạo thành glucose trong gan của brazilin [73]

Hoạt tính giảm đau, hoạt huyết: Từ lâu, trong y học dân gian, gỗ Tô mộc đã được sử dụng trong các vị thuốc giúp giảm đau, hoạt huyết, trị chấn thương Trong các nghiên cứu gần đây, Tô mộc đã được chứng minh bằng thực nghiệm rằng các chiết xuất của nó có khả năng thúc đẩy lưu thông máu, loại bỏ ứ máu và giảm sưng, đau Chiết xuất ethanol của lõi gỗ và ba phân đoạn thô khác nhau của Tô mộc cũng

đã được chứng minh có tác dụng giảm đau ngoại vi [48]

Hoạt tính kháng tiểu cầu: Brazilin được báo cáo cho thấy hoạt tính kháng tiểu cầu thông qua sự ức chế hoạt tính phospholipase A2 (PLA2) và sự gia tăng nồng độ

Ca2+ nội bào, các dẫn xuất của nó như BRX-018, (6aS, cis) -Malonic axit 3- acetoxy-6a9-bis- (2-methoxycarbonyl-acetoxy) -6,6a, 7,11b-tetrahydro-indeno (2,1-c) chromen-10-yl ester methylester cũng được xác nhận là một trong những tác nhân kháng tiểu cầu tiềm năng Hoạt tính kháng tiểu cầu của nó có thể dựa trên cơ chế ức chế tổng hợp TXA2 trong các tiểu cầu kích thích [48]

Bất hoạt tinh trùng: Chiết xuất Tô mộc được báo cáo là một tác nhân mạnh

gây bất hoạt tinh trùng của người trong điều kiện in vitro và có khả năng phát triển

thành một loại thuốc tránh thai đường uống cho nam giới [48]

Ngoài ra chiết xuất ethyl acetate của Tô mộc còn cho thấy hoạt động ức chế arginase mà gần đây đã được báo cáo là một mục tiêu điều trị mới cho các bệnh tim mạch như xơ vữa động mạch Sự ức chế hoạt động arginase của chiết xuất Tô mộc

đã làm tăng sản lượng NOx bằng cách tăng cường sự ổn định của eNOS mà không

có bất kỳ thay đổi đáng kể nào về mức protein của eNOS và biểu hiện arginase II Hơn nữa, sự ức chế arginase còn làm tăng sản sinh NO và giảm sản xuất superoxide trên nội mô của các động mạch chủ chuột bị cô lập [60] Chiết xuất methanol còn thể hiện hoạt tính diệt giun sán mạnh với thời gian gây tê liệt (19,13 ± 0,340 phút)

và thời gian chết (54,21 ± 0,533 phút) Những hoạt tính này được cho là do tính chất hóa học phức tạp của chiết xuất Tô mộc [18]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu Tô mộc ở Việt Nam

1.2.2.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học của Tô mộc

Tại Việt Nam, Tô mộc được biết tới là một vị thuốc nam quý, được sử dụng khá phổ biến trong dân gian nhưng các công trình nghiên cứu về Tô mộc hiện nay chưa nhiều Trong một nghiên cứu của GS TS Đào Hùng Cường (2008), thành phần hóa học trong gỗ cây Tô mộc thu hái tại Quảng Nam, Việt Nam đã lần đầu được nghiên cứu Các thành phần hóa học trong ba loại dịch chiết của gỗ Tô mộc là methanol, ethanol và nước đã được sàng lọc và phân tích Kết quả thu được như sau: Trong dịch chiết methanol thu được các hợp chất chính là brazilin và đồng phân với tổng hàm lượng là 12,65 %; heamatoxylin và đồng phân với tổng hàm lượng là 22,32 %; brazilide A 15,5 % và một số hợp chất khác với hàm lượng nhỏ

và chưa định danh Trong dịch chiết ethanol thu được một số hợp chất chính là hydroxy-3-(4-hydroxybenzylidene)-4-chromanone và đồng phân với tổng hàm lượng 24,47 %; brazilin và đồng phân với tổng hàm lượng là 14,87%, heamatoxylin

7-và đồng phân với tổng hàm lượng rất nhỏ là 1,97 % 7-và các hợp chất chưa được định danh Với dung môi tách chiết là nước thu được các hợp chất chính là brazilein (3,87%); brazilin (13,02%); hematoxylin (3,16%), hematein (2,94%) và một số hợp chất khác [1]

1.2.2.2 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Tô mộc

Các nghiên cứu tại Việt Nam gần đây cũng đã đánh giá được một số hoạt tính sinh học mới của gỗ Tô mộc Chiết xuất và một số hợp chất phân lập từ Tô mộc đã được chứng minh có khả năng ức chế mạnh xanthien oxidase - một loại enzyme liên quan đến hình thanh bệnh gout trong đó sappanchalcone có khả năng ức chế mạnh nhất [45] Trong một nghiên cứu khác, sappanchalcone và 3-deoxysappanone B được phân lập từ chiết xuất ethyl acetate của lõi gỗ Tô mộc đã được thử nghiệm hoạt tính chống ung thư bằng kỹ thuật Sulforhodamine B (SRB) Trong đó sappanchalcone cho thấy tác dụng mạnh hơn các thuốc chống ung thư trên cả ba dòng tế bào ung thư NCl-H460, MCF-7 và Hela Sappanchalcone cho thấy khả năng

ức chế mạnh nhất trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela với IC50 là 6,05 ± 5,56 µg/ml, trong khi đó 3-deoxysappanone B biểu hiện hiệu quả tốt nhất trên tế bào ung thư phổi NCI-H460 với giá trị IC50 là 10,09 ± 2,62 µg/ml Các chiết xuất methanol của gỗ Tô mộc cũng đã được xác định có hoạt tính gây độc đối với một số dòng tế bào ung thư Hoạt tính mạnh nhất được được ghi nhận chống lại các tế bào HeLa với giá trị IC50 là 26,5 ± 3,2 μg/ml Chiết xuất methanol được chỉ ra rằng đã ức chế

sự tăng trưởng, kích thích quá trình apoptosis thông qua phân sự phân cắt ADN và hoạt hóa enzyme caspase-3 [21] Những phát hiện này góp phần khẳng đinh rằng Tô mộc có thể được phát triển thành một loại thuốc tốt trong việc ngăn ngừa và điều trị ung thư [63]

Dịch chiết từ các bộ phận khác nhau của cây Tô mộc như thân và hạt cũng đã được nghiên cứu về khả năng ảnh hưởng đến hoạt độ của một số proteinase Kết quả cho thấy dịch chiết từ phần vỏ cũng như phần gỗ thân cây Tô mộc đều có hoạt tính ức chế trypsin (TIA) và chymotrypsin (ChlA) [3] Ngoài ra, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã nghiên cứu và thử nghiệm một loại chế phẩm có chứa 10% cao

Tô mộc có tác dụng phòng và trị bệnh do E coli trên gà Lượng Phượng gây nhiễm

thực nghiệm [5]

1.3 Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu

1.3.1 Tổng quan về chiết xuất dược liệu

Chiết xuất dược liệu có vai trò cực kỳ lớn, quyết định đến chất lượng, độ an toàn và hiệu quả của các chế phẩm dược, là yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của quá trình nghiên cứu thuốc Đặc biệt xu hướng phát triển thuốc có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng phổ biến vì hiệu quả tốt mà lại an toàn Do đó vấn đề chiết xuất đang ngày càng được quan tâm

Ngày nay, sự phát triển của các phương pháp chiết xuất hiện đại với những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp thông thường có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự sẵn có của các sản phẩm thảo dược chất lượng cao đến người tiêu dùng trên toàn thế giới Với nhu cầu ngày càng tăng, các nhà sản xuất thảo dược

đang hướng đến việc sử dụng những công nghệ chiết xuất phù hợp nhất để sản xuất trên quy mô lớn nhưng vẫn đảm bảo được chất lượng và sự ổn định của dược phẩm Các phương pháp truyền thống như ngâm chiết và chiết Soxhlet thường được sử dụng tại các cơ sở nghiên cứu nhỏ, thủ công hoặc trong các doanh nghiệp vừa và nhỏ Bên cạnh đó các nhà khoa học cũng đã không ngừng nghiên cứu và thử nghiệm để tìm ra những phương pháp chiết xuất tối ưu nhằm nâng cao hiệu suất tách chiết và đạt hiệu quả cao Hiệu suất tách chiết đề cập đến năng suất tách chiết trong khi hiệu quả đề cập đến chất lượng, tiềm năng (hoạt tính /dược tính) của dược phẩm Sự phát triển của kỹ thuật tách chiết hiện đại có lợi thế đáng kể so với những phương pháp thông thường do giảm được lượng dung môi hữu cơ tiêu thụ, giảm thời gian tách chiết, hiệu quả cao, hạn chế được tối đa sự biến đổi các hợp chất trong dược liệu và an toàn Các phương pháp chiết xuất hiện đại bao gồm: phương pháp chiết xuất có sự hỗ trợ của vi sóng (MAE), chiết xuất có sợ hỗ trợ của sóng siêu âm (UAE), chiết xuất lỏng siêu tới hạn (SFE), tách chiết pha rắn (SPME), Soxhwave, [16]

1.3.2 Các phương pháp chiết xuất dược liệu

1.3.2.1 Một số phương pháp chiết xuất thông thường

a, Phương pháp chiết ngâm

Chiết ngâm là phương pháp chiết xuất truyền thống đã có từ xa xưa và vẫn được sử dụng cho tới hiện nay, đặc biệt là trong y học dân tộc Quy trình chiết xuất rất đơn giản, dược liệu nghiền nhỏ tới độ mịn thích hợp sẽ được tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định sau đó lọc thu dịch chiết [64] Tùy theo mục đích tách chiết mà người nghiên cứu sử dụng nhiệt độ và cách thức chiết cho phù hợp như: + Ngâm lạnh: ngâm chiết ở nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, thường áp dụng với các dược liệu có chứa hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt

+ Hãm: ngâm chiết dược liệu đã được nghiền nhỏ trong dung môi nóng trong một khoảng thời gian nhất định, có thể khuấy trộn, thường áp dụng cho hợp chất dễ tan trong một thời gian ngắn ở nhiệt độ cao

+ Hầm: ngâm dược liệu với dung môi trong một bình kín, giữ nhiệt độ chiết thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi nhưng cao hơn nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian nhất định, thường áp dụng với những dược chất ít tan ở nhiệt độ thường, dễ phân hủy ở nhiệt độ cao

+ Sắc: đun sôi đều và nhẹ nhàng dược liệu với dung môi trong một khoảng thời gian nhất định

Tùy theo dược liệu và mục đích thu nhận chiết xuất mà có thể tiến hành ngâm một lần với toàn bộ dung môi hoặc ngâm nhiều lần với từng loại dung môi

b, Phương pháp ngấm kiệt

Ngấm kiệt là phương pháp cho dung môi chảy rất chậm qua khối dược liệu đựng trong một dụng cụ “ngấm kiệt”, trong suốt quá trình tách chiết không khuấy trộn, dược liệu luôn được tiếp xúc với dung môi mới, tạo ra sự chênh lệch nồng độ hoạt chất cao nên có thể chiết kiệt được hoạt chất Ưu điểm của phương pháp là dược liệu được chiết kiệt, dịch chiết ban đầu thu được đậm đặc nhưng lại có nhược điểm là năng xuất thấp, quy trình thủ công [7, 64]

c, Phương pháp chiết Soxhlet

Dược liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết, dung môi mới được chứa trong bình cầu và đun hồi lưu Dung môi mới bay hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ dược liệu Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bay hơi lên được ngưng tụ xuống bình và đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất tan còn lại Quá trình chiết lặp lại cho tới khi vật liệu được chiết kiệt Ưu điểm của phương pháp là quá trình chiết xuất diễn ra liên tục, tốn ít dung môi, dịch chiết không cần phải lọc nhưng lại có nhược điểm là dịch chiết luôn được duy trì ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ bị phá hủy [9]

Hình 1.3 Một số phương pháp tách chiết thông thường [7]

1.3.2.2 Một số phương pháp chiết xuất hiện đại

a, Phương pháp chiết có hỗ trợ của vi sóng (Microwave assisted extraction - MAE)

MAE là một kỹ thuật đơn giản, thân thiện với môi trường và kinh tế cho việc tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các nguyên liệu thực vật khác nhau Ứng dụng MAE trong tách chiết thực vật lần đầu tiên được báo cáo bởi Ganzler và cộng sự vào năm 1986 Vi sóng là các sóng cực ngắn hay sóng siêu tần, có tần số từ 0,3 GHz đến 300 GHz, thường sử dụng bức xạ điện từ ở tần số 2,45 GHz Vi sóng

có điện trường và từ trường vuông góc với nhau Điện trường tạo ra nhiệt thông qua hai cơ chế đồng thời là quay lưỡng cực và dẫn truyền ion Sự quay lưỡng cực là do

sự liên kết trên điện trường của các phân tử sở hữu một moment lưỡng cực trong cả dung môi và chất rắn Dao động này tạo ra xung đột với các phân tử xung quanh dẫn đến giải phóng năng lượng nhiệt vào môi trường Với tần số 2,45 GHz, hiện tượng này xảy ra nhanh hơn 4,9 × 109 lần và do đó việc gia nhiệt cho kết quả rất nhanh Hằng số điện môi của dung môi càng lớn sự gia nhiệt càng nhanh Do đó, không giống như những phương pháp gia nhiệt thông thường, vi sóng làm nóng

bởi dung môi, dẫn đến làm nóng t

cho hơi ẩm bay hơi và t

nền vào dung môi Dung môi đư

những hằng số điện môi cao và có kh

nhiên, khả năng chọn l

bằng cách sử dụng hỗn h

MAE có thời gian chi

độ tinh khiết của chiế

Soxhlet Do đó nó đã

t cách đồng thời Trong trường hợp tách chiết, l

vi sóng là sự gián đoạn của các liên kết hydro yếu đư

c của các phân tử [16]

Sơ đồ phương pháp tách chiết có hỗ trợ vi sóng

n của mẫu hấp thụ năng lượng vi sóng theo các h

ật liệu thực vật được nhúng vào một dung môi không h

c xạ vi sóng truyền trực tiếp đến chất rắn mà không b

n làm nóng tức thời độ ẩm còn lại trong ch

m bay hơi và tạo ra áp suất hơi cao làm vỡ thành tế bào và gi

dung môi Dung môi được sử dụng cho hầu hết các ho

n môi cao và có khả năng hấp thụ mạnh năng lư

n lọc và khả năng tương tác với vi sóng có th

n hợp dung môi [16]

i gian chiết ngắn hơn, yêu cầu lượng dung môi th

ết xuất, chi phí thấp và năng suất chiết t

ã được coi là một phương án thay thế tiề

t, lợi thế của việc gia

u được thúc đẩy bởi

t các hoạt động MAE là

nh năng lượng vi sóng, tuy

i vi sóng có thể được điều chỉnh

ng dung môi thấp hơn, cải thiện

t tốt hơn so với chiết

ềm năng cho các kỹ

thuật tách chiết thông thường Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là không áp dụng được cho các phân tử không phân cực do hiệu suất thấp, khó áp dụng cho quy mô công nghiệp do thiết bị tạo vi sóng là không nhỏ để có đủ công suất và do quá trình gia nhiệt rất nhanh, có thể dẫn đến cháy nổ Vi sóng đã được báo cáo là gây ra sự suy giảm chất lượng không đáng kể khi áp dụng cho các chất

có nguồn gốc thực vật như axit ascorbic Tuy nhiên MAE đã được chứng minh là có thể rút ngắn thời gian so với phương pháp hồi lưu để chiết xuất các hợp chất phenolic

b, Phương pháp chiết có hỗ trợ của sóng siêu âm (Ultrasound assisted extraction - UAE)

UAE bao gồm việc sử dụng sóng âm tần số cao (> 20 kHz), cường độ cao tương tác với vật liệu tách chiết UAE là một công nghệ hữu ích tiềm năng vì nó không đòi hỏi các công cụ phức tạp và có chi phí tương đối thấp, có thể được sử dụng cả trên quy mô nhỏ và lớn Dưới tác dụng của siêu âm, các hạt chất rắn và lỏng được rung và tăng cường chuyển động do đó chất tan nhanh chóng khuếch tán

từ pha rắn sang dung môi Một số cơ chế có khả năng xảy ra khi siêu âm như phá vỡ

tế bào, cải thiện sự thẩm thấu, hiệu ứng mao dẫn và quá trình hydrat hóa đã được đề xuất Nếu cường độ siêu âm tăng lên trong chất lỏng, khi đạt tới điểm mà tại đó lực nội sinh không thể giữ cấu trúc phân tử ở trạng thái nguyên vẹn, do đó nó bị phá vỡ

và các bong bóng được tạo thành, quá trình này được gọi là cavitation (sự hình thành các bóng hơi) Sự vỡ tan của bong bóng có thể tạo ra các hiệu ứng vật lý, hóa học và cơ học dẫn đến sự phá vỡ màng sinh học để tạo điều kiện giải phóng các hợp chất, tăng cường sự xâm nhập của dung môi vào vật liệu [16]

Phương pháp siêu âm có ưu điểm là rút ngắn được thời gian chiết, thiết bị tương đối đơn giản không quá đắt tiền, dễ bảo quản và vận hành, có thể áp dụng được với nhiều nhóm hợp chất, dung môi chiết khá đa dạng với lượng mẫu lớn và tăng khối lượng dịch chiết thu được Bên cạnh đó, phương pháp này không yêu cầu nhiệt độ và áp xuất cao, thuận lợi cho các hợp chất không bền với nhiệt Nó rất hữu

ích cho sự phân lập và tinh sạch các chất có hoạt tính sinh học Một bất lợi của quy trình này là tác dụng gây hại không thường xuyên của năng lượng siêu âm (>20 kHz) trên hoạt chất của cây thuốc thông qua sự hình thành các gốc tự do và do đó

có thể dẫn đến những thay đổi không mong muốn trong thành phần thuốc

c, Phương pháp chiết siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction - SFE)

Được biết đến cách đây rất lâu, từ năm 1879 nhưng đến năm 1980, phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn mới được áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực tách chiết các hợp chất thiên nhiên từ thực vật Bất kỳ một dung môi nào cũng

có thể tồn tại ở trạng thái siêu tới hạn nếu ở điều kiện nhiệt độ và áp suất trên giá trị giới hạn Ở trạng thái siêu tới hạn, các dung môi này không còn ở thể lỏng nhưng vẫn chưa thành thể khí Vật chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng: linh động như chất khí, khả năng chuyển khối lớn hơn chất khí, có khả năng hòa tan các chất như chất lỏng nhưng độ nhớt và sức căng bề mặt thấp hơn chất lỏng Năm 1920

- 1960, hàng loạt các công trình nghiên cứu về dung môi ở trang thái siêu tới hạn ra đời Đó là các dung môi như: ethanol, methanol, di-ethyl eter,… và các chất tan dùng để nghiên cứu: các chất thơm, tinh dầu, các dẫn xuất halogen, các tri-glyxerit

và các hợp chất hữu cơ khác Dung môi thông dụng nhất là CO2 vì nó có các tính chất mà dung môi khác không có được như: không phân cực, điểm siêu tới hạn là

31oC/ 74 atm nên dễ đạt, dễ duy trì, an toàn và không độc hại Nguyên tắc hoạt động của công nghệ tách chiết bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn là đưa CO2 từ trạng thái lỏng sang trạng thái siêu tới hạn trong điều kiện nhiệt độ và áp suất thích hợp Dòng CO2 siêu tới hạn này sẽ đi vào bình chiết có chứa dược liệu Hoạt chất theo dòng CO2 qua bộ phận làm lạnh, tại đây CO2 hóa lỏng và được đưa vào bình tách Điều chỉnh nhiệt độ và áp xuất thích hợp để CO2 trở thành dạng khí, sản phẩm sẽ lắng xuống và thu được riêng Khí CO2 sau đó được đưa qua bộ phận nén lạnh, hóa lỏng và trở lại bình chứa, quá trình chiết lặp lại liên tục [9, 16]

Hình 1.5 Sơ đồ phương pháp chiết siêu tới hạn [37]

SFE hiện là phương pháp được thiết lập tốt để tách chiết và phân lập các hợp chất bởi các tiêu chí thiết kế và điều hành hiện đã được hiểu đầy đủ SFE có ưu điểm là hiệu suất chiết cao, độ chọn lọc cao với loại hợp chất cần thiết, dung môi an toàn có thể tái sử dụng SFE được áp dụng để trích xuất các hợp chất nhất định từ thực vật ở nhiệt độ gần với môi trường xung quanh, do đó ngăn chặn các chất phát sinh trong quá trình biến tính nhiệt Tuy là một kỹ thuật tách chiết đã được phát triển từ lâu nhưng ứng dụng thương mại của SFE không khả thi do đòi hỏi thiết bị

và công nghệ phức tạp, yêu cầu chặt chẽ và tốn kém Dung môi CO2 siêu tới hạn là dung môi không phân cực, chỉ chiết được các chất kém phân cực nên trong trường hợp cần có thể phối hợp với một lượng dung môi phân cực để thay đổi tính phân cực của dung môi [16]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu thực vật

Đối tượng nghiên cứu là mẫu thân cây Tô mộc có tên khoa học là Caesalpinia

sappan Linn., thuộc phân họ Vang (Caesalpiniaceae), được thu hái và định danh bởi

TS Nguyễn Kim Thanh - bộ môn Khoa học Thực vật, khoa Sinh học trường ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

2.1.2 Chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật sử dụng trong luận văn bao gồm:

- Các chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Trung tâm Chứng nhận Phù hợp (QUACERT) - Tổng Cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng (Bộ KHCN) gồm có: + Vi khuẩn Gram âm:

 Escherichia coli ATCC 25922: là vi khuẩn thường trú ở đường tiêu hóa

của người, đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy, viêm tiết niệu, viêm đường mật, tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết

 Salmonella typhimurium ATCC 14028: là tác nhân gây ngộ độc thực

phẩm với các triệu chứng chính như sốt, tiêu chảy, buồn nôn, có thể dẫn tới viêm dạ dày và ruột

 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: là trực khuẩn mủ xanh, gây bệnh

cơ hội khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, gây nhiễm trùng da, mắt, nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, tiết niệu và hô hấp

+ Vi khuẩn Gram dương:

 Staphylococcus aureus ATCC 25923: gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm

nghiêm trọng như viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim

 Bacillus subtilis ATCC 6633: là trực khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn có lợi

probiotic và thường không gây bệnh

 Bacillus cereus ATCC 10876: phân bố nhiều trong tự nhiên, thường gây

ngộ độc thực phẩm Chúng sinh ra hai loại độc tố không tốt cho sức khỏe gây tiêu chảy và nôn mửa Độc tố gây tiêu chảy có thể làm hủy hoại biểu

bì và niêm mạc ruột, nặng nhất có thể dẫn đến tử vong

- Các chủng Vibrio: thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp

Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Vibrio gây ra bệnh hoại tử gan tụy

cấp tính dẫn đến tôm chết sớm (EMS/AHPND) gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành công nghiệp nuôi tôm toàn cầu

Các chủng Vibrio được cung cấp và định danh bởi TS Trần Văn Tuấn - Bộ

môn Vi sinh vật học, khoa Sinh học trường ĐH Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN bao gồm:

 Vibrio parahaemolyticus (bao gồm các chủng VP1, VP2, VP3, VP4)

 Vibrio harveyi (VH)

- Các chủng nấm được cung cấp bởi TS Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, khoa Sinh học trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQGHN bao gồm:

 Aspergillus niger: gây ra bệnh nấm mốc đen trên một số loại trái cây và

rau quả như nho, hành tây, đậu phộng và là một tác nhân gây ô nhiễm

phổ biến trên thực phẩm

 Candida albicans: một loại nấm men sống với số lượng nhỏ trên da,

trong đường tiêu hóa và âm đạo, có thể ảnh hưởng đến hầu hết các bộ phận cơ thể, từ da, miệng, họng, vùng sinh dục tới ruột và máu

 Penicillium digitatum: là một chủng nấm mốc thuộc chi Penicillium, một

trong những tác nhân chính gây hại trên cam sau thu hoạch hay còn được biết đến với bệnh mốc xanh Bệnh này gây hậu quả nghiêm trọng trong quá trình bảo quản cam, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và gây thiệt hại kinh tế

2.1.3 Dụng cụ thí nghiệm

- Đĩa petri thủy tinh; ống falcon (Biologix, Mỹ); ống eppendorf (Biologix, Mỹ); pipetman (Gilson, Pháp); đầu tip các loại; bình thủy tinh đựng hóa chất, bình tam giác, màng lọc vô trùng;…

2.1.4 Thiết bị và hóa chất

- Thiết bị: Máy cô quay chân không Stuart (Anh), tủ điều nhiệt Daihan (Hàn Quốc), tủ cấy hút khí độc Daihan (Hàn Quốc), tủ cấy vô trùng Essco (Singapore); tủ lạnh 4oC LG (Hàn Quốc), -20oC Sanyo (Nhật Bản), -80oC Biobase (Trung Quốc); tủ ấm Memmert (Đức), tủ sấy Memmert (Đức); máy

đo pH Horiba (Nhật Bản); máy khuấy từ IKA (Đức); máy đo quang phổ Thermo Scentific BioMate 3S (Singapore); lò vi sóng Sharp (Thái Lan); nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản); …

- Hóa chất:

+ Dung môi tách chiết: n-hexan, dichloromethane, ethyl acetat, ethanol, methanol (Sigma)

+ Hóa chất định lượng Phenolic: thuốc thử Folin-Ciocalteau 10% (Merck);

Na2CO3 7,5% (Sigma); axit gallic (3,4,5-Trihydroxybenzoic acid - C7H6O5, Sigma)

+ Hóa chất thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa: DPPH picrylhydrazyl - C18H12N5O6, Sigma); axit ascorbic (C6H8O6, Sigma)

(2,2-diphenyl-1-+ Hóa chất thử nghiệm MIC/MBC: DMSO (Dimethyl sulfoxit, Prolabo), MgCl2 (Merck), CaCl2 (Sigma)

+ Kháng sinh: Gentamycin, rifampicin, chloramphenicol (Sigma)

2.1.5 Môi trường

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường LB; MHA, MHB; CAMHB

- Môi trường nuôi cấy nấm: Môi trường PDA

(Thành phần các môi trường được chú thích ở phụ lục)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu

Thân cây Tô mộc được loại bỏ phần vỏ ngoài, phần dác gỗ màu trắng và lõi gỗ màu nâu đỏ được tách riêng Bộ phận được sử dụng trong nghiên cứu là phần lõi gỗ màu nâu đỏ được phơi khô, chẻ nhỏ và nghiền thành bột mịn

Hình 2.1 Mẫu gỗ Tô mộc

2.2.2 Phương pháp chiết phân đoạn

Gỗ Tô mộc được tiến hành chiết phân đoạn với các dung môi khác nhau để phân tách các nhóm hợp chất theo độ phân cực của chúng Trong phương pháp này, mẫu thực vật sau khi được xử lý sẽ được chiết xuất lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần Sau khi chiết xuất với một dung môi, phần bã được sấy khô để loại bỏ hoàn toàn dung mỗi cũ, sau đó dung môi mới bổ sung dung môi khác để tiếp tục tách chiết [11] Đối với mỗi một dung môi quá trình chiết được lặp lại ba lần với

tỷ lệ nguyên liệu dung môi là 1/10 (w/v) [49]

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn gỗ Tô mộc

2.2.3 Phương pháp định lượng Phenolic tổng số

Hàm lượng Phenolic trong mẫu thực vật được xác định dựa vào phản ứng oxi hóa của các Phenolic với thuốc thử Folin-Ciocalteau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với hàm lượng Phenolic trong một phạm vi nhất định Dựa vào cường độ màu đo được ở bước sóng 765 nm

và đồ thị chuẩn của axit gallic với thuốc thử này có thể xác định được hàm lượng Phenolic trong dịch chiết [61]

- Vật liệu và hóa chất

+ Thuốc thử Folin-Ciocalteau 10% (v/v) được chuẩn bị từ dung dịch gốc, sử dụng trong ngày và bảo quản tránh ánh sáng

+ Dung dịch Na2CO3 7,5% (w/v) được pha trong nước cất

+ Dung dịch chuẩn axit gallic (10 mg/ml) được pha trong methanol 99% + Chuẩn bị mẫu cao chiết: cao chiết khô được hòa tan trong methanol để thu được dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/ml

- Quy trình thực hiện:

+ Xây dựng đường chuẩn axit gallic:

 Chuẩn bị dung dịch axit gallic ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40,

50, 60, 70, 80, 90 µg/ml trong dung môi methanol từ dung dịch gốc

 Lấy 0,2 ml dung dịch axit gallic ở mỗi nồng độ vào các ống nghiệm sau

đó cho thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteau 10% vào và lắc đều Sau 5 phút bổ sung tiếp 0,8 ml dung dịch Na2CO3 7,5%, lắc đều Hỗn hợp phản ứng được giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 60 phút, tránh ánh sáng Đo

độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 765 nm

Các thí nghiệm tiến hành 3 lần để đảm bảo độ tin cậy, kết quả lấy trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm

+ Kết quả xây dựng đường chuẩn axit gallic:

Bảng 2.1: Độ hấp thụ quang phổ của axit gallic ở bước sóng 765 nm

Hình 2.3 Đường chuẩn axit gallic

+ Xác định hàm lượng Phenolic trong mẫu dược liệu: Mẫu cao chiết được chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau và tiến hành thí nghiệm tương tự như axit gallic Hàm lượng Phenolic tổng số được xác định dựa trên đường chuẩn axit gallic theo công thức:

TP (mg GAE/g) = C x K x V

m x 1000Trong đó:

TP: Hàm lượng Phenolic tổng số tương đương hàm lượng axit gallic trong 1 g mẫu thử, mg GAE/g

C: Nồng độ Phenolic (µg/ml) tương đương axit gallic được xác định

từ đường chuẩn

K: Hệ số pha loãng V: Thể tích định mức của dung dịch mẫu thử 1000: Hệ số quy đổi từ µg GAE/g sang mg GAE/g m: Khối lượng mẫu thô

y = 0,011x + 0,015 R² = 0,993

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2