Tinh nong do d NA bang ky thuat quang pho hap thu

ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA  Định lượng của các axit nucleic là thường được thực hiện để xác định nồng độ trung bình của DNA hoặc RNA có mặt trong hỗn hợp...  Ứng dụng của phương pháp

Đề tài Sinh học phân tử

 Nguyễn Thị Xuân Thảo

 Nguyễn Thị Thúy Hằng

 Nguyễn Thị Mỹ Thuận

 Lê Thị Diệu Anh

 Phan Hoàng Yến

 Mai Văn Điểu

 Trần Văn Thảo

 Võ Hiệp

ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

DNA

 Định lượng của các axit nucleic là

thường được thực hiện để xác định nồng

độ trung bình của DNA hoặc RNA có

mặt trong hỗn hợp.

 Ứng dụng của phương pháp định tính, định lượng DNA được dùng nhiều nhất trong lĩnh vực y học như để chẩn đoán các bệnh học về di truyền

PHƯƠNG PHÁP

ĐO QUANG PHỔ

Mục đích

Nguyên tắc hoạt động

Các yếu tố ảnh hưởng

Mục đích

Xác định hàm lượng và kiểm tra

độ tinh khiết của phân tử DNA, ARN

có trong dung dịch

 Phương pháp đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại

ở bước sóng 260nm của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này

tỷ lệ với nồng độ DNA

Nguyên tắc

 Dựa vào tính chất này mà người

ta có thể xác định được hàm

lượng các nucleic acid bằng

phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density260nm). 

Một đơn vị OD ở bước sóng 260nm ký hiệu là OD260nm.

OD260nm = 50g/ml cho một dung dịch DNA mạch kép

OD260nm = 40g/ml cho một dung dịch DNA mạch đơn hoặc RNA

Độ hấp thụ ánh sáng của

các base

Công thức xác định hàm lượng DNA trong dung dịch

DNA mạch đôi

Hàm lượng ADN (µg/ml)= 50 x OD260nm x n

Trong đó :

OD 260nm : độ hấp thụ của dung dịch DNA

ở 260 nm

50: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi

n: hệ số pha loãng

DNA mạch đơn hay ARN

Hàm lượng DNA (µg/ml)= 40 x OD260nm x n

Trong đó :

40: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn.

Các yếu tố ảnh hưởng đến độ

hấp thụ quang phổ

PH

Nhiệt độ

Nồng

độ ion

Tạp chất protein

Để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DNA, người ta còn đo dung dịch

ở bước sóng 280nm là mức hấp thụ cực đại của protein, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các nucleic acid do

đó làm sai lệch giá trị thật của nồng

độ acid nucleic

- Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 thì

có thể xem dịch chiết DNA là tinh sạch.

- Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm > 2 thì dung dịch chiết RNA là tinh sạch, dung dịch DNA bị biến tính hoặc phân hủy.

- Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm < 1,8 thì dung dịch DNA,ARN có lẫn tạp chất.

Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, độ

chính xác tương đối cao

lượng DNA trong mẫu tinh khiết