Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn (democarpus longan)

Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn.... Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn.... Dòng sản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian hoàn thiện đề tài ngoài sự cố gắng và nỗ lực củabản thân em cũng đã nhận được sự giúp đỡ tận tình, và quý báu của các tậpthể và cá nhân trong và ngoài trường Đặc biệt đề tài này được hoàn thànhdưới sự quan tâm, chỉ bảo và hướng dẫn tận tình của PGS.TS Đinh Thị KimNhung

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô giáo, cáccán bộ trong phòng thí nghiệm vi sinh và ban chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN,cùng ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiệngiúp đỡ cho em trong suốt thời gian làm đề tài Cuối cùng em xin gửi lời cảm

ơn tới gia đình và bạn bè, những người luôn yêu thương em cho em sự khích

lệ, động viên và luôn bên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh Viên

Vũ Lệ Giang

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì tôi viết trong khóa luận này là sự thật, là kếtquả tôi làm ra Các số liệu ở trong bảng biểu và hình ảnh đều được tôi thuthập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không trùng với kết quả của bất kỳtác giả nào đã công bố dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung

Trong đề tài của tôi có sử dụng một số dẫn liệu của tác giả khác, tôi xinphép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình được hoànthiện hơn

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Vũ Lệ Giang

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATP Adenozin triphotphat

Nxb Nhà xuất bản

MT1 Môi trường phân lập giữ giống

MT2 Môi trường nhân giống cơ bản

MT3 Môi trường lên men

STT Số thứ tự

Tb Tế bào

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

Vsv Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g thịt nhãn 7

Bảng 2.2 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 17

Bảng 2.3 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của nước giải khát 18

Bảng 2.4 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 19

Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái và kích thước của các chủng nấm men 21

Bảng 3.6 Hoạt lực lên men của chủng nấm men 25

Bảng 3.7 Khả năng lên men ở các nồng độ cồn khác nhau của các chủng nấm men 26

Bảng 3.8 Khả năng đồng hóa lên men đường saccharose và đường glucose của các chủng giống đã phân lập 28

Bảng 3.9 Xác định khả năng lên men ở các độ pH khác nhau 29

Bảng 3.10 Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của các chủng nấm men 30

Bảng 3.11 Bảng tổng hợp kết quả tuyển chọn 6 chủng nấm men 31

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây nhãn 6Hình 3.2 Chủng nấm men phân lập trên môi trường thạch đĩa 22Hình 3.3 Chủng nấm men trên môi trường thạch nghiêng 23Hình 3.4 Ảnh chụp tế bào nấm men trên kính hiển vi điện tử

(× 1000 lần) 23Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn chiều cao cột kết lắng của các chủng

nấm men 27Hình 3.6 Thử hoạt tính catalaza 28Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae PI6 32

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

4.1 Ý nghĩa khoa học 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

5 Điểm mới của đề tài 2

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nước giải khát lên men 3

1.2 Tổng quan về nguyên liệu 5

1.2.1 Nguồn gốc, phân loại 5

1.2.2 Đặc điểm hình thái 5

1.2.3 Đặc tính mùa vụ năng suất 6

1.2.4 Thành phần dinh dưỡng 6

1.2.5 Ứng dụng 7

1.3 Hệ vi sinh vật 8

1.3.1 Nấm men 8

1.4 Lịch sử nghiên cứu vấn đề 9

1.4.1 Trên thế giới 9

1.4.2 Ở Việt Nam 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.1 Mẫu thực vật 12

2.1.2 Mẫu vi sinh vật 12

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 12

2.1.5 Phạm vi nghiên cứu 13

2.1.6 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Phương pháp vi sinh 13

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 17

2.2.3 Phương pháp cảm quan 17

2.2.4 Phương pháp phân tích thống kê 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn 21

3.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn 24

3.2.1 Đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men 24

3.2.2 Khả năng chịu cồn của các chủng nấm men 25

3.2.3 Thử nghiệm khả năng kết lắng 27

3.2.4 Thử nghiệm hoạt tính catalaza 27

3.2.5 Thử khả năng sử dụng đường glucozo của các chủng nấm men 28

3.2.6 Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau 29

3.2.7 Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm 30

3.4 Lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn 33

3.4.1 Sơ đồ quy trình công nghệ lên men nước giải khát lên men từ nhãn 33

3.4.2 Thuyết minh quy trình công nghệ 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC

1 Lý do chọn đề tài

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có khí hậu khô nóng nên nhu cầu về nước giải khátcủa người dân vô cùng lớn, chính vì vậy việc tìm ra một loại nước giải khátvừa phù hợp với sức khỏe con người vừa gần gũi với thiên nhiên được ưu tiênhàng đầu Trong đó phải kể đến dòng sản phẩm lên men đang rất được ngườidân ưa chuộng hiện nay Dòng sản phẩm này đang xâm nhập mạnh mẽ vào thịtrường tiêu dùng và dần trở nên quen thuộc gần gũi đối với chúng ta.

Khác với sản phẩm nước giải khát công nghiệp nước giải khát lên menđược chế biến hoàn toàn từ các loại trái cây tươi không sử dụng chất bảoquản, các phụ phẩm hóa học và chất tạo màu thực phẩm còn dòng sản phẩmnước giải khát công nghiệp vẫn còn chứa một số chất hóa học tổng hợp có thểgây bệnh béo phì, không tốt cho tim mạch Chính vì vậy chúng tôi lựa chọnnước giải khát lên men để thay thế cho sản phẩm nước giải khát công nghiệpđảm bảo an toàn cho mọi đối tượng sử dụng Sản phẩm này ngoài việc thamgia vào quá trình trao đổi chất của tế bào mà nó còn bổ sung các dưỡng chấtthiết yếu cho cơ thể để bù lại những hao hụt về năng lượng và dinh dưỡng bịtiêu hao trong các hoạt động sống của con người Sản phẩm này có độ cồnnhẹ, vị chua ngọt và vẫn giữ được hương thơm của dịch quả vậy nên nó dễdàng chinh phục thị hiếu của người tiêu dùng hiện đại, nhất là thế hệ trẻnhững người luôn tìm kiếm cảm giác mới mẻ

Nước giải khát lên men là dòng sản phẩm lên men nhờ vi sinh vật.Ngoài việc tạo cho các chủng vi sinh vật môi trường lên men tốt đầy đủ chấtdinh dưỡng thì để có sản phẩm có chất lượng tốt chúng tôi cần tuyển chọn cácchủng vi sinh vật có khả năng lên men tốt, không sinh độc tố và tạo cho sản

phẩm độ trong đẹp mắt Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài " Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn (democarpus longan)”.

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo

đồ uống giải khát từ nhãn

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uốnggiải khát từ nhãn

3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uốnggiải khát từ nhãn

3.3 Nghiên cứu động thái lên men của chủng tuyển chọn

3.4 Lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu là quá trình lên men yếmkhí với sự có mặt của nấm men chúng sẽ chuyển hóa đường thành rượu vàchuyển tiếp thành các acid hữu cơ

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng sản phẩm nước giải khát lên men từ dịch nhãn phục vụ cho đờisống hàng ngày của người dân, góp phần nâng cao giá trị cây nhãn Tạo ra sảnphẩm mới góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngàycàng cao của người tiêu dùng Tận dụng được nguồn nguyên liệu rẻ tiền, lênmen tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng, có lợi cho sức khỏe con người

5 Điểm mới của đề tài

Chúng tôi đã phân lập được 50 chủng sơ tuyển được 6 chủng nấm men

là PI1, PI2, PI3, PI4, PI5, PI6 Tuyển chọn được 1 chủng có khả năng lênmen tạo sản phẩm nước giải khát và dựa vào đặc tính sinh học của nấm men

xác định chủng tuyển chọn là nấm men Saccharomyces serevisiae PI6.

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nước giải khát lên men

Nước giải khát lên men là sản phẩm tạo thành nhờ tác nhân là nấm men

từ môi trường lên men là nước quả tự nhiên Trong quá trình lên men này chủyếu là quá trình lên men rượu ngoài ra còn có quá trình lên men axit hữu cơ

* Lên men ethanol (lên men rượu)

Quá trình lên men rượu chia làm 2 thời kì chính: thời kì phát triển sinhkhối (với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kì lênmen chuyển đường thành rượu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ cácchất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tácsinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và

CO2)

Sau khi đường cùng các chất dinh dưỡng khác của môi trường lên menđược hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men, khuếch tán qua màng bánthấm vào trong tế bào Đường bị chuyển hóa qua một chuỗi phản ứng theocon đường đường phân để tạo pyruvate, pyruvate bị decarbonxyl dưới tácdụng xúc tác của enzim pyruvate decarboxylase tạo thành acetaldehyde giảiphóng CO2, acetaldehyde nhận H+ từ NADH tạo ethanol Trong quá trình lênmen ethanol, nhiều axit hữu cơ được tạo thành và một số axit hữu cơ đượcsinh tổng hợp từ chu trình Krep, nếu quá trình lên men không ở trong điềukiện kị khí nghiêm ngặt thì các axit chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lênmen là axit citric, axit malic, axit axetic, axit lactic… [6]

Phương trình tổng quát của quá trình lên men:

C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tếbào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm mentrong điều kiện kị khí Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải

vào môi trường lên men Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vàodịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợpchất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quátrình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990).

* Lên men axetic

Lên men axetic là quá trình oxi hóa rượu thành acid axetic dưới tácdụng của vi khuẩn

C2H5OH + O2 CH3CHO (Axetaldehyd) + H2O

CH3CHO + H2O CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyd)

CH3CH(OH)2 + O2 CH3COOH + H2O

* Lên men lactic

Lên men lactic là quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP đượchình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong

tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trưởng của vi sinh vật Ngượclại các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môitrường lên men Kết quả hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lênmen ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi lýhóa khác Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ visinh vật Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên menđồng hình), acid axetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên mencòn xuất hiện nhiều hợp chất hóa học mới khác, đây là sản phẩm trung gianhoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men Một số hợp chất trong nhóm trênrất dễ bay hơi, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thànhnên mùi vị đặc trưng cho các sản phẩm lên men lactic Lượng sản phẩm phụtạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinhdưỡng và điều kiện ngoại cảnh, acid lactic thường chiếm 40% lượng đường

đã được phân hủy, acid sucxinic 20%, rượu etylic chiếm 10%, acid axetic10% và các loại khí gần 20% [6].

1.2 Tổng quan về nguyên liệu

1.2.1 Nguồn gốc, phân loại

Nhãn có tên khoa học là Dimocarpus longan

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Nhãn là cây thân gỗ, tương đối lớn, cao khoảng 5- 10m, có thể lên đến20m, tán tròn đều, rậm lá, xanh quanh năm Vỏ thân dày, thường sần sùi, có nhiều vết nứt dọc nhỏ đôi khi bong tróc từng mảng, gỗ giòn

Lá thuộc lá kép lông chim, mọc đối xứng hay so le Mặt lá xanh đậm,bóng loáng còn lưng lá có màu xanh nhạt, cuống lá ngắn, gân chính và gânphụ nổi rõ Lá non màu đỏ tím hay đỏ nâu tùy giống và thay đổi màu theo thờigian sống

Hoa nhãn màu trắng vàng, 5 cánh mọc từng chùm ở đầu cành Nhãn córất nhiều hoa, số lượng hoa nhiều hay ít tùy thuộc vào tuổi của cây, giốngnhãn, mùa vụ trong năm,… có thể vài trăm hoa tới 2- 3 nghìn hoa

Quả nhãn thuộc loại quả hạch, mọc theo chùm rủ xuống, đỉnh quả tròncuống hơi lõm, thường quả sẽ chín sau khi hoa nở được 3- 5 tháng Vỏ quảmỏng, bóng loáng màu nâu Giữa vỏ và hạt có lớp thịt quả do cuống noãnphát triển thành, màu trắng trong hay trắng sữa, rất mềm và ngọt có mùi thơmđặc trưng Thịt nhãn gồm khoảng 70% nước và 16% chất khô hòa tan Hạtnhãn tròn, đen và láng, cuống hạt có màu trắng Lá mầm trong hạt màu trắng

có nhiều tinh bột, phôi màu vàng, độ lớn của hạt khác nhau tùy giống cógiống hạt rất lớn (nhãn long) có giống hạt rất nhỏ (nhãn tiêu) hoặc hầu nhưkhông có hạt do kết quả thụ tinh kém [16].

Hình 1.1 Hình ảnh cây nhãn

1.2.3 Đặc tính mùa vụ năng suất

Giống địa phương nhãn nước có đặc tính dễ trồng thích hợp với đất thịtpha cát và cho năng suất cao, mỗi năm thường có 1 vụ vào khoảng tháng 8đến tháng 9 Một số giống nhãn khác như nhãn long, nhãn Vĩnh Châu có thểcho 2 vụ một năm vào tháng 2 – 3 và tháng 8 – 9

1.2.4 Thành phần dinh dưỡng

Nhãn rất giàu giá trị dinh dưỡng như protein, chất béo, đường thiênnhiên, các loại vitamin và khoáng chất như: vitamin A, C, kali, photpho,magie, sắt, axit hữu cơ, chất xơ…Trong quả nhãn chứa hợp chất có khả nănglàm chậm quá trình lão hóa ở con người Ngoài ra, nhãn còn có tác dụng tăngcường sức đề kháng cho cơ thể, chống lại các bệnh như cảm cúm và làm đẹpda

Nhãn tăng cường hàm lượng Vitamin C trong cơ thể con người Trong

100 gam nhãn có chứa đến 84 mg hàm lượng Vitamin C và con số này đủcung cấp 100% nhu cầu Vitamin C cần thiết hàng ngày cho nữ và 93% nhucầu cho nam giới

Trong thành phần của quả nhãn có chứa Riboflavin, đây là một loạivitamin có tác dụng tích cực đối với mắt, nếu như thiếu loại Vitamin này rất

dễ dẫn đến hiện tượng đục thủy tinh thể hay mờ mắt…

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g thịt nhãn [16]

Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng

Hạt nhãn, vỏ quả nhãn dùng làm thuốc trong đông y Nhãn là câynguồn mật quan trọng có chất lượng cao Gỗ nhãn non có thể làm thức ăn giasúc, hạt nhãn có thể làm hồ, chế rượu…[19]

1.3 Hệ vi sinh vật

1.3.1 Nấm men

1.3.1.1 Hình thái và cấu tạo tế bào của nấm men

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, hình trụ, elip, ovan…, và cókích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn Chiều dài trung bình từ 9-

10 µm, chiều rộng trung bình từ 2-7 µm Ở mỗi loài, mỗi lứa tuổi và điều kiệnnuôi cấy khác nhau chúng có hình dạng và kích thước khác nhau

1.3.1.2 Sự sinh sản của nấm men

Một số hình thức sinh sản của nấm men là nảy chồi, phân đôi, sinh sảnbằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinhsản đơn tính)

1.3.1.3 Phân loại nấm men

Chủ yếu có 2 lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (fungi

imporfecti)

Lớp nấm men thật (Ascomyces) phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Sacchromyces; giống

Endomyces; giống Schizosaccharomyces.

Lớp nấm men giả (fungi imporfecti) Crytococus (toscula, tornlopsis);

Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc); Rhodotorula [9].

Phần lớn các loài nấm men thuộc về ngành nấm túi (Ascomycota), một

số ít loài thuộc ngành nấm đảm (Basidimycota) Saccharomyces là một chi

nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm Trên 1000 loài nấmmen đã được miêu tả, loài nấm men được con người sử dụng nhiều nhất là

Saccharomyces cerevisiae trong sản xuất rượu vang, bánh mì, bia… từ hàng

nghìn năm trước

Saccharomyces cerevisiae phổ biến trong quá trình lên men nước hoa

quả, chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên

men Nguồn dinh dưỡng cacbon của loại này là đường, axit hữu cơ và nhữngtác nhân sinh trưởng là axit pantotinic, biotin, thiamin, piridoxin…

1.4 Lịch sử nghiên cứu vấn đề

1.4.1 Trên thế giới

Ngành sản xuất nước uống lên men đã có từ lâu đời và đang ngày càngphát triển với tốc độ rất nhanh Trong số các loại nước giải khát thì đây đượccoi là mặt hàng chiến lược chủ yếu của thế kỷ XXI nên các quốc gia như Mỹ,

Hà Lan, Trung Quốc, Nhật, Đức…đã và đang tập trung nghiên cứu và sảnxuất các loại nước uống lên men từ nhiều loại trái cây khác nhau như táo, dứa,chanh leo, mơ, xoài… có chất lượng rất cao đáp ứng được nhu cầu ngày càngcao của con người Đối với những người tiêu dùng ở các nước châu Âu và Mĩ

do có thói quen ăn thịt ít ăn rau đặc biệt là trẻ nhỏ nên nhu cầu sử dụng cácloại nước trái cây và rau củ thơm ngon, bổ dưỡng ngày càng tăng làm cho thịtrường nước trái cây ngày càng phát triển

Ngày nay, khi điều kiện sống của con người ngày được nâng cao thìnhu cầu sử dụng nước giải khát ngày càng tăng và đang chuyển dần từ loạinước giải khát pha chế truyền thống sang sử dụng loại nước giải khát có chứacác loại chất dinh dưỡng như các loại: axit amin, vitamin, muối khoáng… đượclên men từ dịch trái cây Đây được coi là mặt hàng đóng vai trò chủ đạo củathế kỉ 21, nên nhiều quốc gia như: Hà Lan, Mỹ, Đức, Úc, Nhật, HànQuốc, Trung Quốc, Thái Lan… đã tập trung nghiên cứu và sản xuất đượcnhiều loại nước giải khát từ các loại trái cây khác nhau như: dâu, cam, dứa,

mơ, xoài,…có chất lượng tốt đã nhanh chóng chiếm lĩnh thị trường tiêu thụ

Theo dự đoán của các nhà chiến lược, trong các loại nước giải khátđược sản xuất từ trái cây thì loại nước giải khát lên men được đánh giá là mặthàng “mạnh” trong tương lai vì đây là sản phẩm được đánh giá có giá trị dinhdưỡng cao nhờ quá trình lên men của vi sinh vật và rất phù hợp với thế hệ trẻ.

1.4.2 Ở Việt Nam

Việt Nam có khí hậu nóng khô nên nhu cầu sử dụng nước giải khát làrất lớn Mặc dù cho đến nay đã có một số công ty nước ngoài được cấp giấyphép đầu tư và sản xuất nước giải khát từ trái cây tại Việt Nam, song mức tiêuthụ bình quân của người Việt Nam mới chỉ đạt 0,16 lít/ người năm (là quáthấp so với nhiều quốc gia trong khu vực), trong khi nguồn nguyên liệu để sảnxuất nước trái cây ở Việt Nam lại vô cùng phong phú đa dạng hoàn toàn cóthể đáp ứng nhu cầu về nguyên liệu để sản xuất ổn định lâu dài lại đang cónguy cơ bị dư thừa do thiếu công nghệ chế biến phù hợp

Tại Việt Nam có những nghiên cứu về sản xuất nước ép và rượu vang

từ trái cây như: dứa, nho, dâu tây… Việc nghiên cứu nước trái cây lên men làhoàn toàn phù hợp với xu thế phát triển chung của thế giới và khu vực

Tuy nhiên việc lựa chọn nguyên liệu để có thể mang lại một loại nướcgiải khát lên men chất lượng cao, giá cả thích hợp cho người tiêu dùng khôngphải là vấn đề đơn giản và nó cũng đang là vấn đề cấp thiết đối với nghànhnước giải khát của Việt Nam Bởi chọn nguyên liệu phải nghiên cứu nguyênliệu có thỏa mãn về thành phần dinh dưỡng, giá cả, mùa vụ, trữ lượng haykhông hoặc có phù hợp với công nghệ sản xuất hay không Dù chưa phổ biếnnhưng những năm gần đây và trong tương lai nước giải khát lên men sẽ phổbiến Song để đạt được điều đó đòi hỏi Việt Nam phải tiếp tục nghiên cứu đểtận dụng các trái cây có sẵn tại Việt Nam để sản xuất nước giải khát lên mennhằm đa dạng hóa sản phẩm

Hiện tại, một số chuyên gia thực phẩm Viện nghiên cứu Hà Nội đã

dứa Bên cạnh nước quả lên men từ một loại quả thì hiện nay đã có nhiềucông trình nghiên cứu nước quả lên men hỗn hợp Ví dụ như quy trình nghiêncứu nước quả lên men hỗn hợp của Nguyễn Đỗ Hồng Hạnh – Khoa CNSTHthực hiện với phương trình dự kiến như sau:

Nguyên liệu 1 Nguyên liệu 2

Làm sạch Làm sạch

Phối trộn

Bổ sung đường, phụ không bổ sung

gia Thanh trùng

Làm nguội

Bổ sung menLắng, lọc cặn, thêm CO2

Sản phẩm

Trong các loại quả hiện có ở Việt Nam, quả nhãn chiếm sản lượng lớn

và chất lượng cao nhưng hiện nay nhãn vẫn chỉ được sử dụng làm thức ăntráng miệng Để góp phần làm đa dạng hóa sản phẩm đồ uống lên men và sửdụng có hiệu quả hơn nguồn đặc sản dồi dào là trái nhãn ở các địa phươngchúng tôi đề xuất một hướng nghiên cứu sử dụng nhãn để chế biến nước giảikhát lên men

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Box vô trùng (Haraeus)

- Cân (Precisa XT 320M - Thụy Sĩ)

- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)

- Nguồn cacbon: Glucose (C6H12O6), saccharose (C12H12O11), acidaxetic.

- Nguồn nitơ: Nấm men, pepton, (NH4)2SO4

- Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4, NaCl, CaCO3

- Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, tím gentian, phenolphtalein,

- H2SO4, thạch Agar, dịch nước nhãn

2.1.4.2 Các loại môi trường

- Môi trường phân lập và giữ giống: (MT1)

2.1.6 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Thời gian: tháng 9 năm 2018 đến tháng 4 năm 2019

Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật

Để chọn một tập hợp các tế bào nấm men ta sử dụng phương pháp phânlập trên đĩa petri Môi trường để tuyển chọn các chủng vsv là môi trườngHanxen.

Tiến hành phân lập: Sử dụng dịch giống có chứa vi sinh vật, cho dịchgiống vào ống nghiệm chứa nước cất thanh trùng Lắc đều bằng máy vonotextrong 5 phút thu được dịch huyền phù vi sinh vật Pha loãng dịch huyền phù ởcác nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-10 Dùng pipetman hút 50ml mẫu ở các

độ pha loãng 10-3 đến 10-10 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộppetri, dùng que chang chang đều Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong

5 - 7 ngày Dựa vào của hình thái khuẩn lạc chúng ta tiến hành tách một sốkhuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyểnsang thạch nghiêng bảo quản trong tủ lạnh

2.2.1.2 Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram, nhuộm đơn.

Nhuộm Gram: là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốcnhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi sinh vật

Các dung dịch thuốc nhuộm:

+ Thuốc nhuộm Fuchsin

+ Thuốc nhuộm Xanh methylene

Cách làm tiêu bản nhuộm bào tử nấm men

Cố định vết bôi: chuẩn bị vết bôi của nấm men trên lam kính, hơ nóngnhẹ để cố định vết bôi (cố định bằng nhiệt)

Nhuộm Fuchsin: đặt phiến kính lên thanh đỡ ngang trên cốc đong cóchứa nước đang sôi Đậy lên vết bôi một mẫu giấy thấm có kích thước vừavới phiến kính Phủ thuốc nhuộm Fuchsin lên phiến kính Để yên 5 phút

Lấy mẫu giấy ra, rửa thuốc nhuộm dư bằng nước và khử màu vết bôibằng dung dịch cồn 330C hoặc H2SO4 1 % trong khoảng thời gian 1 phút sau

đó rửa lại bằng nước trong 5 giây

Rửa lại với nước, thấm khô vết bôi nhẹ nhàng với giấy thấm rồi quansát dưới vật kính dầu của kính hiển vi.

Bào tử sẽ bắt màu đỏ, còn tế bào sẽ bắt màu xanh [3]

2.2.1.3 Phương pháp đếm số lượng tế bào

Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa.

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi sinh vật, pha loãng theo phươngpháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trangđều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 30oC sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc(CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào nấm men

trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [7].

N = A

Trong đó: N - Tổng số CFU trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu.

A - Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri

Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm

Đây là phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trongmẫu phân tích Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật đến 10-n, nhỏ một giọtdịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa buồng đếm và đậy lá kính, dichuyển nhẹ buồng đếm cho dịch chiếm đầy khoang Đếm số lượng tế bào theocác ô theo đường chéo hoặc theo các góc ở trung tâm buồng đếm Thườngđếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm buồng đếm để tính số lượng tế bàotrung bình của ô lớn Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1mlban đầu: [7]

N = A 25 : V : N

Trong đó: N – Số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù

A – Số lượng tế bào trung bình trong một ô lớn

V – Thể tích của 1 ô lớn

25 – Số ô đếm của toàn buồng đếm

2.2.1.4 Bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữgiống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 30oC Sau đó giữ trong tủlạnh 4oC dùng cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyền giữ giống trên thạchnghiêng định kì mỗi tháng một lần [7]

2.2.1.5 Phương pháp hoạt hóa giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sửdụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vậtcho quá trình lên men Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêuchuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút Sau

đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêngvào nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [5], [7]

2.2.1.6 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men đã phân lập tuyểnchọn thông qua xác định hàm lượng CO2 thoát ra (g/l dịch lên men) bằngphương pháp cân trọng lượng bình hàm lượng CO2 thoát ra càng nhiều thìchứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt

Phương pháp: dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250ml môitrường, có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau Sau 24hlên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại [5],[7]

2.2.1.7 Xác định khả năng kết lắng

Khả năng kết lắng của chủng nấm men được xác định bằng tốc độ lắngcủa sinh khối Phương pháp này được tiến hành như sau: hòa sinh khối vsvvào dung dịch đệm axetat được đựng trong ống nghiệm có hình dạng và kíchthước như nhau Lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 3– 5 phút để lắng 15 phút Lúc này toàn bộ khối đệm phân thành 2 lớp tiếnhành đo chiều cao lớp phía dưới trong từng ống nghiệm để xác định khả năng

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Xác định độ pH

pH được đo bằng máy đo pH meter (có độ chính xác 0,01)

2.2.2.2 Phát hiện hoạt tính catalaza

Các vi sinh vật có enzim chứa flavoprotein khử O2 tạo ra H2O2 hoặc O2đây là những chất oxi hóa cực mạnh, phá hủy nhanh chóng cấu trúc của tếbào Nhiều loài vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzim chuyển hóa cácchất trên Các enzim này có thể là catalaza hoặc peroxidaza như phương trìnhsau [7]

có trọng lượng là số điểm cho tương ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗichỉ tiêu chất lượng và được quy định trong bảng 2.3, hệ số quan trọng củatừng chỉ tiêu được quy định trong bảng 2.2, đánh giá mức chất lượng sảnphẩm ở bảng 2.4

Bảng 2.2 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu

Mùi Vị

0,8

Tổng cộng 4,0