Phát hiện gián tiếp đột biến gen EGFR trong ung thư biểu mô tuyến của phổi bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch

Với tốc độ phát triển dân số và sự gia tăng tuổi thọ như hiện nay thì ước tính đến năm 2050, thế giới sẽ có thêm khoảng 27 triệu trường hợp ung thư mới mắc và khoảng 17,5 triệu bệnh nhân

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

NINH VĂN QUYẾT

PH¸T HIÖN GI¸N TIÕP §éT BIÕN GEN EGFR TRONG UNG TH¦ BIÓU M¤ TUYÕN CñA PHæI B»NG Kü THUËT HãA M¤ MIÔN DÞCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

NINH VĂN QUYẾT

PH¸T HIÖN GI¸N TIÕP §éT BIÕN GEN EGFR TRONG UNG TH¦ BIÓU M¤ TUYÕN CñA PHæI B»NG Kü THUËT HãA M¤ MIÔN DÞCH

Chuyên ngành: Công nghệ Nano Sinh học

Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn:1 TS Trần Đăng Khoa

2 PGS.TS Nguyễn Văn Hưng

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

các Thầy, Cô Khoa Vật lý kỹ thuật và Công nghệ nano, đặc biệt là các thầy,

cô chuyên ngành Công nghệ nano Sinh học và Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Công nghệ - ĐHQGHN đã dạy dỗ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn của mình tới TS Trần Đăng Khoa, PGS.TS Nguyễn Văn Hưng là hai người thầy đã trực tiếp dạy

dỗ, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô, đồng nghiệp, những người đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi thực hiện luận văn gồm:

- Ban Giám đốc Trung tâm Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Bạch Mai cùng

tất cả các anh, chị nhân viên đồng nghiệp

- Các anh, chị đồng nghiệp tại Đơn vị Gen – Trung tâm Ung bướu và Y học hạt nhân – Bệnh viện Bạch Mai

Từ tận đáy lòng mình, xin được gửi lời cảm ơn chân tình nhất đến tất cả bệnh nhân cùng gia đình của họ đã giúp tôi có được các số liệu trong luận văn này

Cuối cùng, con xin ghi nhớ công ơn sinh thành, dưỡng dục của bố mẹ Con xin cảm ơn bố mẹ, và tất cả những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn luôn kề bên, là chỗ dựa vững chắc, giúp con vượt mọi trở ngại, khó khăn trong cuộc sống và công việc

Xin chân thành cảm ơn!

Ninh Văn Quyết

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Ninh Văn Quyết, học viên cao học khóa 22 của trường Đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội chuyên ngành Công nghệ nano Sinh học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy Trần Đăng Khoa, Thầy Nguyễn Văn Hưng

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Ninh Văn Quyết

CHỮ VIẾT TẮT

HMMD Hóa Mô Miễn Dịch EGFR Thụ thể yếu tố phát triển biểu bì MBH Mô Bệnh Học

UTBM Ung thƣ biểu mô UTBMT Ung thƣ biểu mô tuyến UTP Ung thƣ phổi

WHO Tổ chức y tế thế giới LPĐTTĐ Liệu pháp điều trị trúng đích

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về dịch tễ học ung thư phổi và các yếu tố nguy cơ 3

1.1.1 Dịch tễ học 3

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ 4

1.2 Một số đặc điểm lâm sàng – cận lâm sàng của ung thư phổi và ung thư biểu mô tuyến của phổi 7

1.2.1 Lâm sàng 7

1.2.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng khác 7

1.3 Đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến của phổi 9

1.3.1 Ung thư biểu mô tuyến xâm nhập thông thường 9

1.3.2 Các biến thể đặc biệt của ung thư biểu mô tuyến xâm nhập 10

1.3.3 Ung thư biểu mô tuyến tại chỗ 10

1.3.4 Ung thư biểu mô tuyến xâm nhập tối thiểu 11

1.4 Đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi 11 1.4.1 Đặc điểm phân tử EGFR 11

1.4.2 Đột biến gen EGFR trong ung thư biểu mô tuyến của phổi 13

1.5 Hóa mô miễn dịch 15

1.5.1 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch 15

1.5.2 Các nguyên lý của phương pháp hóa mô miễn dịch 16

1.5.3 Yêu cầu kỹ thuật 18

1.5.4 Phương pháp 18

1.6 Một số phương pháp khác phát hiện đột biến gen EGFR 22

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng 26

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn 26

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 26

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 26

2.1.5 Thời gian nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 27

2.2.2 Cỡ mẫu và chọn mẫu 27

2.2.3 Biến số nghiên cứu 27

2.2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu 28

2.2.5 Xử lí số liệu 28

2.2.6 Khía cạnh đạo đức nghiên cứu 28

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Phân bố bệnh theo tuổi và giới 29

3.2 Chất lượng tiêu bản được phủ chất hiện màu ở thời gian 1 phút và 3 phút 30

3.3 Hóa mô miễn dịch đột biến gen EGFR 31

3.3.1 Bộc lộ dấu ấn EGFR 31

3.3.2 Bộc lộ dấu ấn EGFR đánh giá theo mức độ biểu hiện trên HMMD 32

3.4 Một số mối liên quan 32

3.4.1 Bộc lộ dấu ấn EGFR theo tuổi 32

3.4.2 Bộc lộ dấu ấn EGFR theo giới 33

3.5 Đối chiếu kết quả giữa hóa mô miễn dịch và phương pháp PCR phát hiện đột biến gen EGFR trong UTBMT phổi 33

Chương 4: BÀN LUẬN 36

4.1 Một số đặc điểm về giới và tuổi 36

4.2 Thời gian phủ chất hiện màu ảnh hưởng đến chất lượng tiêu bản 37

4.3 Bộc lộ EGFR 37

4.4 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với các yếu tố 39

4.4.1 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với tuổi 39

4.4.2 Liên quan giữa bộc lộ EGFR với giới 40

4.5 Đối chiếu kết quả giữa hóa mô miễn dịch và phương pháp PCR phát hiện đột biến gen EGFR trong UTBMT phổi 40

KẾT LUẬN 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng1.1: Trình tự một số mồi nhân dòng exon EGFR 25Bảng 3.1: Phân bố bệnh theo nhóm tuổi và giới 29Bảng 3.2: Chất lượng tiêu bản được nhuộm HMMD và phủ DaB ở thời

gian 1 phút và 3 phút 30Bảng 3.3: Bộc lộc dấu ấn EGFR 31Bảng3.4: Bộc lộ dấu ấn EGFR đánh giá theo mức độ biểu hiện trên

HMMD 32Bảng 3.5: Bộc lộ dấu ấn EGFR theo tuổi 32Bảng 3.6: Bộc lộ dấu ấn EGFR theo giới 33Bảng 3.7: Kết quả giữa phương pháp HMMD và phương pháp PCR

trong phát hiện đột biến gen EGFR 33

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Phân bố bệnh theo giới 29

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh UTP trên X-quang thường quy ngực và trên nội soi phế quản 8

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc và hoạt động của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô 12

Hình 1.3: Cơ chế gây đột biến 14

Hình 1.4: Cấu trúc kháng nguyên – kháng thể 19

Hình 1.5: Nguyên lý và mô tả phương pháp hóa mô miễn dịch 20

Hình 1.6: Ảnh minh họa dương tính EGFR 22

Hình 3.1: Tiêu bản nhuộm lỗi, phủ DAB lâu bị nền 30

Hình 3.2: Tiêu bản nhuộm HMMD bị lỗi, tiêu bản bị gấp xước 31

Hình 3.3: Tiêu bản nhuộm HMMD đạt chất lượng 34

Hình 3.4: Minh họa kết quả PCR-EGFR 35

8,12,14,19,20,29,30,31,34,35

1-7,9-11,13,15-18,21-28,32-33,36-56,65-

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, trên toàn thế giới, bệnh ung thư đã vượt qua bệnh tim mạch để trở thành căn nguyên gây tử vong hàng đầu với tỷ lệ mắc bệnh cao và độ tuổi mắc bệnh ngày càng giảm[6][9] [70] Với tốc độ phát triển dân số và sự gia tăng tuổi thọ như hiện nay thì ước tính đến năm 2050, thế giới sẽ có thêm khoảng 27 triệu trường hợp ung thư mới mắc và khoảng 17,5 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm[6] [70]; trong đó phải kể đến ung thư phổi (UTP), căn nguyên gây tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu với thể ung thư biểu mô tuyến của phổichiếmđến40%cáctrườnghợp [12][13]

Những nghiên cứu thực hiện ở các nước có nền y học tiên tiến cho thấy việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị đã mang lại những lợi ích nổi bật cho bệnh nhân ung thư Các nhà khoa học có thể đánh giá một cách tổng quát sự tương tác gen, các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào

và ảnh hưởng của các dòng thác tín hiệu trong tế bào đến quá trình tái bản, sao chép và phiên mã, từ đó tác động lên quá trình sinh trưởng, biệt hóa, di chuyển

và chết theo chương trình của tế bào Như vậy, với mỗi một biến đổi gen xảy ra đều có thể làm thay đổi sự cân bằng các hoạt động sống tế bào, biến một tế bào lành trở thành tế bào ác tính hoặc gây chết tế bào Mặt khác, có những biến đổi gen lại khiến các tế bào trở nên nhạy cảm hoặc đề kháng hơn với những tác nhân ngoại bào như tác nhân lý, hóa Trong đó, sự thay đổi tính đáp ứng của tế bào với các các thuốc điều trị ung thư là một ví dụ điển hình Đây là cơ sở khoa học để các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng các loại thuốc mới tác động trực tiếp lên các thụ thể tế bào nhằm ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gọi

là liệu pháp điều trị ung thư trúng đích (targeted cancer therapy) Ưu điểm của phương pháp này là liều điều trịthấp, đặc hiệu, ít độc hại và đặc biệt là hiệu quả được nâng cao một cách rõ rệt, thể trạng người bệnh được tăng cường

và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân[9][28]

Việc phân tích tình trạng các gen đóng vai trò chủ chốt trong quá trình phát sinh khối u giúp các bác sĩ lựa chọn pháp đồ điều trị phù hợp nhất để nâng cao hiệu quả điều trị đích cho người bệnh Qua nhiều công trình nghiên cứu cũng như sự kiểm duyệt khắt khe của các Tổ chức quản lý y dược uy tín trên thế giới (FDA-Hoa Kì, EMEA-Liên Minh Châu Âu), liệu pháp điều trị trúng đích (LPĐTTĐ) đã chứng tỏ hiệu quả rất tốt trong việc điều trị cho các bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi giai đoạn cuối: kích thước các khối u giảm đáng kể, thời gian sống kéo dài hơn, chất lượng cuộc sống được cải thiện, … Tuy nhiên, mức độ đáp ứng với thuốc điều trị đích ở mỗi bệnh nhân phụ thuộc phần lớn vào tình trạng một số gen, mà quan trọng nhất là gen EGFR Việc xác định đột biến gen hay sự tương tác protein bị đột biến có ý nghĩa rất lớn giúp bác sĩ lựa chọn được phác đồ điều trị thích hợp để nâng cao hiệu quả điều trị đích cho bệnh nhân Tháng 6/2009, Cục Quản lý Thực phẩm

và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chính thức đưa ra khuyến cáo: bệnh nhân trước khi được chỉ định dùng thuốc ức chế EGFR cần phải được làm xét nghiệm tình trạng gen[17][78]

Tại Việt Nam, số lượng bệnh nhân bệnh ung thư ngày càng nhiều, nhu cầu sử dụng LPĐTTĐ ngày càng tăng, trên thị trường đã có một số dược phẩmđiềutrịđíchđangđượclưuhành;tuynhiênbệnh nhân muốn sử dụng LPĐTTĐ cần phải được làm xét nghiệm đột biến gen Xuất phát từ thực tiễn

đó, đề tàinghiêncứu“Phát hiện gián tiếp đột biến gen EGFR trong ung thư biểu mô tuyến của phổi bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch”được thực hiện với

các mục tiêu sau:

1 Khảo sát kỹ thuật hóa mô miễn dịch xác định đột biến gen EGFR

2 Xác định tỷ lệ đột biến gen EGFR trong ung thư biểu mô tuyến của phổi

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về dịch tễ học ung thư phổi và các yếu tố nguy cơ

1.1.1 Dịch tễ học

 Thế giới

Kể từ năm 1985, UTP đã đứng đầu trong các bệnh lý ung thư cả về tỉ lệ

mắc và tử vong trên toàn cầu[14][103] Tính tại thời điểm năm 2012, cả thế giới có khoảng 1,8 triệu ca UTP mới mắc (chiếm 12,9% tổng số ca ung thư mới mắc), 1,59 triệu ca tử vong (chiếm 19,4% tổng số ca tử vong do ung thư) [3][78][102] Tại Hoa Kỳ, theo số liệu năm 2016 của American Cancer Society, số ca mắc mới UTP là 224390 ca (chiếm khoảng 13% tổng số ca ung thư mới mắc), số ca tử vong do UTP là 158080 ca Cũng theo đó, tổng số ca

tử vong do ung thư đại tràng (49190 ca), vú (40890 ca), tiền liệt tuyến (26120 ca) chỉ chiếm xấp xỉ gần 3/4 tổng số ca tử vong của UTP[19][70]

Về mặt phân bố theo giới, trên toàn cầu năm 2012, UTP là bệnh lý ung thư hay gặp nhất ở nam, xếp sau đó là ung thư tiền liệt tuyến và ung thư đại trực tràng, chiếm tỉ lệ xấp xỉ 17% tổng số ca ung thư mới mắc ở nam; ở nữ, UTP chỉ đứng hàng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng, chiếm gần 9% tổng số ca ung thư mới mắc của giới này[19][21][102] Trước đây, nhìn chung UTP hay gặp và gây tử vong cho nam giới nhiều hơn hẳn nữ giới trên nhiều quốc gia Tuy nhiên, hiện nay khoảng cách đó đã dần bị xóa bỏ, bệnh có

tỉ lệ mắc và tử vong gần như tương đương nhau ở cả 2 giới Tại Hoa Kỳ, tỉ lệ mắc và tử vong của nam/nữ đã thay đổi rõ rệt: năm 2004 tương ứng là 1,15/1

và 1,34/1 đến năm 2016 ước tính các tỉ lệ này tương ứng chỉ còn 1,11/1 và 1,19/1[3][19][77]

UTBMT cùng với UTBM vảy, UTBM tế bào nhỏ và UTBM tế bào lớn

là các týp MBH hay gặp nhất của UTP UTBMT đến giai đoạn 2006 – 2010

đã chiếm tới hơn 40% các ca UTP, trở thành týp MBH hay gặp nhất của UTP nói chung[13][14][79] Đến nay, UTBMT đã thay thế UTBM vảy để trở thành týp MBH hay gặp nhất ở nam giới, đồng thời vẫn luôn là týp MBH phổ biến nhất ở nữ giới trong thời gian dài[13][14]

 Việt Nam

Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, UTP đứng hàng thứ hai về tỉ lệ

tử vong của các loại ung thư hằng năm ở cả hai giới nam và nữ Mỗi năm cả nước có hơn 20000 bệnh nhân UTP mới được phát hiện và có tới 17000 trường hợp tử vong Riêng tại Bệnh viện Phổi Trung ương, theo Lê Trung Thọ, tính đến năm 2012, số người mắc bệnh này đến khám và điều trị đã lên tới 16677 người[4][6][34] Theo số liệu ghi nhân ung thư tại Hà Nội giai đoạn 2001 –

2004, ước tính hằng năm có 17073 trường hợp mắc mới UTP, trong đó có

12958 nam và 4115 nữ và là ung thư đứng đầu ở nam giới[4][47] Theo Phạm Duy Hiển và cộng sự, nghiên cứu trên 1151 trường hợp UTP tại thành phố Hồ Chí Minh, UTBMT chiếm tỉ lệ rất cao, lên tới 48,54% [8] Theo Phạm Nguyên Cường (2015), trong tổng số 258 trường hợp UTP có 67,1% là týp UTBMT, týp UTBM vảy chỉ chiếm 11,4%, các týp chiếm tỉ lệ rất nhỏ [5]

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ

 Thuốc lá

Thuốc lá là yếu tố nguy cơ quan trọng hàng đầu làm gia tăng UTP, dịch

tễ học UTP thay đổi gần như song song với sự phổ biến của thuốc lá Không chỉ những người hút, mà cả những người hít phải khói thuốc (hút thuốc lá bị động) cũng có nguy cơ cao mắc UTP, đặc biệt là týp UTBMT tại chỗ [13][20] Thuốc lá chứa hơn 4000 hợp chất hóa học [5], trong đó có nhiều

chất đã được chứng minh có khả năng gây ra UTP như carbon oxit và nitrosamine Tại Hoa Kỳ, khoảng 80% - 90% các ca UTP có liên quan đến hút thuốc lá [26][33] Nguy cơ mắc UTP tăng lên theo thời gian hút và số lượng thuốc lá hút mỗi ngày, gấp 9 đến 10 lần với nam giới hút thuốc mức độ trung bình và ít nhất 20 lần với người nghiện hút thuốc lá [103]

Bằng chứng về xu hướng thay đổi trong các týp MBH UTP được xem xét một cách toàn diện tại báo cáo của Hội ngoại khoa Hoa Kỳ năm 2014 Báo cáo đã đưa ra 4 kết luận quan trọng liên quan đến sự thay đổi trong mô hình UTP liên quan đến thuốc lá:

- Có đủ bằng chứng để kết luận rằng nguy cơ làm phát triển UTBMT của phổi do hút thuốc lá tăng lên từ những năm 1960

- Có đủ bằng chứng để kết luận rằng sự tăng nguy cơ bị UTBMT của phổi ở những người hút thuốc lá là hậu quả từ sự thay đổi trong cấu trúc và thành phần của thuốc lá từ những năm 1950

- Chưa có đầy đủ bằng chứng để kết luận sự thay đổi nào trong cấu trúc của thuốc lá gây tăng nguy cơ bị UTBMT của phổi, nhưng có một chứng cứ gợi ý được đưa ra là các đầu lọc và sự tăng hàm lượng nitrosamine trong thuốc lá đóng vai trò gây hậu quả này

- Bằng chứng chỉ ra rằng sự giảm tỉ lệ mắc UTBM vảy theo sau sự giảm

tỉ lệ hút thuốc lá

 Yếu tố nghề nghiệp

Radon là một loại khí gas có sẵn trong tự nhiên, hình thành do sự phân

rã của các nguyên tố uranium, thorium và radium trong đất đá Nồng độ của khí này thay đổi tùy vị trí địa lý, và thường có mức độ tập trung rất cao ở các khu vực hầm mỏ Radon không màu, không mùi, không vị, có khả năng phát

tia phóng xa và tùy vào mức độ và thời gian tiếp xúc có thể trở thành tác nhân gây UTP Tại Mỹ, nói chung Radon là nguyên nhân gây UTP đứng thứ hai sau thuốc lá và là nguyên nhân hàng đầu trong nhóm không hút thuốc lá, với khoảng 15000 đến 22000 ca tử vong có liên quan đến Radon[16][81] Radon

có thể hiệp đồng với thuốc lá làm tăng nguy cơ mắc UTP lên gấp nhiều lần

Amiante là nguyên nhân gây UTP liên quan đến nghề nghiệp được biết

đến rõ nhất và hay găp nhất Amiante gồm 2 nhóm chính là Amphibole và Serpentine hay còn gọi là Amiante trắng Nhóm Amphibole khi lưu thông qua đường hô hấp, bị hấp thụ tại phổi thì rất khó đào thải ra ngoài Đây là nguyên nhân chính gây UTP và u trung biểu mô Nguy cơ tương đối gây UTP của Amiante là 6 lần, trong khi của thuốc lá là 11 lần, nhưng nếu đồng thời phơi nhiễm với cả 2 yếu tố thì nguy cơ mắc có thể tăng lên 59 lần [16][103]

Ngoài ra cũng đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra nhiều nguyên nhân gây UTP khác có liên quan đến yếu tố nghề nghiệp được biết đến như niken, thạch tím, than, nhựa, khí đốt…Nguy cơ gây ung thư phụ thuộc vào mức độ và thời gian tiếp xúc với các tác nhân và khả năng hiệp đồng giữa chúng

 Một số yếu tố nguy cơ khác

Tiền sử gia đình có người mắc UTP, tình trạng miễn dịch kém, mắc bệnh hô hấp mạn tính…đều là các yếu tố làm tăng nguy cơ mắc UTP đã được chứng minh Nếu gia đình có người mắc UTP thì nguy cơ mắc UTP ở thế hệ đầu tiên tăng lên gấp khoảng 1,5 lần Bệnh nhân đã từng bị lao phổi có nguy

cơ mắc UTP cao gấp 2 lần so với người bình thường, và nguy cơ này tiếp tục kéo dài sau 20 năm kể từ khi mắc lao phổi[16][103]

1.2 Một số đặc điểm lâm sàng – cận lâm sàng của ung thư phổi và ung thư biểu mô tuyến của phổi

1.2.1 Lâm sàng

 Biểu hiện hô hấp

- Ho dai dẳng, kéo dài, nặng dần lên, điều trị thông thường không khỏi

- Hội chứng cận u : hội chứng Cushing, Pierre – Marrie, hội chứng vú to…

 Biểu hiện di căn

- Tùy thuộc vào cơ quan mà UTP đi tới, thường gặp nhất là di căn não, xương, tuyến thượng thận, gan, hạch ngoại vi, phối đối bên mà bệnh nhân có các triệu chứng tương ứng như đau đầu, co giật, hoàng đảm, đau xương…

1.2.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng khác

1.2.2.1 Xquang thường quy (thẳng, nghiêng)

Hình ảnh nốt, đám mờ : đây là dấu hiệu quan trọng và hay gặp nhất Những dấu hiệu gợi ý ác tính bao gồm bờ không nhẵn, gợi hình ảnh chia thùy,

múi, xâm lấn trực tiếp vào màng phổi, thành ngực hoặc trung thất…Đôi lúc

có thể gặp hình ảnh tạo hang trong ung thư với đặc điểm hang lệch tâm, bờ ghồ ghề, khúc khuỷu

1.2.2.2 Chụp cắt lớp vi tính

So với Xquang thường quy chỉ có khả năng phát hiện các tổn thương u phổi kích thước từ 0,8 cm đến 1 cm trở lên, chụp cắt lớp vi tính có khả năng phát hiện các tổn thương nhỏ tới 0,3 cm Những đặc điểm hướng tới ác tính trên chụp cắt lớp vi tính cũng tương tự như Xquang thường quy Ngoài ra, phương pháp này còn có giá trị giúp phát hiện xâm lấn u vào mô kế cận, các ổ

di căn nhỏ

1.2.2.3 Nội soi phế quản

Nội soi phế quản có vai trò trong cả chẩn đoán và điều trị UTP Nội soi ống mềm thường được sử dụng để chẩn đoán UTP, từ đó có thể thấy trực tiếp hình ảnh tổn thương ung thư hoặc gián tiếp với hình ảnh lòng phế quản bị thu hẹp, bít tắc Phương pháp này rất có hiệu quả với các u ở trung tâm Thông qua nội soi phế quản còn có thể thực hiện sinh thiết chẩn đoán MBH, chải, rửa phế quản lấy tế bào bong để chẩn đoán UTP trên tế bào học

Hình 1.1: Hình ảnh UTP trên X-quang thường quy ngực [3][67] và trên

nội soi phế quản[3][59]

1.3 Đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến của phổi[12][13][79]

1.3.1 Ung thư biểu mô tuyến xâm nhập thông thường

Về cấu trúc, UTBMT xâm nhập thông thường có thể có một dạng phát triển

u duy nhất hoăc phối hợp nhiều dạng phát triển (Lepidic, chùm nang, nhú, vi nhú, đặc)

 Dạng phát triển Lepidic (Lepidic growth pattern)

Tế bào u phát triển thành một hàng, dọc theo bề mặt các vách phế nang,

kèm theo sự xơ hóa, dầy lên của vách phế nang, hình thái cấu trúc chung của vách phế nang vẫn được bảo tồn Tế bào u hình khối vuông, hoặc hơi tròn, bào tương hẹp, nhân không điển hình ở mức độ thấp đến trung bình, nhân tăng sắc, chất nhiễm sắc phân tán tương đối đều, hạt nhân nhỏ, nhân thường

có khía hoặc thể giả vùi

 Dạng phát triển chùm nang (Acinar growth pattern)

Tế bào u phát triển tạo cấu trúc dạng tuyến, ống gập góc, kích thước đa

dạng, dạng mắt sàng hoặc gợi cấu trúc đặc những vẫn tạo cực tính Chất nhầy

có thể xuất hiện trong lòng tuyến hoặc trong bào tương tế bào u

 Dạng phát triển nhú (Papillary growth pattern)

Các tế bào u tạo cấu trúc nhú với trục xơ mạch thật sự, kích thước đa dạng Đặc điểm tế bào u trong dạng phát triển này cũng rất thay đổi, có thể từ đơn dạng, mức độ không điển hình thấp đến rất đa hình thái, ác tính rõ Ngoài

ra, trong dạng phát triển nhú còn hay bắt gặp các thể cát

 Dạng phát triển vi nhú (Micropapillary growth pattern)

Các tế bào u tăng sinh tạo cấu trúc dạng chồi hay dạng nhú thấp, nhỏ

mà không có trục liên kết xơ mạch rõ Hình thái tế bào u trong dạng này cũng thay đổi từ mức đơn dạng, không điển hình mức độ nhẹ đến đa hình thái, ác tính rõ

 Dạng phát triển đặc (Solid growth pattern)

Tế bào u tăng sinh, liên kết tạo cấu trúc dạng ổ, đám đặc, sắp xếp lộn

xộn, không rõ cực tính Tế bào u hình đa diện, nhân kích thước lớn, kiềm tính,

và thường có xu hướng rất đa hình thái

1.3.2 Các biến thể đặc biệt của ung thư biểu mô tuyến xâm nhập

 Ung thư biểu mô tuyến nhầy xâm nhập (Invasive mucinous

adenocarcinoma)

Cấu trúc u có thể có các dạng nêu trên Mô u có thể chế nhầy ngoại bào

mạnh, làm giãn rộng các khoang phế nang lợp bởi các tế bào u hoặc khoang phế nang lân cận nhưng không phá vỡ cấu trúc, hình thái của phế nang

 Ung thư biểu mô tuyến dạng keo (Colloid adenocarcinoma)

Mô u chế nhầy ngoại bào mạnh, tạo nhiều bể nhầy lớn, lan tỏa, phá vỡ

cấu trúc phế nang, xâm nhập mô phổi kế cận, trong ổ nhầy có thể có một số tế bào u đơn lẻ hoặc đám tế bào u trôi nổi

 Ung thư biểu mô tuyến týp ruột (Enteric adenocarcinoma)

Biến thể này có đặc điểm hình thái mô u giống như UTBMT của đại trực tràng

 Ung thư biểu mô tuyến bào thai (Fetal adenocarcinoma)

Đây là biến thể rất hiếm gặp của UTBMT của phổi MBH của u gợi lại hình ảnh MBH của phổi bào thai

1.3.3 Ung thư biểu mô tuyến tại chỗ (Adenocarcinoma in situ - AIS)

UTBMT tại chỗ của phổi là tổn thương đơn độc, kích thước > 0,5 cm

và ≤ 3 cm, có cấu trúc hoàn toàn là dạng phát triển Lepidic, và không có bất

cứ bằng chứng xâm nhập nào của mô u Trong trường hợp có nhiều hơn một ổ tổn thương gồm nhiều ổ ung thư nguyên phát khác nhau thì tổn thương có đầy

đủ tính chất trên vẫn được coi là UTBMT tại chỗ

1.3.4 Ung thư biểu mô tuyến xâm nhập tối thiểu (Minimally invasive adenocarcinoma - MIA)

UTBMT xâm nhập tối thiểu đa số thuộc nhóm không chế nhầy, tuy

nhiên vẫn có tỉ lệ nhỏ thuộc nhóm chế nhầy với đặc điểm tế bào giống như UTBMT nhầy xâm nhập

Để chẩn đoán cần đầy đủ các tiêu chuẩn MBH sau:

 U kích thước ≤ 3 cm

 Cấu trúc mô u chủ yếu dạng Lepidic

 Không có xâm nhập mạch, màng phổi, phế nang

 Không có hoại tử

 Ổ xâm nhập mô phổi có kích thước ≤ 5 mm, với cấu trúc không phải dạng Lepidic (là dạng chùm nang, nhú, vi nhú, đặc) hoặc có tế bào u trong mô đệm phản ứng xơ hóa Nếu ổ xâm nhập với tính chất trên có kích thước > 5 mm thì sẽ được xếp vào UTBMT xâm nhập Nếu có nhiều ổ xâm nhập thì cần xác định kích thước thông qua tổng số % các

ổ sau đó nhân với kích thước u để tính ra kích thước xâm nhập

1.4 Đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi

1.4.1 Đặc điểm phân tử EGFR

EGFR hay thụ thể yếu tố phát triển biểu bì, là một thành viên thuộc

nhóm thụ thể xuyên màng có hoạt tính tyrosine kinase gồm 4 loại: ERBB1/Her1/EGFR, ERBB/Her2, ERBB/Her3 và ERBB/Her4 [25] EGFR là glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 170 kDa, xuất hiện ở một số mô

có nguồn gốc biểu mô, trung mô và mô thần kinh[10][101]

EGFR có cấu trúc gồm 3 phần: phần ngoại màng có khả năng gắn đặc hiệu với ligand (EGF, TGFα…), phần xuyên màng và phần nội màng Phần nội màng bao gồm một vùng ngắn cạnh màng dài 38 axit amin và vùng tyrosine kinase chiếm khoảng 50% chiều dài vùng nội màng và đuôi carboxyl tận cùng[10],[24], [52]

Khi vùng ngoại bào của EGFR gắn với ligand đặc hiệu như EGF, TGFα…, phân tử EGFR sẽ có thể thực hiên phản ứng nhị hợp với một EGFR khác lân cận hoặc một thành viên khác thuộc gia đình ERBB [27],[33],[33]

Sự trùng hợp đồng loại hoặc khác loại này sẽ khiến EGFR thay đổi cấu hình, xảy ra sự phosphoryl hóa phần nội màng (trao đổi gốc phosphate từ phân tử ATP sang vị trí gắn đặc hiệu trên vùng tyrosine kinase của phân tử EGFR), dẫn đến tạo ra một dòng thác tín hiệu liên tục, gây hoạt hóa các trục RAS/RAF/ERK, PI3K/AKT, STAT…Các trục tín hiệu này có vai trò quan trọng trong điều hòa sự sống tế bào, bao gồm cả sư sinh sản, tồn tại và chết theo chương trình của tế bào[10],[60],[105],[39]

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc và hoạt động của thụ thể yếu tố tăng trưởng

biểu mô

(A) Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR) gồm ba vùng: vùng ngoại bào chứa miền tương tác với yếu tố tăng trưởng, vùng xuyên màng tế bào, và vùng nội bào chứa miền tyrosine kinase (B) Hoạt động của EGFR: khi yếu tố tăng trưởng biểu mô liên kết vào thụ thể, hai phân tử EGFR kết hợp với nhau (dimer hóa), từ đó

tự phosphoryl hóa vùng tyrosine kinase giúp EGFR kết hợp được với các phân tử

tín hiệu ở giai đoạn sau của con đường tín hiệu

1.4.2 Đột biến gen EGFR trong ung thư biểu mô tuyến của phổi

Đột biến gen EGFR chủ yếu xảy ra ở người Đông Á, không hút thuốc,

phụ nữ [30] [65] Trong các týp MBH của UTP thì UTBMT có tần suất mắc đột biến gen EGFR cao nhất Các loại đột biến gen EGFR chủ yếu gây ra sự phosphoryl hóa không phụ thuộc ligand của phân tử EGFR, dẫn đến sự kích hoạt liên tục các trục tín hiệu RAS/RAF, PI3K/AKT, STAT…Hậu quả là sự tăng sinh tế bào, ức chế quá trình chết theo chương trình, tăng sinh mạch máu, thoát khỏi kiểm soát miễn dịch của cơ thể đối với tế bào u

Dựa vào tính chất sinh bệnh học như trên, liệu pháp điều trị trúng đích với cơ chế kinh điển ức chế hoạt tính tyrosine kinase bằng cách cạnh tranh trực tiếp vào vị trí gắn gốc phosphate của ATP trên vùng tyrosine kinase đã ra đời Thế hệ thuốc tác dụng đích ức chế hoat tính tyrosine kinase (Tyrosine kinase inhibitor – TKI) đầu tiên là Gefitinib và Erlotinib[7], [22] Tuy nhiên, người ta nhận thấy rằng, sau khi dùng TKI, hầu hết các bệnh nhân UTBMT đều xuất hiện các đột biến kháng thuốc mắc phải/thứ phát với thời gian thay đổi tùy theo các nghiên cứu, có thể từ 6 tháng đến hơn 1 năm[7][109],[68],[69] Bên cạnh các đột biến kháng TKI thứ phát, vẫn có một tỉ lệ nhất định đột biến kháng thuốc nguyên phát Cơ chế gây ra đột biến kháng thuốc này còn chưa được sáng tỏ, tuy nhiên đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra được một số loại đột biến gen EGFR như đột biến T790M ở exon 20 có liên quan đến tính kháng thuốc Đột biến kép T790M/L8585R có khả năng làm tăng ái lực với ATP của vùng tyrosine kinase (nếu chỉ một mình đột biến T790M không có khả năng làm tăng

ái lực của vùng tyrosine kinase với ATP) [66]

Hình 1.3: Cơ chế gây đột biến

Gen quy định EGFR nằm ở nhiễm sắc thể 7p12 gồm 30 exon Đột biến gen EGFR chủ yếu xảy ra ở exon 18, 19, 20, 21, được chia làm 3 nhóm chính, trong đó đột biến gen EGFR nhạy cảm với TKI chủ yếu thuộc nhóm I, II Nhóm I bao gồm các đột biến xóa đoạn ở exon 19, chiếm khoảng 44% các đột biến hoạt hóa vùng tyrosine kinase của EGFR, trong đó rất hay gặp sự xóa các axit amin tương ứng từ vị trí 747 – Leucine đến 749 – Axit glutamic Nhóm II gồm các đột biến thay thế 1 cặp nucleotid, dẫn đến thay 1 axit amin tương ứng, trong đó đột biến thay Arginine bằng Leucine tại codon L858 (đột biến điểm L858R) ở exon 21 có tỉ lệ gặp cao nhất, chiếm khoảng 41% các đột biến hoạt hóa vùng tyrosine kinase của EGFR Nhóm III gồm các đột biến lặp và thêm đoạn ở exon 20, chiếm khoảng 5% các đột biến hoạt hóa vùng tyrosine kinase của EGFR [105] Nhóm này chứa các đột biến làm tế bào UTP có khả năng kháng lại điều trị đích như T790M, V769L, S768I…[7],[16],[24]

1.5 Hóa mô miễn dịch

1.5.1 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch

Hóa mô miễn dịch (HMMD) là sự kết hợp giữa mô học và miễn dịch học nhằm xác định sự biểu hiện của một kháng nguyên riêng biệt của một mô

và tình trạng kháng nguyên khác nhau của các tế bào trong cùng một mô, dựa vào tính chất đặc hiệu cao của các kháng thể để xác định các kháng nguyên riêng biệt Từ đó nhận dạng đặc hiệu dòng các quần thể tế bào, xác định đƣợc các đặc tính sinh học và chức năng các tế bào trong cùng một dòng[9][10]

Trong lĩnh vực giải phẫu bệnh ngoại khoa, HMMD góp phần quan trọng nâng cao chất lƣợng chẩn đoán Kỹ thuật HMMD có thể áp dụng trên các tiêu bản cắt từ bệnh phẩm đúc paraffin các bệnh phẩm mô và dịch cơ thể

Có thể nói thực hiện thành công kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch trên các mảnh vùi trong paraffin là một cuộc cách mạng trong bệnh học phân tử

Có nhiều kháng nguyên rất bền vững, nhưng cũng có những kháng nguyên rất nhanh bị phân hủy, một số kháng nguyên chỉ tồn tại trên tiêu bản cắt lạnh nhưng lại bị mất tính kháng nguyên trong quá trình chuyển đúc Do vậy công tác kỹ thuật sau khi lấy bệnh phẩm là hết sức quan trọng

HMMD đang được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực chẩn đoán các bệnh ung thư, trong đó có bệnh ung thư phổi, một trong 10 loại ung thư phổ biến nhất hiện nay Tại Việt Nam, việc nghiên cứu bộc lộ các sản phẩm gen

và các dấu ấn miễn dịch bằng nhuộm HMMD trong ung thư biểu mô tuyến của phổi còn chưa được nghiên cứu nhiều Tìm hiểu nguyên lý của phương pháp HMMD và các dấu ấn miễn dịch là cơ sở cho các nhà giải phẫu bệnh trong việc góp phần chẩn đoán chính xác bệnh ung thư phổi để bệnh nhân sớm được điều trị tốt nhất[5],[10]

1.5.2 Các nguyên lý của phương pháp hóa mô miễn dịch

HMMD là một kỹ thuật nhuộm đặc biệt, sử dụng kháng thể (KT) đặc hiệu để xác đinh sự hiện diện của các kháng nguyên (KN) tương ứng trên các lát cắt mô học hoặc trên các loại tế bào có trong mô Nguyên tắc là cho KT đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có KN sẽ có phản ứng kết hợp KN – KT Khi phản ứng xảy ra sẽ cho kết hợp với chất hiện màu và có thể nhìn thấy trên kính hiển vi quang học

Kháng nguyên: các KN thường là các protein, một số khác là carbohydrat, có thể từ ngoài cơ thể vào (vi khuẩn, độc tố, virus…) hoặc từ trong cơ thể (các tơ trung gian, các thụ thể hormon, các protein là sản phẩm của đột biến gen…, có thể hiện diện ở bào tương, màng tế bào hoặc nhân)

Quyết định KN (epitop) là một phần nhỏ của KN, nơi tiếp xúc với KT Một KN có thể có vài epitop, mỗi epitop được nhận biết bởi một KT riêng biệt Trong quy trình nhuộm HMMD, cần bộc lộ epitop trước khi cho tiếp xúc với KT

Kháng thể: là các protein nhận biết và kết nối với KN đặc hiệu, mỗi

KT có ít nhất hai vị trí kết nối KN KT chủ yếu là IgG, tiếp đến là IgM

KT kết hợp trực tiếp với KN gọi là KT thứ nhất Tùy theo cách sản xuất

có 02 loại KT:

+ KT đa dòng: được sản xuất bằng cách gây miễn dịch ở động vật với

KN đặc hiệu Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không đặc hiệu Sau đó KT được làm tinh khiết (loại bỏ các KT không cần thiết) KT đa dòng có thể kết hợp với nhiều vị trí của một KN nên độ nhạy cao, tăng khả năng phát hiện Tuy nhiên

KT đa dòng có thể chứa các KT phản ứng không đặc hiệu với các KN nên có khuynh hướng nhuộm nền cao

+ KT đơn dòng: được sản xuất bằng kỹ thuật u lai, phối hợp khả năng tạo

KT đặc hiệu từ tương bào với lympho bào B ở lách động vật được gây miễn dịch, hình thành nhiều dòng tế bào u lai sản xuất ra KT đặc hiệu Các tế bào này được lựa chọn và nhân giống trong môi trường nuôi cấy tế bào KT đơn dòng được sản xuất ra từ một dòng của tế bào u lai nên rất tinh khiết, chỉ phản ứng với một loại quyết định KN Tuy nhiên, vì Kt đơn dòng chỉ phản ứng với một vị trí đặc hiệu chứ không phải toàn bộ KN nên ít nhạy hơn so với KT đa dòng Hơn nữa, một số KT đơn dòng chỉ phản ứng được trên tiêu bản cắt lạnh Cấu trúc của KT có hình chữ Y với 4 chuỗi protein, gồm 02 chuỗi nhẹ và

02 chuỗi nặng KT có hai vùng:

+ Vùng thay đổi (Fab): hai phần đầu của nhánh chữ Y chứa vị trí kết nối KN + Vùng ổn định (Fc): phần gốc của chữ Y, đây là vùng rất quan trọng vì

có thể kết nối với bổ thể hay các tế bào

1.5.3 Yêu cầu kỹ thuật

Một chất được định vị trong mô trên HMMD phải có các tiêu chuẩn sau:

- Chất đó đã được tinh chế sẵn dưới dạng kháng nguyên tương đối thuần khiết (để sản xuất kháng thể đặc hiệu)

- Sự bảo toàn (ít nhất một phần) của chất kháng nguyên muốn định vị trong quá trình thao tác kỹ thuật mô học và HMMD

Khi cả hai điều trên được tôn trọng, kỹ thuật HMMD có thể được thực hiện hiệu quả

1.5.4 Phương pháp

- Vật liệu kháng nguyên (KN) có mặt trong một mô và đặc biệt hơn

trong một lát cắt mô phản ứng đặc hiệu với một kháng thể (KT) chống lại nó Phản ứng miễn dịch này gây một lắng đọng của một KT đặc hiệu trên vùng mô

có KN Kháng thể này được gắn với một enzym, ban đầu người ta gắn với phosphatase acid, nhưng sự kết hợp này khó và không ổn định Hiện nay người

ta gắn với Peroxydase ổn định hơn và có thể bảo quản lâu hơn ở 4 độ C

- Trong kỹ thuật miễn dịch men avidin – biotin, ái lực cao giữa avidin với biotin được sử dụng để ghép cặp peroxidase đánh dấu với kháng thể thứ nhất Có các phương pháp khác nhau được sử dụng để làm tăng độ nhạy của kỹ thuật Mục đích của nó là bộc lộc vị trí kháng nguyên, nó có thể bị che đậy, vì vậy người ta gọi bước này là bộc lộ KN hoặc phục hồi KN Kỹ thuật này có thể

là làm tiêu với nhiều loại enzyme, tiêu protein, xử lý bằng lò vi sóng hoặc cho tiếp xúc với tác động kết hợp của nhiệt và áp suất trong nồi áp suất

HMMD đã thay thế nhiều kỹ thuật thường quy và ở chừng mực nhất định, đã có nhiều áp dụng chẩn đoán trên hiển vị điện tử Tuy thế, giống như các kỹ thuật khác, cũng có nhiều cạm bẫy, đó là hoạt động của peroxydase nội sinh, nhuộm nền Để loại bỏ các yếu tố này, có hai điều quan trọng là khử hoạt động của peroxydase nội sinh bằng hydrogen (H2O2) và pha loãng KT ở nồng độ loãng tối ưu nhất Cần tiến hành các kỹ thuật một cách tỷ mỉ, kiểm tra thường xuyên hoạt động kháng thể, chứng âm và chứng dương

Hình 1.4: Cấu trúc kháng nguyên – kháng thể

Khái niệm HMMD - Khuyếch đại

Enzym

Biotin Avidin

Kháng thể thứ 2 gắn biotin Kháng thể thứ 1 Kháng nguyên

- Chuẩn bị dung dịch Tris – Buffer – Saline (TBS)

- Phục hồi nhúm quyết định khỏng nguyờn (Epitop Retrieval Techniques)

- Khử hoạt động men nội sinh

- Pha loóng khỏng thể

- Nhuộm tiờu bản

Phương pháp nhuộm HMMD được thực hiện theo các bước:

1 Tiêu bản sau khi tẩy paraffin được nhúng nước cất 2 lần x 5 phút

2 Khử peroxydase nội sinh bằng dung dịch H2O2 x 20 phút

13 Nhuộm nhân bằng hematoxyline 1 phút

14 Khử nước, làm sạch tiêu bản rồi đọc kết quả trên kính hiển vi quang học Điều kiện đọc kết quả:

-Sử dụng kháng thể EGFR clone DAK – H1- WT là kháng thể đơn dòng pha sẵn của hãng Dako

-Phải có chứng dương và âm trên tiêu bản

Đánh giá kết quả nhuộm EGFR trong UTBMT của Phổi theo Dako:

- 0(Âm tính): Không bắt màu trên màng bào tương hoặc bắt màu trong bào tương

- 1+: Màng bào tương bắt màu nhạt <10% tế bào u, bắt màu một phần màng bào tương

- 2+: Màng bào tương bắt màu trung bình >10% tế bào u, bắt màu hoàn toàn hoặc một phần màng bào tương

- 3+: Màng bào tương bắt màu đậm >10% tế bào u, bắt màu hoàn toàn màng bào tương tạo hình ảnh mạng lưới

Hình 1.6:Ảnh minh họa dương tính EGFR

1.6 Một số phương pháp khác phát hiện đột biến gen EGFR

 PCR – RFLP

Về cơ bản, phương pháp này là sự phối hợp giữa kĩ thuật PCR cổ điển và

kĩ thuật RFLP Sau mỗi chu kỳ của PCR, từ một đoạn gen cần phân tích sẽ được tái bản theo nguyên tắc bổ sung thành 2 đoạn gen có trình tự nucleotid giống hệt như đoạn gen gốc Nguyên liệu cần cho phản ứng gồm đoạn ADN chứa gen cần phân tích, các đoạn mồi ngược xuôi, ADN polymerase chịu nhiệt (như Taq polymerase), 4 loại deoxyribonucleotid (dNTP), ion Mg2+, dung dịch đệm Phản ứng PCR trải qua 3 giai đoạn (biến tính, ghép cặp, kéo dài); được kiểm soát chặt chẽ về thời gian và nhiệt độ để các phản ứng diễn ra tối ưu Sau khi kết thúc phản ứng PCR, các sản phẩm sẽ được tinh sạch để xử

lí tiếp Kĩ thuật RFLP sau đó dựa trên sự nhận biết và phân tách đặc hiệu của

các enzyme cắt giới hạn đối với ADN để tách ra các đoạn ADN ngắn hơn Các đoạn ADN này sau đó tiếp tục được điện di trên gel agarose để đọc ra đột biến Đối với gen EGFR, exon 21 có trình tự nucleotid đặc hiệu với enzym cắt MscI Đột biến tại exon 21 sẽ làm mất vị trí cắt đặc hiệu của enzym do đó sản

phẩm sau PCR sẽ không bị cắt bởi enzyme này

 Giải trình tự gen

Giải trình tự gen được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bất thường của các loại gen trong đó có đột biến gen EGFR Có 2 phương pháp chính để giải trình tự gen đó là phương pháp hóa học của Maxam – Gibler và phương pháp enzym sử dụng các nucleotid tự do (dNTP) của Sanger Do sự phức tạp và hiệu quả thấp mà ngày nay phương pháp hóa học không còn được sử dụng mà chỉ giải trình tự gen áp dụng phương pháp của Sanger kết hợp với PCR (thay cho sử dụng các vector) Sau PCR, các bản sao đoạn gen cần phân tích sẽ được sử dụng như là một trình tự mẫu để thực hiện phản ứng giải trình tự bắt đầu từ vị trí gắn mồi Nguyên liệu chính gồm các đoạn gen cần xác định, đoạn mồi đặc hiệu, 4 loại dNTP, một lượng nhất định dideoxyribonucleotid (ddNTP) đã được đánh dấu và enzym ADN polymerase ADN polymerase sẽ gắn các dNTP để tạo mạch bổ sung với ADN cần phân tích Phản ứng sẽ dừng lại đến khi ddNTP được gắn tiếp thay cho dNTP vì phân tử ddNTP bị mất gốc (–OH) ở vị trí carbon số 3 của đường deoxyribose nên dNTP kế tiếp sẽ không gắn vào được mạch mới Sản phẩm sau phản ứng sẽ được điện di trên gel polyacrylamide để xác định trình tự ADN Máy giải trình tự tự động sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang và các nguyên lý quang học để phát hiện và mã hóa các vạch điện di dưới dạng trình tự các nucleotid

 Kĩ thuật Scorpion ARMS

Phương pháp này kết hợp kĩ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến

ARMS và kĩ thuật Scorpion trong phản ứng real-time PCR ARMS dựa trên đặc tính của Taq ADN polymerase chỉ khuếch đại phân tử ADN khi đầu 3’

của sợi khuôn và mồi bổ sung hoàn toàn với nhau Nguyên lý này cho phép khuếch đại một trình tự chứa đột biến kể cả khi trình tự đó rất ngắn chỉ 1% trong sợi khuôn ADN Phản ứng real-time PCR sử dụng mồi Scorpion chứa trình tự bổ sung với trình tự nucleotid của alen đột biến Đoạn mồi này sẽ được gắn với một đầu dò có cấu tạo gắn với chất phát huỳnh quang ở một đầu (gọi là reporter) và một đầu khác gắn với chất hấp phụ huỳnh quang tương ứng (gọi là quencher) Khi đầu dò gắn đặc hiệu với trình tự chứa alen đột biến, một loại enzym đặc hiệu sẽ phân cắt đầu dò, làm cho phần reporter được tách khỏi phần quencher, dẫn đến giải phóng ra được tín hiệu huỳnh quang khi được chiếu ánh sáng thích hợp Khi số lượng alen đột biến đủ lớn, các đầu

dò sau khi phân tách sẽ phá ra tín hiệu huỳnh quang đủ mạnh để bộ phận cảm biến của máy real-time PCR thu nhận và từ đó đọc ra đột biến Phương pháp này có ưu điểm có thể phát hiện ra hầu hết các đột biến gen EGFR đáp ứng TKI có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tuy nhiên nhược điểm lớn nhất là hoàn toàn dựa vào ngân hàng dữ liệu các đột biến gen đã biết chứ không có khả năng tìm ra đột biến gen mới như phương pháp giải trình tự gen

Quy trình thực hiện xét nghiệm tìm đột biến gen EGFR tại Đơn vị gen – Trung tâm y học hạt nhân và ung bướu – Bệnh viện Bạch Mai

Quy trình xét nghiệm: gồm 4 giai đoạn chính

- Tách DNA từ mẫu cố định formalin, vùi paraffin (PureLink® Genomic DNA Mini Kit, Invitrogen)

- Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phản ứng PCR (EGFR XL StripAssay®, ViennaLab)

- Lai sản phẩm khuếch đại với đầu dò đặc hiệu được phân bố trên teststrip (EGFR XL StripAssay®, ViennaLab)

- Phân tích kết quả

Bảng1.1 : trình tự một số mồi nhân dòng exon EGFR

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Bao gồm khoảng 120 bệnh nhân được chẩn đoán trên sinh thiết là

UTBMT nguyên phát của phổi, và được thực hiện xét nghiệm hóa mô miễn dịchtìm đột biến gen EGFR, tại Trung tâm Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Bạch Mai, trong thời gian từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2017, thỏa mãn các tiêu chuẩn nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn

 Thỏa mãn tiêu chuẩn chẩn đoán UTBMT phổi nguyên phát hoặc hướng tới UTBMT trên sinh thiết theo tiêu chuẩn và hướng dẫn chẩn đoán của WHO năm 2014, không phân biệt tuổi, giới

 Được làm xét nghiệm tìm đột biến gen EGFR trên bệnh phẩm sinh thiết

 Các trường hợp hồi cứu còn đủ tiêu bản nhuộm HE, PAS, block còn đủ bệnh phẩm đảm bảo cắt nhuộm, nhuộm thêm hóa mô miễn dịch nếu cần

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

 Mọi trường hợp không thỏa mãn bất kì một tiêu chuẩn lựa chọn nào kể trên

 Người bệnh có 2 ung thư

 Người bệnh đã điều trị UTP ở nơi khác chuyển đến (hóa trị, xạ trị, điều trị đích hoặc phối hợp)

 Vùng mô u trên sinh thiết quá ít hoặc hoại tử quá nhiều

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

 Trung tâm Giải phẫu bệnh và Đơn vị Gen trị liệu Bệnh viện Bạch Mai

2.1.5 Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2017