GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM TRONG PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Chất màu đặc biệt trên đĩa khiến các khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường.. • Trong kỹ thuật này, môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định trên một giá th

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMPHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFFILM TRONG

PHAÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Lệ Nhóm thực hiện: Nhóm 14

1.G IỚ

I T HIỆ

U V

Ề PE TR IF IL M

•

2.Ư

U Đ IỂ

M K

HI D ÙN

G PE TR IF ILM

•

3.M ỘT S

Ố HÌ

NH ẢN

H CỤ T HỂ T RO NG PHÂ

N T ÍCH V

I S IN

H V ẬT.

•

4 NHƯ ỢC Đ IỂ

M K

HI DÙ NG Đ ĨA PE TR IF IL M.

•

5.B ẢO Q UẢ

N Đ ĨA PE TR IF IL M.

•

6.C ÁC

H S

Ử D ỤN

G CÁ

C L OẠ

I Đ ĨA PE TR IF ILM

•

7.E

nte ro ba cte ria ce ae

Co unt P la te

•

8.E

.c oli /Co lif orm

s Co

un

t P la te

•

9.Y ea

st an

d M old Co

unt P la te

Nội dung trình bày

Đĩa petrifilm là đĩa chứa môi trường làm sẵn thay thế cho môi trường agar truyền thống Mỗi đĩa gồm chất gel hòa tan trong nước, dinh dưỡng và chất chỉ thị được làm khô và cố định trên lớp film mỏng.

1.GIỚI THIỆU VỀ PETRIFILM

• Khi tiến hành thí nghiệm, 1ml mẫu được cấy vào petrifilm và ủ Chất màu đặc biệt trên đĩa khiến các khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường Và các đường kẻ ô vuông sẽ giúp cho việc đếm số lượng khuẩn lạc dễ dàng hơn.

• Trong kỹ thuật này, môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định trên một giá thể mỏng và được phủ bằng một màng bảo vệ.

• Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ được tách một phần để có thể bổ sung 1ml dịch mẫu lên bề mặt môi trường, sau đó phủ lại bằng màng bảo vệ

Đĩa petrifilm có thể kiểm tra hầu hết các loại vi sinh vật phổ biến và không cần qua các bước

khẳng định Sinh Hóa như phương pháp truyền thống.Bao gồm:

• Aerobic Count - Tổng vi khuẩn hiếu khí.

• Coliform Count.

• E.coli/Coliform Count.

• Enterobacteriaceae Count - Họ vi khuẩn đường ruột.

• Environmental Listeria - Listeria trong môi trường.

• High – Sensitivity Coliform Count - Coliform nhạy.

• Rapid Coliform Count - Coliform nhanh.

• Staph Express Count - staph, aureus và các loài khác.

• Yeast and Mold Count - Nấm men và nấm mốc.

• Dễ thao tác.

• Kết quả nhất quán.

• Thời gian sử dụng lâu.

• Không cần hấp khử trùng môi trường.

• Nhanh, loại bỏ các bước chuẩn bị môi trường

• Thiết kế nhỏ gọn, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản.

2.ƯU ĐIỂM KHI DÙNG PETRIFILM.

• Khuẩn lạc Coliform có màu đỏ và

sinh bọt khí trên tấm film.Kết

quả sau 24 giờ.

3.MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỤ THỂ TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT.

Coliform Count Plate

• Khuẩn lạc nấm men có màu

xanh dương khuẩn lạc nấm mốc

tạo nhiều màu sắc, to và rõ rệt

Kết quả trong 3 – 5 ngày.

Yeast and Mold Count Plate

• Khuẩn lạc listera có màu

tím đỏ Kết quả trong 31

giờ.

Environmental Listeria Plate

• Giá thành khá cao.

• Phải lưu trữ lạnh

• Phải sử dụng hết 1 gói trong khoảng thời gian nhất định khi đem ra khỏi tủ lạnh và không được để lại tủ lạnh

• Miếng film có khả năng làm nhòe khuẩn lạc khi mọc to

• Có khả năng lây nhiễm khéo giữa các đĩa petrifilm với nhau trong quá trình nuôi cấy

4 NHƯỢC ĐIỂM KHI DÙNG ĐĨA PETRIFILM.

• Bảo quản các gói chưa mở ở nhiệt độ dưới 80C có thể để nơi ngăn lạnh Sử dụng trước hạn sử dụng ghi trên gói Ở những khu vực có độ ẩm cao, nơi sự đông đặc có thể là một vấn đề, tốt nhất nên để ở nhiệt độ phòng trước khi mở sử dụng.

1.Bảo quản các túi chưa sử dụng ở ≤ 8°C Sử dụng trước ngày hết hạn ghi trên túi Để đạt hiệu quả tốt

nhất, cần đưa các túi về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

2 Mở túi theo hướng dẫn

3 Bảo quản các túi còn lại ở chỗ khô ráo, nhiệt độ ≤ 25°C trong vòng một tháng.

6.Cách sử dụng các loại đĩa petrifilm

• 4.Pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/10 trong túi đồng nhất mẫu vô trùng

• 5 Sử dụng nước đệm pepton hoặc pepton muối để pha loãng mẫu Không sử dụng nước đệm có citrat, bisulphite hoặc thiosulphate vì ức chế sự phát triển của vi khuẩn

• 6 Đồng nhất mẫu, chỉnh pH trong khoảng 6-8 Sử dụng NaOH 1N cho sản phẩm acid, HCl 1N cho sản phẩm kiềm

• 7 Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang Nâng màng đậy đĩa lên, dùng pipet man nhỏ nhẹ nhàng 1ml mẫu vào giữa đĩa

• 8 Cẩn thận đặt màng film xuống sao cho không tạo thành bọt khí

• 9 Nhẹ nhàng đặt spreader lên và dàn đều mẫu trước khi gel đông đặc Không xoắn hoặc trượt

spreader Nhấc spreader ra và để yên 1 phút Chú ý làm tuần tự từng đĩa một

• 10 Ủ ấm các đĩa đã nuôi cấy ở 24h/37°C ±1°C Mỗi chồng để tối đa 20 đĩa

• 11 Nếu không có khuẩn lạc nào xuất hiện sau 24 ± 2h, kết quả trả lời (-)

• 12 Nếu có, đếm các khuẩn lạc điển hình theo đặc trưng của từng loại vi khuẩn

• Bảo quản và thải bỏ:

• — Bảo quản các đĩa Petrifilm chưa mở ở ≤ 8°C

• — Để tránh làm ẩm các túi đã mở, không để lại vào tủ lạnh

• — Giữ các túi đã mở ở nơi khô ráo, mát, chỉ trong vòng một tháng.

• — Không sử dụng các đĩa đã ngả màu vàng hoặc nâu.

• — Không sử dụng các đĩa đã lây nhiễm vi khuẩn Việc thải bỏ phải tuân theo hướng dẫn hiện hành của nhà sản xuất.

7.Enterobacteriaceae Count Plate

• Giới thiệu chung

• Chuẩn bị mẫu thử

• Enterobacteriaceae – Đặc điểm

• Trực khuẩn Gram âm

• Lên men glucose

• Oxidase âm

• Khuẩn lạc màu đỏ với một vùng xung quanh màu vàng/ hoặc khuẩn lạc đỏ có bóng hơi,

có hoặc không có vùng bao quanh màu vàng.

• Các loại nước pha loãng:

• — Đệm Butterfield’s phosphate

• - Đệm IDF phosphate ( KH2PO4 :0,0425g/l), pH 7,2

• - Nước pepton 0,1%

• - Dung dịch pepton muối (ISO method 6887)

• - Nước đệm pepton (ISO method 6579)

• - Nước muối sinh lý

• Đổ đĩa:

• — Đặt đĩa Petrifilm EB trên mặt phẳng ngang

• — Nâng màng đậy petrifilm và nhỏ 1ml mẫu thử hoặc dung dịch mẫu thử vào giữa đĩa

• — Cẩn thận cuốn và đặt tấm film xuống sao cho không tạo thành bọt khí

• — Dàn mẫu trong vùng đường kính 20cm2 bằng spreader

• — Đặt nhẹ spreader vào giữa đĩa

• — Ấn nhẹ để dàn đều mẫu

• — Nhấc spreader ra và để ít nhất 1 phút để gel đông đặc

• Chú ý:

• Phải dàn nhanh mẫu trước khi gel đông đặc

• Không đưa spreader từ bên này sang bên kia đĩa

• Ủ ấm:

• — Ủ ấm các đĩa ở 24h±2h/ 30°C ± 1; 35°C±1 hoặc 37°C± 1, mỗi chồng không quá 20 đĩa

• — Phải làm ẩm buồng ủ mẫu sao cho lượng hơi ẩm thoát ra từ các đĩa không vượt quá 15% trong quá trình ủ ấm

• Giải thích kết quả:

• — Đĩa Petrifilm EB có thể đếm trên máy đếm khuẩn lạc hoặc nguồn sáng có kính phóng đại

• — Khuẩn lạc Enterobacteriaceae có màu đỏ với vùng màu vàng bao quanh/ hoặc khuẩn lạc màu đỏ có

bóng hơi, có hoặc không có vùng màu vàng bao quanh

• — Đường kính vùng phát triển khoảng 20 cm2

• — Nếu ước tính trên đĩa có nhiều hơn 100 khuẩn lạc thì đếm một vài ô đại diện rồi tính kết quả trung bình cho một ô

• — Nhân số trung bình của một ô với 20 để tính ra số khuẩn lạc trên cả đĩa

• Chú ý:

khuẩn lạc này không chịu tác động ức chế của môi trường nuôi cấy chọn lọc

không đếm những khuẩn lạc nằm ngoài bóng hơi hoặc không có vùng màu vàng

hơi có thể không rõ ràng; acid sinh ra sẽ làm thay đổi toàn bộ đĩa thành màu vàng, trường hợp này cần tăng độ pha loãng mẫu và thử lại.

bằng cách nâng tấm film đậy lên và lấy khuẩn lạc trên gel.

• Định nghĩa hiện nay về Coliforms

• — Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, sinh acid và hơi khi lên men lactose (24- 48h/36±2°C)

• —Thermotolerant (Fecal) coliform : thuộc họ Enterobacteriaceae, có khả năng phát triển và lên men

lactose ở 44,5±2°C bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter (E.coli sinh Indol từ

tryptophan)

• Coliforms được coi là nhóm vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh

8.E.coli/Coliforms Count Plate

Video clips

• Chuẩn bị mẫu:

• - Sử dụng dung dịch pha loãng vô trùng thích hợp

• - Đối với sản phẩm acid, chỉnh pH của mẫu thử tới 6.6 – 7.2 bằng NaOH 1N

• - Đối với sản phẩm kiềm, chỉnh pH bằng HCl 1N

• - Trộn đều hoặc đồng nhất mẫu

• Đổ đĩa:

Hơi ẩm từ các đĩa không vượt quá 15% trong 48 h nuôi cấy.

• Thời gian ủ ấm và nhiệt độ nuôi cấy:

• Giải thích kết quả:

mm)

Coliform = 7  

Vong số 1 = Khuẩn lạc không sinh hơi Vong 2 = Bóng hơi do thao tác

Vong 3 = Khuẩn lạc sinh hơi

Số khuẩn lạc Coliformcount = 69 Vong 1, 2 và 3 có thể cho thấy sự khác nhau của các kiểu bóng hơi.

• Chuẩn bị mẫu

• — Chuẩn bị dung dịch pha loãng

• — Cân mẫu vào túi

• — Đổ một lượng thích hơp dung dịch Butterfield’s phosphate vào túi

• — Đồng nhất mẫu

• Nuôi cấy

• — Đặt đĩa petrifilm trên bề mặt phẳng, nâng tấm phim lên

• — Nhẹ nhàng nhỏ 1ml mẫu đã pha loãng vào giữa đĩa

• — Hạ tấm phim xuống sao cho không tạo thành bóng hơi

• — Không sử dụng nước pha loãng có citrat, thiosulfate, bisulfate vì ức chế sự phát triển

9.Yeast and Mold Count Plate

Khi số KL lớn hơn 150, ước

KL nấm men có màu từ nâu

nhạt tới hồng hoặc xanh tím

Ước tính số KL nấm men >104

Đĩa này quá nhiều Kl không thể đếm đươc Các Kl nhỏ mầu xanh ơ rìa đĩa không đươc tính

Trường hợp 5

Ước tính số KL nấm mốc bằng 64

Đếm số KL ở ¼ đĩa rồi nhân với 4 để ra tổng số

Video clips