HOÀN THIỆN kĩ THUẬT REALTIME PCR để xác ĐỊNH đột BIẾN GEN BRAF v6 từ các mẫu BỆNH PHẨM ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP

Các phương pháp điều trị bao gồm: - Phẫu thuật: Phẫu thuật tuyến giáp đã được biết đến từ những năm trướccông nguyên với các phẫu thuật viên như Galen và tác giả Albucais Ả Rập chođến n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

=======

BÙI THỊ LÀNH

HOÀN THIỆN KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V6 TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM Ở

BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

=======

BÙI THỊ LÀNH

HOÀN THIỆN KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V6 TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM Ở

BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP

Chuyên ngành : Y sinh học Di truyền

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Nguyễn Thị Trang

2 PGS.TS Nguyễn Quang Trung

HÀ NỘI - 2019

ARMS – PCR : Amplification refactory mutation system – PCRATC : Ung thư tuyến giáp kém biệt hóa

DNA : Deoxynucleotid acid

FTC : Ung thư tuyến giáp thể nang

MTC : Ung thư tuyến giáp thể tủy

PCR : Polymerase chain reaction

PTC : Ung thư tuyến giáp thể nhú

UTTG : Ung thư tuyến giáp

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái niệm và tình hình mắc ung thư tuyến giáp 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại ung thư tuyến giáp ( UTTG) 3

1.1.3 Các phương pháp điều trị UTTG 4

1.1.4 Tình hình mắc UTUG 5

1.2 Các yếu tố nguy cơ UTTG 6

1.2.1 Phơi nhiễm phóng xạ 6

1.2.2 Béo phì 6

1.2.3 Estrogen 6

1.2.4 Chế độ ăn và lối sống ít vận động 7

1.2.5 Yếu tố di truyền 7

1.3 Các con đường tín hiệu trong UTTG 8

1.3.1 Con đường MAPK 9

1.3.2 Con đường tín hiệu phosphotidylinositol 3-kinase (PI3K) 10

1.3.3 Các con đường phụ trợ 11

1.4 Đột biến gen BRAF V600E 12

1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen BRAF V600E 13

1.5.1 Phương pháp giải trình tự trực tiếp 13

1.5.2 Các phương pháp dựa trên phản ứng PCR 16

Chương 2: 21ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 21

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ 21

2.3 Nguyên liệu và các phương tiện nghiên cứu 21

2.3.1 Hóa chất 21

2.3.2 Các thiết bị 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.3 Phương pháp chọn mẫu 23

2.4.4 Quy trình nghiên cứu 23

2.5 Các bước nghiên cứu 24

2.6 Xử lý và phân tích số liệu 28

2.7 Đạo đức nghiên cứu 28

Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 29

3.1 Kết quả hoàn chỉnh quy trình xác định đột biến gen BRAF V600E từ các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư tuyến giáp 29

3.1.1 Kết quả chiết tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm 29

3.1.2 Kết quả kiểu gen BRAF của các đối tượng nghiên cứu xác định được bằng phương pháp Real - time PCR 30

3.1.3 Kết quả kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự gen 31

3.1.4 So sánh kết quả của kỹ thuật Real - time PCR với kết quả giải trình tự gen 32

3.2 Kết quả ứng dụng quy trình Real - time PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E 32

3.2.1 Đặc điểm chung về đối tượng nghiên cứu 32

3.2.2 Phân bố kiểu gen ở đối tượng nghiên cứu 34

Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 35

4.1 Bàn luận về hoàn thiện quy trình kỹ thuật Real – time PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E từ các mẫu bệnh phẩm ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp 35

4.2 Bàn luận về so sánh kết quả Real – time PCR và kết quả giải trình tự.35 4.3 Bàn luận về ứng dụng kỹ thuật Real – time PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E ở đối tượng nghiên cứu 35

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 36

DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2.1: Hóa chất dùng cho xác định đột biến gen BRAF V600E bằng kỹ

thuật Real - time PCR 21

Bảng 2.2: Thiết bị dùng xác định đột biến gen BRAF V600E bằng kỹ thuật Realtime-PCR 22

Bảng 2.3: Xác định kiểu gen 27

Bảng 3.1 Kết quả chiết tách DNA các mẫu thử nghiệm 29

Bảng 3.2: So sánh kết quả của kỹ thuật Real - time PCR với kết quả giải trình tự gen của các mẫu kiểm chứng 32

Bảng 3.3: Độ tuổi của đối tượng nghiên cứu 32

Bảng 3.4: Đặc điểm các yếu tố tiên lượng ung thư tuyến giáp 33

Bảng 3.5: Phân bố kiểu gen BRAF V600E ở mẫu máu 34

Bảng 3.6: Phân bố kiểu gen BRAF V600E ở mẫu mô 34

Biểu đồ 3.1: Đặc điểm về giới tính 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2: Các con đường tín hiệu trong ung thư tuyến giáp 8

Hình 1.3: Con đường MAPK trong ung thư tuyến giáp 9

Hình 1.4: Con đường PI3K trong UTTG 10

Hình 1.5: Vị trị gen BRAF trên nhiễm sắc thể số 7 12

Hình 3.1: Kết quả Real – time PCR có kiểu gen đồng hợp tử bình thường với gen BRAF 30

Hình 3.2: Kết quả Real – time PCR có kiểu gen dị hợp tử với gen BRAF 30

Hình 3.3: Kết quả Real – time PCR có kiểu gen đồng hợp tử đột biến gen BRAF 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư tuyến giáp là bệnh ác tính nội tiết phổ biến nhất với tỷ lệ mắcđang gia tăng nhanh chóng ở nhiều khu vực trên thế giới [1], [2], [3] Tại Mỹ,

sự gia tăng tỷ lệ mắc bệnh ung thư tuyến giáp là nhanh nhất, với hơn 50.000

ca mới mắc, chiếm tỷ lệ 3% trong số tất cả các ca ung thư mới tính tới thờiđiểm hiện tại [4] Ung thư tuyến giáp được phân loại theo mô bệnh học thành

4 nhóm chính: ung thư tuyến giáp dạng nhú (PTC), ung thư tuyến giáp dạngnang (FTC), ung thư tuyến dạng dạng tủy (MTC) và ung thư tuyến giáp kémbiệt hóa (ATC) Trong đó PTC chiếm tỷ lệ cao nhất, hơn 80% [5] Đây lànhóm ung thư có tiên lượng tốt nhất với tỷ lệ sống sau 5 năm là hơn 90%,bệnh hoàn toàn có thể chữa khỏi nếu được phát hiện sớm và điều trị kịp thời.Tuy nhiên tỷ lệ tái phát sau điều trị tăng đáng kể theo thời gian, khoảng 20%sau 10 năm, 30% sau 30 năm theo dõi [6] Việt Nam nằm trong nhóm cácnước có tỷ lệ mắc ung thư tuyến giáp cao Theo Globocan 2018, ung thưtuyến giáp nằm trong nhóm mười ung thư phổ biến nhất Lý giải sự gia tăngnày, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của việc chẩn đoán bệnh ở những giaiđoạn sớm bằng các phương tiện chẩn đoán tiên tiến, hiện đại với độ nhạy, độđặc hiệu cao [7]

Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh sinh ung thư để từ

đó tìm ra phương pháp chẩn đoán cũng như can thiệp kịp thời là mối quantâm hàng đầu của các nhà Y- sinh học hiện nay Những phát hiện mới về cơchế bệnh sinh ở mức độ phân tử cho thấy ung thư tuyến giáp là kết quả tíchlũy các đột biến gen Những đột biến gen này làm suy giảm hoặc tăng cườngquá mức các tín hiệu tế bào gây rối loạn các quá trình phát triển, phân chia,biệt hóa, chết theo chương trình (apotosis) dẫn đến phát sinh ung thư Nhiều

đột biến đã được phát hiện trong ung thư tuyến giáp bao gồm: đột biến gengây ung thư, đột biến gen ức chế khối u và đột biến các gen sửa chữa Trong

đó phải kể đến vai trò của đột biến gen BRAF V600E đối với chẩn đoán, tiên

lượng và điều trị bệnh [8], [9] Việc xét nghiệm tìm đột biến này ở bệnh nhânung thư tuyến giáp đặc biệt là trước phẫu thuật có ý nghĩa vô cùng to lớn Nókhông chỉ kết hợp với phương pháp chọc hút tế bào bằng kim nhỏ để tăng khảnăng phát hiện ung thư mà còn có giá trị tiên lượng cũng như định hướnggiúp các bác sĩ lâm sàng lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp cho bệnhnhân [10] Tại Việt Nam xét nghiệm này còn chưa phổ biến, giá thành cao Vì

vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “ Hoàn thiện kỹ thuật Realtime-PCR để xác

định đột biến gen BRAF V600E từ các mẫu bệnh phẩm ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp” với hai mục tiêu sau:

1 Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp.

2 Xác định tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp bằng kỹ thuật Realtime-PCR.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái niệm và tình hình mắc ung thư tuyến giáp.

1.1.1 Khái niệm.

Tuyến giáp là tuyến nội tiết lớn nhất cơ thể, có trọng lượng 20-25 g ởngười trưởng thành, nằm ở vị trí trước cổ, ngang đốt sống cổ 5 đến đốt sốngngực 1, ngay dưới sụn nhẫn, trước khí quản Vai trò sản xuất hormone T4(Tetra-iod-thyronin) và T3 (Tri-iod-thyronin) điều hòa chuyển hóa cũng nhưhoạt động của một số cơ quan trong cơ thể

Hình 1.1: Giải phẫu tuyến giáp

Ung thư tuyến giáp là loại ung thư có nguồn gốc chủ yếu từ hai loại tếbào bao gồm tế bào nang giáp và tế bào C cận nang

1.1.2 Phân loại ung thư tuyến giáp ( UTTG).

Theo mô bệnh học chia làm 4 nhóm chính:

- Ung thư tuyến giáp thể nhú (PTC): chiếm tỷ lệ 70- 80%, đây là thể dễchữa khỏi nhất bởi tiến triển chậm Bệnh nhân dễ có di căn hạch cổ nhưngvẫn được tiên lượng tốt

- Ung thư tuyến giáp thể nang (FTC): chiếm tỷ lệ 10-15% có thể có dicăn hạch cổ nhưng tốc độ tiến triển nhanh hơn Cũng có thể có khả năng dicăn xa hơn vào xương hay hai lá phổi

- Ung thư tuyến giáp thể tủy (MTC): chiếm tỷ lệ 5-10%, nguồn gốc từ tếbào C cận nang, dạng ung thư này liên quan đến vấn đề nội tiết và yếu tố ditruyền gen trong gia đình

- Thể không biệt hóa (ATC): chiểm tỷ lệ dưới 2% đây là thể khó tiênlượng, ác tính nhất và khó có khả năng điều trị khỏi nhất.

1.1.3 Các phương pháp điều trị UTTG.

Tùy từng thể, giai đoạn, tình trạng người bệnh mà các bác sỹ lâm sànglựa chọn phương pháp điều trị phù hợp Các phương pháp điều trị bao gồm:

- Phẫu thuật: Phẫu thuật tuyến giáp đã được biết đến từ những năm trướccông nguyên với các phẫu thuật viên như Galen và tác giả Albucais ( Ả Rập) chođến ngày nay vai trò của nó vẫn chiếm vị trí quan trọng, là một trong những biệnpháp chính, lựa chọn đầu tay cho hầu hết bệnh nhân ung thư tuyến giáp

- Điều trị I 131: mục đích tiêu hủy mô giáp còn lại sau phẫu thuật, tiêu diệtcác tổn thương vi di căn hoặc di căn xa không có khả năng phẫu thuật Liều

I131 thường dùng là 50-200mCi trong giai đoạn chưa có di căn xa Có thể nângliều lên tới 500mCi hoặc hơn khi có di căn xa

- Điều trị hormon thay thế: Liệu pháp hormon thay thế bổ sung lượngT3, T4 ngoại sinh, giúp tạo nên nồng độ cao các hormon trong máu, gián tiếpthông qua tuyến dưới đồi và tuyến yên làm giảm hoạt động và phát triển củacác tế bào tuyến giáp trong cơ thể, giúp duy trì bệnh ổn định lâu dài Theokhuyến cáo của các nhà ung thư học Mỹ, hormon hay dùng là Lovothyroxinhoặc Levothyrox với liều 50-200 µg/24h, uống 1 lần vào 8h sáng, tùy theotừng bệnh nhân sao cho đạt được nồng độ TSH huyết thanh duy trì trongkhoảng 0.1-2 mUI/l với giai đoạn I, II và dưới 0.1 mUI/l với giai đoạn III và

IV hoặc có di căn xa

- Xạ trị: Trong ung thư tuyến giáp biệt hóa chỉ định xạ trị là rất hạn chế bởi

tế bào ung thư của thể này ít nhạy cảm với xạ trị Xạ trị chỉ được chỉ định chonhững bệnh nhân tái phát, di căn tại những vị trí tổn thương không cắt bỏ được Trong ung thư tuyến giáp thể tủy và thể không biệt hóa xạ trị lại có vaitrò rất quan trọng Sau phẫu thuật, xạ trị bổ trợ được chỉ định gần như bắtbuộc với mục đích kiểm soát tái phát tại chỗ, tại vùng

- Hóa trị: Hóa chất ít có vai trò và chỉ được chỉ định trong ung thư tuyếngiáp thể không biệt hóa Có thể điều trị hóa chất đơn thuần hoặc hóa xạ đồngthời với Paclitaxel và/hoặc Carboplatin

- Điều trị đích: Gần đây, nhận thấy tỷ lệ thất bại điều trị bằng phẫu thuật,hay iod phóng xạ ngày càng tăng, xu hướng cho các nghiên cứu mới hiện nay là

cơ chế phân tử hình thành ung thư tuyến giáp, trong đó nhấn mạnh vai trò củakinase gây ung thư, đặc biệt là ung thư tuyến giáp di căn [11] Từ đó xây dựngcác liệu pháp nhắm mục tiêu mới , đặc biệt là nhóm tác nhân có tác dụng ức chếkinase có liên quan đến tín hiệu tăng trưởng tế bào và tạo mạch [11]

1.1.4 Tình hình mắc UTUG.

Ung thư tuyến giáp chiếm khoảng 1-2% tất cả các loại ung thư trên thếgiới Theo GLOBOCAN 2018, trên thế giới có khoảng 215.000 ca mới mắcung thư tuyến giáp, xếp thứ 20 trong số tất cả các lọai ung thư ở nam, xếp thứ

9 trong số các loại ung thư ở nữ và xếp thứ 17 trong số các loại ung thư ở cả 2giới Tỉ lệ mắc khoảng 3/100000 dân cho cả 2 giới, tỉ lệ nam/nữ khoảng 1/3[12] Kết quả thống kê tại Mỹ năm 2019 có khoảng ước tính có 52.070 ngườitrưởng thành (14.260 nam và 37.810 nữ) sẽ được chẩn đoán mắc bệnh ungthư tuyến giáp [13] Trong nhiều thập kỷ qua, tỷ lệ mắc UTTG có xu hướngtăng đã được báo cáo ở nhiều nơi trên thế giới [2], [14], [15], [16]

1.2 Các yếu tố nguy cơ UTTG.

1.2.1 Phơi nhiễm phóng xạ.

Sau tai nạn điện hạt nhân ở Chernobyl năm 1986, phát hiện tỷ lệ mắcung thư tuyến giáp tăng cao ở các khu vực bị ô nhiễm [17] Tia X sử dụngtrong nha khoa cũng được chứng minh làm tăng nguy cơ ung thư tuyến giáp[18] Tuyến giáp có thể dễ dàng hấp thu tia xạ hơn các mô khác vì vị trí của

nó cũng như khả năng bắt giữ iod Bức xạ ion gây đứt gãy chuỗi DNA và gây

ra các đột biến soma được cho là yếu tố gây ung thư nói chung [19]

1.2.2 Béo phì.

Xu hướng tăng tỷ lệ mắc ung thư tuyến giáp trong vài thập kỷ qua cũngtrùng với xu hướng béo phì và tiểu đường ngày càng tăng [20] Béo phì là mộthội chứng đa yếu tố sự đóng góp vào sự phát sinh ung thư của từng đặc điểm:tình trạng mỡ máu, rối loạn chuyển hóa, kháng insulin… là không rõ ràng Mộtphân tích tổng hợp của 21 nghiên cứu quan sát cho thấy béo phì làm tăng nguy

cơ PTC và giảm nguy cơ MTC [21] Một nghiên cứu gần đây cho rằng tìnhtrạng kháng insulin và tăng khả năng insulin trong máu gặp trong béo phì làmột yếu tố nguy cơ gây ung thư tuyến giáp [22] Kháng insulin có mặt ở 50%bệnh nhân PTC [23] Trong một phân tích tổng hợp khác, chỉ số BMI tăng cóliên quan mạnh mẽ đến nguy cơ ung thư tuyến giáp tăng ở cả hai giới [24]

1.2.3 Estrogen.

Estrogen được biết đến như một yếu tố nguy cơ của các bệnh ung thư

vú [25], ung thư nội mạc tử cung [26] và ung thư buồng trứng [27] TrongUTTG, phụ nữ chiếm tỷ lệ nhiều gấp 3 lần nam giới, điều đó đặt ra câu hỏiliệu rằng estrogen có phải là yếu tố nguy cơ của căn bệnh này? Để trả lời, cácnghiên cứu ở mức độ tế bào đã được tiến hành và chứng minh estrogen cùng

các thụ thể của nó đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng sinh, xâm lấn và

di căn của ung thư tuyến giáp [28], [29], [30]

1.2.4 Chế độ ăn và lối sống ít vận động.

Iod có vai trò thiết yếu trong việc sản xuất và điều hòa hormon tuyếngiáp, chế độ ăn thiếu hoặc thừa iod đều được coi là yếu tố nguy cơ gây bệnhbướu cổ cũng như ung thư tuyến giáp [31]

Chế độ ăn với sự có mặt của nitrat ở nhóm thức ăn nhanh, chế biến sẵn,

có chứa chất bảo quản cũng được coi là yếu tố nguy cơ UTTG [32] bởi nó ứcchế cạnh trạnh sự hấp thu iod của tuyến giáp qua đó ảnh hưởng đến chức năngtuyến giáp [33]

Hoạt động thể chất được đưa ra giả thuyết ảnh hưởng đến nguy cơUTTG thông qua một số cơ chế [34] như là cải thiện khả năng sửa chữa DNAnội sinh, giảm mỡ, giảm kháng insulin và thay đổi các yếu tố viêm lưu hànhtrong máu [35], [36], [37]

1.2.5 Yếu tố di truyền.

Tăng sinh, biệt hóa, chết theo chương trình của dòng tế bào tuyến giápđòi hỏi hiệu ứng kết hợp của tín hiệu từ hormon kích thích giáp trạng TSHthông qua cAMP và tín hiệu từ yếu tố tăng trưởng chủ yếu thông quan MAPkinase (MAPK) và phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) [38] Đột biến dọctheo các con đường tín hiệu này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnhsinh của ung thư tuyến giáp

Ung thư tuyến giáp phát triển thông qua sự tích lũy của nhiều thay đổi

di truyền và làm mất dần tiến trình truyền tín hiệu, kèm theo nhiều thay đổiphân tử thứ cấp trong tế bào và vi môi trường khối u, giúp khuếch đại và phốihợp các tác động của chúng

Đột biến BRAF thường được bắt gặp trong PTC [39] Nó được coi làyếu tố phát sinh, phát triển đồng thời liên quan đến các đặc điểm lâm sàngcũng như điều trị và tiên lượng bệnh.

Đột biến RAS được tìm thấy chủ yếu trong FTC [40]

Kích hoạt con đường MAPK, ví dụ, do đột biến BRAF V600E, gây ung

thư biểu mô tuyến giáp dạng nhú (PTC) Kích hoạt con đường PI3K-AKTbằng các đột biến ở RAS, PTEN và PIK3CA, chủ yếu gây ung thư biểu môtuyến giáp dạng nang (FTC) Khi các thay đổi di truyền tích lũy và tăngcường tín hiệu của cả hai con đường, PTC và FTC có thể tiến triển thành biệthóa kém (PDTC) và ung thư biểu mô tuyến giáp anaplastic (ATC)

ATC có thể đồng thời có đột biến BRAF V600E, RAS và RET-PTC,

loại trừ lẫn nhau trong các bệnh ung thư tuyến giáp biệt hóa tốt

Tăng sản tế bào C là tiền thân của các dạng di truyền của ung thư biểu

mô tuyến giáp tủy (MTC) được thúc đẩy bằng cách kích hoạt các đột biếnRET [41]

1.3 Các con đường tín hiệu trong UTTG.

Hình 1.2: Các con đường tín hiệu trong ung thư tuyến giáp [42]

1.3.1 Con đường MAPK (Mitogen Actvated Protein Kinase).

MAPK là một họ của kinase protein serine / threonine nội bào Conđường MAPK còn được gọi là RAS-RAF-MEK-MAPK-ERK trong đó:

Hình 1.3: Con đường MAPK trong ung thư tuyến giáp [43]

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng tăng kích hoạt conđường MAPK được tìm thấy trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thưtuyến giáp [38] Trong ung thư tuyến giáp, con đường MAPK được thúc đẩybằng cách kích hoạt các đột biến trong BRAF và RAS hoặc bằng cách sắp xếplại RET / PTC, việc kích hoạt một hay nhiều đột biến kể trên có tác dụng loạitrừ lẫn nhau Con đường MAPK hoạt động liên tục còn gây ra những thay đổiphân tử thứ cấp như tái tổ chức các protein gây ung thư và các con đường liênquan, bao gồm VEGF, NF-kB, matrixopopoteinase, HIF1α, TGFβ1 và cácloại chemokine khác nhau qua đó phát sinh, phát triển khối u.

1.3.2 Con đường tín hiệu phosphotidylinositol 3-kinase (PI3K).

Enzym PI3K xúc tác quá trình phosphoryl hóa phosphotidylinositol vàcác dẫn xuất là các chất dẫn truyền thông tin thứ cấp điều hòa các hoạt độngcủa tế bào như quá trình sao chép và sinh tổng hợp protein

Hình 1.4: Con đường PI3K trong UTTG [43].

PI3K được kích hoạt trực tiếp bởi cả thụ thể xuyên màng RET, gián tiếpthông qua RAS và được điều chỉnh bằng sự khử phospho qua trung gianPTEN Đột biến gen RAS, PIK3CA và AKT hoặc làm bất hoạt đột biến gen

ức chế khối u PTEN có thể làm sai lệch sự dẫn truyền tín hiệu trong conđường này

Con đường PI3K-AKT có vai trò chủ yếu trong sự xâm chiếm và di căncủa FTC

Những thay đổi phân tử thứ cấp, gây ra bởi tín hiệu PI3K-AKT, là nhữngthay đổi của con đường Wnt-β-catenin, HIF1α và NF-kB

1.3.3 Các con đường phụ trợ.

1.3.3.1 Con đường TSHR-cAMP

TSHR (Receptor kích thích tuyến giáp) là một thụ thể khi kết hợp vớiprotein G sẽ kích hoạt tín hiệu cAMP để thúc đẩy tăng trưởng và biệt hóa các

tế bào tuyến giáp TSHR đóng vai trò trung gian trong các con đường kinaseRAS-MAPK, PI3K và JAK-STAT Quá kích thích tín hiệu TSHR thông quakích hoạt các đột biến trong TSHR hoặc Gsα dẫn đến sự phát triển khối u vớinồng độ TSH huyết thanh tăng cao cùng với sự tăng tín hiệu TSH góp phầnphát triển thành ung thư tuyến giáp

1.3.3.2 Con đường NF-kB

Được kích hoạt khi các con đường MAPK và PI3K đã kích hoạt vai tròkiểm soát tín hiệu tăng sinh và chống chết theo chương trình trong các tế bàoung thư tuyến giáp và điều chỉnh các phản ứng viêm liên quan đến nguyênnhân khối u

1.3.3.3 Con đường Wnt catenin

Vai trò điều chỉnh sự phát triển của tế bào, tăng sinh và biệt hóa tế bàogốc β-catenin Khi được điều hòa bởi tín hiệu Wnt ngược dòng, tín hiệuchuyển vào nhân tế bào phiên mã các gen thúc đẩy khối u phát triển

Trong ung thư tuyến giáp, việc kích hoạt tín hiệu Wnt catenin thườngđược gây ra bằng cách kích hoạt các đột biến của CTNNB1 (mã hóa-catenin),đặc biệt là trong PDTC và ATC Tín hiệu PI3K-AKT bất thường cũng gây ra

sự kích hoạt bất thường của con đường này

1.3.3.4 Con đường HIF1α

Xảy ra khi có tình trạng thiếu oxy, khi đó HIF1α liên kết với HIF1β đểhình thành yếu tố phiên mã HIF1 tạo ra sự biểu hiện của các gen khác nhauliên quan đến chuyển hóa tế bào và tân sinh mạch (ví dụ VEGFA) HIF1αđược phát hiện ở ung thư tuyến giáp xâm lấn, phù hợp với vai trò của nó trongtiến triển ung thư tuyến giáp HIF1 cũng có thể được điều chỉnh theo cả haicon đường MAPK và PI3K

1.4 Đột biến gen BRAF V600E.

Gen BRAF gồm 18 exon có 208.816 bp nằm trên nhánh dài nhiễm sắcthể số 7 [46]

Hình 1.5: Vị trị gen BRAF trên nhiễm sắc thể số 7 [47]

Gen BRAF mã hóa thông tin cho protein BRAF có trọng lượng phân tử

94 kDa là chất có hoạt tính kinase với chức năng truyền tín hiệu nội bào xuôidòng phía sau protein KRAS của con đường tín hiệu RAS-MAPK[33]

Đối với gen BRAF có hơn 40 loại đột biến khác nhau được mô tả.

Trong đó khoảng 90% đột biến là sự thay thế thymin bằng adenin ở nucleotid

1799 dẫn đến sự thay đổi acid amin Valin thành Glutamic tại codon 600

(V600E) [48] Sự thay đổi này làm cho BRAF hoạt động liên tục [49], [50],

[51] với ái lực cao hơn với MEK1 và MEK2 từ đó kích hoạt mạnh mẽ conđường MAPK Nó được tìm thấy có mặt trong các khối u tuyến giáp và chứngminh có mối quan hệ chặt chẽ với các đặc điểm lâm sàng của UTTG đặc biệt

là PTC [52], [53] Ba nghiên cứu của Hàn Quốc đã chỉ ra mối liên quan của

đột biến BRAF với di căn hạch, và tình trạng xâm lấn của khối u [54], [55],

[56] Trong một nghiên cứu đa trung tâm quốc tế lớn, Xing và cộng sự đã báo

cáo mối liên quan chặt chẽ của đột biến gen BRAF với sự xâm lấn, di căn

cũng như các giai đoạn tiến triển của UTTG [57] Các bằng chứng này có thểcoi đột biến này như một dấu ấn phân tử mới có vai trò tiên lượng cho UTTGđặc biệt là nhóm PTC Ngoài ra con đường MAPK là một mục tiêu điều trịmới có hiệu quả đối với PTC [58]

1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen BRAF

V600E

1.5.1 Phương pháp giải trình tự trực tiếp.

Trình tự nucleotid của một đoạn DNA có thể được xác định bằng cách

sử dụng một quy trình hóa học theo nguyên lý của Alan Maxam và WalterGilbert hay một quy trình enzym được phát triển bởi Fred Sanger, quy trìnhcủa Sanger thường được gọi là phương pháp dideoxynucleotid, và hiện nayquy trình này là cơ sở để phát triển những phương pháp giải trình tự hiện đại.Phương pháp enzyme được phát triển bởi Sanger và các cộng sự năm 1977 đãnhanh chóng trở thành phương pháp được lựa chọn rộng rãi vì dễ tiến hành và

có độ tin cậy cao

- Phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert [59]: Năm 1976-1977,

Allan Maxam và Walter Gilbert đã phát triển một phương pháp giải trình tựDNA dựa trên sự cải biến hóa học DNA và sự phân cắt giới hạn tại nhữngnucleotid đặc hiệu Phương pháp này đòi hỏi phải gắn phóng xạ tại đầu 5’ kếtthúc của sợi DNA (thường bằng một phản ứng kinase sử dụng gamma-32PATP) và đoạn DNA giải trình tự phải được tinh sạch.DNA được xử lý với hóachất tạo ra các điểm gãy ở một vị trí nhỏ của một hoặc hai trong số bốnnucleotid của một trong bốn phản ứng (Dimethyl sunphat phá hủy G,Glicosidic phá hủy A + G, Hydrazin phá hủy C, Hydrazin+ NaCl phá hủy C +T) Phân tử DNA cải biến này sau đó được làm đứt bởi piperidine nóng ở vịtrí các nucleotid cải biến.Nồng độ của các chất hóa học được điều khiển đểtrung bình chỉ có một cải biến trên mỗi phân tử DNA.Như vậy, một loạt cácđoạn đứt có đánh dấu được tạo ra.Các đoạn đứt trong bốn phản ứng được điện

di trong làn cạnh nhau trên gel polyacrylamide Để quan sát kích thước cácđoạn đứt, gel được đưa lên phim chụp phóng xạ tự ghi X-ray để phát hiện

vạch, từ các vạch đó đó ta suy ra trình tự đoạn DNA ban đầu Phương phápgiải trình tự của Maxam-Gilbert ít được sử dụng vì những nhược điểm bộc lộngày càng rõ như những phức tạp về mặt kỹ thuật không thể sử dụng trongcác kit sinh học phân tử tiêu chuẩn, cũng như việc phương pháp này sử dụngnhiều hóa chất độc hại và gặp những khó khăn trong việc mở rộng quy mô vàcải tiến phương pháp.

- Phương pháp enzym (phương pháp Sanger): Vì phương pháp Sanger

có hiệu quả cao hơn đồng thời sử dụng ít hóa chất độc hại cũng như ít cácchất phóng xạ hơn phương pháp của Maxam và Gilbert, nó nhanh chóng trởthành phương pháp được chọn lựa phổ biến hơn

Ví dụ: Nếu ta thêm ddCTP vào hỗn hợp phản ứng đang tổng hợp DNAthì quá trình tổng hợp chuỗi polynucleotide sẽ dừng lại ở vị trí C

+ Điện di các đoạn DNA này với việc bổ sung 1% các loại ddNTP riêngbiệt (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) sẽ được 4 bản điện di khác nhau Cácbăng DNA xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các

ddNTP Dưa vào đó để đọc trình tự DNA.

Các vạch DNA được hiện hình bằng cách chụp phóng xạ tự ghi hoặc soitrên tia cực tím, và trình tự DNA có thể được đọc trực tiếp trên film X-rayhoặc hình ảnh của gel

Những thay đổi trong kỹ thuật giải trình tự bằng chất kết thúc chuỗi chủyếu nằm ở việc gắn các nucleotid với đuôi phospho có chứa phóng xạ, hoặc

sử dụng mồi có gắn chất nhuộm huỳnh quang ở đuôi 5’ Việc gắn chất nhuộmvào mồi tạo điều kiện phát triển một hệ thống quang học để có thể phân tíchnhanh hơn, kinh tế hơn và dễ dàng tự động hóa Sau này, Leroy Hood và cácđồng nghiệp của ông đã sử dụng hai phương pháp gắn chất nhuộm huỳnhquang lên các ddNTPs và mồi để mở ra kỷ nguyên tự động hóa và giải trình

tự công suất lớn

- Phương pháp giải trình tự tự động: Cấu tạo của máy giải trình tự tựđộng gồm 2 phần chính yếu: phần điện di với gel pop7 và capilary36 và phầnphát hiện peak điện di Các mạch đơn DNA trong ống phản ứng giải trình tựđược đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phátsáng khi đi qua chùm tia laser Nguyên tắc hoạt động: trong suốt quá trìnhđiện di, mỗi khi có 1vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phátsáng lên và con mắt cảm quang sẽ ghi nhận và lưu lại thành 1 đỉnh cường độsáng trong biểu đồ Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ sodòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình

tự DNA

Ngày nay, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong 1

ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di 1 hàng mà không cần phải trên

4 hàng khác nhau như trước đây

Hình 1.6: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP

1.5.2 Các phương pháp dựa trên phản ứng PCR.

1.5.2.1 Phương pháp Realtime-PCR.

Real - time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đíchđược hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Có thể nói Real -time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỉbản sao dựa vào chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứngđược hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thínghiệm có thể thấy được Trong phương pháp Real – time PCR, khuếch đạigen và đọc kết quả được thực hiện trong một ống hay một giếng mẫu.Phương pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị

phát huỳnh quang từ một giếng mẫu và được trang bị chương trình vi tínhcho phép xử lý kết quả, xác định độ biến đổi cường độ huỳnh quang trongtừng phản ứng khuếch đại.

Real - time PCR là một cải biến của phương pháp PCR dựa trên chứcnăng 5’-3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công

bố năm 1991 [60] Trong phản ứng Real - time PCR, người ta thường sử dụngtác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào mạch đôi (EthidiumBromide, SYBR Green I, EvaGreen…) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dòđặc hiệu (Taqman probe, FAM, HEX, TAMRA…)

Các tín hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệtReal - time PCR thu nhận và xử lí Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang củamẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền (base line) của phản ứng mẫuthì được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiệnqua giá trị chu kì ngưỡng- Ct- Cycle threshold) để so sánh với 1 đường congchuẩn (standard curve) đã biết để suy ra nồng độ trình tự DNA đích trong thửnghiệm ban đầu Đường cong chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trướcnồng độ

Hình 1.7: Phương pháp Realtime-PCR với tác nhân phát huỳnh quang

SYBR Green I

Hình 1.8: Phương pháp Realtime - PCR với mẫu dò Taqman

1.5.2.2 Phương pháp ARMS - PCR (amplification refractory mutation system - PCR)

Là kỹ thuật để phát hiện các đột biến điểm được biết đến và mô tả lầnđầu tiên bởi Newton C.R [61] Kỹ thuật ARMS - PCR dựa trên nguyên tắccủa alen mồi cụ thể của quá trình PCR, tức là một mồi cụ thể sẽ chỉ cho phépquá trình khuếch đại diễn ra khi nó được bắt cặp đặc hiệu với alen đột biến

Nguyên lý của kỹ thuật là dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerasechỉ khuếch đại hoàn chỉnh 1 phân tử DNA một khi đầu 3’ của mồi và sợi

khuôn bổ sung hoàn toàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợikhuôn, phản ứng bị ức chế hoàn toàn.

ARMS - PCR là phương pháp rất hữu ích cho việc xác định các độtbiến điểm hoặc đa hình Nó cũng là phương pháp quan trọng để xác định sựthay đổi trong DNA là đồng thời hay dị hợp Dị hợp tử hoặc đồng hợp tửđược phân biệt bằng cách sử dụng ARMS mồi cho alen đột biến (Mutation)

và bình thường (Wild type) Các phản ứng cho alen đột biến và alen bìnhthường được thực hiện trong ống riêng biệt Trong phương pháp này ống 1 sửdụng cặp mồi F (Forward primer) và Rw (Reverse wild type), ống 2 sử dụngcặp mồi F và RM (Reverse mutation) Sự xuất hiện của sản phẩm đặc hiệu ở

cả hai ống là kiểu gen dị hợp tử, nếu chỉ xuất hiện ở ống thứ 1 là đồng hợp tửbình thường, nếu chỉ xuất hiện ở ống thứ 2 là đồng hợp tử đột biến

Nguyên tắc chung của thiết kế mồi PCR cũng được áp dụng với các cặpmồi ARMS Các ARMS-PCR đòi hỏi 1 cặp mồi bao gồm 1 mồi chung (F) và

1 mồi ARMS (Rw hoặc Rm) Mồi ARMS có tính năng đặc biệt sau đây

+ Các mồi thông thường có chiều dài 30 base

+ Các nucleotid ở đầu 3’của mồi nên bổ sung với các nucleotid mục tiêunghĩa là C-G, G-C, A-T, T-A Sự không phù hợp ở vị trí này có thể làm giảmđáng kể khả năng khuếch đại, ví dụ 1 đột biến thay thế C-T các nucleotid cuốicùng của mồi ARMS cho alen bình thường là G (bổ sung cho C), cho alen độtbiến là A (bổ sung cho T)

+ Nếu thêm một điểm không bắt cặp ở 1 trong 5 nucleotid cuối cùngtrong mồi ARMS làm tăng thêm tính đặc hiệu cho phản ứng

+ Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự âm tính giả ví dụ như quá ít hoặcquá nhiều DNA, chất lượng mẫu DNA kém, thất bại trong việc thêm mồi,enzyme Taq, hoặc thuốc thử khác và sự xuất hiện của yếu tố ức chế PCR

+ Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ARMS có thể kiểm soát đượcbởi các điều kiện phản ứng nghiêm ngặt, thiết kế mồi tốt, và giới hạn số lượngcác chu kỳ là rất quan trọng để tránh kết quả sai Số lượng chu kỳ phải đủ đểtạo ra một kết quả dương tính chắc chắn, việc tăng số lượng chu kỳ không cầnthiết có thể gây ra kết quả dương tính giả.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu.

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 7/2019 – 9/2020

Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Sinh học – Di truyền trường Đại học

Y Hà Nội

2.2 Đối tượng nghiên cứu.

Các bệnh nhân được chẩn đoán ung thư tuyến giáp có kết quả giải phẫubệnh đến xét nghiệm tại Bộ môn Y sinh học – Di truyền Đại học Y Hà Nội.Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Thỏa mãn đồng thời ba tiêu chuẩn sau:

- Được chẩn đoán xác định ung thư tuyến giáp bằng mô bệnh học

- Đồng ý xét nghiệm tìm đột biến BRAF V600E.

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ.

Người bệnh có kèm theo ung thư cơ quan khác và/hoặc không đồng ýtham gia nghiên cứu

2.3 Nguyên liệu và các phương tiện nghiên cứu.

2.3.1 Hóa chất.