NGHIÊN cứu SÀNG lọc rối LOẠN CHUYỂN hóa bẩm SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ kép

Ở Việt Nam, có nhiều bệnhnhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh nhưng không được chẩn đoán xácđịnh sớm đã dẫn đến những di chứng nặng nề [1].Chương trình sàng lọc sơ sinh là một hệ thống

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRỊNH THỊ PHƯƠNG DUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA BẨM SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ KÉP

HÀ NỘI - 2019

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS.BS Trần Thị Chi Mai người Thầy đã tận tình hướng dẫn, cung cấp cho tôi những kiến thức, phương pháp luận quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình học tập, triển khai nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

TS BS Vũ Chí Dũng – Trưởng khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di Truyền, Giám đốc Trung tâm sàng lọc sơ sinh và quản lý bệnh hiếm, Bệnh viện Nhi Trung Ương đã luôn tận tình hướng dẫn nghiên cứu, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm chuyên môn và tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Phòng Quản lý và Đào tạo Sau đại học, Khoa Kỹ Thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu.

Tôi xin được cảm ơn tập thể Khoa Sinh hóa, Trung tâm sàng lọc sơ sinh

và quản lý bệnh hiếm, Bệnh viện Nhi Trung Ươngđã cho phép, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu và thu thập

số liệu.

Cuối cùng, tôi xin gửi lòng biết ơn và tình cảm yêu quý nhất đến Bố mẹ, chồng con, bạn bè và đồng nghiệp đã hết lòng ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và là động lực giúp tôi vượt qua những khó khăn để hoàn thành khóa học.

Tôi xin trân trọng cảm ơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Trịnh Thị Phương Dung

Tôi là Trịnh Thị Phương Dung, học viên Cao học khóa 26, chuyên ngành

Kỹ thuật y học, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn củaTS.BS Trần Thị Chi Mai và TS BS Vũ Chí Dũng

2 Công trình nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ công trìnhnghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 5 tháng 9 năm 2019

Học viên

Trịnh Thị Phương Dung

CH Congenital hypothyroidism - Suy giáp bẩm sinh

CLSI Clinical And Laboratory Standards Institute

CUD Cartitin uptake deficiency - khiếm khuyết hấp thu carnitinCTLN1 Citrullinemia type 1 – Tăng citrulin máu

CTLN Citrullinemia type 2 – Thiếu citrin

CV Coefficient of Variation – Hệ số biến thiên

DBS Dried Blood Spot - Giọt máu thấm khô

FDA

The Food and Drug AdministrationTrung tâm Quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa KỳG6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase

IVA Isovaleric acidemia - Tăng acid isovaleric máu

MCAD Thiếu hụt acyl-CoA dehydrogenase chuỗi trung bìnhMMA Methylmalonic acidemia – Tăng acid methylmalonic máu MSMS Khối phổ kép

MSUD Maple syrup urine disease – Bệnh si rô niệu

PAH Enzym phenylalanin hydroxylase

PKU Phenylketonuria – Phenyl xê tôn niệu

PPA Propionic acidemia - Tăng acid propionic máu

PXN Phòng xét nghiệm

QC Quality Control – Kiểm tra chất lượng

RLCHBS Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh

SLSS Sàng lọc sơ sinh

TEa Total Analytical error - Sai số toàn bộ cho phép

VLCAD Thiếu hụt enzym acyl-CoA dehydrogenases chuỗi rất dài

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sàng lọc sơ sinh và sàng lọc sơ sinh mở rộng 3

1.1.1 Lịch sử sàng lọc sơ sinh 3

1.1.2 Khái niệm và mục đích sàng lọc sơ sinh 5

1.1.3 Sàng lọc sơ sinh mở rộng 6

1.2 Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh 7

1.2.1 Khái niệm, phân loại, biểu hiện RLCHBS 7

1.2.1 Một số rối loạn chuyển hóa bẩm sinh thường gặp 11

1.3 Phương pháp khối phổkép 14

1.3.1 Nguyên tắc/ nguyên lý của kỹ thuật MSMS trong sàng lọc rối loạn chuyển hoá bẩm sinh 14

1.3.2 Bệnh phẩm dùng trong phân tích 16

1.4 Xác nhận phương pháp 19

1.4.1 Khái niệm và mục đích xác nhận phương pháp 19

1.4.2 Khi nào cần tiến hành xác nhận phương pháp 19

1.4.3 Các thông số xác nhận phương pháp 20

1.4.4 Các thực nghiệm xác nhận phương pháp 23

1.5 Xây dựng khoảng tham chiếu 24

1.5.1 Khái niệm 24

1.5.2 EP28A3 - Hướng dẫn xây dựng khoảng tham chiếu 25

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Trang thiết bị, hoá chất nghiên cứu: 28

2.3 Thiết kế nghiên cứu 28

2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 29

2.5 Nội dung nghiên cứu 29

2.5.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.5.2 Quy trình nghiên cứu 30

2.5 Xử lý số liệu 35

2.6 Đạo đức nghiên cứu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Thẩm định phương pháp 36

3.1.1 Kết quả đánh giá độ tập trung 36

3.1.2 Kết quả đánh giá độ chính xác 40

3.2 Kết quả xây dựng khoảng tham chiếu của các acid amin và acylcarnitin cho trẻ sơ sinh 42

3.2.1 Kết quả xây dựng khoảng tham chiếu của xét nghiệm Alanin 42

3.2.2 Kết quả khoảng tham chiếu các acid amin 44

3.2.3 Kết quả khoảng tham chiếu các acylcarnitin 45

3.3 Áp dụng kỹ thuật trong sàng lọc các bệnh chuyển hóa tại Khoa sinh hóa Bệnh viện Nhi trung ương 46

3.3.3 Rối loạn chuyển hóa acid hữu cơ 62

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 67

4.1 Xác nhận giá trị phương pháp khổi phổ kép MSMS 67

4.2 Áp dụng sàng lọc bệnh RLCHBS 73

4.3.1 Rối loạn chuyển hóa acid amin 74

4.3.2 Rối loạn chuyển hóa acid béo 77

4.3.3 Bênh acid hữu cơ niệu 81

KẾT LUẬN 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1: Các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh và chất chỉ điểm sàng lọc 18

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá độ tập trung ngắn hạn của các xét nghiệm acid amin trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 36

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ tập trung ngắn hạn của các xét nghiệm acylcarnitintrên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 37

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ tập trung dài hạn của các xét nghiệm acid amin trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 38

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ tập trung dài hạn của các xét nghiệm acylcarnitin trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 39

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ chính xác của các xét nghiệm acid amin trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 40

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác của các xét nghiệm acylcarnitin trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 41

Bảng 3.7: Kiểm nghiệm tính chuẩn của Alanin 42

Bảng 3.8 Kết quả khoảng tham chiếu của các acid amin cho trẻ sơ sinh 44

Bảng 3.9 Kết quả khoảng tham chiếu của các acylcarnitin cho trẻ sơ sinh 45

Bảng 3.10 Các bệnh rối loạn chuyển hoá acid amin phát hiện được khi sàng lọc bệnh nhân nguy cơ cao 46

Bảng 3.11 Kết quả sàng lọc của bệnh nhân MSUD 47

Bảng 3.12 Kết quả định lượng acid amin huyết tương của bệnh nhân MSUD 49 Bảng 3.13 Kết quả sàng lọc của bệnh nhân PKU 49

Bảng 3.14 Kết quả định lượng acid amin huyết tương của bệnh nhân PKU 51

Bảng 3.15 Kết quả sàng lọc của bệnh nhân CTLN2 52

Bảng 3.16 Các rối loạn chuyển hoá acid béo được chỉ định theo dõi khi sàng lọc bệnh nhân nguy cơ cao 53

Bảng 3.17 Kết quả sàng lọc lần 1 của bệnh nhân theo dõi CUD 53

Bảng 3.18: Kết quả sàng lọc lần 2 của bệnh nhân theo dõi CUD 54

Bảng 3.19 Kết quả sàng lọc của bệnh nhân theo dõi SCAD 55

Bảng 3.20 Kết quả sàng lọc của bệnh nhân theo dõi CPT I 58

Bảng 3.21 Kết quả sàng lọc của bệnh nhân theo dõi CPT II 60

Bảng 3.22: Các bệnh rối loạn chuyển hoá acid hữu cơ phát hiện được khi sàng lọc bệnh nhân nguy cơ cao 62

Bảng 3.23 Kết quả sàng lọc của bệnh nhân BKT 63

Hình 1.1: Sơ đồ minh họa nguyên tắc kỹ thuậtMSMS 15

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

Hình 3.1 Sự phân bố mức độ Alanin 42

Hình 3.2 Giá trị - tần số của Alanin 43

Hình 3.3 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân MSUD 48

Hình 3.4: Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân PKU số 3 50

Hình 3.5 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân CTLN1 51

Hình 3.6: Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân CTLN2 52

Hình 3.7 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân theo dõi CUD 55

Hình 3.8 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân theo dõiSCAD 56

Hình 3.9 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân theo dõi VLCAD 57

Hình 3.10: Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân theo dõiCPT I 59

Hình 3.11: Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân theo dõi CPT II số 1 61

Hình 3.12 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân IVA 62

Hình 3.13 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân BKT 64

Hình 3.14 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân PPA 65

Hình 3.15 Hình ảnh sắc ký đồ MSMS của bênh nhân MMA 66

từ khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung Ương và kếtquả sàng lọc sơ sinh mở rộng trên 60 000 trẻ sơ sinh trong vài năm gần đâythì tỷ lệ mới mắc bệnh khoảng 1/3750 trẻ sinh ra sống, trong đó tỷ lệ tử vonglên đến 48% trước năm 2010 và giảm còn dưới 10% trong những năm gầnđây [1] Nếu xét riêng một bệnh thì hiếm gặp, nhóm chúng lại thì tỷ lệ thayđổi từ 1/800 đến 1/2400 trẻ sinh ra sống [2] Rối loạn chuyển hóa là một gánhnặng với bản thân người bệnh, gia đình và xã hội.Việc điều trị đòi hỏi thờigian dài và còn tùy thuộc vào mức độ nặng nhẹ của bệnh Cho đến nay bệnhvẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu mà chỉ dừng lại ở các biện phápđiều trị hỗ trợ nhằm hạn chế các dấu hiệu của bệnh Bởi vậy, sàng lọc bệnhbằng chương trình sàng lọc sơ sinh là cần thiết cho việc phát hiện sớm, để cónhững can thiệp, hỗ trợ kịp thời, nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnhnhân, đồng thời giảm bớt gánh nặng cho gia đình Ở Việt Nam, có nhiều bệnhnhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh nhưng không được chẩn đoán xácđịnh sớm đã dẫn đến những di chứng nặng nề [1].

Chương trình sàng lọc sơ sinh là một hệ thống toàn diện bao gồm giáodục, sàng lọc, theo dõi kết quả xét nghiệm bất thường, xét nghiệm khẳngđịnh, chẩn đoán, điều trị và đánh giá kết quả và hiệu quả định kỳ Trong thập

kỷ qua, kỹ thuật phân tích khối phổ đã trở thành công nghệ chủ chốt tronglĩnh vực sàng lọc sơ sinh, thay thế các kỹ thuật sàng lọc cổ điển nhờ khả năngphân tích đồng thời nhiều chất chuyển hóa trong cùng một mẫu máu thấm khô

và vì vậy có thể sàng lọc nhiều bệnh một lúc Hệ thống khối phổ kép (MSMS)

là một công cụ hiệu quả giúp sàng lọc các rối loạn chuyển hóa acid béo, acidamin và acid hữu cơ [3]

Khoa Sinh hóa Bệnh viện Nhi trung ương đã được trang bị hệ thốngsàng lọc bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bằng MSMS với danh mục cácbệnh lý có thể phát hiện lên đến 55 bệnh rối loạn chuyển hóa khác nhau nhằmphục vụ cho sàng lọc, chẩn đoán các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh Để

có thể áp dụng thiết bị MSMS vào sàng lọc bệnh lý rối loạn chuyển hóa, cần

phải xác nhận phương pháp trước khi đưa vào sử dụng Do đó, đề tài “Nghiên

cứu sàng lọc bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bằng phương pháp khối phổ kép” được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Xác nhận quy trình kỹ thuật định lượng một số acid amin và acylcarnitin trong giọt máu thấm khô bằng MSMS.

2 Áp dụng kỹ thuật định lượng acid amin và acylcarnitin bằng MSMS trong sàng lọc bệnh rối loạn chuyển hoá cho các bệnh nhân nguy cơ cao tại Bệnh viện Nhi trung ương.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sàng lọc sơ sinh và sàng lọc sơ sinh mở rộng

1.1.1 Lịch sử sàng lọc sơ sinh

Sàng lọc sơ sinh (SLSS) được bắt đầu từ những năm 1960 bởi RobertGuthrie (1916-1995) - một nhà y sinh học người Mỹ khi ông tìm ra phươngpháp phát hiện phenylketon niệu (PKU) bằng việc sử dụng xét nghiệm ức chế

vi khuẩn bán định lượng phenylalanin trong các mẫu máu toàn phần chích từgót chân trẻ sơ sinh được thấm trên giấy lọc [4], [5] Năm 1968, hướng dẫnquyết định một bệnh có sàng lọc sơ sinh hay không được Wilson và Jungnerđưa ra dưới sự ủy quyền của WHO[6] Hướng dẫn gồm có 10 tiêu chí và đượctrình bày trong ấn phẩm “Nguyên tắc và thực hành sàng lọc rối loạn chuyển hóa

sơ sinh” Đến những năm 1970, bệnh suy giáp bẩm sinh là bệnh thứ hai đượcthêm vào danh sách sàng lọc sơ sinh.Trong bốn thập kỷ qua, các rối loạn khác

đã được thêm vào danh sách SLSS và các chương trình SLSS phổ cập ngàycàng trở nên phổ biến [7], [8] Có sự đồng thuận phổ biến về SLSS đối vớiPKU, suy giáp bẩm sinh (Congenital Hypothyroidism - CH) và xơ nang (CF)[7], [9], [10],[11] Cho đến đầu thế kỷ này, trẻ sơ sinh đã được kiểm tra PKU,

CH, CF, galactosemia, bệnh hồng cầu liềm, tăng sản thượng thận bẩm sinh(CAH), thiếu biotinidase và khiếm thính [6],[12] Hiện nay, gần như tất cả trẻ

sơ sinh ở Mỹ đều được sàng lọc hơn 30 bệnh Bệnh rối loạn chuyển hóa bẩmsinh (RLCHBS) nếu xét riêng từng bệnh là hiếm gặp, tuy nhiên khi xét là mộtnhóm thì tỷ lệ mắc ước tính 1/4000 trẻ sinh ra [13],[14] Danh sách các rốiloạn cho SLSS không đồng đều và thay đổi từ quốc gia này sang quốc giakhác, thậm chí từ khu vực này đến khu vực khác trong cùng một quốc gia, tùythuộc vào kinh phí, quy định, kỹ thuật được sử dụng và tỷ lệ mắc một rối loạn

cụ thể trong cộng đồng [15] Bất chấp những thách thức kinh tế, nhiều quốcgia có thu nhập trung bình và thấp cố gắng triển khai sàng lọc ít nhất một vàirối loạn và phát triển chương trình mô hình quốc gia bao gồm theo dõi, chẩnđoán, điều trị, giáo dục và đánh giá [16], [17].

Ở châu Á, Singapore là nước đầu tiên thực hiện sàng lọc sơ sinh vàonăm 1965 Sau đó, sàng lọc sơ sinh cũng nhanh chóng được triển khai rộngkhắp các nước khác trong khu vực, và Đài Loan hiện có tỷ lệ bao phủ sànglọc sơ sinh mở rộng cao nhất [18] Ngày nay, hầu hết tất cả các nước pháttriển đã mở rộng các chương trình sàng lọc sơ sinh từ khoảng 20 đến hơn 40bệnh chuyển hóa Trong đó có thể kể đến Mỹ với sàng lọc trên 30 bệnh [13].Tuy nhiên, các nước châu Âu có dịch vụ chăm sóc y tế tiêu chuẩn cao nhưAnh và Pháp, vẫn sàng lọc dưới 10 bệnh Chương trình sàng lọc sơ sinh hiệntại của Anh có phạm vi tương đối hẹp với 5 bệnh là PKU, suy giáp bẩm sinh,bệnh lý hemoglobin (hemoglobinopathies), xơ nang và thiếu hụt acylCoAdehydrogenase chuỗi trung bình Tại Pháp cũng có 5 bệnh được sàng lọc sơsinh là: PKU, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, suy giáp bẩm sinh, bệnhhồng cầu hình liềm và xơ nang [4]

Tại Việt Nam tình hình sàng lọc bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinhcòn chưa có tính hệ thống nên thông tin còn hạn chế Đến nay, các bệnh lýđang được tiến hành sàng lọc là suy giáp bẩm sinh, tăng sản tuyến thượngthận bẩm sinh, thiếu G6PD, rối loạn chuyển hóa bẩm sinh Theo thống kê củaBệnh viện Nhi Trung ương, từ tháng 11/2012 đến tháng 10/2013, tại Bệnhviện Nhi Trung ương đã phát hiện được 160 trẻ mắc RLCHBS trong số 1.709

ca có nguy cơ cao được xét nghiệm sàng lọc, chiếm 9,4%.Việt Nam áp dụngsàng lọc sơ sinh muộnhơn so với các nước trong khu vực Tình hình sàng lọcbệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh còn chưa có tính hệ thống nên thông tincòn hạn chế Năm 1998, dự án SLSS đầu tiên được khởi động trên suy giáp

bẩm sinh và thiếu hụt G6PD [19] Sau đó các bệnh được đưa vào chươngtrình sàng lọc sơ sinh là suy giáp bẩm sinh, tăng sản tuyến thượng thận bẩmsinh, thiếu G6PD Từ tháng 12/2017 Bệnh viện Nhi Trung ương đã tiến hànhtriển khai sàng lọc mở rộng 55 bệnh RLCHBS cho tất cả các trẻ mới sinh.Như vậy có thể đánh giá, tuy công tác sàng lọc sơ sinh của Việt Nam bắt đầukhá muộn nhưng chúng ta đã càng ngày càng hiểu rõ tầm quan trọng của nó.Công tác sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh cũng từ đó mà càng ngàycàng được quan tâm và mở rộng.

1.1.2 Khái niệm và mục đích sàng lọc sơ sinh

Sàng lọc sơ sinh (SLSS) là một quá trình sàng lọc cho trẻ sơ sinh ở thờiđiểm ngay sau khi sinh với một nhóm các rối loạn có thể gây bệnh nặng hoặc

tử vong nếu không được phát hiện và điều trị sớm [4] Mục đích của việc sànglọc là phát hiện những trẻ có nhiều khả năng mắc các bệnh lý rối loạn trao đổichất, nội tiết tố…[20] Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh (RLCHBS) có bệnhcảnh lâm sàng phức tạp, các triệu chứng lâm sàng có thể chưa xuất hiện ngaykhi sinh, nhưng khi đã xuất hiện triệu chứng thì đã nặng và nguy cơ tử vong

và tàn tật cao do tổn thương thần kinh trung ương, nhiều trường hợp tử vongtrước khi được chẩn đoán và điều trị Hầu hết các triệu chứng của RLCHBSkhông cụ thể, bao gồm kích thích, li bì, nôn, tăng hoặc giảm trương lực cơ,mùi hôi bất thường, toan chuyển hoá, hạ glucose máu, chậm phát triển tinhthần vận động [13] Các chương trình SLSS được thiết kế để cung cấp chẩnđoán sớm và điều trị trước khi có những biến chứng nặng nề [21] SLSS làmột hệ thống toàn diện bao gồm giáo dục, sàng lọc, theo dõi, chẩn đoán, điềutrị, đánh giá, đào tạo [4], [21] SLSS đã được chứng minh làm giảm tỷ lệ tửvong và ngăn ngừa tình trạng khuyết tật nghiêm trọng [3] Xét nghiệm SLSS

là cần thiết trong phòng xét nghiệm để sàng lọc, phát hiện, chẩn đoán, theo

dõi rối loạn chuyển hóa bẩm sinh, thường là các dấu ấn sinh hóa liên quan đếnrối loạn được sàng lọc [22] Một kết quả sàng lọc dương tính không có nghĩatrẻ sơ sinh chắc chắn bị một rối loạn nhưng cần tiến hành các thử nghiệmkhẳng định lại chẩn đoán [3], [15].

1.1.3 Sàng lọc sơ sinh mở rộng

Sự phát triển về kỹ thuật như phương pháp khối phổ kép (MS / MS)cho phép xác định chính xác và hiệu quả của nhiều rối loạn trên một mẫubệnh phẩm với một lần phân tích, một số rối loạn đáp ứng nhưng một số rốiloạn khác không đáp ứng tiêu chí Wilson-Jungner về việc có thể điều trị được[3], [23] Khả năng đo MSMS đồng thời nhiều chất chuyển hóa đã thay đổisâu sắc cách tiếp cận SLSS cũ “1 xét nghiệm phát hiện 1 bệnh’’ thành “1 xétnghiệm phát hiện nhiều bệnh’’, MSMS có thể coi là một xét nghiệmmultiplex Điều này đã dẫn đến việc sửa đổi hướng dẫn truyền thống củaWilson - Jungner [3], [13] MSMS cho phép các rối loạn khác được thêm vào

để sàng lọc mà không cần thêm mẫu hoặc thời gian phân tích Nếu tính trênmột xét nghiệm, chi phí cho MSMS là khá cao, nhưng khi phân tích mỗi xétnghiệm có thể sàng lọc khoảng trên 30 rối loạn thì chi phí của MSMS lại thấp[3] Trong những thập kỷ gần đây, phương pháp xét nghiệm nhằm sàng lọcđang được phát triển nhanh hơn phương pháp điều trị bệnh lý Phát hiện sớmcác rối loạn không điều trị được có thể không cứu sống trẻ sơ sinh, nhưng cóthể cải thiện chất lượng cuộc sống cho trẻ và giúp đỡ gia đình lập kế hoạchtương lai [3], [7] Những phát triển mới trong MSMS và ion hóa bằng điện(ESI) cho phép phân tích nhanh và hiệu quả trên mẫu máu thấm khô được thuthập để sàng lọc số lượng lớn các rối loạn chuyển hóa [18], [23], [24], [25]

Số lượng bệnh do MSMSphát hiện trung bình khoảng 20 (từ 10 đến 40 bệnh)[26] Một trong những quốc gia đầu tiên triển khai chương trình sàng lọc sơ

sinh trên thế giới là NewZealand Được bắt đầu như là một nghiên cứu thíđiểm cho phenylketon niệu (PKU) vào năm 1966 và trở thành một chươngtrình sàng lọc quốc gia vào năm 1970 Một số quốc gia thực hiện nghiên cứutương tự như Úc bắt đầu sàng lọc PKU năm 1967 và đến 1970 tiến triểnthành chương trình sàng lọc quốc gia; Nhật Bản bắt đầu năm 1967, phát triểnthành một chương trình quốc gia năm 1977; Singapore bắt đầu sàng lọc thiếuglucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) năm 1965 và phát triển thànhchương trình quốc gia năm 1970 [18] Đến nay, SLSS ngày càng trở nên phổbiến trên thế giới và SLSS mở rộng bằng MSMS giúp giảm đáng kể tỷ lệ tửvong và biến chứng nghiêm trọng [27].

1.2 Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh

1.2.1 Khái niệm, phân loại, biểu hiện RLCHBS

Khái niệm

RLCHBS là một nhóm bệnh di truyền liên quan đến các rối loạn bẩmsinh của quá trình chuyển hóa các chất Phần lớn do khiếm khuyết của gen mãhóa các enzym tham gia chuyển cơ chất thành sản phẩm Rối loạn chuyển hóabẩm sinh là các bệnh di truyền đơn gen Các bệnh lý này có thể tuân theo cácquy luật di truyền khác nhau như liên kết giới, trội, lặn nhiễm sắc thể thường,nhưng hầu hết những người bị rối loạn chuyển hóa bẩm sinh thừa hưởng haibản sao khiếm khuyết của gen-một bản sao từ cha và một bản sao từ mẹ

Cả cha và mẹ đều là “người mang gen” gây bệnh Trẻ sinh ra nhận hai bảnsao của gen khiếm khuyết từ bố và mẹ dẫn đến bị bệnh Nguyên nhân chínhcủa phần lớn các rối loạn chuyển hóa di truyền là do đột biến gen xảy ravới nhiều thế hệ trước đó

Nhóm thiếu hụt quá trình sản xuất năng lượng: rối loạn acid béo, bệnh

lý chu trình citric Biểu hiện thường là các cơn cấp tái phát được thúc đẩy bởichế độ dinh dưỡng hoặc dị hóa Các triệu chứng tiến triển bao gồm cả trướckhi sinh (bẩm sinh) với các tổn thương ở gan, não, tim, cơ Chỉ có một sốbệnh điều trị được

Nhóm tích tụ các đa phân tử (phân tử lớn): rối loạn thể tiêu bào, rốiloạn bẩm sinh glycosyl hóa, và rối loạn tổng hợp cholesterol

Ngoài ra còn một số hội chứng hiếm gặp khác và gen mới xác định: đáiđường sơ sinh, tổn thương gan

Tới nay đã phát hiện hơn 1000 bệnh khác nhau

và nhận biết đúng bệnh trẻ đang mắc phải

 Triệu chứng ngay sau sinh (đột ngột)

Trẻ sinh ra không có biểu hiện gì cho đến khi bắt đầu tiếp nhận các chấtdinh dưỡng từ bên ngoài Triệu chứng xuất hiện sau vài cữ bú sữa mẹ hoặc búbình với biểu hiện: kích thích, li bì, bỏ bú, nôn, ngừng thở hoặc thở nhanh, cogiật, tăng hoặc giảm trương lực cơ, bụng chướng, nước tiểu và mồ hôi có mùihôi hoặc bất thường Nghiêm trọng hơn, trẻ sẽ hôn mê và tử vong.

 Trẻ qua khỏi giai đoạn sơ sinh hoặc giai đoạn bệnh diễn biến từ từ

Các triệu chứng có thể xuất hiện sau khi dùng một loại thực phẩm, thuốcmen nào đó, hoặc khi cơ thể ở trạng thái dị hoá cao như nhiễm trùng cấp tính,nhịn đói kéo dài, gắng sức… bao gồm:

Động kinh, hôn mê

Chán ăn, đau bụng, nôn, nước tiểu, hơi thở, mồ hôi, hoặc nước bọt cómùi bất thường

Sụt cân, không tăng cân, chậm phát triển tinh thần

Vàng da kéo dài, gan to

loạn chuyển hóa bằng sàng lọc sơ sinh, thường được chẩn đoán chỉ sau khicác triệu chứng xuất hiện Khi các triệu trứng lâm sàng xuất hiện, xét nghiệmhóa sinh được sử dụng để chẩn đoán tình trạng bệnh.

Điều trị

Nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh không có phương phápđiều trị triệt để Tất cả các biện pháp điều trị đều nhằm hạn chế các dấuhiệu của bệnh Tùy theo thể bệnh mà trẻ gặp phải sẽ có các cách điều trịbệnh khác nhau

Chế độ ăn thích hợp: Trẻ bị bệnh sẽ không chuyển hóa được một số

chất có trong thức ăn hàng ngày Cần tránh cho trẻ sử dụng loại thức ăn mà cơthể trẻ không chuyển hóa được Đối với trẻ sơ sinh bị bệnh, trẻ sẽ phải dùngcác loại sữa được điều chế riêng Đối với trẻ lớn, chế độ ăn của trẻ phải đượckiểm soát nghiêm ngặt nhưng vẫn đảm bảo nhu cầu dinh dưỡng cần cho sựtăng trưởng và phát triển của trẻ

Bổ sung vitamin (co-enzyme), khoáng chất: tăng sức đề kháng, khả

năng chuyển hóa các chất trong cơ thể Ngoài ra những chất cơ thể trẻ khôngđược chuyển hóa được phải được bổ sung dưới dạng trẻ có thể hấp thu được

Liệu pháp Carnitin: Carnitin được coi là giải pháp loại bỏ các chất

độc tích tụ do rối loạn chuyển hóa ra ngoài và cung cấp năng lượng cho cơ thểmột cách an toàn và hiệu quả

Điều trị cấp cứu và duy trì khác: Bệnh nhân cần tránh nhịn đói và

được theo dõi chặt chẽ, khi xuất hiện triệu trứng lâm sàng cần truyền glucosesớm và đưa tới các cơ sở y tế có kinh nghiệm trong các trường hợp cấp cứu(hỗ trợ hô hấp, tuần hoàn, lọc máu liên tục)

Ghép tạng, enzyme thay thế, tế bào gốc hoặc gen trị liệu: ghép gan, tế

bào gan được chỉ định cho một số bệnh lý như MSUD và một số bệnh acidhữu cơ

1.2.1 Một số rối loạn chuyển hóa bẩm sinh thường gặp

Phenylketonuria (PKU) gây ra do thiếu enzyme phenylalanin

hydroxylase (PAH), enzyme cần thiết cho sự chuyển hoá acid aminphenylalanin thành tyrosin Trẻ mắc PKU khi tiêu thụ thực phẩm có hàmlượng protein cao, phenylalanin tích tụ trong cơ thể, gây ra ảnh hưởng trầmtrọng về trí tuệ, vấn đề thần kinh và rối loạn hành vi Tỷ lệ mắc khoảng1/12.000 trẻ sinh ra [28], [29] Khi thiếu hụt enzyme PAH, phenylalanine tích

tụ và tyrosin giảm Phenylalanin tăngquá mức có thể được chuyển hóa thànhphenylketon [29].Xét nghiệm hóa sinh cho thấy mức phenylalanin tăng caotrong máu và phenylketon trong nước tiểu, tuy nhiên phần lớn bệnh nhânđược phát hiện thông qua sàng lọc RLCHBS sử dụng MSMS dựa vào nồng độPhe và tỷ lệ Phe /Tyr, tỷ lệ này sẽ tăng lên trong PKU [30]

Bệnh xi rô niệu (Maple syrup urine disease –MSUD) là bệnh di truyền

lặn nhiễm sắc thể thường do tổn thương phức hợp enzyme dehydrogenase củaacid α - cetonic mạch nhánh (Branched - chain alpha - ketoaciddehydrogenase- BCKAD) cần thiết cho quá trình khử carboxyl các acid α -cetonic mạch nhánh (branched- chain ketoacids - BCKA), bước thứ hai trongquá trình thoái hoá các acid amin mạch nhánh (branched - chain amino acid -BCAA) Suy giảm hoạt tính của phức hợp BCKAD dẫn đến tăng nồng độ cácacid amin mạch nhánh như leucin, valin và isoleucin trong máu; tăng cácBCKA trong máu và nước tiểu.Tần suất mắc MSUD ước tính là 1:185000 trẻ

sơ sinh ra [31], [32], [33] Phần lớn các bệnh nhân là thể cổ điển với cáctriệu chứng thần kinh cấp tính, nước tiểu có mùi đường cháy ngay từ những

tuần đầu của cuộc sống Phát hiện MSUD bằng kỹ thuật MSMS dựa trên sựtăng cao leucin, valin và isoleucin trong máu, tuy nhiên để khẳng định chẩnđoán cần thực hiện các xét nghiệm chuyên sâu

Citrullinemia gồm hai dạng với các dấu hiệu và triệu trứng khác nhau.

Citrullinemia type 1 gây ra do giảm hoạt tính của enzym argininosuccinatsynthetase làm gián đoạn chu trình ure, ngăn cơ thể xử lý nitơ một cách hiệuquả Nồng độ nitơ dư thừa dưới dạng amoniac và các sản phẩm phụ khác củachu kỳ urê sẽ tích tụ trong máu Tỷ lệ mắc của bệnh khoảng 1/57.000 trẻ sinh

ra với triệu trứng điển hình của thiếu năng lượng (thờ ơ), ăn kém, nôn mửa, cogiật và mất ý thức Citrullinemia type 2 hay còn gọi là thiếu hụt citrin Citrin -protein vận chuyển Aspartate-Glutamate (Aspartate Glutamate Carrier), đóngvai trò thiết yếu trong quá trình tổng hợp ure và kênh vận chuyển aspartate-malate (aspartate-malate shuttle-MA shuttle) Sự thiếu hụt citrin ảnh hưởngđến quá trình tổng hợp protein, tái tạo glucose và sinh tổng hợp nucleotid.Biểu hiện lâm sàng của thiếu citrin ở trẻ nhỏ là vàng da ứ mật, còn ở ngườilớn là tăng citrulin máu typ II với triệu chứng thần kinh cấp tính và suy gankhông hồi phục Citrullinemia được phát hiện thông qua MSMS dựa trên sựgia tăng nồng độ citrulin và nồng độ NH3 trong máu, tuy nhiên để chẩn đoán

và khẳng định chẩn đoán cần thực hiện các xét nghiệm chuyên sâu và kết hợpvới triệu trứng lâm sàng [34]

Khiếm khuyết hấp thu carnitin (Cartitin uptake deficiency – CUD) là

một bệnh di truyền được gây ra bởi đột biến gen SLC22A5 – gen chịu tráchnhiện sản xuất protein OCTN2 đóng vai trò vận chuyển Carnitin vào tế bào.CUD là tình trạng cơ thể không thể sử dụng một số chất béo để cung cấp nănglượng năng lượng, đặc biệt khi nhịn ăndẫn đến sự tích tụ của các acid béokhông sử dụng Triệu trứng lâm sàng của CUD thường xuất hiện sau khi nhịn

ăn hoặc sau khi bị các bệnh nhiễm trùng, bao gồm li bì, thay đổi hành vi, bú

kém, tiêu chảy, sốt và hạ glucose máu CUD có thể được phát hiện từ biểuhiện lâm sàng hoặc được xác định bởi nồng độ Carnitine tự do (C0) thấp đếnrất thấp trong kết quả sàng lọc Khẳng định chẩn đoán bằng xét nghiệm giải

trình tự xác định đột biến gen SLC22A5 mã hóa chất protein OCTN2 [35].

Bệnh thiếu hụt enzyme acyl-CoA dehydrogenases: Enzyme acyl-CoA

dehydrogenases tham gia xúc tác quá trình β-oxi hoá acid béo trong ty thể.Khi thiếu hụt enzyme này dẫn đến giảm khả năng oxi hóa acid béo Bệnhđược chia thành 3 nhóm: thiếu enzyme CoA dehydrogenase chuỗi ngắn(SCAD), thiếu enzyme acyl-CoA dehydrogenase chuỗi trung bình (MCAD)

và bệnh thiếu enzyme xúc tác acyl-CoA dehydrogenase chuỗi rất dài(VLCAD)

Propionic acidemia (PA) là một rối loạn di truyền, do khiếm

khuyết enzyme propionyl-CoA carboxylase chuyển hóa propionyl-CoAthành methylmalonyl-CoA dẫn đến sự tích tụ bất thường của acidpropionic Các triệu chứng ban đầu bao gồm ăn kém, nôn mửa, chán ăn,yếu cơ và thiếu năng lượng có thể tiến triển nặng hơn như động kinh, hôn

mê, và có thể tử vong [36]

Methylmalonic acidemia (MMA): là rối loạn chuyển hóa có tỷ lệ mắc

ước tính khoảng 1 /48.000 trẻ sinh ra Trong MMA, cơ thể không thể thoáihóa các acid amin methionin , threonin , isoleucin và valin do thiếu cácenzyme methylmalonyl CoA mutase , methylmalonyl CoA epimerase , hoặcnhững rối loạn liên quan đến tổng hợp adenosylocobalamin (VitaminB12) ; kết quả là acid methylmalonic tích tụ trong máu và các mô Tất cả cácdạng rối loạn này thường được chẩn đoán ở giai đoạn sơ sinh, xuất hiện bệnhnão tiến triển, và tăng huyết áp thứ phát Rối loạn này có thể dẫn đến tử vongnếu không được chẩn đoán hoặc không điều trị [37]

Isovaleric acidemia (IVA) là bệnh rối loạn chuyển hóa do rối loạn hoặc

ngăn cản sự thoái hóa của acid amin leucine mà nguyên nhân là thiếu enzymeisovaleryl-CoA dehydrogenase Đây là chứng acid hữu cơ đầu tiên được ghinhận ở người và có thể gây ra bệnh với tỷ lệ tử vong đáng kể Các triệu chứng

sơ sinh không đặc hiệu bao gồm bỏ bú, nôn, li bì, hôn mê Trẻ sơ sinh có thể

bị hạ thân nhiệt, mất nước Ở giai đoạn nặng có thể xuất hiện mùi đặc trưng ởchân.Phần lớn bệnh nhân bị IVA ngày nay được chẩn đoán trước khi có triệuchứng qua sàng lọc sơ sinh bằng cách sử dụng MSMScho thấy sự gia tăng C5acylcarnitin trong các mẫu máu thấm khô [38]

β ketothiolase là bệnh do thiếu hụt enzyme β ketothiolase – enzyme tham

gia thoái hóa isoleucin và thể ceton Thiếu hụt enzym β ketothiolase dẫn đếntích tụ các hợp chất có hại và thể ceton Triệu trứng lâm sàng của bệnh điểnhình là các cơn mất bù ngắt quãng do nhiễm toan ceton, kèm theo nôn mửa,khó thở, thờ ơ Bệnh nhân BKT nếu không được phát hiện sớm và điều trịđúng cách sẽ hôn mê sâu và tử vong [39]

1.3 Phương pháp khối phổkép (MSMS)

1.3.1 Nguyên tắc/ nguyên lý của kỹ thuật MSMS trong sàng lọc rối loạn chuyển hoá bẩm sinh

MSMS là thiết bị sử dụng để phân tách và định lượng các ion dựa trên tỷ

số khối lượng/ điện tích của chúng (mass/charge ratio) MSMS tạo ra cácphần tử tích điện từ mẫu cần phân tích, sau đó sử dụng điện và từ trường đểphân tách và đo lường khối lượng của các phần tử tích điện Bộ phận pháthiện sẽ tạo ra đồ thị phổ khối của các đỉnh có thể định lượng được bằng cácchuẩn nội để xác định lượng mỗi chất có mặt trong mẫu

Hình 1.1: Sơ đồ minh họa nguyên tắc kỹ thuậtMSMS

MSMS gồm 2 MS nối với nhau bởi một bộ phận gọi là collision cell.Trước khi đi vào MS thứ nhất, mẫu được ion hoá bằng fast atom bomardmenthoặc electrospray (FAB-MSMS hoặc ES-MSMS) Quá trình này tạo điện tíchnhưng không phân cắt các hợp chất hữu cơ trong mẫu MS thứ nhất phân táchcác ion gốc (parent ions) theo trình tự số khối (mass/charge ratio) và chuyểnsang bộ collision chamber Bộ phận collision chamber phân cắt các ion gốcchuyển các mảnh ion sang MS thứ hai Mẫu hình của các mảnh ion của mỗiion gốc được phân tích và so sánh với phổ đã biết của các chất chuẩn nội.Toàn bộ quá trình ion hoá và phân tích kết quả mất khoảng 2 phút

MSMS là một công cụ hiệu quả giúp sàng lọc các rối loạn chuyển hoáacid béo, acid amin và acid hữu cơ niệu Định lượng acid amin, carnitine tự

do và acylcarnitin đòi hỏi phải tách chiết mẫu máu thấm khô bằng dung dịchchứa nội chuẩn đồng vị ổn định (Stable isotope labeled internal standards) vàphân tích trên MSMS Tín hiệu của mỗi chất phân tích trong mẫu so với nộichuẩn tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích trong mẫu Dữ liệu được thu nhậnbằng phương pháp MRM (Multiple Reaction Monitoring) Trong phương

pháp này, sản phẩm của mỗi chất phân tích sau khi qua bộ phận va chạm(collision cell) được đo lường Dữ liệu được thu và xử lý bởi phần mềm cungcấp cho hệ thống [40]

Hệ thống MS ba tứ cực (triple quadrupole) sử dụng cho phép đo lườngnày được kiểm soát bằng máy tính, phát hiện các phân tử ion hoá trong mẫutheo số khối (m/z) Mẫu tách chiết được đưa vào bộ ion hoá bằng tia điện(electrospray ionization- ESI) của MS nhờ hệ thống sắc ký lỏng (LC), baogồm bơm mẫu tự động, bơm, khử khí của dung môi.ESI tạo sự ion hoá nhẹ,nơi mà các ion được tạo thành khi dung môi bay hơi ESI tạo các phân tửproton hoá hoặc khử proton, được lựa chọn để đưa vào máy phân tích khối đểphát hiện

Trong hệ thống MSMS, các ion được lựa chọn của các chất phân tích đượcphân tách trong tứ cực thứ nhất (Q1), chuyển sang tứ cực thứ 2 (Collision cell)nơi mà khí trơ có áp lực cao gây phân mảnh đặc hiệu Một ion sản phẩm của mỗichất phân tích được lựa chọn đưa vào Q3 và phát hiện bởi đầu dò

1.3.2 Bệnh phẩm dùng trong phân tích

Mẫu máu thấm khô (Dry blood spot) lấy từ gót chân được khuyến cáotrong kỹ thuật MSMS Mẫu bệnh phẩm được lấy trong vòng 48-72h sau khisinh trên giấy thấm chuyên dụng dùng trong sàng lọc các bệnh chuyển hóabẩm sinh Lấy máu tốt nhất từ 48 đến 72h sau sinh [7], [20], [41] Lấy máuquá sớm (trước thời điểm 24h) sẽ dễ dẫn đến kết quả dương tính giả Sau 72giờ việc lấy máu vẫn có thể tiến hành mà giá trị xét nghiệm không thay đổi,tuy nhiên lấy mẫu quá muộn sẽ không đảm bảo được mục tiêu phát hiện bệnhsớm và điều trị kịp thời Đối với trường hợp truyền máu, lấy mẫu trước khitruyền [42] Đối với bé sinh non vẫn có thể lấy mẫu xét nghiệm SLSS Tuynhiên, việc lấy mẫu lặp lại sau đó là cần thiết và thời gian thu mẫu lặp lạiđược chỉ định cụ thể cho từng trường hợp [42] Mỗi giọt máu cần đủ to phủkín 1 vòng tròn trên giấy Cần đảm bảo không có nhiều lớp máu, không áp

giọt máu nhiều lần trên cùng vòng tròn, tránh gây lắng máu hay không đồngnhất nồng độ gây nhiễu kết quả.

1.3.3 Ứng dụng MSMS trong sàng lọc sơ sinh chẩn đoán rối loạn chuyển

hóa acid béo, acid amin và acid hữu cơ.

Trong những năm 1980 và 1990, những phát triển mới trong phươngpháp điện hóa và phân tách khối phổ liên tục cho phép sự phát triển nhanh,phân tích nhiều chỉ số từ các giọt máu thấm khô (DBS) Millington, Chace vàcộng sự đã áp dụng kỹ thuật khối phổ kép (MSMS) để sàng lọc các bệnh rốiloạn chuyển hoá di truyền ở trẻ sơ sinh [23], [25] Là một xét nghiệm sànglọc cho trẻ sơ sinh, MSMS không chỉ là một phương pháp phát hiện acyl-CoAdehydrogenase chuỗi trung bình (MCAD) [43], cũng không chỉ đơn giản làmột sự cải thiện phương pháp phát hiện chính xác PKU ở trẻ sơ sinh với tỷ lệdương tính giả thấp gấp 10 lần so với kết quả phương pháp tốt nhất sẵn cótrước đây [44] Công nghệ MSMS là một cuộc cách mạng đối với các chươngtrình sàng lọc sơ sinh có khả năng sàng lọc cho bệnh rối loạn chuyển hóa chỉtrong một lần phân tích với mẫu máu thấm khô Hơn 3 triệu trẻ được sàng lọctrên toàn thế giới đã phát hiện 500 trẻ mắc các bệnh rối loạn chuyển hóa,MSMStrong sàng lọc sơ sinh là một chứng minh công nghệ sàng lọc lâm sàng[52-55] Đến năm 1990, đã có ba phòng thí nghiệm ở Mỹ tiến hành sàng lọctrẻ sơ sinh bằng MSMS [56] Ở Canada, chương trình sàng lọc sơ sinh bằngMSMS bắt đầu vào năm 2000 tại Nova Scotia và Saskatchewan có thể pháthiện gần 30 bệnh [56] Các nghiên cứu này đã chỉ ra MSMS là một công cụhiệu quả trong việc sàng lọc cho nhiều rối loạn chuyển hóa chỉ trong một lầnxét nghiệm duy nhất Ngày nay, hầu hết các nước phát triển đã mở rộngchương trình SLSS bao gồm từ khoảng 20 đến hơn 40 bệnh rối loạn chuyểnhoá di truyền bằng MSMS Bảng dưới đây đề cập một số rối loạn chuyển hóaacid amin, acid béo và acid hữu cơ phổ biến ở trẻ sơ sinh với các chỉ điểmdùng để sàng lọc [30], [45], [35], [46], [47], [48]

Bảng 1.1: Các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh và chất chỉ điểm sàng lọc

và isoleucin↑

Citrullinemia (CTLN1) Citrullin ↑Citrullinemia (CTLN2) Citrullin ↑, arginin↑

Rối loạn

chuyển hóa

acid béo

(FAOD)

Carnitin uptake defect (CUD) C0↓

Short-chain acyl – coA dehydrogenase deficiency (SCAD)

C14:1↑ & C14:1/C2 ↑

Glutaric aciduria, type 2 (GA2) C8↑, C10↑, C12↑

Carnitine palmitoyltransferase dificiency, type 1 (CPT1)

C0↑, C0/(C16+C18:1)>100Carnitine palmitoyltransferase

dificiency, type 2 (CPT2)

C16↑, (C16+C18:1)/C2>0.2

Rối loạn

chuyển hóa

acid hữu cơ

(OAs)

Isovaleric acidemia (IVA) C5↑

Methylmalonic acidemia (MMA) C3↑

Propionic acidemia (PPA) C3↑

Glutaric acidemia, type 1 (GA1) C5DC↑

Multiple carboxylase deficiency (MCD)

C5OH↑

3- methylcrotony-coA carboxylase deficiency (MCC)

C5OH↑ & C3>3.6

β ketothiolase (BKT) C5:1↑, C5OH↑

1.4 Xác nhận phương pháp

1.4.1 Khái niệm và mục đích xác nhận phương pháp

Xác nhận phương pháp (Verification) là khẳng định bằng kiểm tra cácbằng chứng khách quan cho thấy các yêu cầu cụ thể của một phương phápđịnh sử dụng có thể đáp ứng được [49], [50]

Xác nhận phương pháp là một quá trình mà một phương pháp được xácđịnh là phù hợp với mục đích và dự định sử dụng Xác nhận phương pháp(verification) áp dụng để kiểm tra lại khả năng thực hiện của các phương phápđược công bố hoặc phương pháp không có cải tiến [51] Xác nhận phươngpháp là công cụ dùng để đánh giá tính tin cậy của phương pháp

Mục đích chính của xác nhận phương pháp là đánh giá sai số, để chứngminh rằng trước khi trả kết quả xét nghiệm cho bệnh nhân, phương phápđãđược đánh giá các tiêu chuẩn hiệu năng như độ tập trung (precision), độchính xác (trueness) [51] Ngay cả khi phương pháp đã được nhà sản xuấtđưa ra các thông số kỹ thuật, việc đưa vào áp dụng trong phòng xét nghiệmđòi hỏi phải kiểm tra xem các thông số đó có đúng với điều kiện phòng xétnghiệm hay không (môi trường, trang thiết bị máy móc, nhân viên…)

1.4.2 Khi nào cần tiến hành xác nhận phương pháp

Kết quả của một xét nghiệm bịảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: các yếu tố

về thay đổi hoặc mở rộng đối tượng áp dụng, thay đổi địa điểm phòng thửnghiệm, thay đổi nhân viên, thay đổi thiết bị, thay đổi các điều kiện về tiệnnghi môi trường Điều kiện môi trường ở từng nơi là khác nhau, điều này cóthể dẫn tới sự khác nhau của kết quả xét nghiệm Sự khác nhau này thườngkhông đáng kể, tuy nhiên vẫn cần phải chứng minh phương pháp được thựchiện trong môi trường phòng xét nghiệm phù hợp với những tuyên bố của nhà

sản xuất Trước khi đưa vào sử dụng máy móc thiết bị, cũng cần phải chứngminh những kết quả của nhà sản xuất báo cáo là đáng tin cậy [51].

Ngoài ra, việc xác nhận không phải chỉ cần thực hiện một lần khi pháttriển phương pháp ban đầu mà cần thực hiện trong suốt quá trình áp dụng,thường là đánh giá định kỳ hàng năm vì đa số các điều kiện thực hiện phươngpháp có sự thay đổi trong suốt quá trình này như thay đổi về cơ sở vật chất, vềcon người, về trang thiết bị và hóa chất thuốc thử…Hay trong trường hợp kếtquả phân tích mẫu kiểm tra chất lượng hoặc kết quả đánh giá sự phù hợp của

hệ thống nằm ngoài giới hạn cho phép thì phương pháp cũng cần được xácnhận lại Vì vậy, xác nhận phương pháp cần được tiến hành trước khi đưamáy xét nghiệm vào phục vụ bệnh nhân, sau khi có bất kì chỉnh sửa/cải tiến

từ nhà sản xuất hoặc di chuyển thiết bị và tại các khoảng thời gian nhất định

để đánh giá hiệu năng phương pháp đang sử dụng.Tuy nhiên, các thông sốcần xác nhận lại phụ thuộc vào mức độảnh hưởng của các thay đổi đến cácthông số của phương pháp

1.4.3 Các thông số xác nhận phương pháp

Xác nhận phương pháp là một công việc rất khó khăn và tốn kém, tuynhiên lại là một nội dung quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quảxét nghiệm Cần cân nhắc mục đích yêu cầu của từng phương pháp và nguồnlực để lựa chọn thông số xác nhận cho phù hợp [49], [50], [51], [52] Đối vớicác phương pháp phân tích hóa học, các thông số bao gồm:

- Độ nhạy (Sensitivity)

- Khoảng tuyến tính vàđường chuẩn (Linearity and Calibration curve)

- Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)

- Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation – LOQ)

- Độ lệch (Bias)

- Độchính xác (Trueness)

- Độ tập trung (Precision)

Việc lựa chọn các thông số xác nhận tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụngtrong phòng xét nghiệm, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lựccủa phòng thí nghiệm Tuỳ từng trường hợp cụ thể các thông số có thể có sựkhác nhau

Phương pháp xét nghiệm thường được chia làm 3 loại Một là các xétnghiệm đơn giản (waived test): Các xét nghiệm không đòi hỏi xác nhậnphương pháp, chỉ cần tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất Hai là các xétnghiệm cóđộ phức tạp trung bình và cao, không cải biến (unmodifiedmoderate and high complexity tests): Những xét nghiệm này cần thực hiệnxác nhận phương pháp với những thông số sau: độ chính xác, độ xác thực,khoảng tuyến tính, khoảng tham chiếu Ba là các phương pháp có độ phức tạptrung bình và cao, có cải biến (modified moderate and high complexity tests):Những xét nghiệm này cần thực hiện xác nhận phương pháp với các thông sốsau: độ tập trung, độ chính xác, độ nhạy, độđặc hiệu, khoảng tuyến tính,khoảng tham chiếu

Độ tập trung (Precision)

Độ tập trung (precision) là mức độ gần đúng giữa các kết quả thực hiệnđộc lập trên cùng một mẫu và trong cùng điều kiện thực hiện; được biểu thịdưới dạng độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV)[49]

Độ tập trung là các kết quả xét nghiệm thu được gần nhau, ít phân tán

Độ tập trung tương ứng với khoảng cách giữa kết quả xét nghiệm thu đượccủa cùng một mẫu và trong cùng điều kiện thí nghiệm Sự phân tán của cáckết quả xét nghiệm thu được càng nhỏ thì độ tập trung càng cao và ngược lại[49], [51], [52] Độ tập trung chịu ảnh hưởng nhiều của các sai số ngẫu nhiên

Có hai loại độ tập trung cần kiểm tra: độ tập trung ngắn hạn (short-term

precision) hay độ tập trung trong một lần chạy (within-run precision) và độtập trung dài hạn (long-term precision) hay độ tập trung giữa các lần chạy(between-run precision).

• Độ tập trung ngắn hạn:

Kiểm tra khả năng của một phương pháp lặp lại kết quả của chính mẫu

đó cho dù nó được đặt ở bất kỳ vị trí nào trong lần chạy.Để đánh giá tính lặplại kết quả trong một khoảng thời gian ngắn, hoặc mẫu bệnh phẩm hoặc QCđược đặt ở các vị trí bất kỳ trong lần chạy đó [51], [52]

• Độ tập trung dài hạn:

Đánh giá khả năng của một phương pháp lặp lại kết quả của một mẫu khichạy nhiều lần khác nhau Giả thiết là không có can thiệp y tế nào hoặc thayđổi tình trạng sức khỏe của bệnh nhân giữa các lần lấy mẫu, độ tập trung dàihạn giúp kiểm tra PXN có đạt được kết quả cơ bản là không thay đổi cho mộtchất phân tích trên một bệnh nhân cụ thể cho dù mẫu có được chạy ở các ngàykhác nhau Độ tập trung giữa các lần chạy cũng cần phải được kiểm tra ở ítnhất hai nồng độ khác nhau Các nồng độ này đặc trưng cho các giá trị thấp,trung bình, cao trong khoảng tuyến tính đã thiết lập được và tương ứng vớicác giá trị gặp ở bệnh nhân Các nồng độ này thường liên quan đến các điểm

có tính quyết định về y học [51], [52]

Độ chính xác (Trueness)

Độ chính xác là mức độ gần đúng giữa các kết quả một phép đo và giá trịthật của phép đo Mỗi chất trong mẫu thử đều có trị số thực của nó, việc xácđịnh trị số thực của mỗi thành phần trong một mẫu huyết thanh hay mẫuchuẩn hết sức khó khăn Những kết quả có trị số gần đến thực là trị số có độxác thực cao [53] Mục đích của kiểm tra độ chính xác của kỹ thuật nhằmphát hiện và loại bỏ những sai số hệ thống có thể xảy ra trong quá trình làm

xét nghiệm.Sai số hệ thống luôn có chiều hướng và gây ra tất cả các kết quảxét nghiệm hoặc cao hơn hoặc thấp hơn giá trị thực.

Một phương pháp xét nghiệm thu được kết quả đúng khi kết quả xấp xỉbằng trị số thực của nó Trị số thực là khái niệm lý tưởng rất khó thực hiệnđược trên thực tế mà chỉ có giá trị thực theo quy ước Người ta phải lặp lạinhiều lần trên cùng một mẫu và kết quả cũng phải lặp lại nhiều lần được coi là

số thực

Nguyên tắc kiểm tra độ chính xác là kiểm tra sự gần đúng của các kếtquả xét nghiệm với giá trị thực của chất phân tích.Nếu một phương phápkhông đảm bảo được độ chính xác thì nó không được xác nhận

1.4.4 Các thực nghiệm xác nhận phương pháp

Thực nghiệm đánh giá độ tập trung.

Trong hướng dẫn NBS04A được phát triển cho bệnh RLCHBS có đưa

ra quy trình và tiêu chuẩn giúp đánh giá độ tập trung của xét nghiệm MSMS.Quy trình được tiến hành trong 20 ngày với điều kiện hệ thống xét nghiệmphải được thực hiện nội kiểm hàng ngày Khi kết quả nội kiểm không đạthoặc gặp khó khăn trong quá trình vận hành hệ thống xét nghiệm, cần loại bỏkết quả và tiến hành chạy lặp lại thêm một lần nữa

Độ tập trung ngắn hạn: Thực hiện phân tích 20 lần liên tiếp trên 3 mứcnồng độ trong 1 ngày Kết quả thu được sử dụng các thuật toán thống kê đểphân tích kết quả Từ giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (SD), tính CV Tiêuchuẩn cho độ tập trung ngắn hạn là CV dưới 25% [54]

Độ tập trung dài hạn: Thực hiện phân tích 20 lần liên tiếp trên 3 mứcnồng độ trong 20 ngày Kết quả thu được sử dụng các thuật toán thống kê đểphân tích kết quả Từ giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (SD), tính CV Tiêuchuẩn cho độ tập trung dài hạn là CV dưới 35% [54]

Thực nghiệm đánh giá độ chính xác

Hướng dẫn về thẩm định phương pháp của Trung tâm Quản lý Thựcphẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) được công bố vào năm 2013 Hướng dẫnđưa ra các khuyến nghị cho việc phát triển, thẩm định, xác nhận và sử dụngcác phương pháp nghiên cứu sinh học trong nghiên cứu

Thông tin trong hướng dẫn này áp dụng cho các quy trình phân tíchnhư máu toàn phần, huyết thanh, huyết tương, nước tiểu và mô Đối với đánhgiá độ chính xác, hướng dẫn khuyến nghị mẫu đánh giá là ba mức nồng độ

QC thấp, trung bình và cao với tối thiểu là 06 lần chạy/ 02 ngày Tiêu chuẩnchấp nhận là giá trị trung bình chạy phải nhỏ hơn hoặc bằng ± 20% giá trịđích [55]

1.5 Xây dựng khoảng tham chiếu

1.5.1 Khái niệm

Khoảng tham chiếu sinh học được định nghĩa theo tiêu chuẩn quốc giaTCVN ISO 15189:2014 là khoảng xác định của phân bố các giá trị lấy từ tổngthể chuẩn sinh học[56], theo CLSI EP28-A3 được định nghĩa là khoảng giữa,bao gồm 2 giới hạn tham chiếu trên và giới hạn tham chiếu dưới [57] Khoảngtham chiếu ước tính bao gồm 95% các giá trị trong quần thể từ các đối tượngtham chiếu được chọn Đối với hầu hết các xét nghiệm, giới hạn tham chiếutrên và dưới được ước tính tương ứng là bách phân vị thứ 2.5 và 97.5 củaphân phối các kết quả xét nghiệm trong quần thể tham chiếu Trong một sốtrường hợp, chỉ có một giới hạn ảnh hưởng trên lâm sàng, thường là giới hạntrên, bách phân vị thứ 97.5 Việc xây dựng giá trị tham chiếu và ước tínhkhoảng tham chiếu cho một xét nghiệm cần được tiến hành với một quy trìnhrất rõ ràng CLSI EP28-A3 đã xây dựng quy trình thiết lập KTC áp dụng đốivới một xét nghiệm mới cho một nhóm các cá thể khác nhau hoặc cho một

phương pháp phân tích mới có độ nhạy và độ đặc hiệu hơn so với phươngpháp trước đây.

Theo Cerioti và cộng sự, bốn tiêu chí phải được xem xét trong thẩm địnhcủa bất kỳ nghiên cứu về khoảng tham chiếu nào bao gồm [57]:

- Lựa chọn cá nhân tham chiếu

- Thiết kế nghiên cứu

- Chất lượng phân tích của dữ liệu

- Xử lý thống kê dữ liệu

Việc xây dựng KTC chịu ảnh hưởng của nhiều biến, tuy nhiên hai biếnquan trọng cụ thể là phương pháp phân tích và quần thể tham chiếu

1.5.2 EP28A3 - Hướng dẫn xây dựng khoảng tham chiếu

Hướng dẫn EP28A của CLSI đưa ra hướng dẫn EP28A xây dựngkhoảng tham chiếu với một quy trình cụ thể, rõ ràng bao gồm [57]:

Lựa chọn đối tượng tham chiếu.

Định nghĩa “khỏe mạnh” là vấn đề ban đầu của bất kỳ nghiên cứu nào

Do vậy, xây dựng tiêu chuẩn để loại trừ cá thể không khỏe mạnh là bước đầutiên trong việc lựa chọn cá thể tham chiếu Mỗi một nghiên cứu sẽ đưa ra tiêuchí khác nhau về sức khỏe Việc chỉ định các cá thể tham chiếu tình nguyệnkiểm tra các vấn đề liên quan sức khỏe bao gồm các bài kiểm tra như hỏi tiền

sử, các bài kiểm tra lâm sàng, cận lâm sàng Do đó, ít nhất cũng cần thiết kế

bộ câu hỏi được sử dụng để đánh giá tình trạng sức khỏe của mỗi cá thể thamchiếu Các tiêu chuẩn loại trừ được đặt ra chi tiết giúp việc chọn lựa cá thểtham chiếu được chính xác Ví dụ mẹ bầu có mắc các bệnh lý di truyền, tiền

sử gia đình có người mắc rối loạn chuyển hóa, trẻ quấy khóc, bỏ bù, li bì…

CLSI đề xuất hai kỹ thuật lấy mẫu để chọn đối tượng tham chiếu: trựctiếp và gián tiếp

Kỹ thuật lấy mẫu trực tiếp là chọn các cá thể tham chiếu từ một quầnthể tham chiếu bằng các tiêu chí cụ thể, được xác định rõ Các tiêu chí cầnđược áp dụng trước khi các mẫu được thu thập và phân tích Trong trườnghợp các tiêu chí áp dụng sau khi thu thập mẫu thì được gọi là hậu nghiệm.Phương pháp lấy mẫu trực tiếp này được IFCC khuyến cáo là phương pháp

ưu tiên trong việc lựa chọn cá thể tham chiếu [58]

Trong kỹ thuật lấy mẫu gián tiếp, các giá trị trong phòng thí nghiệm từ

cơ sở dữ liệu có sẵn được thiết lập cho các mục đích khác được sử dụng đểước tính khoảng tham chiếu Phương pháp được sử dụng khi việc lấy mẫu từcác cá thể khỏe mạnh dường như rất khó khăn (ví dụ trẻ nhỏ) Mặc dù cáchtiếp cận khá đơn giản và ít tốn kém nhưng vẫn tồn tại một số lượng lớn dữliệu của người không khỏe mạnh tồn tại trong cơ sở dữ liệu Phương pháp này

có lẽ phù hợp hơn với việc sử dụng dữ liệu từ các cá thể được cho rằng tươngđối khỏe mạnh như những người hiến máu hoặc tham gia vào nghiên cứusàng lọc gen CLSI cũng khuyến cáo thông thường cỡ mẫu tối thiểu là 120với điều kiện không có dữ liệu nào bị loại bỏ

Loại bỏ giá trị ngoại lai.

Một giả thuyết quan trọng được đặt ra trong việc ước tính giới hạntham chiếu là dãy giá trị tham chiếu đo được đại diện là một bộ giá trị đồngnhất Tuy nhiên có một vài giá trị phát sinh từ quần thể khác (outlier) Những

dữ liệu như vậy nằm giữa dãy số liệu, khó có thể phát hiện ra trừ khi ngườithực hiện phân tích biết rằng các giá trị đo đại diện cho các phân tích khôngđiển hình hoặc là kết quả của lỗi quy trình hoặc số học Bởi vậy bước đầu tiêntrong quá trình phân tích dữ liệu là kiểm tra trực quan tần số phân bố.Cónhiều phương pháp thống kê để phát hiện giá trị ngoại lai (outlier) Đa số cácphương pháp này đều dựa trên giả định là quần thể phân bố chuẩn

Xử lý thống kê dữ liệu

Tùy thuộc vào số lượng đối tượng tham chiếu, cũng như sự phân phốicác giá trị tham chiếu, CLSI đã hướng dẫn ba phương pháp khác nhau để xácđịnh khoảng tham chiếu:

- Phương pháp tham số: giả định rằng các giá trị quan sát tuân theo phânphối xác suất Gaussian – phân phối chuẩn Tính toán giá trị trung bình X và

độ lệch chuẩn SD, khoảng tham chiếu được xác định là X ± 2 SD

- Phương pháp phi tham số: Khi các giá trị quan sát không tuân theophân phối chuẩn Giới hạn tham chiếu được xác định bằng cách sử dụngthống kê thứ tự tăng dần Giới hạn tham chiếu thông thường được xác địnhbằng cách tính thứ hạng cho phân vị thứ 2,5 và 97,5[57]

X2,5 = 0.025 (n + 1)X97,5 = 0.975 (n + 1)Với n biểu thị số lượng quan sát trong một tập hợp dữ liệu tham chiếutrong đó 95% khoảng tham chiếu được tính toán

- Phương pháp trung gian: phương pháp này không yêu cầu nhiều quan sátnhư phương pháp phi tham số và nó cũng không yêu cầu các giá trị tuân theophân phối Gaussian Phương pháp này có dạng tương tự như tham số ngoại trừ,

đo vị trí và độ lan truyền thay vì trung bình và độ lệch chuẩn của mẫu Điều đó

có nghĩa là trọng số được dành cho các giá trị trung tâm của phân phối nhiềuhơn so với các giá trị ở xa để tính các khoảng tham chiếu [57]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mục tiêu 1: Trẻ sơ sinh được chỉ định xét nghiệm sàng lọc rối loạn

chuyển hóa tại bệnh viện Nhi Trung ương

 Tiêu chuẩn lựa chọn: Trẻ khỏe mạnh, không có bất thường về chuyển

hóa, không nghi ngờ có rối loạn chuyển hóa và mẹ bầu không mắc các rốiloạn chuyển hóa Gia đình đồng ý cho trẻ được sàng lọc sơ sinh mở rộng

 Tiêu chuẩn loại trừ: Trẻ không đáp ứng được các tiêu chuẩn lựa chọn

mắc các bệnh lý rối loạn, không phải giai đoạn sơ sinh Các mẫu khôngđạt yêu cầu (không đủ thể tích, không đủ số lượng…)

Mục tiêu 2: Bệnh nhi nghi ngờ mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh đến

khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi trung ương, được chỉ định sàng lọc rốiloạn chuyển hoá bẩm sinh

 Tiêu chuẩn lựa chọn: Tất cả các bệnh nhicó các triệu chứng lâm sàng

(bỏ bú, ngừng thở, mùi bất thường, hôn mê, co giật…) và cận lâm sàng(tăng NH3, keton niệu, toan chuyển hoá tăng khoảng chống anion, hạglucose máu…) nghi ngờ mắc RLCHBS

 Tiêu chuẩn loại trừ: Các mẫu không đạt tiêu chuẩn Không đủ thông

tin, hồ sơ bệnh nhân ở thời điểm kết thúc nghiên cứu

2.2 Trang thiết bị, hoá chất nghiên cứu:

- Mẫu chứng chứa các chất phân tích với 3 mức nồng độ khác nhau (QC

3 mức 1, 2, 3)

- Hoá chất thuốc thử (chất chuẩn, thuốc thử) của hãng LabsystemsDiagnostic để thực hiện các xét nghiệm trên mẫu vật liệu kiểm tra

- Hệ thống máy LCMS – 8040 Shimadzu

2.3 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng xét nghiệm được áp dụng để xác

Tiêu chuẩn: CV<35%, Bias<20%

Chuẩn bị mẫu QC 3 mức nồng độ Lựa chọn cá nhân TC

Đánh giá độ tập trung ngắn hạn Đánh giá độ tập trung dài hạn, độ chính xác Thu thập, phân tích mẫu

nhận quy trình kỹ thuật định lượng một số acid amin và acylcarnitin trong giọtmáu thấm khô bằng bằng MSMS, xây dựng giá trị tham chiếu cho trẻ sơ sinh

- Nghiên cứu mô tả một loạt các ca bệnh phát hiện được qua kết quảsàng lọc

2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Khoa Sinh hoá, Bệnh viện Nhi Trung Ương

- Thời gian: tháng 10/2018 – 04/2019

2.5 Nội dung nghiên cứu

2.5.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.5.2 Quy trình nghiên cứu

- Thiết bị phải được hiệu chuẩn và chạy nội kiểm hàng ngày Khi kết quảnội kiểm nằm trong khoảng chấp nhận mới tiến hành chạy mẫu phân tích

 Tiến hành xác nhận phương pháp: đánh giá độ tập trung và độ chính xác

 Tiến hành xây dựng khoảng tham chiếu

 Tiến hành thu thập mẫu máu theo quy trình chuẩn Lựa chọn toàn bộ cácmẫu bệnh phẩm đủ tiêu chuẩn chấp nhận vào nghiên cứu

 Tiến hành phân tích các mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật đã được xác nhậnphương pháp và xây dựng KTC

 Các kết quả sàng lọc dương tính sẽ được thông báo cho bác sĩ chỉ định đểthực hiện các xét nghiệm chuyên sâu khẳng định chẩn đoán Thu thập cácthông tin về lâm sàng, cận lâm sàng khác và tiền sử gia đình, bệnh tật,huyết thống

Quy trình lấy mẫu và phân tích mẫu bằng kỹ thuật MSMS

a Phương pháp lấy mẫu

Mẫu máu thấm khô được thu thập từ gót chân của trẻ sơ sinh không cóbất thường về chuyển hóa Thu thập lượng máu vừa đủ các vòng tròn trêngiấy thấm, để máu khô tự nhiên nơi thoáng sạch ở nhiệt độ phòng ít nhất 4giờ, tránh ánh sáng mặt trời, và hơi nóng chiếu trực tiếp lên mẫu Mẫu máuđược chuyển về phòng xét nghiệm trong vòng 24h

 Tiêu chuẩn chấp nhận mẫu:

- Giọt máu thấm đều, phủ kín vòng tròn trên giấy

- Không có nhiều lớp máu, không áp giọt máu

nhiều lần trên cùng vòng tròn

- Tránh chạm hoặc gây nhiễm bẩn cho mẫu máu

trên giấy mẫu bệnh phẩm

 Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu:

Máu chưa khô

Lượng mẫu không đủ cho XN

Các mẫu máu ở các vòng tròn lan sang nhau

Máu bị pha loãng, mất màu, nhiễm bẩn

Mẫu máu có vòng huyết thanh

Mẫu bị đông cục hoặc tạo thành lớp khác nhau

Không có máu trên giấy thấm

b Phân tích mẫu

Tiến hành phân tích các mẫu máu thấm khô: định lượng acid amin,acylcarnitin bằng phương pháp MSMS

 Chuẩn bị các dung dịch nội chuẩn gốc

- Để lọ chất nội chuẩn và dung dịch chiết về nhiệt độ phòng (18 đến 25°C)

- Thêm vào lọ chất nội chuẩn acid amin (AA) 1 mL dung dịch chiết và

lắc kỹ đến khi tan hết trong 30 phút bằng máy lắc

- Thêm vào lọ chất nội chuẩn acylcarnitins (AC) 1 mL dung dịch chiết và

lắc kỹ đến khi tan hết trong 30 phút bằng máy lắc

 Chuẩn bị dung dịch làm việc hàng ngày: