Nghiên cứu phân loại chi cóc (spondias l ) ở việt nam dựa trên hình thái và phân tử

Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩnhay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong cácnghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật.. Tuy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

ĐẶNG THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CÓC

(SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH

THÁI VÀ PHÂN TỬ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Thực vật học

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

ĐẶNG THỊ ÁNH

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CHI CÓC

(SPONDIAS L.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN HÌNH

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực của khóa luận, tôi xin cam đoan:

Khóa luận ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam

dựa trên hình thái và phân tử‖ là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Lê Chí Toàn Các kết quả trình

bày trong khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ côngtrình nào trước đây

Xuân Hòa, ngày 21 tháng 4 năm 2019

Sinh viên

Đặng Thị Ánh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt khoảng thời gian hoàn thành đề tài khóa luận này, tôi đãnhận được sự quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ của thầy cô, người thân và bạn bèxung quanh Tôi rất cảm kích về điều đó

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các quý thầy cô, cán bộ của

khoa Sinh–KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, bằng cả tấm lòng, sự

nhiệt huyết, và những tri thức uyên bác của mình đã truyền đạt cho tôi nhữngkiến thức quý báu, những bài học kinh nghiệm mà phải mất khoảng thời giandài mới có thể đúc kết ra được

Đặc biệt, với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

nhất đến TS Lê Chí Toàn – người thầy, người hướng dẫn trực tiếp đề tài khóa

luận này của tôi Thầy đã đồng hành, trợ giúp tôi trong các bước đọc tài liệu,chắt lọc, thu thập thông tin, làm thí nghiệm; cho tôi những kinh nghiệm hữuích trong quá trình nghiên cứu Với kiến thức còn non nớt, và những kinhnghiệm còn hạn chế thì việc thất bại trong quá trình nghiên cứu là lẽ tất yếu,những lời khuyên của thầy đã giúp tôi nhận biết và khắc phục những sai sótgặp phải, vượt qua giới hạn của bản thân để hoàn thành tốt đề tài khóa luậnnày Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, chúc thầy có thật nhiều sứckhỏe để có thêm nhiều đóng góp hơn trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học, vàchúc những dự án mà thầy đang ấp ủ thực hiện sẽ gặt hái được nhiều thànhcông

Ngoài ra chúng tôi xin trân thành cảm ơn trường Đại học Sư phạm HàNội 2 đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này thông qua đề tài mã sốC.2019.01

Thời gian tôi được làm quen, tiếp xúc với nghiên cứu khoa học chưanhiều, kiến thức và kinh nghiệm còn hạn hẹp nên không tránh được nhữngthiếu sót, tôi rất mong nhận được những lời góp ý của các quý thầy cô để bảnkhóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Xuân Hòa, ngày 21 tháng 4 năm 2019

Sinh viên

Đặng Thị Ánh

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2

3 Nội dung chính của đề tài 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

PHẦN NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 4

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 7

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu chi Cóc của Việt Nam 9

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Cách tiếp cận 13

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Kết quả nghiên cứu thực địa 20

3.2 Kết quả phân tích điện di và phân tích khối dữ liệu phân tử 20

3.3 Kết quả nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài 22

3.4 Các sửa đổi sắp xếp phân loại cho spondias l Ở việt nam 28

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

4.1 Kết luận 32

4.2 Kiến nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thông tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của cáctrình tự DNA được giải mới hoặc sử dụng trong nghiên cứu này ―–‖ thểhiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới được giải trong nghiêncứu này 12Bảng 2.2 Dụng cụ, máy móc sử dụng trong nghiên cứu 15Bảng 2.3 Hóa chất cần thiết được sử dụng cho các thí nghiệm tách chiếtDNA, PCR, và điện di 17Bảng 2.4 Thông tin các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 18

Hình 3.3 Cây phát sinh loài của chi Cóc (Spondias) theo phân tích Maximum

Likelihood từ dữ liệu kết hợp Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BIđược trình bày trên các nhánh ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.22

Hình 3.4 Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen matK Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI

được trình bày trên các nhánh ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%.23

Hình 3.5 Cây phát sinh loài của chi Cóc Spondias theo phân tích Maximum Likelihood từ dữ liệu gen trnLF Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích

BI được trình bày trên các nhánh ―–‖ thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn50% 23

Hình 3.6 Hình thái lá, số lượng lá chét của Allospondias lakonensis (A) và Spondias dulcis (B) 24 Hình 3.7 Gân ở mép lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonenesis 25 Hình 3.8 Lông ở bề mặt lá của (A) Spondias dulcis và (B) Allospondias lakonensis .25 Hình 3.9 Mẫu chuẩn của Spondias petteloti (A) và Allospondias laxiflora (B).

26

PHỤ LỤC TỪ VIẾT TẮT

PTN SHTT Phòng thí nghiệm Sinh học trung tâm

Viện NCKH & ƯD Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

vi

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Chi Cóc (Spondias L.) là một chi nhỏ thuộc họ Ðào lộn hột hay còn gọi là

họ Xoài (Anacardiaceae R Br.) với khoảng 18 loài trên thế giới, chi Spondias tập trung phân bố ở Nam Mỹ, châu Á và Madagascar [24] Spondias là chi mẫu chuẩn của phân họ Spondioideae Takht emend Pell & J D Mitch và được ủng

hộ bằng dữ liệu phân tử qua nghiên cứu của Pell (2004), Mitchell và cộng sự

(2006), Pell và cộng sự (2011) Spondias là chi thực vật có giá trị kinh tế khá cao Quả, rễ của các loài Spondias có giá trị thương mại và y dược.

Lịch sử phân loại của chi Spondias khá phức tạp, đây là một trong những

chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mô tả bởi Linnaeus(1753) Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ Xoàithành các nhóm và chia họ Xoài thành hai tông Anacardieae và Spondieae Sau

đó, Marchand (1869) đã công bố tông Spondiadeae (như Spondieae) và đây là

lần đầu tiên hình thành một mô hình khái niệm của Spondias [16].

Hai quan điểm phân loại của Spondioideae của Châu Á còn nhiều đối lập

trong sự phân chia các loài Trong phiên bản sửa đổi chi Spondias nhiệt đới của Châu Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc

điểm nhận biết đặc trưng như: lá đơn với lá kép lông chim, noãn đơn với noãn

đa, lá chét có hoặc không có một đường gân ở mép lá [6]

Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đó chấp nhận

Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và

sự phát triển của quả Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng không thuộc

về chi Spondias Ngoài ra các loài Spondias philippinensis, Haplospondias brandisiana, Spondias bipinnata còn là những vấn đề chưa rõ ràng và có lẽ cũng không thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt Ngoài ra,

Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khó

khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19]

Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩnhay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong cácnghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật Kết quả từ dữ liệu phân tử thường đảmbảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiên cứu Tuy nhiênviệc áp dụng công nghệ này vào các nghiên cứu trong nước còn ở mức hạn chế

cả về chất lượng và số lượng nghiên cứu Đối với Spondias, kết quả từ dữ liệu

phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae được chia thành hai nhánh,

trong đó Spondias Nam Mỹ là chi của Spondias châu Á [27].

Chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam được ghi nhận bao gồm 3 loài là S cytherea, S petelotii, S pinnata tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc

và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai) [1]

Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi có giá trị kinh tế và một số loài của

chi này được trồng rộng rãi Tuy vậy việc nghiên cứu phân loại và mối quan hệ

phát sinh của các loài trong chi Spondias ở Việt Nam chưa được thực hiện Do

đó, một nghiên cứu phân loại cho chi Spondias ở Việt Nam là cần thiết.

Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ―Nghiên cứu phân loại

chi Cóc (Spondias L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖.

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu

Tiến hành điều tra và khẳng định số lượng loài thuộc chi Spondias ở Việt

Nam

Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và

xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt

Nam

Xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho

chi Spondias ở Việt Nam.

3 Nội dung chính của đề tài

Nghiên cứu tài liệu, tiêu bản của các loài thuộc chi Spondias ở Việt Nam

tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Dượcliệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên– Đại học Quốc gia Hà Nội

Điều tra thực địa, tiến hành thu mẫu cho việc tách chiết, phân lập DNA và

xây dựng bộ sưu tập tiêu bản khô của một số loài thuộc chi Spondias ở Việt

Nam

Tiến hành các thí nghiệm như tách chiết DNA, PCR, giải trình tự một số

gen (03 gen lục lạp: rbcL, matK, trnLF) cho các mẫu của chi Spondias ở Việt

Nam

Phân tích kết quả xử lí trình tự được nghiên cứu bằng chương trình vàthuật toán: Geneious, jModelTest, Maximum Likelihood, Bayesian Inference

Xây dựng khóa định loại và cây phát sinh loài bằng dữ liệu phân tử cho

chi Spondias ở Việt Nam.

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài góp phần tìm hiểu thực trạng số lượng các loài của chi Spondias ở

Việt Nam, từ đó đánh giá được mức độ đa dạng và đưa ra được các đề xuất nhằm

bảo tồn chi Spondias ở Việt Nam Hơn nữa, đề tài sẽ đóng góp các thông tin, dữ liệu cần thiết (cả hình thái, phân tử và sự phân bố) của chi Spondias ở Việt Nam

cho công tác xây dựng hệ thống Thực vật chí của Việt Nam Ngoài ra, đề tài sẽgiúp sinh viên được tìm hiểu và làm việc trực tiếp với các thí nghiệm và phântích phân tử hiện đại

PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu

Theo hệ thống phân loại APG III (2009), họ Xoài/Đào lộn hột(Anacardiaceae) chứa khoảng 70 chi với khoảng 600 loài trên thế giới HọXoài được chia thành hai phân họ là phân họ Xoài với khoảng 10 chi và 115loài và phân họ Đào lộn hột với khoảng 60 chi và 485 loài [8, 28]

Họ Xoài là họ thực vật có nhiều sản phẩm nông nghiệp nổi tiếng và có giátrị kinh tế cao như là hạt điều, xoài, hạt tiêu hồng, và quả hồ trăn Nhiều loài

trong các chi của họ Xoài được trồng và dùng làm thực phẩm như: Antrocaryon (lấy quả và hạt), Bouea (quả), Buchanania (quả và hạt), Choerospondias (quả), Rhus (quả), Cyrtocarpa (quả), Lannea (quả), Ozoroa (gỗ, quả), Fegimanra (hạt), Haematostaphis (quả, hạt), Harpephyllum (quả), Pleiogynium (quả), Pseudospondias (quả và hạt), Schinus L (quả), Sclerocarya (quả), Searsia (quả), Sorindeia (quả), Spondias (quả), và Trichoscypha (quả và hạt) [20].

Tuy không có thành viên của Anacardiaceae nào được xếp hạng là cây gỗlớn, nhưng giữ vai trò quan trọng trong thị trường gỗ nhỏ và được đánh giá cao

về chất lượng và khả năng chống mối mọt Gỗ của Schinopsis ở Nam Mỹ có khả

năng chống mối mọt tốt và được sử dụng rộng rãi ở Argentina cho ngành đường

sắt Các loại gỗ khác bao gồm: Abrahamia, Anacardium, Astronium, Campnosperma, Ozoroa, Dracontomelon dao, Loxopterygium, Myracrodruon, Protorhus, Schinopsis, Sclerocarya, Trichoscypha được sử dụng vào nhiều mục

đích khác nhau như trong sản xuất: làm diêm, tủ, cung, than, nhà ở, tay cầm rìu,củi, bát, ván, và cột [20]

Nhiều loài của Anacardiaceae có giá trị việc trong trang trí sân vườn Các

loài của Cotinus, Rhus, Schinus, Searsia, P chinensis, P mexicana, Harpephyllum caffrum, Lannea coromandelica, Rhodosphaera, Smodingium, và Toxicodendron được trồng thành cụm, có hoa đẹp để trang trí cho nhà cửa, tạo

hàng cây thường xanh hoặc rụng lá Tuy nhiên, một vài loài sau khi được trồngtrong nông, lâm nghiệp hay trang trí đã phát triển vượt ra sự kiểm soát và trở

thành loài xâm lấn có thể kể tới như: Toxicodendron succedaneum ban đầu được

trồng ở Brazil, nhưng đã phát triển rất mạnh sau khi được giới thiệu trồng tạiNhật Bản, hiện nay đang nằm trong danh sách loài xâm lấn ở Nhật Bản Gần đây

Pistacia chinensishas được nhập trồng và bắt đầu xâm lấn ở Texas (Hoa Kỳ) Ngoài ra, nhiều loài khác có giá trị cao trong y dược phẩm như: Spondias (quả:

lợi tiểu; rễ: làm kem dưỡng da; vỏ cây dùng sản xuất: thuốc tẩy, thuốc xổ, chữabệnh phong, chữa ho, trị các vết thương; lá: chữa bệnh phong, tẩy giun, trị đau

dạ dày) [20]

Chi Cóc thuộc phân họ Spondoideae Chi này gồm 18 loài đã được mô tả,trong số đó có 7 loài tìm thấy ở vùng nhiệt đới châu Á và 10 loài tìm thấy ở vùngnhiệt đới Nam Mỹ, và 01 loài ở Madagascar Trong số 18 loài Cóc được tìmthấy, có 10 loài có lá và quả ăn được, các loài này được thuần hóa để trồng ở

vùng nhiệt đới châu Á và Nam Mỹ [28], trong đó, S dulcis được trồng phổ biến trên thế giới S dulcis ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ được dùng làm nước ép, làm

kem; ở vùng biển Caribbean nó được sử dụng như hương liệu tạo vị cho sữachua chứa nhiều vitamin C [20]

Trên thế giới, các nghiên cứu phân loại và phát sinh loài của thực vật hạtkín được tiến hành từ rất sớm và đã có rất nhiều công bố khoa học được đăngtrên các tạp chí và sách chuyên ngành Tuy nhiên việc sử dụng dữ liệu phân tửvào các hướng nghiên cứu này ở Việt Nam còn rất hạn chế và tồn tại nhiều khókhăn Ngoài ra, số lượng và chất lượng các nghiên cứu phát sinh loài và tiến hóa

ở Việt Nam trong những năm gần đây là chưa cao

Hiện nay dữ liệu phân tử dựa trên trình tự DNA của các đoạn gen chuẩnhay còn gọi DNA barcoding được sử dụng phổ biến trên thế giới trong cácnghiên cứu hệ thống và tiến hóa thực vật và di truyền Kết quả từ dữ liệu phân tửthường đảm bảo được chất lượng và đem lại mức độ tin tưởng cao cho nghiêncứu Trong ba hệ gen gồm: gen nhân, gen ty thể và gen lục lạp; các trình tự của

gen lục lạp được sử dụng nhiều và phổ biến đối với các nghiên cứu thực vật.

Trình tự của ba gen rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), matK (Maturase K), trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence (trình tự từng phần); trnL–trnF intergenic spacer, complete sequence;

và tRNA–Phe (trnF)) được sử dụng nhiều trong nghiên cứu hệ thống và phát sinh của thực vật hạt kín nói chung và Spondias nói riêng [29].

rbcL (ribulose 1,5–bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit), là

gen được tìm thấy trong lục lạp, quy định enzyme RuBisCO trong quá trình

quang hợp rbcL có giá trị lớn và được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đánh giá mối quan hệ phát sinh loài [29] Tuy nhiên trình tự gen rbcL thường có tính bảo thủ loài và chi khá cao, có nghĩa là trình tự rbcL của các loài trong cùng một chi

có độ tương đồng cao Mặc dù vậy, rbcL là gen dễ khuếch đại và tạo thuận lợi

cho nhiều nghiên cứu

matK (Maturase K) là một gen lục lạp, protein của nó mã hóa một maturase intron [29] Trình tự gen matK thường có tính bảo thủ loài thấp do đó rất hữu ích cho nghiên cứu phát sinh Tuy nhiên, matK lại là một trong những trình tự gen lục lạp khó khuếch đại nhất Mặc dù vậy, matK vẫn là một gen được

sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu hiện nay Để khắc phục khó khăn trongquá trình khuếch đại (PCR) các nhà khoa học có thể tác động đến chương trìnhchạy PCR hoặc thay đổi trình tự mồi Yu và cộng sự (2011) đề xuất việc sử dụng

matK và thúc đẩy việc áp dụng matK như một mã vạch DNA bằng việc sử dụng

các loại mồi mới Nghiên cứu sử dụng 58 loài từ 47 họ thực vật hạt kín, kết quảcủa nghiên cứu này chỉ ra rằng các đoạn mồi mới có khả năng khuếch đại mạnh

mã gen matK (93,1%) và tỷ lệ trình tự có thể sử dụng được là rất cao (92,6%)

[14, 23]

trnLF (tRNA–Leu (trnL) gene, partial sequence; trnL–trnF intergenic

spacer, complete sequence; and tRNA–Phe (trnF) gene) cũng là một gen lục lạp,

tuy nhiên trnLF là một gen khảm, phân mảnh, nó bao gồm ba đoạn là trnL, trnL–trnF intergenic spacer và trnF Trình tự của gen trnLF có tính bảo thủ thấp,

do đó cung cấp nhiều thông tin cho việc xác định rõ ràng mối quan hệ của cácloài nên có giá trị sử dụng cao trong nghiên cứu phát sinh Tuy nhiên đây cũng làmột gen khó khuếch đại và đặc biệt là rất khó gióng hàng và căn trình tự [29].

Hệ thực vật của Việt Nam rất đa dạng và chưa được nghiên cứu kĩ, đặcbiệt là các nghiên cứu phát sinh loài sử dụng dữ liệu phân tử Do đó, đây là mộthướng nghiên cứu có thể đóng góp nhiều thông tin và dữ liệu quý giá cho khoahọc thế giới và Việt Nam

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu chi Cóc trên thế giới

Lịch sử phân loại của chi Cóc Spondias khá là phức tạp, đây là một trong

những chi đầu tiên của họ Ðào lộn hột (Anacardiaceae) được mô tả bởi Linnaeus(1753) Bentham và Hooker (1862) đầu tiên đã sắp xếp các chi của họ này thành

các nhóm và chia họ này thành hai tông Anacardieae và Spondieae [9] Sau đó, Marchand (1869) đã công bố tông Spondiadeae (như Spondieae) và đây là lần đầu tiên hình thành một mô hình khái niệm của Spondias [16].

Hai quan điểm phân loại của Spondioideae châu Á còn nhiều đối lập trong

sự phân chia các loài Trong phiên bản sửa đổi của Spondias nhiệt đới của châu

Á, Airy Shaw và Forman (1967) đã gộp Allospondias và Solenocarpus với một khái niệm rộng cho chi Spondias, và điều này làm chi này mất đi các đặc điểm

nhận biết đặc trưng như: lá đơn vs lá kép lông chim, noãn đơn vs noãn đa, láchét có hoặc không có một đường gân ở mép lá [6]

Mitchell và Daly (2015) đưa ra một quan điểm trong đó chấp nhận

Allospondias lakonensis rời khỏi Spondias dựa trên các đặc điểm của gân lá và

sự phát triển của quả Tương tự như vậy, Solenocarpus indicus cũng không thuộc

về chi Spondias [19] Ngoài ra các loài Spondias philippinensis, Haplospondias brandisiana, Spondias bipinnata còn là những vấn đề chưa rõ ràng và có lẽ cũng không thuộc về chi Spondias với những đặc điểm hình thái khác biệt Ngoài ra,

Mitchell và Daly (2015) cũng nhấn mạnh rằng, DNA của Spondias là rất khó

khuếch đại ngay cả với các mẫu lá tươi [19]

Kết quả từ dữ liệu phân tử hiện nay gợi ý rằng, phân họ Spondioideae

được chia thành hai nhánh, trong đó Spondias Nam Mỹ nằm ở một nhánh phát sinh riêng biết và có quan hệ chị em gần gũi với Spondias châu Á, điều này cũng gợi ý cho nghiên cứu lịch sử tiến hóa và phát sinh của chi Spondias trên toàn thế

giới

Chayamarit (1997) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột

ở Thái Lan dựa trên dữ liệu phân tử (bao gồm chi Spondias), tuy nhiên do sự hạn chế về việc lấy mẫu và các trình tự gen (chỉ bao gồm duy nhất một gen rbcL) nên kết quả của nghiên cứu này là rất hạn chế đối với chi Spondias Kết quả chỉ

ra rằng, Spondias có quan hệ gần gũi và nằm trên cùng một nhánh phát sinh với Dracontomelon [10].

Pell (2004) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của họ Ðào lộn hột dựa trên

dữ liệu sinh học phân tử và hình thái (bao gồm chi Spondias) Nghiên cứu được tiến hành trên 9 chi của họ Ðào lộn hột bao gồm cả Spondias, sử dụng trình tự của 5 gen: ETS, ITS, trnLF, rps16, matK Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, khi kết

hợp 2 gen ETS và ITS cho chỉ số ủng hộ bootstrap cao hơn khi kết hợp 3 gen

ETS, ITS và trnLF [20].

Trong thực vật chí Trung Quốc, Min and Barfod (2008) ghi nhận hai loài

của chi Spondias ở Trung Quốc là S pinnata và S lakonensis Loài S lakonensis bao gồm hai thứ là S lakonensis var lakonensis và S lakonensis var hirsuta

[18]

Silva và cộng sự (2015) thực hiện nghiên cứu phát sinh các loài của chi

Spondias ở Nam Mỹ dựa trên dữ liệu phân tử Nghiên cứu được tiến hành trên 6 loài của chi Spondias ở Nam Mỹ sử dụng trình tự của 3 gen là rbcL, matK và trnH–psbA spacer [24] Kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, trình tự gen rbcL và matK của các loài thuộc Spondias ở Nam Mỹ là tương đối bảo thủ, trong khi đó,

trnH–psbA spacer khá là khác biệt giữa các loài và có thể cho phép phân biệt

được các loài

Al–Saghir (2017) tiến hành nghiên cứu bản đồ nhiễm sắc thể của 5 loài

thuộc chi Spondias sử dụng kính hiển vi huỳnh quang [7] Kết quả của nghiên

cứu thể hiện rằng, tất cả 5 loài được nghiên cứu đều có chung bộ nhiễm sắc thể

là 2n = 32 Hơn nữa, tất cả các loài Spondias có quan hệ di truyền gần gũi.

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu chi Cóc của Việt Nam

Chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam đến nay được ghi nhận bao gồm 3 loài là

S cytherea, S petelotii, S pinnata và tập trung phân bố ở các tỉnh miền núi phía

bắc và Nam bộ (Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lâm Đồng, Đồng Nai)

[1] Mặc dù là một chi nhỏ nhưng Spondias là chi có giá trị kinh tế và một số loài

của chi này được trồng rộng rãi

Tuy nhiên, theo Phạm Hoàng Hộ (2003) chi Cóc (Spondias) ở Việt Nam bao gồm 3 loài là S cythera, S pinnata và S mombin Tuy vậy, tác giả cũng nhấn mạnh rằng ông chỉ quan sát thấy S cythera, S pinnata (dọc ven biển từ Vinh tới Đà Lạt, Đồng Nai), trong khi S mombin có lẽ là không chắc chắn [2].

Lê Thị Kim Phụng và Trần Thị Tướng An (2013) tiến hành nghiên cứu

chiết xuất pectin từ vỏ Cóc (S cytherea) bằng phương pháp hỗ trợ bởi vi sóng

[3] Nghiên cứu đưa ra một quy trình tối ưu cho việc chiết xuất pectin từ vỏ cóc

sử dụng các tác nhân hóa học (HCl và cồn 96o) kết hợp với vi sóng (MAE –microwave assisted extraction method) ở 400 W trong 10 phút Quy trình nàyđược cho là giúp giảm chi phí và nâng cao hiệu quả sản xuất pectin so vớiphương pháp chiết xuất truyền thống

Nguyễn Xuân Quyền và cộng sự (2015) tiến hành nghiên cứu giá trị sửdụng của các loài trong họ Xoài ở Việt Nam Nghiên cứu đã chỉ ra các giá trị sửdụng khác nhau của các loài trong họ Xoài, trong đó có giá trị của các loài Cóc

(Spondias L.) là: cây ăn quả, làm thuốc, lấy gỗ, làm cảnh [4].

Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân loại và hệ thống phát sinh của Spondias

chưa được quan tâm chú trọng vì vậy mối quan hệ phát sinh của các loài thuộc

chi Spondias ở Việt Nam là chưa rõ ràng Do đó, một nghiên cứu phân loại và phát sinh cho Spondias ở Việt Nam là cần thiết.

Sử dụng phương pháp phân loại dựa trên dữ liệu hình thái và phân tử

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu phân loại chi Cóc (Spondias

L.) ở Việt Nam dựa trên hình thái và phân tử‖.

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành trên các đối tượng loài thuộc chi Cóc như đã đượcghi nhận trong ―Danh lục các loài thực vật Việt Nam‖ và một số tài liệu có liênquan Ngoài ra, nghiên cứu này cũng tiến hành thu thập và phân tích thông tin,

dữ liệu phân tử một số loài Cóc trên thế giới dựa trên dữ liệu từ Ngân hàng Gen(Genbank–NCBI)

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 14 loài (16 cá thể) của hai chi

Spondias và Allospondias (Bảng 2.1) Trong đó bao gồm: 04 mẫu được thu ở

Việt Nam, 12 mẫu được thu thập trên ngân hành Gen thế giới (Genbank –NCBI)

Nghiên cứu sử dụng 03 loài thuộc chi Buchanania (B siamensis, B reticulata và B glabra) làm đối chứng cho phân tích phát sinh loài.

Nghiên cứu sử dụng 03 gen lục lạp bao gồm rbcL, matK và trnLF cho các

phân tích phát sinh loài Phương pháp tách chiết, PCR, giải trình tự và phân tíchđược trình bày chi tiết ở mục 3

2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian

2.2.1 Phạm vi nghiên cứu

Phân tích hình thái và phân tử sử dụng các mẫu tươi, các tiêu bản khô, cáctrình tự DNA của các loài thuộc chi Cóc ở Việt Nam

2.2.2 Địa điểm

Một số địa điểm được ghi nhận phân bố của các loài thuộc chi Spondias

tại Việt Nam

Địa điểm kiểm tra tiêu bản khô: Phòng tiêu bản, Viện Sinh thái và Tàinguyên Sinh vật; Viện Dược liệu; Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam; Bảo tàngSinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Bảng 2.1 Thông tin mẫu vật và số hiệu trên ngân hàng Gen thế giới của các trình tự DNA được giải mới

hoặc sử dụng trong nghiên cứu này ―–‖ thể hiện thiếu dữ liệu, ―XXX‖ thể hiện các trình tự mới được giải

trong nghiên cứu này.

L oài Đ ị a đi ể m N gười t hu m ẫu m a t K rb c L t rn L F

Spondias radlkoferi Donn.Sm.

Brazil

R Perez s.n.; E Mart nez S., C H.

Ramos, R Lombera & G Dom nguez

Spondias testudinis J.D Mitch & D.C.

Spondias bahiensis P.Carvalho, Van den

Berg & M.Machado Brazil E Melo, M C Machado & B M Silva11933 – – KR081811

M C Machado, A R Barbosa & M R.

Santos 1302; Weiblen, G D WS5B0380 KP774606 JF739148 KR081815

Pell 1054 (NY); Toyama et al 554

Pell 1057 (NY); Toyama et al 167

12

Nghiên cứu tiêu bản của các loài Spondias tại phòng tiêu bản Viện Sinh

thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Dược liệu, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,Bảo tàng Sinh học thuộc Đại học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Tiến hành nghiên cứu thực địa và thu mẫu trong điều kiện cho phép

Tiến hành thí nghiệm tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, trườngĐại học Sư phạm Hà Nội 2

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1 Phương pháp thu thập tài liệu và nghiên cứu tiêu bản

Thu thập, tổng hợp các tài liệu liên quan đến chi Spondias và các chi có quan hệ gần gũi với Spondias.

Nghiên cứu tiêu bản của các loài Spondias: kiểm tra đặc điểm hình thái,

thu thập các thông tin cần thiết trên tiêu bản (tên khoa học, tên địa phương, địađiểm thu mẫu, người thu và các ghi chú trên tiêu bản)

2.3.2.2 Phương pháp nghiên cứu thực địa và thu mẫu

Tiến hành thực địa từ một đến hai lần tại những địa điểm được ghi nhận có

sự phân bố của chi Spondias, nhằm thu mẫu tiêu bản (một hoặc hai tiêu bản với

mỗi mẫu thu được) và mẫu để tách chiết DNA

Mẫu tiêu bản sau khi được xử lý cắt tỉa sẽ được ép phẳng và sấy khô đểbảo quản cho nghiên cứu lâu dài Trong khi đó, đối với mẫu DNA, các mẫu lá sẽđược lấy và chứa trong các túi kẹp có chứa hạt hút ẩm để làm khô mẫu và tránhphá hủy cấu trúc DNA, các mẫu DNA này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệmphân tử

2.3.2.3 Phương pháp nghiên cứu hình thái

Nghiên cứu sử dụng phương pháp hình thái so sánh dựa trên các đặc điểmcấu tạo bên ngoài của các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản của thực vật, trong đóđặc biệt là cơ quan sinh sản [5] Nhiều tiêu bản chi Cóc được nghiên cứu (nghiêncứu online thông qua các hình ảnh của tiêu bản được công bố) ở nhiều phòngtiêu bản và bảo tàng trên thế giới như: HN, HNU, PE, HAL, TCD, L, C, A vàKUN Các kí hiệu tên của phòng tiêu bản theo the Index Herbariorum (h tt p : / /

s w e e t g u m n y bg .o r g / i h / ) Ngoài ra, chúng tôi cũng nghiên cứu tiêu bản ở phòngtiêu bản bộ môn Thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 (*) và phòng tiêubản của Viện Dược liệu (**)

Khóa định loại được xây dựng theo kiểu khóa lưỡng phân

2.3.2.4 Phương pháp tách chiết DNA, PCR, giải trình tự gen

Các mẫu DNA được đánh kí hiệu tương đồng với mẫu tiêu bản và tiếnhành tách DNA theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide)[12]

Các dụng cụ, máy móc, và hóa chất cần thiết cho các thí nghiệm tách chiếtDNA, PCR, và điện di được trình bày trong Bảng 2.2 và 2.3

Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

Để tiến hành các thí nghiệm tách chiết DNA, PCR và điện di cần chuẩn bị:Các loại đầu tip, bi sắt nghiền mẫu, ống eppendorf (1,5 µl; 2,0 µl) cầnđược hấp vô trùng và để khô

Số TT Tên dụng cụ máy móc

1 Ống eppendorf

2 Đầu típ các loại

3 Bi nghiền mẫu

4 Kẹp, giấy lau, giấy parafilm, gang

tay, khẩu trang

5 Đèn cồn

6 Máy sấy mẫu

7 Tủ lạnh

8 Tủ lạnh âm sâu

9 Bộ micropipet đơn kênh

10 Máy nghiền mẫu Tissuelyser II

PTN Thực vật PTN Thực vật PTN Thực vật PTN SHTT và Viện NCKH & ƯD PTN SHTT và Viện NCKH & ƯD Viện NCKH & ƯD

Viện NCKH & ƯD Viện NCKH & ƯD Viện NCKH & ƯD Viện NCKH & ƯD Viện NCKH & ƯD Viện NCKH & ƯD Viện NCKH & ƯDCác ống eppendorf (1,5 µl; 2,0 µl) được dùng trong thí nghiệm cần đượcđánh số mã hóa và ghi thông tin đầy đủ như: thời gian, tên mẫu…