Sự đa dạng di truyền của các chủng Staphylococcus aureus phân lập được ở bếp ăn tập thể tại một số trường tiểu học bán trú Hà Nội

Hiện nay, ngộ độc thực phẩm, bao gồm ngộ độc do nhiễm khuẩn đang là vấn đề nghiêm trọng trên thế giới, đặc biệt là ở Việt Nam. Hàng năm, các bệnh lây truyền qua thực phẩm ảnh hưởng tới hàng triệu người, nhiều người trong số đó bị những rối loạn nghiêm trọng, biến chứng lâu dài hoặc tử vong do ăn phải thực phẩm không an toàn. Các bệnh lây truyền qua thực phẩm là mối quan tâm lớn trên toàn thế giới. Ở hầu hết các nước, vi khuẩn là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh lây truyền qua thực phẩm, chiếm khoảng 23 số dịch bệnh.Trong số các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, một số là đặc biệt quan trọng cả về tần số và mức độ nghiêm trọng của bệnh. Vi khuẩn (bao gồm cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm) sản sinh các độc tố gây ngộ độc thực phẩm, dẫn đến các triệu chứng khác nhau, từ rối loạn tiêu hóa đến tê liệt và chết. Trong số những vi khuẩn ấy, phải kể đến Salmonella, Clostridium perfringen, Clostridium botulinum, Bacillus cereus… và đặc biệt là Staphylococcus aureus (hay còn gọi là tụ cầu vàng). S.aureus được xem là một trong ba tác nhân chính gây ngộ thực phẩm chính ở nhiều nước trên thế giới. Do đó, đề tài “Sự đa dạng di truyền của các chủng Staphylococcus aureus phân lập được ở bếp ăn tập thể tại một số trường tiểu học bán trú Hà Nội” được thực hiện với mục tiêu: 1. Phân lập các chủng Staphylococcus aureus trong thực phầm. 2. Đánh giá sự đa dạng di truyền giữa các chủng S.aureus. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã áp dụng phương pháp PCR kết hợp PFGE để phân tích sự đa dạng di truyền và mối quan hệ của các chủng Staphylococcus aureusmột trong những nguyên nhân gây ngộ độc tập thể hàng đầu trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Các chủng S. aureus được phân lập trong bếp ăn tập thể ở một số trường tiều học bán trú Hà Nội năm 2015. Nghiên cứu của chúng tôi thu được một số kết quả như sau: Phân lập thành công một số chủng S. aureus có trong thực phẩm với đặc điểm sinh hóa: khuẩn lạc đen nhánh, bóng, lồi, tròn, bờ đều, có 2 vòng quanh khuẩn lạc: vòng đục ở trong và vòng trong ở ngoài trên môi trường BairdParker; Gram dương, hình cầu xếp chùm nho, Coagulase dương. Ti ến h ành Tỉ lệ các gen sinh độc tố ruột (sea, seb, sec) của các chủng S. aureus phân lập được trong các nhóm đối tượng mẫu là 20,6% (n=68). 12. Khả năng ứng dụng trong thực tiễn: Khuyến cáo cho cơ sở chế biến thực phẩm về vấn đề lây nhiễm chéo từ các dụng cụ chế biến, người chế biến vào thực phẩm 13. Những hướng nghiên cứu tiếp theo: (nếu có)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thị Thu Huyên

SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP ĐƯỢC

Ở BẾP ĂN TẬP THỂ TẠI MỘT SỐ

TRƯỜNG TIỂU HỌC BÁN TRÚ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thị Thu Huyên

SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP ĐƯỢC

Lời cảm ơn

Đối với mỗi học viên cao học, luận văn tốt nghiệp là một công trình nghiên cứu khoa học nhỏ nhưng lại mang ý nghĩa vô cùng to lớn, đánh dấu một bước trưởng thành của mỗi người trên con đường nghiên cứu khoa học

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thế Hải – Bộ môn

Vi sinh vật học, khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người đã dành nhiều thời gian, công sức, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Giang – Trung tâm dịch vụ Khoa

học kỹ thuật, Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, người đã chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị thuộc khoa Vi sinh vật học, Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã chỉ bảo, giúp đỡ tôi tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi cũng xin cảm ơn các cô, các chị phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện đề tài trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, đã luôn bên cạnh, động viên, khuyến khích, chia sẻ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập để tôi đạt được kết quả như ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 08 tháng 10 năm 2018

Nguyễn Thị Thu Huyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kếtquả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ côngtrình nào khác

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Huyên

MỤC LỤ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn 3

1.1.1 Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng 4

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng 5

1.2 Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus 7

1.2.1 Giới thiệu về Staphylococcus 7

1.2.2 Hình thái, đặc điểm sinh hóa 8

1.2.3 Điều kiện sinh trưởng 10

1.2.4 Sự phân bố 12

1.2.5 Khả năng gây bệnh 13

1.2.6 Khả năng kháng kháng sinh 14

1.2.7 Các yếu tố độc lực và cấu trúc kháng nguyên 15

1.2.8 Độc tố 16

1.3 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Staphylococcus aureus 18 1.3.1 Phân tích plasmid 18

1.3.2 Phân tích DNA nhiễm sắc thể sau khi xử lý enzyme cắt giới hạn (REA) 19

1.3.3 Phương pháp lai đầu dò (Southern blotting) 19

1.3.4 Phương pháp điện di trường xung (PFGE) 20

1.3.5 Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 21 1.3.6 Multilocus Sequence Typing (MLST) 21

1.4 Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus trong và ngoài nước 22

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 24

2.2 Các hóa chất, môi trường và thiết bị thí nghiệm 24

2.2.1 Các loại hóa chất 24

2.2.2 Thiết bị thí nghiệm 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phân lập các chủng Staphylococcus aureus 25

2.3.2 Tách chiết DNA tổng số 27

2.3.3 PCR xác định các gen sinh độc tố ruột của S aureus 28

2.3.4 PFGE xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng 29

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 34

3.1 Kết quả phân lập các chủng Staphylococcus aureus trong thực phẩm 34

3.1.1 Hình thái khuẩn lạc 34

3.1.2 Hình thái nhuộm Gram 36

3.1.3 Kết quả thử phản ứng coagulase 37

3.2 Kết quả phân loại các gen coa và gen sinh độc tố ruột của S aureus bằng kỹ thuật PCR 38

3.2.1 Kết quả chạy gen coa bằng PCR 38

3.2.2 Kết quả phân loại các gen sinh độc tố ruột của S aureus bằng PCR 40

3.3 Kết quả PFGE xác định đa dạng di truyền giữa các chủng S aureus 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

Tiếng Việt 49

Tiếng Anh 50

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

bp Base pair (cặp bazơ)

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleic triphosphate

ET Exfoliative toxin

(Độc tố chốc lở da)MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus

(Tụ cầu vàng kháng Methicillin)PCR Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng trùng hợp chuỗi)PFGE Pulsed-field Gel Electroforesis

(Điện di trường xung)

SE Staphylococcal Enterotoxin

(Độc tố ruột tụ cầu)TSST Toxin Shock Syndrome Toxin

(Độc tố hội chứng sốc)VRSA Vancomicin resistant Staphylococcus aureus

(Tụ cầu vàng kháng Vancomicin)

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ở Pháp năm 1999-2000 (%)

[] 3

Bảng 2: Các loại hóa chất 24

Bảng 3 Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR [] 29

Bảng 4 Thành phần các chất ủ enzyme cắt giới hạn 32

Bảng 5 Số lượng các chủng S aureus trên các đối tượng mẫu 35

Bảng 6 Nguồn gốc các chủng S aureus 45

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Hình thái nhuộm Gram của các tế bào Staphylococcus aureus [] 9

Hình 2 Khuẩn lạc của S aureus trên môi trường thạch máu sau 24 giờ nuôi cấy [] 11

Hình 3 Khuẩn lạc của S aureus trên môi trường Baird Parker [] 11

Hình 4 Khuẩn lạc của S aureus trên môi trường MSA [] 12

Hình 5 Vị trí nhiễm trùng và bệnh do Staphylococcus aureus gây ra [] 13

Hình 6 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus [] 16

Hình 7 Tạo plug chủng vi khuẩn 30

Hình 8 Rửa plug bằng đệm 31

Hình 9 Cắt plug thành các miếng nhỏ 31

Hình 10 Hình ảnh mô tả đổ gel điện di 33

Hình 11 Điện di gel dưới trường xung 33

Hình 12 Khuẩn lạc của Staphylococcus aureus trên môi trường Baird-Parker 35

Hình 13 Kết quả nhuộm Gram 37

Hình 14 Kết quả thử phản ứng đông huyết tương của S aureus 38

Hình 15 Kết quả điện di sản phẩm chạy PCR gen coa 39

Hình 16 Kết quả điện di các chủng dương tính với gen sinh độc tố 40

Hình 17 Biểu đồ phân bố các chủng S aureus theo gen sinh độc tố 41

Hình 18 Kết quả điện di trường xung (PFGE) 43

Hình 19 Kết quả phân tích quan hệ các chủng bằng PFGE 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, ngộ độc thực phẩm, bao gồm ngộ độc do nhiễm khuẩn đang là vấn đềnghiêm trọng trên thế giới, đặc biệt là ở Việt Nam Hàng năm, các bệnh lâytruyền qua thực phẩm ảnh hưởng tới hàng triệu người, nhiều người trong số đó

bị những rối loạn nghiêm trọng, biến chứng lâu dài hoặc tử vong do ăn phải thựcphẩm không an toàn

Các bệnh lây truyền qua thực phẩm là mối quan tâm lớn trên toàn thế giới Chođến nay, khoảng 250 bệnh lây truyền qua thực phẩm khác nhau đã được mô tả

Ở hầu hết các nước, vi khuẩn là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh lâytruyền qua thực phẩm, chiếm khoảng 2/3 số dịch bệnh Nhiều vi khuẩn (baogồm cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm) sản sinh các độc tố gây ngộ độcthực phẩm, dẫn đến các triệu chứng khác nhau, từ rối loạn tiêu hóa đến tê liệt và

chết Trong số những vi khuẩn ấy, phải kể đến Salmonella, Clostridium

perfringen, Clostridium botulinum, Bacillus cereus…và đặc biệt là Staphylococcus aureus (hay còn gọi là tụ cầu vàng) S aureus được xem là một

trong ba tác nhân chính gây ngộ thực phẩm chính ở nhiều nước trên thế giới, chỉ

sau Salmonella và Clostridium perfringen

S aureus là một thành viên của hệ vi khuẩn ở người Phần lớn các chủng đều có

một hay một số gen độc lực liên quan đến tình trạng nhiễm trùng hay các bệnh

lý khác nhau Chúng mang một số gen chịu trách nhiệm sản xuất các độc tố ruột,độc tố gây hội chứng sốc, hay một số gen liên quan đến hiện tượng kháng kháng

sinh… Trên thế giới, ngày càng có nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử của S.

aureus và mối liên quan giữa các yếu tố độc lực, các kiểu gen….

Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu là kết quả của việc tiêu thụ thực phẩm có

chứa độc tố ruột enterotoxin của loài vi khuẩn này Ở Việt Nam, S aureus là

nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm Do khí hậu nóng ẩm, thiếu các điều

kiện bảo quản phù hợp, S aureus xuất hiện với số lượng lớn trong thực phẩm.

Nước ta cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học về tụ cầu của một sốnhóm tác giả Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu này vẫn chỉ dừng lại ở mức

độ tìm hiểu đặc tính của chúng, xác định các kiểu gen độc tố mà chưa đi sâu vào

việc đánh giá mối quan hệ di truyền của chúng Và hiện vẫn chưa có nhómnghiên cứu nào áp dụng kỹ thuật PFGE để điều tra dịch tễ, đánh giá mối quan hệ

di truyền giữa các chủng Do đó, đề tài “Sự đa dạng di truyền của các chủng

Staphylococcus aureus phân lập được ở bếp ăn tập thể tại một số trường tiểu học

bán trú Hà Nội” được thực hiện với mục tiêu:

1 Phân lập các chủng Staphylococcus aureus trong thực phẩm tại một số bếp ăn tập

thể

2 Đánh giá sự đa dạng di truyền giữa các chủng S aureus Từ đó xác định con

đường lây nhiễm tụ cầu vàng trong thực phẩm

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Các bệnh gây ra bởi thực phẩm là mối quan tâm hàng đầu trên thế giới.Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), bệnh gây ra bởi thực phẩm là bệnh do tiêuthụ thực phẩm hay nước bị nhiễm khuẩn hoặc độc tố của chúng [ 41] Đã cókhoảng hơn 250 bệnh do thực phẩm được báo cáo, trong đó vi khuẩn là nguyênnhân hàng đầu, chiếm hai phần ba các vụ ngộ độc thực phẩm [41]

Cuộc chiến chống lại các bệnh do thực phẩm đang phải đối mặt với nhiềuthách thức mới do sự thay đổi nhanh chóng cách thức sử dụng thực phẩm củacon người, sự toàn cầu hóa của thị trường thực phẩm và biến đổi khí hậu Ởnhiều quốc gia, tổ chức chăm sóc sức khỏe quốc gia ghi nhận sự bùng phát cácbệnh do thực phẩm, được định nghĩa là sự xuất hiện của hai hay nhiều trườnghợp bệnh tương tự do ăn phải thực phẩm thông thường Trên thực tế, tỷ lệ củacác bệnh do thực phẩm khó đánh giá vì nhiều trường hợp không báo cáo Trongnhững trường hợp đó, vi khuẩn gây bệnh đã được xác định (bảng 1), một số vikhuẩn Gram dương liên quan đến ngộ độc thực phẩm đã được mô tả

Bảng 1 Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ở Pháp năm 1999-2000 (%)

Nhậpviện(n=8

Tử vong(n=7)

Salmonella sp (Enteritidis, Typhimurium,

Dinophylis, C.botulinum, Shigella sp.,

HAV, Vibrio sp., E.coli, )

Nhiều vi khuẩn (kể cả Gram dương và Gram âm) sản xuất độc tố gây ngộđộc thực phẩm, dẫn đến các triệu chứng khác nhau, từ rối loạn tiêu hóa đến têliệt và tử vong [41] Sau đây là một số ví dụ về vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm:

Clostridium perfringens là tác nhân gây bệnh phổ biến thứ hai của các bệnh từ

thực phẩm ở Mỹ, sau Salmonella Nó là vi khuẩn kỵ khí, Gram dương, hình thành bào

tử [18] và được phân bố rộng rãi trong môi trường (thường xuyên trong ruột người vànhiều động vật) Các bào tử tồn tại trong đất, trầm tích và các khu vực ô nhiễm phân

của người và động vật Các triệu chứng ngộ độc thực phẩm do Clostridium

perfringens gồm đau bụng dữ dội và tiêu chảy, xuất hiện từ 8 đến 22 giờ sau khi tiêu

thụ thực phẩm bị ô nhiễm Trường hợp nghiêm trọng hơn nhưng hiếm gặp là bệnhviêm ruột hoại tử (còn gọi là pig-bel) và thường gây tử vong Nguyên nhân tử vongcủa bệnh là do nhiễm trùng và hoại tử ruột dẫn đến nhiễm trùng máu [41]

Bacillus cereus là một loại trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử và gây ra hai

loại bệnh do hai chất chuyển hóa khác nhau Bệnh tiêu chảy gây ra bởi một proteinphân tử có trọng lượng phân tử lớn Loại này có các triệu chứng ngộ độc giống với

ngộ độc thực phẩm bởi C perfringen, bao gồm: tiêu chảy ra nước, đau rút khoang

bụng [6 đến 15 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm, kéo dài 24 giờ) Nôn mửa(emetic) là triệu chứng gây ra bởi đoạn peptide có trọng lượng phân tử thấp và ổnnhiệt Loại này gây nôn trong vòng 0,5 đến 6 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm ô nhiễm

và thi thoảng đau bụng hoặc tiêu chảy Các triệu chứng của loại này tương tự như cáctriệu chứng của ngộ độc thực phẩm do tụ cầu [53]

1.1.1 Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng

Staphylococcus aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ

ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringens Ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus là kết quả của sự nhiễm độc do tiêu thụ thức ăn có chứa độc tố do S aureus sinh ra Triệu chứng thường gặp ở các vụ ngộ

độc do tụ cầu là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, có hay không có tiêu chảy, ngoài racòn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết áp Triệu chứng ngộ độc xảy ranhanh, từ 3-6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy vào lượng thực phẩm đã dùng,lượng độc tố có trong thực phẩm và độ nhạy với độc tố cũng như sức khỏe của từngngười Thường thì các triệu chứng chỉ kéo dài trong một thời gian ngắn, khoảng 6-8

giờ và hết bệnh sau 1 - 2 ngày Tuy nhiên khoảng 10% trường hợp người bệnh bị mấtnhiều nước cần phải nhập viện để truyền dịch [41].

Nguồn gốc dẫn đến ngộ độc thực phẩm do tụ cầu rất đa dạng và khác nhau.Các loại thực phẩm thường xuyên bị nhiễm độc tụ cầu bao gồm thịt và các sản phẩmthịt, thịt gia cầm; các sản phẩm trứng, sữa và các sản phẩm từ sữa; xà lách; các sảnphẩm bánh mì, đặc biệt là bánh ngọt và bánh kem và bánh kẹp Các sản phẩm thực

phẩm muối, chẳng hạn như giăm bông, cũng là nguồn cư trú của S aureus…Tuy

nhiên, trong mọi trường hợp, nguồn gốc chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm là conngười Tụ cầu có thể nhiễm vào thức ăn thông qua tiếp xúc bằng tay hoặc qua đường

hô hấp khi ho và hắt hơi [13]

2000 có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc, 59 người tử vong [1] Năm

2006, số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là 164 vụ (tăng 14,6% so với năm 2005),làm 7.135 người bị ngộ độc (tăng 65,8% so với năm 2005), trong đó có 64 vụ(38,8%) là do vi sinh vật gây ra (Hội nghị tổng kết dự án đảm bảo an toàn vệ sinhthực phẩm, tháng 3/2007, Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, Bộ Y tế)

Một số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta có liên quan đến S aureus và độc tố

ruột của chúng đã được báo cáo Ví dụ như vụ ngộ độc của các cán bộ, sinh viên khoaĐịa chất và Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM trong chuyến đithực tế và đã nhiễm độc tố do tụ cầu vàng sinh ra Các bệnh nhân nhập viện với cáctriệu chứng như đau đầu, tiêu chảy, ói mửa Nguyên nhân là do thức ăn chế biến

không hợp vệ sinh, lại để lâu ngày nên đã nhiễm S aureus và đã sinh độc tố

enterotoxin

S aureus cũng chịu trách nhiệm cho vụ ngộ độc ở một nhà trẻ huyện Phú

Quốc, trong khẩu phần ăn gồm có sữa chua, cơm, thịt xào Các triệu chứng cũngtương tự như nôn ói, đau bụng Kết quả kiểm tra cho thấy phần lớn các mẫu thực

phẩm đều nhiễm S aureus từ 101 CFU/g cho đến 107 CFU/g Trong đó độc tố được

phát hiện có trong mẫu sữa chua và thuộc độc tố nhóm C [7].

Ngộ độc thực phẩm không chỉ xảy ra ở nước ta mà còn xảy ra ở nhiều nướctrên thế giới kể cả những nước phát triển Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độcthực phẩm ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và kinh tế, làm 1,5 tỉ lượtngười bệnh, ở các nước công nghiệp 30% dân số bị ngộ độc thực phẩm hàng năm

Vụ ngộ độc lớn đầu tiên có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ởMichigan (Mỹ) do phomai Tiếp đến là ở Pháp vào năm 1894 do thịt từ bò bị bệnh.Khô bò bị nhiễm tụ cầu cũng từng gây ngộ độc ở Kalamazoo, Michigan vào năm

1907 Năm 1914, ở Philippines, Barbert xác định rằng sữa lấy từ bò bị viêm vú đã

gây ra ngộ độc ở người Năm 1930, Dark lại xác định được vụ ngộ độc do S aureus

từ bánh giáng sinh [17]

Trên thế giới nhiều vụ ngộ độc thực phẩm tại các trường học như: vụ ngộ độc

ở một trường tiểu học tại Texas năm 1968 và năm 1992 do ăn sa lát gà làm hơn 1300trường hợp nhiễm độc; năm 1985 xảy ra một vụ ngộ độc ở một trường trung học tạiKentucky làm hơn 1000 ca nhiễm độc do ăn sô cô la sữa; năm 2007 tại một trường

tiểu học ở Áo có 166 trường hợp nhiễm độc mà nguyên nhân là S aureus [12] Theo

báo cáo tại Hồng Kông, số vụ ngộ độc tại các trường học chiếm 5%, tại các nhà hàng

và cơ sở thực phẩm chiếm 47% và tại nhà chiếm 39% tổng số ca nhiễm độc

Ở Đài Loan, S aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986 đến năm

1995 Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trường trunghọc ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờsau khi ăn sáng [63] Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụdịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu [26]

Năm 2000, một vụ bùng phát ngộ độc thực phẩm do tụ cầu đã xảy ra ở quậnKansai, Nhật Bản có tới 13420 trường hợp có các triệu chứng như buồn nôn, chuộtrút bụng và tiêu chảy trong vòng 24 giờ sau khi tiêu thụ sữa được sản xuất tại một nhàmáy ở thành phố Osaka Người ta đã xác định được sữa ít béo bổ sung canxi là nguồngây nhiễm độc và độc tố gây ngộ độc là SEA [14]

Tụ cầu gây ra khoảng 14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm; và hàng năm, Mỹmất khoảng 1,5 tỉ đô la cho những vụ ngộ độc do tụ cầu Trong các loại độc tố gây racác vụ ngộ độc thì SEA là loại độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất (77,8%), SED (37,5%) và

SEB (10%) [44].

Báo cáo mới nhất do Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu, nhận được dữ liệu

từ 27 quốc gia thành viên Liên minh châu Âu, cho thấy S aureus là tác nhân gây bệnh phổ biến thứ tư gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm năm 2008, sau Salmonella, virus gây bệnh ở thực phẩm và Campylobacter S aureus gây ra 291 vụ ngộ độc thực

phẩm chiếm 5,5% tổng số vụ dịch được báo cáo ở Liên minh châu Âu [21]

Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản thựcphẩm không tốt Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay người chế biến

bị trầy xước hay do ho, hắt hơi Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ không phù hợpcũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu, chúng sẽ tăng nhanh sốlượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt độ rất lớn, từ 7-48oC Điều đáng

lo ngại là độc tố được tạo ra trong suốt quá trình phát triển của tụ cầu nhưng lạikhông gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó ít được chú ý [48]

1.2.1 Giới thiệu về Staphylococcus

Staphylococcus được biết đến là cầu khuẩn và một số loài là thành viên của hệ

vi sinh vật bình thường trên da và màng nhày của con người Tuy nhiên, một số khác

là nguyên nhân gây ra mưng mủ, làm hình thành các vết áp xe, hàng loạt các hiệntượng nhiễm trùng sinh mủ, thậm chí tử vong do nhiễm trùng huyết Staphylococcigây bệnh thường gây tan máu, đông huyết tương, sản xuất hàng loạt các enzymengoại bào và nhiều loại độc tố Ngộ độc thực phẩm phổ biến nhất do các độc tố ruột

có tính ổn nhiệt Staphylococci phát triển nhanh chóng với khả năng kháng các tácnhân kháng khuẩn, do đó gây khó khăn trong quá trình điều trị [20]

Chi Staphylococcus có ít nhất 45 loài Trong đó, bốn loài quan trọng nhất là

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, và Staphylococcus saprophyticus S aureus cho phản ứng coagulase dương tính, khác

biệt với các staphylococci khác S aureus là loài gây bệnh chính cho con người Hầu hết mọi người sẽ bị một số loài S aureus xâm nhiễm trong suốt cuộc đời, với mức độ

từ ngộ độc thực phẩm hoặc nhiễm trùng da nhẹ đến nhiễm trùng đe dọa tính mạngnghiêm trọng Các staphylococci cho phản ứng coagulase âm tính là những vi sinh

vật bình thường ở người và đôi khi lây nhiễm bởi các thiết bị cấy ghép như cấy ghépkhớp nhân tạo, ống xông đường tiểu…, đặc biệt là ở các bệnh nhân còn trẻ, người giàhay những người bị suy giảm miễn dịch Khoảng 75% nhiễm trùng gây ra bởi các loài

staphylococci cho phản ứng coagulase âm tính bao gồm S lugdunensis, S warneri, S.

hominis, và một số khác thì hiếm gặp hơn S srophrophyticus là một nguyên nhân

tương đối phổ biến của nhiễm trùng đường tiết niệu ở phụ nữ trẻ, mặc dù nó hiếm khigây nhiễm trùng ở bệnh nhân nhập viện [20]

1.2.2 Hình thái, đặc điểm sinh hóa

Năm 1881, Sir Alexander Ogston, một bác sĩ phẫu thuật người Scotland, đã

phát hiện ra rằng Staphylococcus có thể gây nhiễm trùng vết thương sau khi nhận

thấy các nhóm vi khuẩn trong mủ do vết áp xe khi thực hiện thủ thuật Ông đặt tên

cho nó là Staphylococcus dạng cụm dưới kính hiển vi Sau đó, vào năm 1884, nhà khoa học người Đức Friedrich Julius Rosenbach đã xác định loài Staphylococcus

- Loài: Staphylococcus aureus

- Tên khoa học: Staphylococcus aureus Rosenbach 1884

Staphylococcus aureus thuộc chi Staphylococcus, do đó mang những tính chất

chung của Staphylococcus S aureus là những vi khuẩn hình cầu, Gram dương,

không di động, đường kính 0,5 - 1,5 µm; tế bào có xu hướng xếp thành cụm và được

mô tả dạng chùm nho (hình 1) [56] Staphylococcus aureus phát triển thành cụm vì

các tế bào phân chia liên tiếp thành ba mặt phẳng vuông góc và các tế bào chị em gắnliền với nhau sau mỗi lần phân chia liên tiếp Vì điểm đính kèm chính xác của các tếbào chị em có thể không nằm trong mặt phẳng phân chia và các tế bào có thể thay đổi

vị trí một chút trong khi vẫn gắn liền, kết quả là hình thành một cụm tế bào không

đều [59].

Hình 1 Hình thái nhuộm Gram của các tế bào Staphylococcus aureus [20].

Thành tế bào của S aureus có tới 50% khối lượng là peptidoglycan Lớp

peptidoglycan bao gồm các tiểu phần polysaccharide sắp xếp luân phiên xen kẽ củaN-acetylglucosamine và axit N-acetylmuramic bằng liên kết 1,4-β glycosidic Cácchuỗi peptidoglycan được liên kết chéo với các chuỗi tetrapeptide liên kết với axit N-

acetylmuramic bằng cầu nối pentaglycine đặc trưng cho S aureus Peptidoglycan có

thể có hoạt tính giống như nội độc tố, kích thích sự giải phóng các cytokine của cácđại thực bào, kích hoạt bổ sung và tập hợp các tiểu cầu Sự khác biệt trong cấu trúcpeptidoglycan của các chủng tụ cầu có thể góp phần làm thay đổi khả năng gây đôngmáu của chúng [42] Peptidoglycan hình thành một mạng lưới vững chắc bao quanh

tế bào Staphylococcus aureus kháng với lysozyme nhưng nhạy cảm với lysostaphin

do nó tấn công vào liên kết glycine-glycine có trong cầu nối peptide củapeptidoglycan [41]

Staphylococcus aureus là những vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, có enzyme catalase

phân giải hydrogen peroxide (H2O2) giải phóng oxy và nước:

catalase

2 H2O2 2 H2O + O2Coagulase là một enzyme làm đông huyết tương theo cơ chế tương tự đôngmáu thông thường Xét nghiệm coagulase là phương pháp xác định vi khuẩn gây

bệnh cho con người là Staphylococcus aureus Đây được xem là tính chất đặc trưng

của S aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt S aureus với các tụ cầu khác Ở cơ thể vật

chủ con người, hoạt động của enzyme coagulase tạo ra khối đông huyết tương bằngcách chuyển đổi ngay lập tức fibrinogen thành fibrin ở vùng lân cận của vi khuẩn nhưmột biện pháp bảo vệ chính nó Cấu trúc lưới fibrin được hình thành bởi sự chuyểnđổi này bao quanh các tế bào vi khuẩn hoặc mô bị nhiễm khuẩn, bảo vệ vi khuẩn khỏi

sự đề kháng không đặc hiệu của vật chủ như thực bào và hoạt tính chống tụ cầu củahuyết thanh bình thường Điều này cho phép vi khuẩn tồn tại trong sự hiện diện củaphản ứng miễn dịch của vật chủ, có thể dẫn đến hiện tượng nhiễm trùng Do đó,

coagulase được mô tả là yếu tố độc lực của S aureus Phần lớn các chủng S aureus

tạo ra một hoặc hai loại coagulase: coagulase cố định (bound coagulase) gắn vàothành tế bào và coagulase tự do (free coagulase) được giải phóng khỏi thành tế bào

Có hai phương pháp để thực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính vàtrong ống nghiệm Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase cố địnhbằng cách phản ứng trực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiệnnhững coagulase tự do bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp vớinhững yếu tố khác trong huyết tương tạo thành từng khối hay thành cục [24]

1.2.3 Điều kiện sinh trưởng

Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở nhiều điều kiện sinh trưởng khác

nhau từ hiếu khí đến vi hiếu khí Chúng có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độrất rộng, từ 7 – 48,5oC, với nhiệt độ cực thuận là 30 – 45oC; khoảng pH 4,2-9,3, với

độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl [40] Khuẩn lạctrên các môi trường rắn thường tròn, bóng, lồi và tạo sắc tố tốt nhất ở nhiệt độ phòng(20 – 25oC) [20]

S aureus có khả năng lên men chậm nhiều loại carbonhydrate, sản sinh nhiều acid lactic Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch

máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu hẹp

hơn so với đường kính khuẩn lạc Hầu hết các chủng S aureus đều tạo sắc tố vàng,

nhưng các sắc tố thấy rõ sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Các khuẩn lạc cóđường kính 3 – 4 mm được bao quanh bởi vòng tan máu có đường kính khoảng 1 cm(hình 2) [20]

Hình 2 Khuẩn lạc của S aureus trên môi trường thạch máu sau 24 giờ nuôi cấy [20] Trên môi trường Baird Parker (BP), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có màu

đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1 1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2

-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏtrứng của lethinase) (hình 3) Trên môi trường Manitol salt agar (MSA) hay còn gọi

là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm

và làm chuyển màu môi trường từ màu đỏ sang màu vàng (do lên men đườngmanitol) [48] (hình 4)

Hình 3 Khuẩn lạc của S aureus trên môi trường Baird Parker [10]

Hình 4 Khuẩn lạc của S aureus trên môi trường MSA [35]

Đa số các chủng S aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong

môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ

35-37oC [9]

1.2.4 Sự phân bố

Staphylococcus aureus thuộc hệ vi sinh vật bình thường được tìm thấy trên da

và màng nhầy của động vật có vú và chim Người ta ước tính rằng có tới một nửa

người trưởng thành nhiễm vi khuẩn này và khoảng 15% dân số nhiễm S aureus lâu

dài Chúng có thể được phát tán ra môi trường bên ngoài xung quanh vật chủ và tồntại lâu dài ở những khu vực đó Do vậy, chúng có mặt khắp nơi ở bên ngoài khôngkhí, bám vào những hạt bụi, trong nước, nước thải…[32]

S aureus có mặt ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố, do đó khả năng nhiễm

vào thực phẩm và gây bệnh của S aureus rất lớn Tụ cầu nhiễm vào thực phẩm chủ

yếu qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người Những

người xử lý thực phẩm mang S aureus sản xuất enterotoxin trong mũi hoặc trên tay

của họ được coi là nguồn ô nhiễm thực phẩm chính, thông qua tiếp xúc thủ công hoặc

qua dịch tiết đường hô hấp Do S aureus không cạnh tranh tốt với nguồn vi sinh vật

trong thực phẩm thô, ô nhiễm chủ yếu liên quan đến việc xử lý thực phẩm không

đúng cách, tiếp theo là bảo quản trong điều kiện cho phép S aureus phát triển và sản xuất enterotoxin Sự hiện diện với mật độ cao của S aureus trong thực phẩm cho thấy

điều kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạnchế biến không tốt Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm

đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S aureus được phân lập tạo độc tố Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ S aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc [13] Các loại

thực phẩm thường xuyên bị nhiễm độc tụ cầu bao gồm thịt và các sản phẩm thịt, thịtgia cầm và các sản phẩm từ trứng, sữa và các sản phẩm từ sữa, xà lách, các sản phẩmbánh, đặc biệt là bánh ngọt và bánh sandwich Các sản phẩm thực phẩm muối, chẳng

hạn như giăm bông, cũng có liên quan do khả năng của S aureus có thể phát triển ở

hoạt động nước tương đối thấp [13]

1.2.5 Khả năng gây bệnh

Staphylococcus aureus là một trong những vi khuẩn cư trú ở người nhưng

cũng là mầm bệnh của con người S aureus gây ra một loạt các bệnh nhiễm trùng

(hình thành mủ) và nhiễm độc ở người Nó gây ra các tổn thương bề mặt da như mụnnhọt, nhiễm trùng nghiêm trọng hơn như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêmmàng não, viêm đường tiết niệu, thậm chí còn gây viêm tủy xương và viêm nội tâm

mạc S aureus là một nguyên nhân chính của nhiễm trùng bệnh viện tại các vết thương phẫu thuật và nhiễm trùng liên quan đến các thiết bị y tế S aureus gây ngộ

độc thực phẩm bằng cách giải phóng các enterotoxin vào thực phẩm, và gây ra hộichứng sốc độc tố bằng cách sản sinh các siêu kháng nguyên vào máu [59]

Hình 5 Vị trí nhiễm trùng và bệnh do Staphylococcus aureus gây ra [59]

Sự nhiễm Staphylococcus aureus ở người xảy ra thường xuyên và mang tính

cục bộ tại một số vị trí khi chúng vượt qua được hàng rào bảo vệ thông thường của cơthể Các vị trí ấy có thể là một nang lông hoặc một vết trầy xước trên da Nhiễm trùngnghiêm trọng hơn của da có thể xảy ra, chẳng hạn như nhọt hoặc chốc lở Một vị trínhiễm trùng khác nữa là đường hô hấp Viêm phổi do tụ cầu là một biến chứngthường gặp của bệnh cúm Phản ứng của cơ thể đối với nhiễm trùng tụ cầu là viêm,đặc trưng bởi nhiệt độ tăng cao tại chỗ, sưng, tích tụ mủ và hoại tử mô Nhiễm trùngcục bộ của xương được gọi là viêm tủy xương Hậu quả nghiêm trọng của nhiễmtrùng tụ cầu xảy ra khi vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nhiễm trùng máu và có thểnhanh chóng gây tử vong Nhiễm trùng máu cũng có thể gây bởi các vết áp xe trên dahoặc nhiễm trùng ở phổi, thận, tim, cơ xương hoặc màng não [20]

1.2.6 Khả năng kháng kháng sinh

Hầu hết các chủng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau Một

vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những dòng

này ngày càng tăng Những dòng MRSA (Methicilin resistant Staphylococcus aureus)

rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác Trong

phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở Enterococcus

faecalis có thể chuyển sang S aureus, và việc chuyển gen này có thể xảy ra ngoài tự

nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn Ngoài ra, S aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế [16] Hiện tượng kháng kháng sinh của S aureus có thể xảy ra ở

một số cơ chế [20]:

1 Sinh β-lactamase: đây là cơ chế phổ biến, do gen nằm trên plasmid kiểmsoát, nên chúng kháng với nhiều penicillins (penicillin G, ampicillin,ticarcillin, piperacillin, và nhiều loại thuốc tương tự)

2 Kháng nafcillin (methicillin và oxacillin): Khả năng này được mã hoá vàquy định bởi một chuỗi các gen được tìm thấy tại một vùng của nhiễm sắcthể gọi là mec staphylococcal (SCCmec) Có 12 type SCCmec khác nhau.Các type I, II, III, VI, VIII có liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện (HA-

MRSA) SCCmec type IV được tìm thấy trong S aureus kháng methicillin

ngoài cộng đồng (CA-MRSA)

3 Tại Hoa Kỳ, S aureus được coi là nhạy cảm với Vancomycin nếu nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) là 2 μg/mL hoặc ít hơn; nhạy cảm trung bình nếug/mL hoặc ít hơn; nhạy cảm trung bình nếu

MIC là 4-8 μg/mL hoặc ít hơn; nhạy cảm trung bình nếug/mL; và kháng nếu MIC 16 μg/mL hoặc ít hơn; nhạy cảm trung bình nếug/mL hoặc cao hơn Chủng S.

aureus nhạy cảm trung bình với Vancomycin (VISA) đã được phân lập ở

Nhật Bản, Hoa Kỳ, và một số nước khác Cơ chế này liên quan tới tăng sinhtổng hợp thành tế bào, biến đổi trong thành tế bào mà không phải gây ra bởi

các gen van được tìm thấy trong enterococci.

4 Từ năm 2002, tại Hoa Kỳ người ta đã phân lập được từ bệnh nhân một số

chủng S aureus kháng Vancomycin (VRSA) (MICs ≥ 16 μg/mL hoặc ít hơn; nhạy cảm trung bình nếug/mL) Các chủng này mang gen kháng Vancomycin vanA giống như enterococci và gen kháng nafcillin mecA Tất cả các chủng VRSA nhạy cảm với các kháng sinh

khác và chúng đang là mối quan tâm chính trên toàn thế giới

5 Thu nhận các plasmid trung gian kháng với tetracycline, erythromycins,aminoglycosides, và các loại thuốc khác được sử dụng thường xuyên trongđiều trị tụ cầu

6 Hiện tượng “dung nạp” thuốc, nghĩa là bị ức chế bởi một loại thuốc nhưngkhông bị giết bởi nó Đó là khác biệt lớn giữa ức chế tối thiểu và nồng độ ứcchế gây chết tối thiểu của một loại thuốc kháng sinh “Dung nạp” thuốc cóthể có do sự hoạt hóa các enzyme tự phân hủy trong thành tế bào

Khảo sát tính chất kháng kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005

cho thấy các chủng S aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng

kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% khángGetamicin [6]

1.2.7 Các yếu tố độc lực và cấu trúc kháng nguyên

S aureus mang nhiều yếu tố độc lực tiềm tàng: (1) protein bề mặt thúc đẩy quá

trình xâm lấn mô chủ; (2) yếu tố xâm lấn thúc đẩy vi khuẩn lây lan (leucocidin,kinase, hyaluronidase); (3) các yếu tố bề mặt có tác dụng ức chế quá trình thực bào(capsule, protein A); (4) đặc tính sinh hóa giúp tăng cường khả năng sống sót củachúng trong thực bào (carotenoids, catalase); (5) yếu tố cải trang miễn dịch (protein

A, coagulase); (6) độc tố gây phá hủy màng (hemolysins, leukotoxin, leucocidin); (7)các ngoại độc tố (SEA-G, TSST, ET) và (8) khả năng kháng các chất tẩy rửa [59]

Hình 6 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus [59]

Staphylococcus aureus có kháng nguyên polysaccharides và protein cũng như

các chất quan trọng cấu trúc trên thành tế bào Chúng có vai trò quan trọng trong cơchế lây nhiễm: sản sinh interleukin-1 (pyrogen nội sinh) và opsonin hóa các khángthể của bạch cầu đơn nhân, hoạt động như nội độc tố và kích hoạt bổ thể Việc lắp ráppeptidoglycan chính là đích tấn công của các kháng sinh β-lactam và glycopeptide[20]

Acid teichoic, polymer của polyribitol-phosphate, liên kết chéo vớipeptidoglycan và có thể là kháng nguyên Chúng rất quan trọng đối với cơ chếchuyển hóa thành tế bào Kháng thể kháng acid teichoic phát hiện bằng khuếch tán

gel có thể được tìm thấy ở những bệnh nhân viêm nội tâm mạc do S aureus [20]

Protein A là thành phần của thành tế bào của S aureus và là protein bề mặt

đặc trưng trong nhóm các chất kết dính Protein A liên kết với vùng Fc của phân tửIgG ngoại trừ IgG3 Trong huyết thanh, vi khuẩn sẽ gắn các phân tử IgG sai hướng

làm phá hủy sự opsonin hóa và sự thực bào Các chủng S aureus đột biến thiếu

protein A cho sự thực bào trong ống nghiệm hiệu quả hơn, và các nghiên cứu với cácđột biến trong các mẫu bệnh cho thấy protein A tăng độc lực [16]

1.2.8 Độc tố

Hemolysin: S aureus có 4 hemolysin được điều hòa bởi gen agr α

-hemolysin là một protein không đồng nhất, có khả năng khử màng tế bào nhân chuẩn

Độc tố β làm suy giảm sphingomyelin và gây độc đối với nhiều loại tế bào, bao gồm

cả tế bào hồng cầu của người Độc tố δ không đồng nhất và phân ly thành các tiểuđơn vị trong chất tẩy rửa không ion Nó phá vỡ màng sinh học và có thể có vai trò

trong các bệnh tiêu chảy do S aureus γ - hemolysin là một leukocidin làm phân giải

các tế bào bạch cầu và bao gồm hai protein được gọi là S và F γ - hemolysin có thểtương tác với hai protein của Panton - Valentine Leukocidin (PVL) Phức hệ proteinnày có khả năng làm mất hiệu quả các tế bào bạch cầu bằng cách gây ra sự hình thành

lỗ hổng trên màng tế bào làm tăng tính thấm cation Điều này dẫn đến việc giải phóng

ồ ạt các chất trung gian gây viêm như IL-8, leukotriene và histamine, dẫn đến hiệntượng hoại tử và viêm nặng [20]

Panton - Valentine Leukocidin (PVL): Độc tố này của S aureus có hai

thành phần và không giống như các hemolysin được mã hóa nhiễm sắc thể, PVLđược mã hóa trên một phage di động Nó có thể giết chết các tế bào bạch cầu củangười và thỏ Hai thành phần được gọi là S và F hoạt động phối hợp trên màng tế bàobạch cầu như được mô tả như γ – hemolysin Độc tố này là một yếu tố độc lực quantrọng trong nhiễm trùng CA-MRSA [20]

Độc tố phồng rộp (chốc lở) da (ET): những độc tố này của S aureus là hai

loại protein có cùng trọng lượng phân tử Độc tố ETA được mã hóa bởi eta nằm trênphage và ổn định nhiệt (chịu được nhiệt độ sôi trong 20 phút) Độc tố ETB quy địnhbởi gen nằm trên plasmid và không bền với nhiệt Những độc tố làm bong da do tụcầu gây bỏng bằng cách phân hủy mucopolysaccharide của lớp biểu bì Các độc tốnày là siêu kháng nguyên [20]

Độc tố hội chứng sốc: hầu hết các chủng S aureus được phân lập từ các bệnh

nhân có hội chứng sốc nhiễm độc sản xuất một chất độc gọi là độc tố hội chứng sốc(TSST-1), mà giống như enterotoxin F TSST-1 là siêu kháng nguyên TSST-1 liênkết với các phân tử MHC lớp II của tế bào trình diện kháng nguyên, kích thích sảnxuất tế bào T Các độc tố kết hợp gây sốt, sốc, và sự tham gia đa hệ, bao gồm phát

ban da Các gen TSST-1 được tìm thấy trong khoảng 20% các chủng S aureus đã

được phân lập, kể cả MRSA

Độc tố ruột (Staphylococcal Enterotoxin - SE): Có 15 độc tố (A-E, G-P)

giống như TSST-1, là các siêu kháng nguyên Khoảng 50% các chủng S aureus có

thể sản xuất một hoặc nhiều độc tố này Các độc tố có tính ổn định nhiệt và đề khángvới hoạt động của các enzyme đường ruột Độc tố ruột là nguyên nhân chủ yếu của

ngộ độc thực phẩm Chúng được sinh ra khi S aureus sinh trưởng nhờ carbohydrate

và protein trong thức ăn Hoạt tính gây nôn của enterotoxin là kết quả của sự kíchthích hệ thần kinh trung ương sau khi độc tố tác động lên các thụ thể thần kinh trongruột [20]

Các gen mã hóa độc tố ET, TSST-1 và độc tố ruột nằm trên một vùng củanhiễm sắc thể gọi là đảo gen gây bệnh Nó tương tác với các yếu tố di truyền, thựckhuẩn thể và sản sinh độc tố [20]

aureus

Từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước, các kỹ thuật chỉ thị DNA được bắt đầu và pháttriển nhanh chóng trở thành lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử Các chỉ thịDNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chọn lọc Các kỹ thuật chỉ thị DNAđược xây dựng phục vụ nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh loài, phân loại, đánhdấu và xác định gen Sự phát triển của hàng loạt các chỉ thị DNA khác nhau cùng vớicác nguyên lý, phương pháp và ứng dụng của chúng dẫn đến việc cần thiết xem xétmột cách cẩn thận trong việc lựa chọn kỹ thuật phù hợp cho mục đích nghiên cứu.Không có chỉ thị DNA nào hiện biết có thể đáp ứng đầy đủ tất cả các yêu cầu của nhànghiên cứu Phụ thuộc vào vấn đề nghiên cứu, có thể chọn trong các kỹ thuật chỉ thịDNA khác nhau vì mỗi kỹ thuật có thể có một số đặc tính cơ bản riêng [58]

Hiện nay, có rất nhiều kỹ thuật để phân biệt các chủng Staphylococcus aureus,

có thể được áp dụng như một công cụ vô giá cho cả bác sĩ lâm sàng và nhà dịch tễhọc Các kỹ thuật phân tử có thể kể đến bao gồm: phân tích plasmid, phân tích DNAnhiễm sắc thể sau khi xử lý enzyme giới hạn, Southern blotting, điện di trường xung(PFGE), các kỹ thuật liên quan đến phản ứng PCR và multilocus sequence typing(MLST) PCR trình tự DNA lặp lại (rep-PCR) có thể được sử dụng để sàng lọc dotính thực tế, chi phí thấp và khả năng lặp lại của nó Do khả năng phân tách cao, điện

di trường xung (PFGE) vẫn là tiêu chuẩn vàng cho nghiên cứu đa dạng loài của tụ cầu[60]

1.3.1 Phân tích plasmid

Phân tích các plasmid vi khuẩn là kỹ thuật phân tử đầu tiên được sử dụng đểđiều tra dịch tễ học MRSA Kỹ thuật này bao gồm chiết tách DNA plasmid và táchDNA này sau đó bằng điện di trong gel agarose Đây là một kỹ thuật dễ thực hiện và

rõ ràng, tuy nhiên nó có một số hạn chế, thực tế rằng plasmid là các yếu tố ngoại bào

di động có thể bị mất tự nhiên hoặc dễ dàng bị vi khuẩn thu nhận Do đó, các chủngliên quan đến dịch tễ học có thể hiển thị các cấu hình plasmid khác nhau Hơn nữa,nhiều plasmid mang yếu tố quyết định kháng thuốc có trong transposons có thể dễdàng bị mất hoặc thu được, làm thay đổi nhanh chóng cách sắp xếp của DNAplasmid Độ lặp lại của các băng được tạo ra có thể bị ảnh hưởng các plasmid tồn tại

ở nhiều dạng khác nhau (siêu xoắn, vòng và thẳng), có vận tốc di chuyển khác nhaukhi điện di trên gel agarose [31]

Phần lớn các chủng S aureus mang plasmid, nhưng khi chúng vắng mặt, việc

typing tở nên khó khăn Một hạn chế khác là số lượng plasmid có trong các chủngphân lập, thường là một hoặc hai, dẫn đến sự phân biệt kém giữa các chủng [Weller,2000]

1.3.2 Phân tích DNA nhiễm sắc thể sau khi xử lý enzyme cắt giới hạn (REA)

Trong kỹ thuật này, DNA nhiễm sắc thể bị phân cắt bởi các endonuclease vàkết quả được phân tách bằng điện di trên gel agarose thông thường Các endonuclease

BglII và EcoRI được sử dụng cho S aureus, vì chúng phân cắt tại các vị trí thường

gặp dọc theo nhiễm sắc thể, tạo ra các đoạn ngắn và nhiều đoạn [38] Sau khi điện di,

một dải các băng được so sánh với nhau Tất cả các chủng S aureus đều có thể phân

biệt bằng phương pháp này, tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là kết quả cónhiều đoạn chồng chéo, khiến cho việc phân tích kết quả trở nên khó khăn [19]

1.3.3 Phương pháp lai đầu dò (Southern blotting)

Sau khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn, DNA được phân cắt thành các đoạn cókích thước khác nhau, đặc trưng cho đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) đa hìnhDNA được xác định bằng cách lai đoạn dò DNA (DNA probe) đánh dấu với DNAsau khi cắt bằng enzyme giới hạn và được thấm truyền lên màng lai bằng phươngpháp Southern Kết quả là tạo ra hình ảnh các phân đoạn DNA khác nhau Việc xác

định các phân đoạn DNA được tiến hành bằng lai các phân đoạn DNA này với đoạn

dò được đánh dấu huỳnh quang hoặc phóng xạ để có thể phát hiện bằng phản ứnghuỳnh quang hoặc phim chụp phóng xạ [58]

Nhiều đầu dò đã được thiết kế để phân tích S aureus, trình tự được sử dụng

thường xuyên nhất là RNA của ribosome (rRNA); kỹ thuật đặc biệt này là

Ribotyping Kỹ thuật này dựa trên phân tích đa dạng của gen nhiễm sắc thể mã hóa

cho rRNA, hiện diện ở một số vị trí tương đối được bảo tồn trong các loài.Ribotyping có khả năng lặp lại cao và khả năng phân tách tốt các đặc điểm dịch tễhọc của MRSA, tuy nhiên khả năng phân biệt giữa các chủng thấp hơn khi so sánhvới các kỹ thuật khác [66]

Các đầu dò DNA khác được thiết kế để nghiên cứu dịch tễ học MRSA bằngphương pháp Southern blot bao gồm các trình tự chèn khác nhau, chẳng hạn như

IS431, IS256 và IS1181, đầu dò gen mecA và transposons Tn554 (mecA: Tn554).

Việc phân tách với các đầu dò liên kết với các trình tự chèn có một vài hạn chế, vìkhông phải tất cả các chủng MRSA đều có các trình tự chèn này Do đó, một sốchủng phân lập có thể không xác định được bằng cách này [64]

1.3.4 Phương pháp điện di trường xung (PFGE)

Kỹ thuật này được phát triển bởi Schwarz và Cantor, dựa trên sự phân cắtDNA của vi khuẩn bởi các endonuclease, tạo ra các đoạn DNA lớn (10-800 Kb) màkhông thể tách rời một cách hiệu quả bằng cách điện di thông thường Trong PFGE,hướng của điện trường trên gel được thay đổi định kỳ (xung), cho phép các đoạnDNA được phân tách hiệu quả theo kích thước [45] Do đó, PFGE cho phép so sánhDNA nhiễm sắc thể đơn giản hơn nhiều so với các phương pháp khác [64] Về mặt lýthuyết, tất cả các vi khuẩn có thể được phân loại bởi PFGE và kết quả có khả nănglặp lại cao [11]

PFGE đòi hỏi DNA nguyên vẹn và phải được bảo quản đặc biệt trong quátrình phân lập DNA Để tránh nguy cơ phá vỡ cơ học đối với các phân tử DNA trongquá trình tách chiết, mỗi mẫu được đưa vào agarose có điểm nóng chảy thấp, do đóbảo vệ DNA đồng thời cho các dung dịch tự do hoạt động để ly giải thành tế bào vàthủy phân protein tế bào DNA được tách chiết sau đó được phân cắt bởi cácendonuclease giới hạn Các plug agarose chứa DNA đã được phân cắt sau đó được

điện di dưới trường xung (PFGE) [45].

PFGE đã được sử dụng để phân tích đa dạng S aureus và đã được so sánh với

các phương pháp khác trong một số nghiên cứu [15, 23] Mặc dù một sốendonuclease giới hạn đã được thử nghiệm, không có loại nào cho thấy hiệu suất tốthơn SmaI [46] Tất cả các chủng phân lập đều có thể phân tích được với enzyme này.PFGE có khả năng phân biệt bằng hoặc vượt trội so với các kỹ thuật phân tích kiểuhình cũng như các kỹ thuật phân tích kiểu gen như ribotyping, RAPD, PCR-RFLP vàPCR trình tự chèn IS256 PFGE có nhiều đặc điểm cho một kỹ thuật phân tích lý

tưởng và đã được đề xuất làm tiêu chuẩn vàng cho typing S aureus và xác định mối

quan hệ di truyền giữa các chủng Tuy nhiên, có những hạn chế đối với việc sử dụngPFGE, chẳng hạn như khoảng thời gian dài cho đến khi thu được kết quả cuối cùng

và thiết bị chuyên dụng được sử dụng cho kỹ thuật này [15,64]

1.3.5 Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

PCR đã tạo ra một loạt các kỹ thuật với nhiều ứng dụng, trong số đó, sự phânbiệt giữa các chủng vi khuẩn Các kỹ thuật liên quan đến PCR có thể được chia thànhbốn nhóm chính: PCR-RFLP, PCR-ribotyping, AP-PCR/RAPD và Rep-PCR Tuynhiên PCR-RFLP và PCR-ribotyping đã không còn đươc sử dụng nhiều để phân biệt

các chủng S aureus nữa [60].

Kỹ thuật PCR với đoạn mồi ngẫu nhiên (AP-PCR), hoặc RAPD (DNA đa hìnhđược nhân bản ngẫu nhiên) là một biến thể của PCR cổ điển để phân tích gen của visinh vật Kỹ thuật này bao gồm việc khuếch đại ngẫu nhiên các phân đoạn DNA đíchbằng cách sử dụng một đoạn mồi nhỏ (gồm 10 bazơ) với một chuỗi nucleotide tùy ý,nghĩa là một đoạn không tương đồng đã biết với trình tự đích Trong quá trình PCR,đoạn mồi này bắt cặp với DNA vi khuẩn dẫn đến sự khuếch đại của một hoặc nhiềuchuỗi DNA, tạo ra một tập hợp đặc trưng các đoạn, có thể sử dụng như các dấu hiệu

di truyền Kỹ thuật này không yêu cầu phải cắt DNA, bởi vì các mảnh khác nhau cókích thước khác nhau có thể được tạo ra trong quá trình PCR Số lượng và kích thướccủa các mảnh này là cơ sở để phân tích so sánh [60]

Một kỹ thuật khác, kỹ thuật Rep-PCR sử dụng các đoạn mồi dựa trên trình tựngắn của các yếu tố lặp lại được phân bố trên hệ gen của vi khuẩn Những yếu tố nàydường như được bảo tồn trong một số chi và loài vi khuẩn Theo cách này, các đoạn

thu được và sự khác biệt giữa kích thước các băng thể hiện tính đa hình trong khoảngcách giữa các yếu tố lặp đi lặp lại của các bộ gen khác nhau Kỹ thuật này đã được sử

dụng để phân biệt các chủng vi khuẩn, bao gồm Staphylococcus aureus [36].

1.3.6 Multilocus Sequence Typing (MLST)

MLST là một kỹ thuật phân tích nhiều locus Một số locus được chọn cho mỗiloài, thường là đoạn bên trong của gen quản gia (housekeeping gene), tạo ra các chuỗikhoảng 500 bp cho mỗi locus Các gen quản gia được chọn do thực tế là chúng luônluôn có mặt trong một loài nhất định và vẫn có sự biến đổi đủ trong loài để đảm bảonhiều alen của locus đó [60]

Ưu điểm của MLST là khả năng phân biệt giữa các chủng cao cùng với lượng

dữ liệu alen lớn Tuy nhiên, một bất lợi của MLST là chi phí cao và yêu cầu các thiết

bị cần thiết của nó Điều này đã làm hạn chế việc sử dụng phương pháp MLST đểđiều tra dịch tễ học Gần đây, các nhà khoa học đang dần ứng dụng MLST vào cácnghiên cứu do khả năng lặp lại cao và tiêu chuẩn hóa của nó nhưng do được côngnhận rộng rãi hơn, PFGE vẫn được cho là tiêu chuẩn vàng cho việc phân biệt

Staphylococcus aureus [60].

Nghiên cứu về độc tố tụ cầu bắt đầu từ việc phân tích các chủng S aureus có

liên quan đến các vụ ngộ độc thực phẩm và đã xác định được các chuỗi peptide gây racác triệu chứng ngộ độc Ngoài các độc tố ban đầu: SEA, SEB, SEC, SED, SEEngười ta đã tìm ra một loạt các độc tố khác SEs (SEG, SEH, SEI, SER, SES, SET) và

SEls (SElJ, SElK, SElL, SElM, SElN, SElO, SElP, SElQ, SElU, SElU2, và SElV)

[13] Với sự tiến bộ về khoa học, các nhà khoa học đã xác định được trình tự các gen

mã hóa cho các loại độc tố; giải trình tự genome một số chủng S aureus; xác định được các đảo gen gây bệnh của S aureus; xây dựng được đảo gen gây bệnh nhân tạo của S aureus nhằm mô tả hoạt động của các độc tố với mục đích ứng dụng trong các

lĩnh vực khác [13]

S aureus enterotoxin có thể được phát hiện trên cơ sở ba loại phương pháp:

sinh học, sinh học phân tử và hoặc kỹ thuật miễn dịch Phản ứng chuỗi polymerase(PCR), RT-PCR và RT-qPCR có thể được thực hiện để đánh giá độc lực của chủng

[32] Xét nghiệm miễn dịch enzyme và xét nghiệm huỳnh quang liên kết với enzyme

là phương pháp miễn dịch được sử dụng phổ biến nhất dựa trên việc sử dụng khángthể đa dòng hoặc kháng thể đơn dòng Những kỹ thuật sinh học phân tử cung cấpphương tiện để theo dõi các chủng liên quan đến dịch tễ học có thể theo dõi trở lạinguồn gốc của ô nhiễm [34] Tuy nhiên, các phương thức này có sự khác biệt trongkhả năng phân biệt giữa các chủng và điều này có thể được cải thiện bằng cách kếthợp các phương thức [65] Phương pháp dựa trên sinh học phân tử cung cấp thông tin

về nguồn gây ô nhiễm (nguồn gốc của người hoặc động vật) PFGE và spa-typing có

thể được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp để thu thập thông tin liên quan đến nguồn gốc

của nhiễm S aureus [32].

Sau những thành công về điều tra dịch tễ học, các nhà khoa học đang không

ngừng tìm tòi, phát triển kỹ thuật để phù hợp với sự biến đổi nhanh chóng của S.

aureus Một loạt các kỹ thuật điện di trường xung điện (PFGE), spa-typing, phân loại

gen độc tố…đã xác định được sự đa dạng di truyền của các chủng S aureus trong các

trường hợp nghiên cứu khác nhau: phân lập, đánh giá mối quan hệ di truyền được hơn

309 chủng S aureus kháng methicillin (MRSA) và các chủng tụ cầu ở mũi [13]; 152

chủng tụ cầu từ trâu, bò, cừu và dê ở Pháp [28] Kỹ thuật điện di trường xung(PFGE) là tiêu chuẩn vàng để phân biệt các chủng tụ cầu trong việc điều tra dịch tễ

học Trong vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus tại Nhật Bản, PFGE đã phân biệt được

các chủng tụ cầu gây bệnh tại các quận khác nhau, cho thấy sự phân bố rộng rãi củacác chủng, giúp chẩn đoán chính xác nguyên nhân, có ý nghĩa trong điều tra dịch tễhọc [51]

Tại Việt Nam cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học về tụ cầu củamột số nhóm tác giả.Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu này vẫn chỉ dừng lại ởmức độ tìm hiểu đặc tính của chúng, xác định các kiểu gen độc tố mà chưa đi sâu vàoviệc đánh giá mối quan hệ di truyền của chúng Kỹ thuật PFGE là một kỹ thuật tươngđối mới ở Việt Nam, tuy đã được áp dụng để nghiên cứu dịch tễ học trên một số

chủng như Salmonella nhưng hiện vẫn chưa có nhóm nghiên cứu nào áp dụng kỹ

thuật PFGE để điều tra dịch tễ, đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng

Staphylococcus aureus.