Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp chất ức chế ezyme α glucosidase và α amylase

--- ---PHÙNG THỊ HUỆ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT ỨC CHẾ EZYME α-GLUCOSIDASE VÀ α-AMYLASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018...

-

 -PHÙNG THỊ HUỆ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT ỨC CHẾ

EZYME α-GLUCOSIDASE VÀ α-AMYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo của Viện Sinh thái và Tàinguyên sinh vật, Trường Đại Học Thái Nguyên đã tận tình truyền đạt cho tôikiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiêncứu luận văn và cũng là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ths Hoàng Kim Chi, Ths Nguyễn

Đình Tuấn và tập thể cán bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện

Hoá học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoànthành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi,những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc đểtôi yên tâm học tập và hoàn thành khóa học này

Cuối cùng tôi xin kính chúc quý thầy, cô, anh, chị và gia đình dồi dàosức khỏe, thành công trong sự nghiệp!

Tôi xin chân thành cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là hoàn toàn trung thực, chưa được sử dụng cho bảo vệ một học vị nào.Mọi sự giúp đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn Các thôngtin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Phùng Thị Huệ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Hình 3 3 Các thử nghiệm ức chế α-amylase và α-glucosidase 39Hình 3 4 Các thử nghiệm đo nồng độ ức chế IC50 với enzyme α-amylase(A) và α-glucosidase (B) 41Hình 3 5 Nồng độ ức chế IC50 của dịch chiết các chủng (HVA)DL-NA6 lên enzyme α-amylase và DTC-Rt-N1.2 lên enzyme α-glucosidase so sánh với Acarbose 42Hình 3 6 Sơ đồ phân loại của chủng DTC-Rt-N1.2 dựa trên đoạn trình tựITS……….47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Dịch chiết/hoạt chất chiết xuất từ thực vật có hoạt tính ức chế glucosidase [6] 13Bảng 3.1 Danh sách các chủng vi sinh vật phân lập được và một số đặcđiểm hình thái 31Bảng 3 2 Phần trăm ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase 40

α-DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của chủng (HVA)DL-NA6 44Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của chủng DTC-Rt-N1.2 44

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh tiểu đường 3

Th c tr ng ệnh tiểu đường tr n thế giới v t i Việt N m 4

1.1.1 Trên thế giới 4

1.1.2 Tại Việt Nam 5

1.2 Một số phương pháp điều trị ệnh tiểu đường 6

1.2.1 Điều trị bằng chế độ ăn uống 7

1.2.2 Điều trị bằng thảo dược 7

1.2.3 Sử dụng thuốc có hoạt tính chữa bệnh tiểu đường 7

1.3 Chất ức chế enzyme α- myl se v α-glucosidase 8

1.3.1 Khái niệm chất ức chế enzyme 8

1.3.2 Các loại chất ức chế: có 2 loại 8

1.3.3 Cấu tạo và phản ứng xúc tác của enzyme amylase và α-glucosidase 10

1.3.3.1.α-Amylase 10

1.3.3.2.Enzyme α-glucosidase 12

1.3.4 Vai trò của α-glucosidase và α-amylase đối với người bệnh tiểu đường 12

1.3.5 Chất ức chế hoạt động của α-glucosidase và α-amylase 13

1.4 Tình hình nghi n cứu tìm kiếm hợp chất có ho t tính chống tiểu đường tr n thế giới v t i Việt N m 15

1.4.1 Trên thế giới 16

1.4.2 Tại Việt Nam 18

1.5 Hợp chất thi n nhi n có ho t tính chống tiểu đường từ vi sinh vật 21

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Vật liệu v đối tượng nghi n cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi sinh vật 22

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 22

2.2 Phương pháp nghi n cứu 23

2.2.1 Phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu thực vật 23

2.2.2 Lựa chọn và lưu giữ giống 23

2.2.3 Phương pháp tách chiết dịch nuôi cấy 23

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 25

2.2.4.1 Thử nghiệm ức chế enzyme α-amylase 25

2.2.4.2 Sàng lọc hoạt tính ức chế α-Glucosidase 26

2.2.5 Phương pháp xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng và tổng hợp chất ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase 28 2.2.6 Định danh các chủng nấm bằng sinh học phân tử 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu th c vật 30

3.2 Ho t tính ức chế enzyme α- myl se v α-glucosidase 38

3.3 Ảnh hưởng củ nguồn c c on đến sinh trưởng v tổng hợp chất ức chế enzyme α- myl se v α-glucosidase 43

3.4 Định d nh các chủng nấm ằng sinh học phân tử 45

3.4.1 Chủng DTC-Rt-N1.2 45

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

4 Kết luận 50

4 2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

MỞ ĐẦU

Từ những năm 90 của thế kỷ 20, các chuyên gia y tế đã dự báo “Thế kỷ

21 là thế kỷ của các bệnh rối loạn chuyển hoá” Tiểu đường (TĐ) là bệnh do sựrối loạn chuyển hoá carbohydrate khi hormone insulin của tuyến tu bị thiếuhay giảm tác động trong cơ thể, và biểu hiện ở lượng glucose trong máu cao.Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới WHO và Liên đoàn TĐ quốc tế IDF,

số bệnh nhân TĐ sẽ tăng từ 150 triệu người vào năm 2009 lên 399 triệu ngườivào năm

2025, tăng 214% so với năm 2006 Đáng chú ý, trong khi tốc độ gia tăng tỷ lệmắc bệnh ở các nước phát triển chỉ là 42% thì ở các nước đang phát triển trong

đó có Việt Nam là 170% Bệnh TĐ có thể gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm

và là nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu cơ tim, đột qu , suy thận giai đoạncuối và mù lòa, làm tăng tỷ lệ tử vong lên gấp 2-4 lần Trên thế giới cứ 10 giây

đi qua có thêm 1 người bị chết do TĐ và các biến chứng [4], [39]

Thực trạng trên đã khiến cho nhu cầu sử dụng thuốc chữa TĐ gia tăng, vìvậy việc tìm kiếm các nguồn hợp chất có hoạt tính để điều trị bệnh tiểu đườngđang trở nên vô cùng cấp bách Các giải pháp được đặt ra cho việc tìm kiếmnguồn chất điều trị bệnh tiểu đường bao gồm tổng hợp hợp chất hóa học hoặcbán tổng hợp, và khai thác các hợp chất thiên nhiên từ nguồn tài nguyên sinhvật Mặc dù cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu sàng lọc các chất nguồngốc thực vật có hoạt tính ức chế hoạt động của các enzyme có vai trò lớntrong các bệnh nhân tiểu đường là α-amylase và α-glucosidase, nhưng các hợpchất sử dụng làm thuốc phổ biến trong lâm sàng để điều trị bệnh tiểu đườnglại có nguồn gốc từ vi sinh vật Tuy nhiên các thuốc điều trị hiện hành đềucho thấy hiệu quả ức chế không quá cao, thực tế đó đặt ra vấn đề việc sàng lọccác chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase vàα-amylase ở nồng độ ức chế thấp hơn, là một hướng đi tiềm năng và cần tậptrung nghiên cứu

Xuất phát từ những yêu cầu và thực tế trên đây, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài: “Phân lập v tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase và α- myl se”.

Mục đích nghiên cứu của đề tài là: sàng lọc các chủng vi sinh vật, nhằmtìm kiếm và khai thác các chất có khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase tiềm năng

CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường (TĐ) còn gọi là bệnh đái tháo đường, là một bệnh rốiloạn trao đổi chất mãn tính được đặc trưng bởi nồng độ glucose cao trongmáu (tăng đường huyết), giảm tiết insulin hoặc giảm tác dụng của insulin

từ tuyến tụy trong cơ thể của người bệnh [28] Insulin là một hormoneđược tổng hợp trong các tế bào beta của tuyến tụy nhằm đáp ứng với cáckích thích khác nhau như từ glucose, sulphonylurea và arginine tuy nhiênglucose là yếu tố chính Tăng nồng độ đường trong máu thời gian dài cóthể gây ra các biến chứng như bệnh tim, đột qu , mù lòa và bệnh thận, vìthế TĐ đang là một trong ba bệnh hàng đầu gây tử vong cao trên thế giớichỉ sau ung thư và các bệnh tim mạch [21], [24] Bệnh TĐ có thể đượcphân loại theo nhiều cách khác nhau, nhưng theo phân loại của Hiệp hộiTiểu đường Hoa Kỳ, bệnh TĐ gồm: (1) Bệnh TĐ loại I (Phụ thuộc insulin -IDDM) là do sự phá hủy các tế bào beta qua trung gian miễn dịch, dẫn đếnthiếu insulin; (2) Bệnh TĐ tự phát là bệnh TĐ loại I nhưng không cónguyên nhân rõ ràng và có liên quan di truyền; (3) Bệnh TĐ loại II (Khôngphụ thuộc insulin - NIDDM) là do khiếm khuyết trong tiết insulin và khánginsulin; (4) Đái tháo đường thai kỳ là bất kỳ dạng không dung nạp nào vớiglucose khi bắt đầu mang thai Tuy nhiên, bệnh tiểu đường chủ yếu đượcphân loại thành hai loại chính: TĐ loại I (IDDM) và TĐ loại II (NIDDM),trong đó bệnh TĐ loại II chiếm đến 90% các ca bệnh TĐ Nguyên nhân gâybệnh TĐ là do một số cơ chế để duy trì sự điều chỉnh giữa độ nhạy của các

mô với insulin bị phá vỡ dẫn đến sự tiết insulin bởi các tế bào beta tuyếntụy bị suy yếu và tác dụng insulin bị suy giảm do hiện tượng kháng insulin[16] Bệnh TĐ loại II này liên quan chặt chẽ đến nhiều khiếm khuyết về ditruyền, và một số yếu tố môi trường đặc biệt là béo phì từ đó gây ra các sailệch trong tế bào beta và kháng insulin ngoại mô [29]

1.1 Th c tr ng ệnh tiểu đường tr n thế giới v t i Việt N m

1.1.1 Tr n thế giới

Theo một thông báo vào năm 1998 của các chuyên gia thuộc Tổ chức

TĐ quốc tế, tỷ lệ người mắc bệnh TĐ trên toàn thế giới là: 110 triệu ngườivào năm 1994, 135 triệu người vào năm 1995, dự kiến năm 2000 là 151triệu người Tuy nhiên con số thống kê thực tế cho thấy số bệnh nhân TĐtrên toàn thế giới trong năm 2000 là 171 triệu người (chiếm 2,8% dân sốthế giới), tức là vượt 13% so với dự đoán của năm 1998 Ước tính hiện có

366 triệu người trên thế giới bị bệnh TĐ, số lượng ca bệnh TĐ trên toàncầu tăng gấp đôi trong ba thập kỷ qua Trong các trường hợp mắc bệnh TĐ,

TĐ type 2 chiếm đa số Tỷ lệ mắc bệnh tăng nhanh ở các nước đang pháttriển là do sự thay đổi về lối sống, thói quen ăn uống, đặc biệt là lối sống ítvận động thể lực TĐ type 2 tiến triển một cách âm thầm và liên tục, nếukhông được theo dõi và quản lý, điều trị tốt sẽ gây nhiều biến chứng nguyhiểm để lại di chứng nặng nề và đe dọa tính mạng người bệnh và là mộttrong những nguyên nhân tử vong chính của bệnh TĐ [12] Theo khuyếncáo của Tổ chức IDF, trên thế giới mỗi năm có khoảng 3,2 triệu người chết

vì bệnh TĐ, như vậy một ngày có 8700 người và mỗi phút có 6 người chết do

TĐ Trong số 17 triệu người chết vì đột qu tim mạch thì có 50-70% là donguyên nhân của bệnh TĐ, nhất là TĐ type 2 thường do phát hiện bệnh muộn

Có 30-90% TĐ type 2 không được chẩn đoán và 50% bệnh nhân đã có mộthoặc nhiều biến chứng vào thời điểm phát hiện bệnh Nhiều bệnh nhân khiphát hiện bệnh lại không được quản lý, theo dõi và điều trị đúng chuyên khoadẫn đến biến chứng sớm và nặng nề ảnh hưởng đến đời sống của người bệnh,đồng thời tốn kém kinh tế của gia đình và ngân sách xã hội [39]

Các khu vực đặc biệt bị ảnh hưởng bởi căn bệnh TĐ này là TrungQuốc và Ấn Độ, nơi tỷ lệ mắc bệnh TĐ loại II đã tăng lên đột ngột mặc dù

tỷ lệ béo phì tương đối thấp Với cùng một chỉ số khối cơ thể (BMI), ngườichâu Á có xu hướng có tỷ lệ mỡ trên cơ thể cao hơn người châu Âu do thườngbéo phì bụng hơn và khối lượng cơ ít hơn, điều này có thể là nguyênnhân gia tăng TĐ loại II ở châu Á Ngoài ra, dinh dưỡng kém giai đoạn mangthai và đầu đời, kết hợp với suy dinh dưỡng cũng góp phần vào sự gia tăngcủa bệnh TĐ loại II, đặc biệt là ở những người thay đổi thói quen ănuống đột ngột và ít hoạt động thể chất Tỷ lệ bệnh TĐ loại II ở nam giớicũng cao hơn một chút so với ở nữ giới [17].

1.1.2 T i Việt N m

Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh TĐ của các khu vực đã được điều chỉnhphân chia theo cấu trúc tuổi của quần thể là: tỷ lệ mắc bệnh TĐ toàn quốc

là 2,7%, tỷ lệ mắc TĐ ở nữ là 3,7%, tỷ lệ tương ứng ở nam là 3,3% Tỷ lệmắc TĐ ở vùng núi cao là 2,1%, vùng trung du là 2,2%, vùng đồng bằngven biển là 2,7%, vùng đô thị và công nghiệp là 4,4% Đặc biệt tỷ lệ mắcbệnh TĐ ở nhóm đối tượng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30 đến 64 chiếm tỷ

lệ 10,5%, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 13,8% Theo phân loại củaHiệp hội Tiểu đường quốc tế và Tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ mắc bệnh TĐ

ở Việt Nam nằm trong khu vực hai (tỷ lệ 2% - 4,99%) giống của các nướckhác trong khu vực như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia và thấp hơn cácnước thuộc khu vực ba (tỷ lệ 5-7,99%) bao gồm Nhật Bản, Hàn Quốc,Malaysia, Singapore, Australia… [6]

Tỷ lệ mắc TĐ ở Việt Nam tăng tỷ lệ thuận theo tuổi (p < 0,0005) Ởlứa tuổi dưới 40 tỷ lệ mắc bệnh TĐ vẫn thấp khoảng dưới 1%, tỷ lệ bệnh

TĐ đường tăng nhanh ở hai mốc tuổi là 45 (4,6%) và 60 tuổi (10,1%) Tỷ

lệ rối loạn dung nạp glucose cũng có diễn biến gần giống như tỷ lệ mắcbệnh TĐ là tăng tỷ lệ thuận theo tuổi (p < 0,0005) nhưng không có mốctăng đột ngột như tỷ lệ bệnh TĐ Tuổi trung bình của các đối tượng mắc

bệnh TĐ là 52,4 tuổi Hầu hết người bị bệnh TĐ đã được chẩn đoán từtrước đều đang được điều trị đều đặn (85,8%), số người bệnh không đượcđiều trị chỉ có 14,2% [4], [9].

1.2 Một số phương pháp điều trị ệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường loại 2 là một căn bệnh khó điều trị và không có mộtcông thức điều trị cụ thể nào phù hợp cho tất cả bệnh nhân mà đều phải dựavào dấu hiệu lâm sàng của từng ca bệnh Hình 1.1 minh họa một số loạithuốc phổ biến trong phương pháp điều trị bệnh tiểu đường đang được lưuhành hiện nay

Hình 1.1 Một số loại thuốc điều trị bệnh tiểu đường và cơ chế tác dụng [17]

Trong đó các phương án điều trị bệnh TĐ tương đối đa dạng và chủyếu tập trung vào các hướng điều trị với đơn thuốc đơn thuần (70,9%),thuốc kết hợp với chế độ ăn (29,1%), chế độ ăn và luyện tập đơn thuần chỉ

có 2,9% Các phương pháp khác nhau tuy nhiên đều hướng đến một mụctiêu chung là hạ chỉ số đường huyết HbA1c xuống mức tiêu chuẩn Trong

đó sử dụng các chất ức chế các enzyme có vai trò trong việc dung nạpglucose (như α-amylase và α-glucosidase) cũng là một giải pháp Một sốphương pháp điều trị có thể kể đến như sau:

1.2.1 Điều trị ằng chế độ ăn uống

Một trong số những liệu pháp hiệu quả cho các bệnh nhân TĐ type 2

là điều chỉnh lượng đường huyết thông qua chế độ dinh dưỡng Người bệnhcần đảm bảo chế độ ăn đầy đủ chất đạm, béo, bột đường, vitamin, muốikhoáng với số lượng hợp lý Tuân thủ nguyên tắc thức ăn đa dạng, nhiềuthành phần, ăn đủ để có trọng lượng vừa phải, hạn chế ăn chất béo, đặc biệt

là mỡ động vật, ăn lượng vừa phải chất xơ, hạn chế ăn mặn, tránh rượu bia

và thức uống có cồn [24]

1.2.2 Điều trị ằng thảo dược

Một số loại thảo dược rất tốt cho người bệnh TĐ, điển hình như mướpđắng, ổi, nha đam, cây cà ri, cây húng quế, lá xoài… Người bệnh có thểkết hợp bổ sung các thảo được này trong chế độ ăn uống sẽ tốt cho quátrình điều trị

1.2.3 Sử dụng thuốc có ho t tính chữ ệnh tiểu đường

Đối với một số nhóm đối tượng bị TĐ cụ thể, việc điều trị bằnginsulin là giải pháp bắt buộc và chưa có giải pháp thay thế Tuy nhiên, sửdụng các nhóm thuốc có thể bắt buộc và chưa được coi là phương án điềutrị nhanh và hiệu quả nhất Song chế độ ăn uống phù hợp sẽ tốt cho quátrình điều chỉnh lượng carbonhydrate trong cơ thể

1.3 Chất ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase

1.3.1 Khái niệm chất ức chế enzyme

Là phân tử nhỏ bám vào enzyme và làm giảm hoạt tính enzyme, chúngphải có một số đặc tính sau:

- Đặc thù với mỗi enzyme và hoạt động ở nồng độ thấp, và thường không phá hủy enzyme

Bởi vì sự giảm hoạt tính của enzyme có thể làm chết tác nhân gâybệnh hay sửa chữa sự mất cân bằng chuyển hóa, nên chất ức chế được sửdụng làm thuốc bảo vệ thực vật (nông nghiệp diệt côn trùng, vi sinh vậtgây bệnh) hoặc làm thuốc chữa bệnh v.v

Chất ức chế có thể bám vào trung tâm hoạt động enzyme hoặc vị tríkhác làm giảm phản ứng

Sự bám của chất cảm ứng vào Enzyme có thể là (i) thuận nghịch hay (ii)không thuận nghịch

+ Bám không thuận nghịch thường là chất ức chế phản ứng (gắn chặt)với enzyme theo kiểu liên kết hóa trị, làm thay đổi các axit amin tại hoạt

động (ví dụ khí độc thần kinh (Ops kết hợp serin của enzyme

acetylcholine esterase).

+ Bám thuận nghịch, chất ức chế bám không có liên kết hóa trị (liênkết hydro, k nước, ions) với enzyme, và dễ bị loại bỏ bằng pha loãnghoặc thẩm tích)

Một số kiểu ức chế khác: bám vào phức hợp enzyme/cơ chất, hoặc ứcchế kiểu tự sát (biến đổi chất ức chế)

1.3.2 Các lo i chất ức chế: có 2 loại

- Loại 1: ức chế cạnh tranh

Chất ức chế và cơ chất không thể bám vào enzyme cùng một thời điểm.Thông thường, chất ức chế rất giống cơ chất về cấu tạo, chúng cạnhtranh nhau với vùng hoạt động của enzyme

- Loại 2: ức chế không cạnh tranh

+ Chất ức chế bám vào phức enzyme/cơ chất (hiếm gặp)

+ Chất ức chế bám vào enzyme tại vị trí khác với vị trí của cơ chất, làmthay đổi cấu trúc tại vị trí hoạt động của enzyme Thường chúng hoạtđộng không phụ thuộc nồng độ cơ chất

Hình 1.2 Hình minh họa chất ức chế tác động lên enzyme.

1.3.3 Cấu t o và phản ứng xúc tác của enzyme α-amylase và α- glucosidase

amylase từ loài vi khuẩn Bacilus macerans có phân tử lượng lên đến

130.000 Dal Đến nay người ta đã biết rõ các chuỗi acid amin của 18 loại

α-amylase nhưng chỉ có 2 loại α-amylase là taka-amylase từ Apergillus

orysee và α-amylase của tụy lợn được nghiên cứu kĩ về hình thể không

gian cấu trúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗimạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch amino acidcủa tất cả các enzyme α-amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau

 Phản ứng xúc tác củ α-amylase

Mặc dù có thể được thu từ các nguồn khác nhau, α-amylase (EC3.2.1.1) đều tham gia xúc tác một phản ứng giống nhau Alpha amylasegiúp phân cắt các liên kết α-1,4-glucosidae ở phía bên trong phân tử cơchất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tựnào Enzyme α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân

cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn:+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bịthủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp ( -dextrin), độnhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịchhóa nhanh) [40]

+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành

bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine

Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide vàmonosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khánhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose [15].

+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạchpolyglucosecolagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,maltotriose và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thuỷphân của amylose chưa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt đượcliên kết α-1,6-glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù

có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên còn

có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% [26]

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng với sự tham gia của các gốc amino acid trong

trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase (Ogawa và cs 2014)

bộ chiều dài ruột non với hoạt tính tăng chậm dần và đạt đỉnh ở hồi tràng.Ngoài ra, α-glucosidase còn được tìm thấy ở biểu mô thận [26].

Enzym alpha glucosidase có 2 tiểu phần: tiểu phần N tận và tiểu phần Ctận Cả 2 tiểu đơn vị này đều có trọng lượng phân tử ~100 kDa và thuộc giađình GH31 phân nhóm 1 do có chuỗi WiDMNE trong trung tâm xúc tác [37]

 Phản ứng xúc tác

Alpha glucosidase (EC.3.2.1.20) có vai trò xúc tác cho phản ứngchuyển oligosacarid thành các phân tử đường nhỏ hơn để được hấp thu vàomáu Cơ chế của nó là cắt đứt liên kết α-D-1,4 glucose đầu không khử

Cụ thể, khi thức ăn là các carbohydrate được đưa vào cơ thể, dưới tácdụng của các enzym trong hệ tiêu hóa là α-amylase tuyến nước bọt vàtuyến tụy, carbohydrat được thủy phân thành các phân tử đường nhỏ hơnnhư dextrin, maltotriose, maltose Hỗn hợp này sau đó được thủy phân bởicác enzym alpha-glucosidase ở màng ruột non (EC.3.2.1.20), enzym alphaglucosidase trong lysosym (EC.3.2.1.3) và sucrase-isomaltase(EC.3.2.1.48, EC.3.2.10) thành glucose và được hấp thu vào máu [27], [40]

1.3.4 Vai trò của α-glucosidase và α-amylase đối với người bệnh tiểu đường

Biểu hiện bệnh của TĐ là lượng glucose trong máu cao hơn bìnhthường Do đó, việc kiểm soát lượng glucose là một mục tiêu quan trọng đểlàm giảm nguy cơ biến chứng sức kho lâu dài của bệnh TĐ Carbohydrate

là nguồn cung ứng lớn glucose trong cơ thể Phân tử carbohydrate bị thuỷphân thành các oligosaccharide bởi enzyme α-amylase (tu tạng), tiếp theo

ở ruột non, enzyme α-glucosidase thuỷ phân oligosaccharide thành glucose

và sau đó thẩm thấu vào máu Do đó, nếu ức chế được 2 enzyme này thìlượng glucose trong máu sẽ giảm, việc điều trị TĐ sẽ dễ dàng hơn

Bằng cách ức chế hoạt động của enzyme alpha glucosidase có thểlàm giảm sự thủy phân carbohydrate và làm chậm quá trình hấp thu glucosevào máu do đó giúp kiểm soát lượng glucose máu sau ăn [34]

1.3.5 Chất ức chế hoạt động của α-glucosidase và α-amylase

Hiện nay TĐ được kiểm soát bằng nhiều phương pháp khác nhau như

sử dụng thuốc duy trì lượng glucose trong máu ổn định (Sulfonylurea), chất

ức chế tiêu hoá và hấp thụ tinh bột (Glucobay), thuốc cảm ứng độ nhạy củainsulin [3] Các thuốc điều trị TĐ thường hiếm và có giá thành cao Vì vậy,làm thế nào để tổng hợp được một số lượng lớn các chất có khả năng ứcchế enzym 2 α-glucosidase (EC 3.2.1.20) và α-amylase (EC 3.2.1.1) đểmang lại những loại thuốc với giá thành thấp hơn và đến được với tay củamọi người dân là rất quan trọng Bảng 1.1 liệt kê một số hợp chất có hoạttính ức chế enzyme α-glucosidase có nguồn gốc từ thực vật đã được nghiêncứu và xác định giá trị ức chế IC50

Bảng 1.1 Dịch chiết/ho t chất chiết xuất từ th c vật có ho t tính

ức chế α- glucosidase [6]

Th c vật Bộ Dịch chiết Ho t chất Giá trị IC 50

phận thu hái

panamense

(Onychiuroidea)–

Balsamo

Dịch chiết chloroformDịch chiết n-hexane

33,83±1,3μg/mL45,14±1,13μg/mL6,28±1,02μg/mL10,63±0,31μg/mL

Ecklonia Vỏ thân Dịch chiết nước

Dịch chiết methanol

0,026 mg/mL0,022 mg/mL

tessmannii cây 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone 900±3,5 μM(Rutaceae) 3β-acetoxy-16β hydroxybetulinic 7,6±0,6 μM

acid

(Asteracerae) 3,5-Dicaffeoylquinic acid 0,90 mM

từ nguồn này vì vậy có ý nghĩa rất quan trọng, đặc biệt là trong bối cảnhbệnh tiểu đường đang phát triển đáng báo động như hiện nay Hiện nay,trước nhu cầu sử dụng thuốc gia tăng, thì việc tìm kiếm các nguồn hợp cóhoạt tính để điều trị bệnh tiểu đường trở nên vô cùng cần thiết.

1.4.1 Trên thế giới

Theo Arnoldi (2004) và Dham cs (2006), đến nay trên thế giới có rấtnhiều loại thực vật được biết đến với khả năng làm thay đổi nồng độ đườnghuyết Tuy nhiên, tác dụng của chúng chưa được nghiên cứu kỹ ở các mức độ

in vitro và in vivo, và các ứng dụng trong điều trị bệnh nhân đôi khi không

theo mong muốn Một số loài thực vật đã được chứng minh là có tác dụng

làm hạ đường huyết, trong số đó phải kể đến quế (Cinnamomum verum hoặc

C zeylanicum, C.cassia), hồ lô bá (Trigonella foenum), mướp đắng

(Momordica charantia), dây thìa canh (Gymnema sylvestre) và tỏi (Allium

sativum) Sau đây là một số ví dụ cụ thể về hợp chất từ thực vật có tác dụng

làm hạ đường huyết trong điều trị tiểu đường [18], [32]

 Cinn m ldehyde từ cây quế

Từ cây quế C verum tách chiết được hợp chất cinnamaldehyde có tác dụng làm hạ đường huyết và cholesterol in vivo Thí nghiệm cho chuột TĐ

type 2 uống dịch chiết từ quế với liều 50 đến 200 mg/kg chuột/ngày trongvòng 6 tuần, kết quả cho thấy đường huyết giảm xuống một cách đáng kể

và nồng độ insulin trong huyết tương tăng lên, cholesterol và triglyceride

giảm xuống Dựa trên các xét nghiệm in vitro, tác dụng của quế lên đường

huyết một phần là nhờ sự tăng cường tiết insulin Các thành phần có hoạttính khác trong cây quế là các polymer dạng polyphenol của catechin vàepicatechin Các polymer tan trong nước này có chứa hoạt chất chống oxihóa và tăng cường hoạt tính của insulin Sự hoạt hóa insulin bởi các thànhphần của quế có thể được thực hiện thông qua sự tự phosphoryl hóa các thụthể của insulin định vị trên bề mặt của tế bào mỡ, do đó hỗ trợ thúc đẩy sự

truyền tín hiệu insulin và vận chuyển glucose trong tế bào.

 4-hydroxyisoleucine từ cây hồ lô á

Một loại thảo mộc khác có tác dụng hạ đường huyết là cây hồ lô bá T.

foenum graecum Các bệnh nhân TĐ type 2 được uống 1g bột hạt hồ lô bá

mỗi ngày sau bữa ăn trong sáu tuần, tiếp theo đó là 2 g mỗi ngày trong 6tuần sẽ giúp giảm đáng kể lượng glucose trong máu lúc đói Một trong cácthành phần chính của hạt hồ lô bá có tác dụng giảm đường huyết là 4-hydroxyisoleucine Điều này là quan trọng do hồ lô bá được sử dụng vớilượng lớn hơn nhiều so với lượng thông thường để điều hòa đường máu [30]

 Các gymnemoside ( đến f) từ cây dây thìa canh

Dây thìa canh G sylvestre là một thảo mộc từ Ấn Độ được sự quan tâm

trên toàn thế giới khi xét về phổ hỗ trợ kháng TĐ Các thành phần hoạt tính hạ

đường huyết trong lá G sylvestre đã được xác định là hỗn hợp gymnemic

triterpen glycoside acid còn được biết đến như các gymnemoside (a đến f)[33] Tác dụng của dây thìa canh thể hiện qua sự hoạt hóa enzym chuyển hóaglucose bởi tế bào không phụ thuộc vào cơ chế insulin Nó làm tăng sựchuyển hóa của glucose thành glycogen trong gan và hoạt hóa sử dụngglucose nhờ sự điều khiển khóa hoạt động phosphoryl hóa Chuột thí nghiệmuống dịch chiết lá dây thìa canh trong vòng 10 ngày trước khi bị tiêm dưới davới beryllium nitrate (một hóa chất gây giảm mức đường máu) và 15 ngày saukhi tiêm không bị suy giảm mức đường máu như các con chuột đối chứng.Hiện tượng này là kết quả của sự tái sinh các tế bào beta trong các đảoLangerhans, số lượng các tế bào này tăng gấp đôi so với nhóm đối chứng Tácgiả đã gợi ý rằng cơ chế mà ở đó liệu pháp dùng dây thìa canh khôi phục bìnhthường sự điều hòa glucose có thể liên quan đến sự tái sinh của các tế bào

beta Hiện nay dây thìa canh G sylvestre đã được nghiên cứu và ứng dụng

rộng rãi tại nhiều nước trên thế giới, ví dụ như các sản phẩm thuốc và thực

phẩm chức năng có tên Diabeticin (tại Ấn Độ), Sugarest (tại Mỹ), Gymnema(tại Nhật Bản), và Gluco care (tại Singapore) [36].

 Th nh phần kim lo i vi lượng

Một số nghiên cứu gần đây đã cho thấy hoạt tính chống TĐ của thựcvật liên quan đến thành phần kim loại vi lượng của chúng Các thành phần

vô cơ của hạt của cây vối rừng Eugenia jambolana, một loài thực vật của

Ấn Độ, đã được nghiên cứu in vivo trên mô hình chuột nhắt trắng Sau khi

đốt cháy hạt thành tro, các thành phần vô cơ đã được xác định là có chứacrom, kali, natri và vanadi Đặc biệt, khi cho chuột thí nghiệm bị TĐ uốngthì các thành phần vô cơ này thể hiện rõ rệt khả năng giúp duy trì nồng độđường huyết ở mức bình thường [11], [30]

1.4.2 Tại Việt Nam

Nguồn thực vật dùng làm dược liệu ở nước ta thật sự dồi dào và đadạng, trong đó có những thực vật vốn rất quen thuộc trong đời sống ngườidân, được sử dụng làm nước uống hàng ngày Một số nghiên cứu ở ViệtNam trong thời gian gần đây đã tập trung đến tác dụng hạ đường huyết củamột số thực vật, thảo dược, của các vị thuốc trị bệnh TĐ, tuy nhiên số công

bố chưa thật sự nhiều và mang tính toàn diện Sau đây là một số nghiên cứutiêu biểu về hợp chất từ thực vật có hoạt tính chống tiểu đường

Nhóm tác giả Lê Quốc Duy và cs (năm 2016) đã xác định được thànhphần alkaloid, flavonoid, tannin và saponin trong cao ethanol từ các mẫu lá

ổi, xoài, mãng cầu ta, mãng cầu xiêm và bình bát Cao ethanol từ các mẫu

lá có khả năng ức chế enzym α-amylase với giá trị IC50 từ 42,92 đến 88,93g/mL Đồng thời, cao ethanol từ các mẫu lá cũng ức chế hoạt tính enzymeα-glucosidase: lá bình bát (IC50= 18,18 g/mL), lá xoài (IC50 = 33,18g/mL), lá mãng cầu xiêm (IC50 = 45,49 g/mL), lá mãng cầu ta (IC50 =55,73 g/mL) và lá ổi (IC50 = 97,47 g/mL) [1]

Năm 2011, Nguyễn Thị Thanh Mai và cs tiến hành nghiên cứu sànglọc hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase từ lá mãng cầu ta có giá trị là55,73 µg/mL và lá ổi là 97,47 µg/mL [5].

Hà Thị Bích Ngọc (2013), đã nghiên cứu 24 đối tượng thực vật và xácđịnh được 8 đối tượng có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất đó là: lá chè

đắng (Ilex kaushue S.Y.Hu), củ chuối hột (Musa balbisiana Colla ), thân và

lá chó đ răng cưa Phyllanthus urinaria L., lá tầm gửi Macrosolen

cochinchinensis (Lour.) Blume); dây thìa canh G sylvestre (Retz.) R Br.

ex Schult.), nụ và lá vối Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr Perry; vỏ thân ổi (Psidium guajava L.) Tác giả đã nghiên cứu và xác định được các

thành phần có hoạt tính ức chế α-glucosidase từ các cao chiết thực vật kểtrên là: 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5dimethylchalcone; 3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid; 3β-hydroxy-olean-12(13)-en-28-oic acid và2α,3β,23-trihydroxy-urs-12en-28-oic acid, với giá trị IC50 lần lượt là4,3±0.2; 3,6±0.5; 6,1±0,3; 5,7±0,5 μg/ml Hợp chất H4 từ lá cây chè đắng là24- methyl (3β-hydroxy-lup-20(29)-en-24-oic acid) ester có khả năng ức chế59,5% hoạt tính của α-glucosidase tại nồng độ 4 μg/ml Từ kết quả đó, nhómtác giả đã bào chế được chế phẩm Thivoda có nguồn gốc từ thực vật gồm thân

và lá chó đ răng cưa, lá vối, nụ vối, lá chè đắng, dây thìa canh Chế phẩmThivoda có khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt TĐ type 2 về 7,5±1,4mmol/l tương đương mức giảm 71% và có ý nghĩa thống kê với p<0,001 Chếphẩm Thivoda có khả năng: ức chế 60,6% hoạt tính α-glucosidase tại nồng độ6,7±0,4 μg/ml Đồng thời chưa xác định được liều gây độc LD50 [7]

Nghiên cứu của Đái Thị Xuân Trang và Nguyễn Thị Lam Phương(năm 2014) cho thấy: khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của

cao chiết ethanol các bộ phận cây nhàu Morinda citrifolia L đều có hoạt

tính ức chế enzyme -glucosidase mạnh hơn acarbose Cao rễ nhàu ức chếenzyme α-glucosidase mạnh nhất với IC50 = 0,36 mg/mL, hỗn hợp cao (rễ,

lá, trái xanh, trái chín) (IC50 = 0,51 mg/mL), tiếp theo là cao trái chín(IC50 = 0,72 mg/mL), kế đến là cao trái xanh (IC50 = 0,97 mg/mL) [10].

Đỗ Trung Đàm và cộng sự (năm 2012) đã tổng kết được khá nhiều câythuốc có tác dụng hạ đường huyết Trong đó phải kể đến họ Đậu - Fabaceae

gồm có các loài Acacia arabica, A benthami, A catechu, A milanoxylon, A.

modesta, Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge và A mongholicus; họ

Nhân sâm – Araliaceae với các loài Acanthopanax sessilifolius (chưa thấy ở Việt Nam), A senticosus (Rupr et Maxim.); cỏ xước Achyranthes aspera L (họ Giền – Amaranthaceae); Agrimonia pilosa Ledeb (họ Hoa hồng – Rosaceae); hành tây Allium cepa L và tỏi Allium sativum L., (họ Hành – Alliaceae); Aloe arborescens Mill var natalensis (họ Lô hội – Asphodelaceae); cây điều Anacardium occidentale L (họ Đào lộn hột – Anacardiaceae); xuyên tâm liên Andrographis paniculata Burm Nees (họ Ô

rô Acanthaceae); tri mẫu Anemarrhena asphodeloides Bunge (họ Loa kèn Liliaceae); ngưu bàng Arctium lappa L., thương truật Atractylis

japonica Kitaga và A lancea (Thunb.) DC., (họ Cúc Asteraceae); Atriplex halimus L hay tên khác là Chenopodium halimus Thunb (họ Rau muối

Chenopodiaceae); sầu đâu Azadirachta indica A Juss (họ Xoan Meliaceae);

a kê Blighia sapida Koen (họ Bồ hòn – Sapindaceae) [2].

Ngoài ra phải kể đến nghiên cứu của các tác giả có tác dụng điều trị

tiểu đường như: quả cây mướp đắng Momordica charantia L (Phạm Văn Thanh, năm 2001), thổ phục linh Smilax glabra Roxb (Nguyễn Ngọc Xuân, năm 2003 ), sinh địa Rehmannia glutinosa Libosch và tri mẫu

Anemarrhena asphodeloides Bunge [3].

Một số chế phẩm được tiêu thụ trên thị trường dùng điều trị TĐ dướidạng thực phẩm chức năng được biết đến như chế phẩm DIABETNA bào chế

từ dây thìa canh, dược liệu quý hiếm mới được tìm thấy tại Việt Nam, dựa

theo đề tài nghiên cứu của Trần Văn Ơn, trường Đại học Dược Hà Nội [8].

1.5 Hợp chất thi n nhi n có ho t tính chống tiểu đường từ vi sinh vật

Các giải pháp được đặt ra cho việc tìm kiếm nguồn chất điều trị bệnh

TĐ bao gồm tổng hợp hợp chất hóa học hoặc bán tổng hợp, và khai tháccác hợp chất thiên nhiên từ nguồn tài nguyên sinh vật Trong đó, khai tháchợp chất thiên nhiên từ vi sinh vật đã và đang được coi là một hướng tìmkiếm khả quan, hiệu quả và bền vững nhất Tuy nhiên, đến nay phạm vikhai thác các hoạt chất từ vi sinh vật còn tương đối hạn chế và chưa xứngvới tiềm năng, đặc biệt là việc khai thác hoạt chất từ nguồn vi sinh vật cộngsinh thực vật

Trước thực trạng đó, việc phân lập và tuyển chọn các vi sinh vật cókhả năng sinh tổng hợp các chất ức chế được 2 enzym trên được ưu tiên lựachọn hàng đầu, bởi vì việc sản xuất các chất từ VSV có những ưu điểmnhư: Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh, các chất thu nhận từ VSV có hoạttính rất cao, VSV là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô côngnghiệp, nguồn nguyên liệu dùng sản xuất r tiền và dễ kiếm, VSV có thểsinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau Vì vậy, việcnghiên cứu ra các chất, các thuốc có khả năng điều trị bệnh TĐ có ý nghĩaquan trọng và cần ưu tiên nghiên cứu

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu v đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu đất vùng rễ và mẫu thực vật (dây thìa canh, húng chanh, nhađam, dưa leo…) thu tại một số tỉnh thuộc miền Bắc và miền Trung ViệtNam (Quảng Ninh, Hưng Yên, Bắc Giang, Nghệ An) đang được lưu giữ tạiPhòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên

2.1.2 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trường PDA(g/L): khoai tây 200g/l, 20 g dextrose; 15 g Agar;

pH6 Sau khi khử trùng bổ sung chloramphenicol (50 µg/mL)

- Môi trường ISP4: tinh bột tan 10g, K2HPO4 1g, MgSO4.7H2O 1g, CaCO3 2g, NaCl 1g, (NH4)2SO4 2g, agar 20g, nước cất đủ 1000ml

pH = 7,2 - 7,4

- Môi trường HVA: Axit Humic 1g; Na2HPO4 0,5g; KCl 1,71g;

MgSO4.7H2O 0,05g; FeSO4.7H2O 0,01g; CaCO3 0,02g; B-vitamins (0,5 mg mỗi chất thiamine-HCl, riboflavin, niacin, pyridoxin-HC1, inositol, Ca-pantothenate, axit p-aminobenzoic, và 0,25 mg biotin); Cycloheximide 50mg

- Môi trường Gause II: cao thịt 4g, peptone 5g, glucose 10g, agar 20g,

nước cất đủ 1000ml pH = 7,2 - 7,4

- Môi trường Gause I: tinh bột tan 20g, MgSO4.7H2O 0,5g, KNO3 1g, NaCl 0,5g, FeSO4.7H2O 0,01g, K2HPO4 0,5g, thạch 20g, nước cất đủ1000ml pH = 7,2 - 7,4

- Môi trường LB: Pepton 10g, NaCl 5g, Cao nấm men 2,5g, thạch 20g,

nước 1000ml

2.1.3 Hóa chất và thiết bị

Các dụng cụ, thiết bị và hóa chất cần thiết cho quá trình thí nghiệmđược sử dụng ở phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất

thiên nhiên, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.

Hóa chất: Axit Humic, K2HPO4, NaCl, CaCO3, KNO3, (NH4)2SO4,Pepton, Cao nấm men, glucose, khoai tây, agar, KCl,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu thực vật

Các chủng vi sinh vật được phân lập theo phương pháp của Harvey,Linda M (1991) [20] Quy trình phân lập như sau:

+ Rửa mẫu dưới vòi nước chảy trong 5 phút

+ Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm mẫu trong cồn 70o trong 1 phút,sau đó ngâm tiếp trong Javen 1,2% trong 15 phút, rửa mẫu 3 lầnvới nước cất vô trùng bằng cách lắc liên tục 15 phút mỗi lần

+ Kiểm tra khả năng khử trùng bề mặt bằng cách dùng 100 l nướcrửa lần 3 cấy lên các môi trường thạch LB

+ Sau đó, dùng dụng cụ vô trùng cắt mẫu thành những đoạn nhỏ dài

từ 5-10 mm; đặt các đoạn đó trên đĩa Petri có môi trường phân lập

LB, môi trường PDA chứa 50 µg/ml kanamycin (hoặcstreptomycin) để phân lập nấm và môi trường ISP4 chứa 50 µg/mlnystatin và 50 µg/ml kanamycin (hoặc streptomycin) để phân lập

xạ khuẩn, sau đó chuyển vào tủ ấm ở nhiệt độ phù hợp

2.2.2 Lựa chọn và lưu giữ giống

Từ các sợi nấm mọc ra từ các mô rễ cây ở các đĩa phân lập, ria cấytrên môi trường LB, ISP4 và PDA để tinh sạch chủng Các chủng sau tinhsạch được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng cùng loại và môi trường

có chứa 15% glyceron trong điều kiện lạnh sâu Chủng nấm bảo quản trướckhi mang ra sử dụng cần được cấy truyền sang ống thạch nghiêng để đượchoạt hóa

2.2.3 Phương pháp tách chiết dịch nuôi cấy

Các chủng phân lập sau khi tinh sạch được nuôi lắc dịch thể trên môitrường thích hợp sẽ được chiết với dung môi lỏng để thu cặn chiết phục vụmục đích thử hoạt tính Phương pháp tách chiết được tiến hành như sau:Dùng dung môi etyl axetat (EtOAc) bổ sung vào dịch lên men (gồm cả sinhkhối) theo tỉ lệ 1:1, sau 24 giờ lọc bỏ sinh khối, cho vào bình chiết và lắcđều Sau 2 giờ, tách riêng và thu phần dịch nổi phía trên bên trong bìnhchiết (gồm dung môi EtOAc và các chất chiết xuất hòa tan) Phần dung môichứa chất chiết được cô quay loại bỏ dung môi để thu cặn chiết Phần cặnchiết EtOAc này được dùng để thử các hoạt tính ức chế enzyme α-amylase

và α-glucosidase Quy trình lên men dịch thể và chiết chất bằng dung môihữu cơ được tóm tắt trong Hình 2.1 dưới đây