Gần đây,tổng hợp các kết quả nghiên cứu về sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trướcchuyển phôi preimplantation genetic screening - PGS cho thấy tỷ lệ chuyểnphôi, có thai tăng lên đáng kể.Để
Trang 1NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN
MỐI LIÊN QUAN GIỮA MỘT SỐ YẾU TỐ NGUY CƠ VÀ TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN NHIỄM SẮC THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI
ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH
HÀ NỘI - 2016
Trang 2NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN
MỐI LIÊN QUAN GIỮA MỘT SỐ YẾU TỐ NGUY CƠ VÀ TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN NHIỄM SẮC THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI
Chuyên ngành : Sản Phụ khoa
ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1 GS.TS Nguyễn Viết Tiến
2 PGS.TS Nguyễn Duy Bắc
HÀ NỘI - 2016
Trang 3Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
BÀI LUẬN VỀ DỰ ĐỊNH NGHIÊN CỨU
Họ và tên thí sinh: Nguyễn Thị Bích Vân
Cơ quan công tác: Bộ môn Phụ Sản, Đại học Y Hà Nội
Chuyên ngành dự tuyển: Sản phụ khoa Mã số: 62720131
Đề tài đăng ký dự tuyển: Mối liên quan giữa một số yếu tố nguy cơ và tình
trạng đột biến nhiễm sắc thể trước chuyển phôi
Cách đây đúng ba mươi năm khi lần tiên đặt chân vào trường chuyêncủa thành phố Hà Nội Amsterdam, trở thành một thành viên của lớp chuyênSinh tôi đã biết mơ ước duy nhất của mình lúc đó là được trở thành 1 sinhviên của Đại học Y Hà Nội Tôi đã nuôi dưỡng và xây dựng cho mơ ước đótrở thành hiện thực vào tháng 9 năm 1989 Sáu năm trôi qua, con đường say
mê lại tiếp tục được nối dài với 3 năm nội trú bệnh viện trong chuyên ngànhSản Những đêm trực dài, những ca mổ khó khăn chưa bao giờ làm nguôi đitình yêu với một công việc mà tôi đã quyết tâm gắn bó cả cuộc đời Niềm vuilớn nhất có lẽ là ngày tôi được nhận quyết định tuyển dụng của nhà trường
Và bây giờ khi tiếp tục con đường nghiên cứu khoa học thì Đại học Y Hà Nộicũng là lựa chọn duy nhất mà tôi hướng tới
Cũng như bất cứ người phụ nữ nào, tôi hiểu mang thai và làm mẹ làthiên chức của mỗi người Tuy nhiên không phải cặp vợ chồng nào cũng cóđược niềm hạnh phúc dản dị mà lớn lao đó Thực tế cho thấy có khoảng 5 –10% các cặp vợ chồng mắc vô sinh do nhiều nguyên nhân khác nhau Có rất
Trang 4cung và thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) là một bước phát triển vượt bậcmang lại niềm hy vọng cho rất nhiều gia đình hiếm muộn.
Với gần 20 năm công tác trong lĩnh vực Sản khoa và hơn 5 năm làmviệc tại trung tâm chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương, chúngtôi nhận thấy tỷ lệ có thai trung bình của phương pháp này chỉ từ 30-35%.Mặc dù đã được chuyển những phôi có chất lượng tốt nhưng tỷ lệ có thai củaIVF vẫn thấp Nguyên nhân chính là do rối loạn nhiễm sắc thể cao ở trứnghoặc ở phôi Rối loạn nhiễm sắc thể cũng dẫn tới sảy thai, thai lưu và dị tậtthai nhi Tần suất rối loạn nhiễm sắc thể cao trong quá trình chuyển phôi đãđặt ra yêu cầu phải sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể đối với phôi trước khichuyển vào tử cung của người phụ nữ
Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản được kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tửtrong chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi ở những bệnh nhân có nguy cơcao đối với bệnh lý đơn gen, rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể Chẩn đoán rốiloạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi giúp sàng lọc phôi, đánh giá rối loạncấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể của phôi trước khi chuyển phôi
Hiện nay, có nhiều kỹ thuật giúp sàng lọc 24 cặp nhiễm sắc thể trênmột tế bào như aCGH, SNP, QF-PCR Kỹ thuật aCGH là kỹ thuật đầu tiênđược sử dụng rộng rãi cho sàng lọc 24 cặp nhiễm sắc thể, tuy nhiên chi phírất cao
Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS)tạo ra cuộc cách mạng trong công nghệ sinh học NGS được ứng dụng trong
cả nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng Sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trướcchuyển phôi dựa trên kỹ thuật NGS khác rất nhiều so với các kỹ thuật khác.PGS-NGS thực hiện chỉ trên một vài tế bào phôi, dữ liệu chính xác, kỹ thuật
Trang 5như giảm chi phí giải trình tự, có khả năng đánh giá tổn thương cấu trúcnhiễm sắc thể, khả năng tự động hóa cao giúp giảm thiểu những sai sót trongquá trình thực hiện.
Áp dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong sàng lọc 24 nhiễm sắcthể ở phôi bước đầu được thực hiện nhưng chưa có đánh giá hiệu quả cụ thể
Vì vậy, việc nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả kỹ thuật NGS trongsàng lọc 24 nhiễm sắc thể trước chuyển phôi là rất cần thiết Thành công của
kỹ thuật này sẽ đem lại những hiệu quả về mặt ưu sinh học, cho ra đời nhữngđứa trẻ thông minh khỏe mạnh Là sự mong mỏi của bất cứ ông bố bà mẹ nào
Nhóm nghiên cứu dự kiến thực hiện đề tài này trong thời gian 2 năm,mẫu sẽ được lấy tại trung tâm công nghệ phôi Học viện Quân y và Trung tâm
Hỗ trợ sinh sản bệnh viện Phụ sản Trung ương với những tiêu chuẩn lựa chọnchi tiết dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Anh hùng lao động NguyễnViết Tiến, PGS.TS Nguyễn Duy Bắc là những chuyên gia hàng đầu tronglĩnh vực hỗ trợ sinh sản và sinh học phân tử
Tôi tin tưởng sẽ thực hiện được nghiên cứu trong khoảng thời gianngắn nhất với kết quả tốt nhất để nhanh chóng đưa kỹ thuật tiên tiến này vàoứng dụng thực tế lâm sàng
Trang 71 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
3.1 Rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi 4
3.1.1 Sự phát triển của phôi 4
3.1.2 Rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi và noãn 7
3.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến rối loạn nhiễm sắc thể 14
3.2 Phương pháp xác định rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi 18
3.2.1 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ 18
3.2.2 Phương pháp lai so sánh bộ gen 19
3.2.3 Phương pháp lai so sánh bộ gen dùng chíp DNA 20
3.2.4 Phương pháp phân tích đa hình đơn nucleotide dùng chíp DNA 21
3.2.5 Phương pháp phản ứng chuỗi Polymerase 21
3.2.6 Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới 21
3.3 Giá trị của PGS sàng lọc 24 nhiễm sắc thề trong IVF 22
4 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
4.1 Đối tượng nghiên cứu 25
4.2 Phương pháp nghiên cứu 25
4.2.1 Thiết kế nghiên cứu 25
4.2.2 Cách thức lựa chọn 26
4.2.3 Nội dung nghiên cứu 27
4.2.4 Kỹ thuật sinh thiết phôi 30
4.3 Xử lý số liệu 33
4.4 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 33
5 Chương 3 DỰ KIẾN KẾT QỦA 34
5.1 Đặc điểm của nhóm tham gia nghiên cứu 34
5.2 Kết quả sàng lọc NGS 36
6 Chương 4 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 38
6.1 Bàn luận về đặc điểm của các cặp BN vô sinh có nuy cơ cao 38
Trang 86.3 Bàn luận về đặc điểm thai nghén, tình trạng thai nghén và kết quả thai nghén ở 2 nhóm nghiên cứu 386.4 Bàn luận về kết quả ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới NGS 386.5 Bàn luận về so sánh KQ caryotpe và NGS 386.6 Bàn luận về giá trị sàng lọc 24 cặp NST bằng kỹ thuật NGS trước chuyển phôi 38
7 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 38
8 TÀI LIỆU THAM KHẢO
9 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU
Trang 9a-CGH : Phương pháp lai so sánh bộ gen dùng chíp DNA
(array –comparative genomic hybridization)
a-SNP : Phương pháp phân tích đa hình đơn nucleotide dùng chíp DNA
(array Single Nucleotide Polymorphism)
CGH : Phương pháp lai so sánh bộ gen
(comparative genomic hybridization)
FISH : Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ
(Fluorescence In Situ Hydridization)
ICSI : Tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn
(IntraCytoplasmic Sperm Injection)
IUI : Bơm tinh trùng vào buồng tử cung (Intra-Uterine Insemination)IVF : Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization)
NGS : Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing)NGS : Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới
(Next GenerationSequencing)
PCR : Phương pháp phản ứng chuỗi Polymerase
(Polymerase chain reaction)
PGD : Chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi
(Preimplantation genetic diagnosis)
PGS : Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi
(preimplantation genetic screening)
PGS : Sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi
(preimplantation genetic screening)
PGS : Sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi
(preimplantation genetic screening)
Trang 101 ĐẶT VẤN ĐỀ
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization-IVF) là kỹ thuật lấynoãn và tinh trùng kết hợp với nhau ở ngoài cơ thể, tạo thành phôi IVF làphương pháp điều trị hiệu quả nhất cho các cặp đôi hiếm muộn Tuy nhiên, tỷ
lệ chuyển phôi và có thai trung bình chỉ từ 30-35% Mặc dù đã được chuyểnphôi có chất lượng tốt nhưng tỷ lệ có thai của IVF vẫn thấp Nguyên nhânchính là tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể cao ở trứng hoặc ở phôi Rối loạn nhiễmsắc thể cũng dẫn tới sảy thai, thai lưu và dị tật thai nhi Tần suất rối loạnnhiễm sắc thể cao trong quá trình chuyển phôi đã đặt ra yêu cầu phải sàng lọcrối loạn nhiễm sắc thể đối với phôi trước khi chuyển vào tử cung của ngườiphụ nữ
Rối loạn nhiễm sắc thể ở noãn và phôi người thu được trong quá trìnhđiều trị thụ tinh trong ống nghiệm đã được nêu lên từ lâu và rất nhiều nghiêncứu cũng đã công nhận là hiện tượng Rối loạn nhiễm sắc thể xẩy ra ở giaiđoạn trước khi làm tổ Rối loạn nhiễm sắc thể tăng theo tuổi, hơn một nửa sốnoãn thu được của phụ nữ trên bốn mươi tuổi có rối loạn nhiễm sắc thể Tỷ lệrối loạn nhiễm sắc thể càng tăng trên phôi của các cặp vợ chồng bị sẩy thailiên tiếp hoặc đã từng điều trị thụ tinh trong ống nghiệm hoặc bơm tinh trùngvào buồng tử cung (IUI/ Intra-Uterine Insemination) nhiều lần thất bại Phầnlớn các trường hợp, rối loạn nhiễm sắc thể gây ảnh hưởng đến sự sống và pháttriển của phôi
Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản được kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tửtrong chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi ở những bệnh nhân có nguy cơcao đối với bệnh lý đơn gen, rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể Chẩn đoán rốiloạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi giúp sàng lọc phôi, đánh giá rối loạncấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể của phôi trước khi chuyển phôi Phươngpháp này đã được áp dụng đối với các bệnh nhân có nguy cơ cao rối loạn
Trang 11nhiễm sắc thể và được ứng dụng trong lâm sàng để cải thiện tỷ lệ thành côngtrong điều trị vô sinh, đặc biệt với những cặp vợ chồng có tiên lượng xấu nhưtuổi mẹ cao, chuyển phôi thất bại nhiều lần và sảy thai liên tiếp Gần đây,tổng hợp các kết quả nghiên cứu về sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trướcchuyển phôi (preimplantation genetic screening - PGS) cho thấy tỷ lệ chuyểnphôi, có thai tăng lên đáng kể.
Để cải thiện tỷ lệ thành công của kỹ thuật IVF, giảm tỷ lệ sảy thai yêucầu phải sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trên toàn bộ bộ nhiễm sắc thể Kỹthuật này không xâm lấn, nhanh chóng, chi phí thấp, có thể áp dụng cho tất cảcác bệnh nhân Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence In SituHydridization – FISH) sử dụng những probe đặc hiệu cho những nhiễm sắcthể có tỷ lệ dị bội cao như 21, 18, 13, X, Y Tuy nhiên, các nghiên cứu chothấy sàng lọc trước chuyển phôi bằng kỹ thuật FISH không hiệu quả Nhiềuthử nghiệm lâm sàng có đối chứng ngẫu nhiên khẳng định sàng lọc bằng kỹthuật FISH không cải thiện tỷ lệ có thai, tỷ lệ sinh con sống Nguyên nhân cóthể do số lượng nhiễm sắc thể được sàng lọc và độ chính xác còn hạn chế
Hiện nay, có nhiều kỹ thuật giúp sàng lọc 24 nhiễm sắc thể trên một tếbào như aCGH, SNP, QF-PCR Kỹ thuật aCGH là kỹ thuật đầu tiên được sửdụng rộng rãi cho sàng lọc 24 cặp nhiễm sắc thể, tuy nhiên chi phí rất cao.Nhiều báo cáo khẳng định tỷ lệ có thai và sinh em bé khỏe mạnh cao hơn sovới sàng lọc bằng kỹ thuật FISH
Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS)tạo ra cuộc cách mạng trong công nghệ sinh học NGS được ứng dụng trong
cả nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng Sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trướcchuyển phôi dựa trên kỹ thuật NGS khác rất nhiều so với các kỹ thuật khác.PGS-NGS thực hiện chỉ trên một vài tế bào phôi, dữ liệu chính xác, kỹ thuậtphân tích đơn giản, các thiết bị đáng tin cậy và có giá thành hợp lý Sàng lọc
Trang 12rối loạn nhiễm sắc thể dựa trên kỹ thuật NGS tạo ra nhiều lợi ích hơn aCGHnhư giảm chi phí giải trình tự, có khả năng đánh giá tổn thương cấu trúcnhiễm sắc thể, khả năng tự động hóa cao giúp giảm thiểu những sai sót trongquá trình thực hiện.
Ở Việt Nam, kỹ thuật FISH bước đầu áp dụng tại Bệnh viện Phụ sảnTrung ương, Bệnh viện Hùng Vương, Học viện Quân y Tuy nhiên hiệu quảcủa việc sàng lọc thấp do hạn chế về số lượng nhiễm sắc thể được sàng lọc.Xác định các yếu tố liên quan tới rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi chưa đượcđánh giá Áp dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong sàng lọc 24 nhiễmsắc thể ở phôi bước đầu được thực hiện nhưng chưa có đánh giá hiệu quả cụthể Vì vậy, việc nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả kỹ thuật NGS trongsàng lọc 24 nhiễm sắc thể trước chuyển phôi là cần thiết
2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xác định một số yếu tố nguy cơ rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi thụ tinh ống nghiệm.
- Áp dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) trong sàng lọc 24 nhiễm sắc thể trước chuyển phôi ở cặp vợ chồng có nguy cơ cao.
- Đánh giá hiệu quả của của sàng lọc 24 nhiễm sắc thể trước chuyển phôi đối với thụ tinh trong ống nghiệm.
Trang 133 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.1 Rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi
3.1.1 Sự phát triển của phôi
* Phôi ở giai đoạn tiền nhân
Noãn được thụ tinh tạo thành hợp tử và phát triển thành phôi quanhiều giai đoạn, khởi đầu là giai đoạn tiền nhân Tiền nhân đực và tiền nhâncái thường hình thành cùng một lúc Tiền nhân đực hình thành gần vị trítinh trùng thâm nhập và tiền nhân cái hình thành ở cực bào tương có thoiphân bào [35] Khoảng 4 giờ sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương củanoãn hoặc 5-6 giờ sau cấy noãn với tinh trùng có thể nhìn thấy hình ảnhcác tiền nhân có kích thước nhỏ và mờ Khoảng 15 giờ sau khi thụ tinh, cáchạt nhân (nucleoli) sẽ di chuyển và xếp hàng cạnh vùng tiếp xúc hai tiềnnhân Mỗi tiền nhân có khoảng 1 đến 9 hạt nhân
* Phôi ở giai đoạn phân chia
- Sự phân chia bào tương
Sự phân chia của phôi bao gồm một loạt các chu kỳ phân bào của bàotương, mặc dù kích thước phôi thay đổi không đáng kể Trung thể của tinhtrùng kiểm soát sự phân chia đầu tiên sau thụ tinh [6]
Trong chu kỳ phân bào đầu tiên ở giai đoạn cuối, bào tương của hợp tửkéo dài ra và thắt lại dần ở giữa cho đến khi hợp tử phân chia thành hai phôibào Trong 3 chu kỳ phân bào đầu tiên, kích thước của phôi thường ít thayđổi Phôi có 2 đến 8 phôi bào phụ thuộc chủ yếu vào sự dịch mã(translation) từ các chất liệu RNA của mẹ để phân chia [34]
- Tốc độ phân chia của phôi.
Tốc độ phân chia có liên quan đến khả năng sống của phôi Phôi phânchia chậm thường có khả năng làm tổ kém hơn Tốc độ nhân đôi tế bào ở
Trang 14phôi người từ ngày 2 đến 6 sau thụ tinh là khoảng 31 giờ, tốc độ nhân đôinày càng nhanh hơn sau hai lần phân chia đầu [34] Phôi tạo ra trong ốngnghiệm thường có tốc độ nhân đôi dưới 24 giờ Phôi khỏe mạnh có tốc độphân chia vào khoảng 18-20 giờ (2 phôi bào sau 24 giờ thụ tinh, 4 phôi bàosau dưới 48 giờ và 8 phôi bào hoặc hơn trước 72 giờ).
Phôi có 3 tiền nhân có thể phân chia với tốc độ nhanh hơn cho đến giaiđoạn phôi dâu và sau đó thường ngừng phát triển Những hợp tử này có thoiphân bào có cực phân chia thành 3 phôi bào ở giai đoạn phân chia đầu tiêndẫn đến phôi có nhiều phôi bào hơn sau phân chia chứ không phải làphôi phát triển nhanh hơn
Hình 1.1: Sự phát triển của phôi ngày 2 và 3 (từ trái qua phải: phôi có 2
phôi bào, 4 phôi bào, 6 phôi bào và 8 phôi bào) (Nguồn: RRFC)
* Phôi dâu (phôi ngày 4).
Ở người phôi dâu bắt đầu hình thành khi phôi ở giai đoạn 8 phôi bào
và bắt đầu quá trình kết đặc Quá trình phôi kết đặc là một quá trình hìnhthành các liên kết chặt chẽ giữa các phôi bào, phần phôi bào tiếp xúc vớinhau tăng lên và dàn phẳng ra tạo thành một khối không nhìn rõ các ranh giớigiữa các phôi bào, bề mặt của phôi được phủ một lớp vi nhung mao(microvilli) Các phôi bào hoặc mảnh vụn tế bào mà không hình thành liênkết với các phôi bào khác sẽ bị đẩy ra ngoài khối phôi nhưng vẫn ở phíatrong màng trong suốt cho tới khi phôi thoát màng [17] Khi phôi bắt đầukết đặc lại, các phôi bào tương tác với nhau làm các phôi bào không còn đặctính toàn năng (totipotency) nữa và đây là sự khởi đầu cho sự sao mã DNAcủa phôi
Trang 15Hình 1.2: Phôi dâu ngày 4 (từ trái qua phải: các phôi bào bắt đầu kết đặc ở
vài điểm nhưng vẫn nhìn rõ ranh giới giữa các phôi bào; các phôi bào kếtđặc nhưng thấy ranh giới ở góc 9-12 giờ, có nhiều nhân; kết đặc hoàn toàn
không rõ ranh giới các phôi bào) (Nguồn: RRFC)
Dưới kính hiển vi, hình thái của phôi dâu được thể hiện bằng sựtăng tiếp xúc giữa các phôi bào, nhưng ranh giới giữa các phôi bào còn nhìnthấy Khi quá trình kết đặc tăng dần, ranh giới giữa các phôi bào trở nên khóphân biệt do các phôi bào dàn phẳng ra và kết liền với nhau Phôi dâu lúc
ở giai đoạn này hoàn toàn trông như một tế bào có nhiều nhân (hình 1.2).Phôi dâu ở người có thể xuất hiện sớm khoảng 65 giờ sau thụ tinh, nhưngthường xuất hiện giữa ngày thứ 3 và thứ 4 sau thụ tinh [16]
* Phôi nang (phôi ngày 5-6).
Sau khi phôi kết đặc, phôi bắt đầu lớn dần và tạo nang dịch bên trong(hình 1.3) tạo điều kiện cho sự phát triển để phôi bào biệt hóa thànhnguyên bào lá nuôi và mầm phôi Quá trình tạo nang bao gồm sự tích lũydịch vận chuyển bởi các nguyên bào lá nuôi Để hoàn thành quá trình này,nguyên bào lá nuôi đầu tiên phụ thuộc vào sự hoàn thành quá trình phâncực tế bào và hình thành mối liên kết chặt giữa các nguyên bào lá nuôi Sựliên kết và vị trí các phôi bào trong phôi kiểm soát sự phân cực tế bào
Hình 1.3: Phôi giai đoạn tạo nang/ cavitation (từ trái qua phải: xuất hiện
khe dịch ở góc 2 giờ; các khe dịch lớn dần, nhiều lên, khe dịch chiếm dưới
1/2 thể tích phôi) (Nguồn: RRFC)
Trang 163.1.2 Rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi và noãn
3.1.2.1 Rối loạn nhiễm sắc thể
Hiện tượng rối loạn nhiễm sắc thể là hiện tượng số lượng nhiễm sắc thểcủa tế bào tăng lên hoặc giảm đi một hoặc vài nhiễm sắc thể so với bộ nhiễmsắc thể lưỡng bội Mất cân bằng về nhiễm sắc thể sẽ dẫn đến tình trạng phôingừng phát triển trước khi làm tổ, sẩy thai hoặc thai chết lưu Tuy nhiên, phôi
bị rối loạn nhiễm sắc thể có thể sống nhưng phát triển thành thai bất thườngnhư trong trường hợp hội chứng Down hoặc hội chứng Klinefelter Rối loạnnhiễm sắc thể là yếu tố quan trọng làm cho tỷ lệ sinh sản ở người thấp
Hơn 50 năm trôi qua kể từ những ca đầu tiên phát hiện tình trạng rốiloạn nhiễm sắc thể, các nhà khoa học trên thế giới đã thu thập được nhiềuthông tin về nguồn gốc cũng như nguyên nhân gây ra tình trạng rối loạnnhiễm sắc thể Nhiều nghiên cứu đã thấy rằng phôi người ở giai đoạn sớmthường có rối loạn nhiễm sắc thể và trên 50% phôi tạo ra trong ống nghiệm cóchứa phôi bào bị rối loạn nhiễm sắc thể Bất thường về nhiễm sắc thể dẫn đếnkết quả không tốt như phôi không làm tổ được, sẩy thai và sinh ra những đứatrẻ bị Trisomy Những hiểu biết về cơ chế, nguồn gốc cũng như những yếu tốảnh hưởng đến hiện tượng rối loạn nhiễm sắc thể sẽ góp phần làm tăng hiệuquả của việc điều trị thụ tinh trong ống nghiệm một cách đáng kể
Rối loạn nhiễm sắc thể là hiện tượng đặc biệt hay gặp ở giao tử và phôingười do sự sai lệch trong phân ly của nhiễm sắc thể Cơ chế được bàn đếnnhiều nhất là hiện tượng không phân ly (non-disjunction) Tuy nhiên, trongnhững năm gần đây vấn đề này được nghiên cứu nhiều và các cơ chế mới đãđược đề xuất
Một số nghiên cứu cho rằng gần một nửa noãn người là bị rối loạnnhiễm sắc thể, tỷ lệ này tăng lên đáng kể khi người phụ nữ trên 35 tuổi [30].Ngược lại, tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở tinh trùng của nam giới có khả năng
Trang 17sinh sản bình thường là tương đối thấp 4-7% [41] Tuy nhiên, tỷ lệ này có thểtăng đáng kể trong một số trường hợp vô sinh nam nặng.
Tình trạng rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi tạo ra trong ống nghiệm hoặcphôi tạo ra tự nhiên trong cơ thể chủ yếu xảy ra trong 3 giai đoạn phát triểnđầu tiên: giai đoạn trước phân bào giảm nhiễm tạo giao tử; trong quá trìnhphân bào giảm nhiễm tạo giao tử và trong giai đoạn phân bào sớm của phôi.Những hiểu biết về cơ chế gây nên hiện tượng rối loạn nhiễm sắc thể ở nhữnggiai đoạn này giúp chúng ta hiểu thêm về những hạn chế của phương phápsàng lọc trước chuyển phôi khi ứng dụng trên lâm sàng và tìm ra các biệnpháp cải tiến
* Rối loạn nhiễm sắc thể do yếu tố nội tại, tế bào sinh dục gốc thểkhảm: Những sai lệch trong quá trình tế bào sinh dục gốc (germ cell) phânchia dẫn đến tình trạng rối loạn nhiễm sắc thể thể khảm ở tế bào gốc dẫn đếnhình thành rối loạn nhiễm sắc thể ở giao tử Đây là giai đoạn ít được quan tâm
và nghiên cứu nhất Trong tất cả các trường hợp, kết quả là tạo ra giao tử cónhiều hoặc ít hơn về số lượng nhiễm sắc thể
* Rối loạn nhiễm sắc thể sinh ra trong quá trình phân bào: Trongtrường hợp này tế bào gốc bình thường nhưng nhiễm sắc thể bị thay đổi xảy
ra trong quá trình phân bào Trong phân bào giảm nhiễm, những sai lệch trongviệc phân chia nhiễm sắc thể trong giai đoạn này sẽ tạo ra giao tử bị rối loạnnhiễm sắc thể và sự hợp nhất giao tử bị rối loạn nhiễm sắc thể sẽ tạo ra phôi
bị rối loạn nhiễm sắc thể Ở người, những sai lệch trong quá trình phân bàonguyên nhiễm thường xảy ra khi phôi ở giai đoạn phân chia sớm, các phôibào còn có xu hướng phân chia sai lệch Hầu hết sự sai lệch trong phân bàonguyên nhiễm ở phôi giai đoạn đầu sẽ dẫn đến tạo ra phôi thể khảm nghĩa làphôi có ≥2 dòng phôi bào có thành phần nhiễm sắc thể khác nhau Có ba giảthiết về cơ chế gây nên rối loạn nhiễm sắc thể trong phân bào nguyên nhiễm:
Trang 18(1) thiếu nhiễm sắc thể do sự chậm trễ của kỳ sau (anaphase); (2) sự nhân lêncủa một nhiễm sắc thể (cơ chế vẫn chưa được hiểu rõ); (3) nhiễm sắc thểthiếu, thừa tương ứng (recỉprocal chromosome loss and gain) do nhiễm sắcthể không phân ly hoặc giai đoạn kỳ sau bị ngừng trệ tạo nên một phôi bàothiếu nhiễm sắc thể và một phôi bào thừa nhiễm sắc thể tương ứng.
* Lệch bội thể sinh ra do những bất thường trong thụ tinh: Khoảng 1%thai có bộ nhiễm sắc thể lớn hơn 2n do bộ nhiễm sắc thể được tăng một sốchẵn hoặc lẻ lần và được gọi là đa bội Có 3 cơ chế dẫn đến hiện tượng đa bội(1) tinh trùng hoặc noãn lưỡng bội tham gia vào quá trình thụ tinh; (2) hai haynhiều tinh trùng tham gia vào quá trình thụ tinh; (3) sự tồn lại của cực cầu 2(second polar body retention) 60% các trường hợp đa bội là do thụ tinh vớinhiều tinh trùng [8]
Phôi thể khảm có thể chứa dòng phôi bào bình thường và dòng phôibào bất thường, hoặc có thể chứa các dòng phôi bào bất thường khác nhau Tỷ
lệ phôi thể khảm thay đổi từ 15% lên đến trên 90% [15] Một trong những lý
do khiến tỷ lệ phôi thể khảm chênh lệch khá nhiều ở các nghiên cứu khácnhau là do tiêu chuẩn xác định phôi thể khảm được sử dụng khác nhau Ví dụ,trong nghiên cứu của Baart và cộng sự (2006), và nghiên cứu của Ziebe vàcộng sự (2003), phôi được cho là bình thường mặc dù vẫn có mặt một sốlượng nhỏ phôi bào bất thường trong phôi [53] Các tác giả này cho rằngnhững phôi này vẫn có khả năng phát triển bình thường
Trang 19Một nguyên nhân khác là nhiều nghiên cứu về phôi thể khảm được tiếnhành trên những phôi thừa, không được sử dụng để chuyển phôi hoặc dự trữđông lạnh, những phôi này thường có chất lượng kém hơn Van Echten-Arends năm 2011 phân tích tổng hợp (meta-analysis) 36 nghiên cứu riêng lẻ
về hiện tượng phôi thể khảm ở ngày 3, thấy rằng trong tổng số 815 phôi thừa,chỉ có 177 (22%) phôi là bình thường, 599 (73%) phôi thể khảm và 39 (5%)phôi có chứa các bất thường nhiễm sắc thể khác Trong số các phôi thể khảm,
480 phôi (59% tổng số 815 phôi nghiên cứu) có chứa cả dòng phôi bào bìnhthường và dòng phôi bào bất thường [7]
Đồng thời phương pháp nghiên cứu di truyền, số lượng nhiễm sắc thểđược đánh giá cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ phôi thể khảm Tỷ lệ phôi bìnhthường thấp hơn và tỷ lệ phôi thể khảm có chứa dòng phôi bào bình thường
và bất thường cao hơn khi nhiều nhiễm sắc thể được đánh giá Đánh giá toàn
bộ 23 cặp nhiễm sắc thể bằng phương pháp a-CGH sẽ có tỷ lệ rối loạn nhiễmsắc thể và thể khảm cao hơn khi dùng phương pháp FISH Tỷ lệ phôi thểkhảm cao ở hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng những sai sót trong phân bàorất thường gặp ở phôi người giai đoạn trước chuyển phôi
Quá trình kích thích buồng trứng và điều kiện nuôi cấy phôi có thể gâyhiện tượng phôi thể khảm Kết quả nghiên cứu của Bean và cộng sự (2002) vàcủa Baart và cộng sự (2007) thấy rằng kích thích buồng trứng quá mạnh cũngnhư nuôi cấy phôi trong điều kiện nồng độ oxygen cao có ảnh hưởng đến tỷ lệphôi thể khảm [1], [13]
Phôi thể khảm thường phát triển chỉ đến giai đoạn phôi dâu và ngừngkhông phát triển đến giai đoạn phôi nang Baart và cộng sự nghiên cứu 12phôi dâu tan đông thấy là cả 12 phôi đều là phôi thể khảm Santos và cộng sựnghiên cứu 18 phôi dâu, và công bố là tỷ lệ phôi thể khảm giảm từ 83% trongngày 4 xuống còn 42% ở phôi nang ngày 5 [38]
Trang 203.1.2.3 Tỷ lệ lệch bội của phôi và noãn
- Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở noãn
Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở noãn tương đối cao và tăng dần ở phụ nữlớn tuổi Munne và cộng sự sử dụng phương pháp FISH cho 7 cặp nhiễm sắc thể(13, 15, 16, 18, 21, 22, XY) để nghiên cứu cực cầu I ở 226 bệnh nhân (26-47tuổi, trung bình 38,2 tuổi) thấy là tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở nhóm dưới 35tuổi là 50%; 35-39 tuổi là 60% và trên 40 tuổi là 66,7%) (Munne et al., 2012)
Sher và cộng sự khi sử dụng phương pháp CGH cho noãn của phụ nữdưới 35 tuổi thấy 64% bị rối loạn nhiễm sắc thể Noãn bị rối loạn nhiễm sắcthể sẽ dẫn tới phôi bị rối loạn nhiễm sắc thể 80% noãn bình thường sau thụtinh sẽ dẫn tới phôi bình thường và 87% phôi không phát triển thành phôinang là bị rối loạn nhiễm sắc thể (Sher et al., 2007)
- Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở tiền nhân
Giannaroli và cộng sự 2003, dùng phương pháp FISH 8 dầu dò (X, Y,
13, 15, 16, 18, 21, 22) kiểm tra 496 phôi thấy tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể là70% Các phôi có tiền nhân nằm cách xa nhau, có kích thước khác nhau nhiềuhoặc có hạt nhân nhỏ nằm rải rác có liên quan đến tốc độ phát triển chậm, vàtăng tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể (Gianaroli et al., 2003)
Chen và cộng sự 2003 sử dụng phương pháp FISH cho nhiễm sắc thể
18, X, Y đánh giá hình thái của tiền nhân theo tiêu chuẩn của Scott thấy là tỷ
lệ phôi ngày 3 bình thường ở Z1=71%; Z2=54%, Z3-4=35% Đánh giá tiềnnhân có giá trị chọn lọc hiệu quả phôi có số lượng nhiễm sắc thể bình thường,đặc biệt là phôi có điểm Z1 (phôi tốt nhất) (Chen et al., 2003)
Balaban và cộng sự năm 2004 sử dụng phương pháp FISH 5 đầu dò(13, 18, 21, X, Y) kiểm tra 267 phôi thấy tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể nóichung là 69,2% và kết luận hình thái của tiền nhân có giá trị tiên lượng khảnăng phát triển của phôi và là chỉ báo rối loạn nhiễm sắc thể Tỷ lệ rối loạn
Trang 21nhiễm sắc thể ở phôi có tiền nhân bình thường là 25,6%, tỷ lệ này là 73% và83% tương ứng lần lượt với phôi có 1 tiền nhân bất thường và phôi có hai tiềnnhân bất thường (Balaban et al., 2004).
- Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi ngày 3
Sau khi thụ tinh phôi thường được nuôi cấy thêm khoảng 3 ngày (giaiđoạn phân chia) đến 5-6 ngày (giai đoạn phôi nang) Trên 50% phôi tạo ratrong ống nghiệm ở giai đoạn phân chia có rối loạn nhiễm sắc thể, tỷ lệ nàytăng lên đến trên 80% ở phụ nữ lớn tuổi Năm 2012 Al-Asmar và cộng sựdùng phương pháp FISH 9 đầu dò (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, XY) đánh giá
393 phôi ngày 3 của 70 bệnh nhân có tuổi trung bình 34,6 có tiền sử sẩy thai
bị rối loạn nhiễm sắc thể (thai tự nhiên hay thai tạo ra trong IVF), tỷ lệ rốiloạn nhiễm sắc thể là 67,8% Nhiễm sắc thể có tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thểcao là 16 và 22 (Al-Asmar et al., 2012)
Rabinowitz và cộng sự năm 2012 sử dụng phương pháp a-SNP đánhgiá 274 phôi ngày 3 của 32 phụ nữ (tuổi từ 26-47, trung bình 38) nêu tỷ lệ rốiloạn nhiễm sắc thể là 72,3%, tỷ lệ này là 65,7% và 76,2% tương ứng lần lượtvới phụ nữ ≤36 tuổi và trên 36 trong đó 19,7% một nhiễm sắc thể bị ảnhhưởng, 52,5% nhiều nhiễm sắc thể bị ảnh hưởng Trong thử nghiệm lâm sàngngẫu nhiên của Rubio và cộng sự năm 2013 sử dụng phương pháp FISH với 9đầu dò 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22 và XY nghiên cứu 265 phôi ngày 3 của 91phụ nữ có phôi không làm tổ liên tiếp (tuổi trung bình 35,2), và 485 phôi của
93 phụ nữ lớn tuổi (41-44 với tuổi trung bình là 41,8), tỷ lệ rối loạn nhiễm sắcthể tương ứng là 57,3% và 69,2% Trong nghiên cứu này nhiễm sắc thể bị ảnhhưởng nhiều nhất ở phụ nữ bị phôi không làm tổ liên tiếp lần lượt là 22, 13,
16, 21, 18, XY, 15 và 17, và ở nhóm phụ nữ lớn tuổi là 22, 16, 21, 15, 13, 18,
17 và XY (Rabinowitz et al., 2012)
Trong một nghiên cứu khác của Rubio và cộng sự năm 2013 sử dụng
Trang 22phương pháp a-CGH kiểm tra phôi của 556 bệnh nhân có tiền sử sảy thai liêntiếp, phôi không làm tổ liên tiếp, vô sinh nam, và phụ nữ lớn tuổi, thấy tỷ lệrối loạn nhiễm sắc thể là 73,5%.
Ở Việt Nam sàng lọc phôi trước chuyển phôi đang bắt đầu phát triển,trong một nghiên cứu sơ bộ bước đầu đánh giá kết quả sàng lọc trước chuyểnphôi, Nguyễn Viết Tiến và cộng sự năm 2014 sử dụng phương pháp FISHđánh giá 5 nhiễm sắc thể 13, 18, 21, XY đã công bố tỷ lệ rối loạn nhiễm sắcthể của 37 phôi ngày 3 là 45,9%, hay gặp nhất ở nhiễm sắc thể 21, thấp nhất ởnhiễm sắc thể giới tính và nhiễm sắc thể (Minh, 2014) Trong một nghiên cứukhác của Hoàng Thị Hương và cộng sự năm 2014, cũng sử dụng phương phápFISH 5 đầu dò cho 127 phôi ngày 3 có 6-8 phôi bào, thấy tỷ lệ rối loạn nhiễmsắc thể là 46,4%, hay gặp nhất là nhiễm sắc thể 21, sau đó là 13 và thấp nhất
là nhiễm sắc thể giới tính (Hoàng Thị Hương, 2014) Một nghiên cứu kháccủa Nguyễn Đình Tảo, Trần Văn Khoa, Hoàng Văn Lương và cộng sự cũngcho thấy tỷ lệ phôi bị rối loạn nhiễm sắc thể khá cao
- Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi nang
Mặc dù một số phôi bất thường ngừng phát triển từ giai đoạn ngày 3
và 5 nhưng phần lớn vẫn phát triển đến giai đoạn phôi nang Ở giai đoạnphôi nang, trên 40% phôi bị rối loạn nhiễm sắc thể, tỷ lệ này tăng cùng vớituổi mẹ
Schoolcraft và cộng sự năm 2010, sử dụng phương pháp CGH trên 269phôi nang của 45 bệnh nhân có tuổi trung bình là 37 tuổi thấy tỷ lệ rối loạnnhiễm sắc thể là 51,3% (Schoolcraft et al., 2010)
Fragouli và cộng sự năm 2010 cũng sử dụng phương pháp CGH ởnhóm bệnh nhân tuổi trung bình 39,8 thấy tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở phôinang là 45,2% (Fragouli et al., 2010)
Trang 23Traversa và cộng sự năm 2011, sử dụng phương pháp a-CGH thấy 43%phôi nang bị rối loạn nhiễm sắc thể trong đó 55% rối loạn nhiễm sắc thể ở 1cặp nhiễm sắc thể, 41% ở 2 cặp và 7% phức tạp (≥3 cặp nhiễm sắc thể)(Schoolcraft et al., 2010).
3.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến rối loạn nhiễm sắc thể
3.1.3.1 Sự phát triển của phôi và tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể.
* Phôi ở giai đoạn phân chia
Rối loạn nhiễm sắc thể có liên quan với tốc độ phát triển của phôi Năm
1995 Munne và cộng sự sử dụng phương pháp FISH nghiên cứu nhiễm sắcthể của phôi thấy rằng phôi ngừng phát triển có tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thểcao hơn phôi phát triển bình thường (71% so với 29%), những rối loạn nhiễmsắc thể này sẽ làm cho phôi bào ngừng phân chia hoặc phân chia chậm, ảnhhưởng trực tiếp tới sự phát triển của phôi [27]
* Phôi ở giai đoạn phôi nang
Nhiều nghiên cứu nêu lên tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể ở giai đoạn phânchia và giai đoạn phôi nang như nhau khi dùng phương pháp FISH [28] Tuynhiên, một số nhà nghiên cứu khác lại thấy rằng Rối loạn nhiễm sắc thể cũngnhư tình trạng phôi thể khảm đều xuất hiện ở giai đoạn phôi nang nhưng tỷ lệthấp hơn so với phôi ở giai đoạn phân chia [4] Đặc biệt khi nghiên cứu sửdụng phương pháp a-CGH thấy tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể ở giai đoạn phôinang thấp hơn so với giai đoạn phân chia [9] Tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể ởgiai đoạn phôi nang thấp hơn là do phôi bị Rối loạn nhiễm sắc thể ở giai đoạnphân chia đã bị dừng phát triển trước khi đến được ngày 5
* Khả năng phát triển thành phôi nang của phôi Rối loạn nhiễm sắc thểngày 3
Phôi Rối loạn nhiễm sắc thể có khả năng phát triển thành phôi nangkém hơn phôi bình thường Năm 2000, Magli dùng phương pháp FISH kiểm
Trang 24tra 5 cặp nhiễm sắc thể (13, 18, 21, 22 và XY) thấy rằng 34,3% phôi có sốlượng nhiễm sắc thể bình thường phát triển đến giai đoạn phôi nang trong khi21,9% phôi lệch bội nhiễm sắc thể phát triển đến giai đoạn phôi nang.Khoảng 59% phôi bất thường ngày 3 ngừng phát triển so với 36% phôi bìnhthường (P<0,001) [21].
3.1.3.2 Hình thái phôi và tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể.
Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể có sự liên quan đến hình thái phôi bào Cácyếu tố như phôi bào không đồng đều; số lượng và tỷ lệ mảnh vụn trong phôi;
sự phân bố của các mảnh vụn trong phôi; số lượng nhân; kích thước noãn vàphôi; sự đồng đều của các phôi bào; hình thái của phôi nang; sự đồng nhất củabào tương… [29]
31.3.3 Hormon kích thích buồng trứng, sự đáp ứng của buồng trứng và tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể.
Mặc dù Rối loạn nhiễm sắc thể xuất phát từ quá trình tạo giao tử, tuynhiên quá trình kích thích hormone và đáp ứng của bệnh nhân có thể ảnhhưởng tới sự hình thành Rối loạn nhiễm sắc thể Các yếu tố ảnh hưởng như:bệnh nhân có đáp ứng kém với kích thích buồng trứng [22]; bệnh nhân có dựtrữ buồng trứng giảm [18] Bệnh nhân có quá mẫn buồng trứng: Sutterlin vàcộng sự năm 2003, nghiên cứu trên những bệnh nhân có quá mẫn buồngtrứng, tạo ra nhiều noãn, thấy rằng tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể cao hơn so vớinhóm chứng [42] Hơn nữa, quá mẫn buồng trứng thường tạo ra phôi có nhiềunhân [37] và tiền nhân không cân xứng [36] Cả 2 hiện tượng này đều có liênquan đến Rối loạn nhiễm sắc thể
3.1.3.4 Một số nguyên nhân gây vô sinh có liên quan đến tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể.
Theo Fasolino và cộng sự, nguyên nhân gây vô sinh có liên quanđáng kể với những rối loạn phân bào giảm phân dẫn đến Rối loạn nhiễmsắc thể ở phôi
Trang 25Tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể tăng đáng kể trong các trường hợp: thaiphụ bị lạc nội mạc tử cung, tác động của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trìnhphóng noãn và ở những phụ nữ có tiền sử sẩy thai Lạc nội mạc tử cung làmảnh hưởng đến chất lượng của noãn do làm thay đổi thành phần khung tế bào(cytoskeleton) [23] Tác giả cho rằng, lạc nội mạc tử cung ảnh hưởng xấu tớithoi phân bào và nhiễm sắc thể và điều này phù hợp với những ý kiến chorằng có mối liên quan giữa lạc nội mạc tử cung và sự hình thành giao tử bịRối loạn nhiễm sắc thể.
Ở phụ nữ có tiền sử bị sẩy thai, khả năng phôi bị Rối loạn nhiễm sắcthể cao hơn Điều này có thể giải thích là do ở những phụ nữ này, buồng trứng
có xu hướng bị già hóa, dẫn đến giảm số lượng noãn ở giai đoạn trưởng thành[19]
3.1.3.5 Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm ảnh hưởng đến tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể.
Ở giai đoạn phân chia, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến bộ nhiễm sắc thểcủa phôi, đặc biệt tỷ lệ phôi bị rối loạn nhiễm sắc thể khác nhau giữa cáctrung tâm thụ tinh trong ống nghiệm, nhưng đến nay có rất ít các nghiên cứu
đi sâu về vấn đề này Một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắcthể như phương pháp kích thích trứng, độ sáng, nhiệt độ, chất lượng nướcdùng trong phòng thí nghiệm, phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương củanoãn (IntraCytoplasmic Sperm Injection/ICSI), nồng độ FSH cơ bản và sự lựachọn bệnh nhân ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm sắc thể của phôi:
- Phương pháp sử dụng hormon kích thích
- Nhiệt độ và chất lượng của nước dùng trong phòng thí nghiệm
- Những yếu tố từ tinh trùng và phương pháp tiêm tinh trùng vào bàotương noãn
Trang 263.1.3.6 Các cặp nhiễm sắc thể và tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể.
Tần suất Rối loạn nhiễm sắc thể khác nhau tùy từng cặp nhiễm sắc thể.Tần suất Rối loạn nhiễm sắc thể cũng khác nhau tùy thuộc vào phương phápđánh giá phôi Các phương pháp cũ thường có độ nhậy thấp nên có tỷ lệ chẩnđoán âm tính giả cao, vì vậy các nghiên cứu trước đây đều nêu tỷ lệ Rối loạnnhiễm sắc thể thấp và tần suất Rối loạn nhiễm sắc thể trên các cặp nhiễm sắcthể sai khác nhiều so với kết quả của các phương pháp hiện đại
3.1.3.7 Tuổi mẹ và tỷ lệ Rối loạn nhiễm sắc thể
Một số nghiên cứu cho rằng ít nhất 20% noãn người là bị Rối loạnnhiễm sắc thể, tỷ lệ này tăng lên đáng kể khi người phụ nữ trên 35 tuổi [5].Nghiên cứu về di truyền trên noãn và cực cầu thứ nhất tạo ra trong ốngnghiệm thấy rằng trên 20% noãn của bệnh nhân dưới 35 tuổi là bị Rối loạnnhiễm sắc thể [11] Tỷ lệ noãn bị Rối loạn nhiễm sắc thể tăng đáng kể cùngvới tuổi của người phụ nữ Đối với phụ nữ lớn tuổi, tỷ lệ này trung bìnhkhoảng 70% [20], tuy nhiên các tác giả này cho rằng bất thường loại thể khảmthường không phụ thuộc vào tuổi, trong khi Munne lại cho rằng thể khảm là
do cơ chế không phân ly và có thể tăng lên cùng với tuổi mẹ tăng
3.1.3.8 Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến Rối loạn nhiễm sắc thể.
Yếu tố môi trường bao gồm các tác nhân tạo ra rối loạn nhiễm sắc thể
và đột biến gen của tế bào trong đó có Rối loạn nhiễm sắc thể Các tác nhânquan trọng bao gồm:
- Hút thuốc lá: Năm 2001, Shi và cộng sự công bố là các chất trongthuốc lá làm tăng tổn thương DNA của tinh trùng và làm giảm chất lượng tinhtrùng [40] Ở người mẹ hút thuốc lá, các tế bào sinh dục gốc có xu hướng bịnhiễm sắc thể không phân ly dẫn đến hình thành phôi thể khảm và Rối loạnnhiễm sắc thể ở bào thai và gây sẩy thai sớm [48]
Trang 27- Cocain: Có mối liên quan giữa thai phụ sử dụng cocain và thai bị dịtật về tim phổi và thần kinh do đột biến gen và rối loạn nhiễm sắc thể [2].
- Phóng xạ; tia X; tia α, tia tử ngoại: cũng liên quan đến dị tật bẩm sinh
và rối loạn nhiễm sắc thể
3.2 Phương pháp xác định rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi
Chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (PGD/ preimplantation geneticdiagnosis) là một kỹ thuật dùng để phát hiện những bất thường về chất liệu ditruyền của phôi tạo ra trong ống nghiệm trước khi chuyển phôi vào buồng tửcung.Chẩn đoán trước chuyển phôi được chỉ định khi hoặc bố mẹ hoặc cả hai
đã biết là có bất thường về di truyền và xét nghiệm được tiến hành trên phôi
để xem phôi có mang bất thường về di truyền hay không
Ngược lại, sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (PGS/preimplantation genetic screening) được chỉ định khi phôi tạo ra từ cặp vợchồng được xem là bình thường về nhiễm sắc thể nhằm kiểm tra những rốiloạn nhiễm sắc của phôi
Gần đây, tổng hợp các kết quả nghiên cứu về sàng lọc rối loạn nhiễmsắc thể trước chuyển phôi (preimplantation genetic screening - PGS) cho thấy
tỷ lệ chuyển phôi, có thai tăng lên đáng kể [38]
3.2.1 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescent in situ hybridization/FISH).
Phương pháp này được dùng để phát hiện hoặc định vị sự có mặt haykhông của một đoạn DNA nào đó trên nhiễm sắc thể Trong phương phápFISH người ta sử dụng đầu dò huỳnh quang đặc hiệu cho trạng thái của nhiễmsắc thể gắn kết với một đoạn nhiễm sắc thể có tần suất diễn biến cao
Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng để xem đầu dò huỳnh quang
đó bám vào nhiễm sắc thể nào sẽ là chỉ báo trạng thái của nhiễm sắc thể đó