Định danh và phân tích cấu trúc của họ gene liên quan đến khả năng ra hoa ở loài sắn (Manihot esculenta Crantz)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== TRẦN THỊ KIỀU TRANG ĐỊNH DANH VÀ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA HỌ GENE LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG RA HOA Ở LOÀI SẮN MANIHOT ESCULENT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

TRẦN THỊ KIỀU TRANG

ĐỊNH DANH VÀ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA

HỌ GENE LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG RA HOA Ở

LOÀI SẮN (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

TRẦN THỊ KIỀU TRANG

ĐỊNH DANH VÀ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA

HỌ GENE LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG RA HOA Ở

LOÀI SẮN (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn: ThS Phạm Phương Thu

TS Chu Đức Hà

Hà Nội, 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận bộ môn Di truyền - Công nghệ sinh học tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và Viện Di truyền Nông nghiệp - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Phạm Phương Thu, Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, người đã động viên chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Chu Đức Hà, Viện Di truyền Nông nghiệp - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô tại Viện Di truyền Nông nghiệp - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian tôi thực hiện khóa luận này

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất, tuy nhiên do hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên khó tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận được hoàn chỉnh hơn

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Kiều Trang

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận “Định danh và phân tích cấu trúc của họ gene

liên quan đến khả năng ra hoa ở loài sắn (Manihot esculenta Crantz)” là công trình

nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Phương Thu và TS Chu Đức Hà Các kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào

Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Kiều Trang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ch vi t

tắt

Thuật ng Ti ng Anh Thuật ng Ti ng Việt

BLAST Basic local alignment search tool Công cụ tìm kiếm trình tự cơ

bản BlastP

Basic local alignment search tool protein

Công cụ tìm kiếm trình tự protein

CDS Coding DNA sequence Trình tự mã hóa DNA

CIAT International center for tropical

agriculture

Trung tâm Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế

DNA Deoxyribonucleic acid Axit đêoxyribônucleic

FAO Food and agriculture organization

of the united nations

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

FD Flowering locus D Locus quy định ra hoa D

FT Flowering locus T Locus quy định ra hoa T GSDS Gene structure display server Công cụ hiển thị cấu trúc gene

HCN Hydrocyanic acid Axit xianhiđric

JGI Joint genome institute Viện hợp tác về genome

MFT Mother of FT and TFL Protein MFT

NCBI Nation center for biotechnology

information

Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia

PVC Polyvinyl chloride Polyvinyl clorua

SAM Shoot apical meristem Mô phân sinh đỉnh chồi

TFL Terminal flower Protein TFL

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

4.1 Ý nghĩa khoa học 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

1.1 Flowering locus T (FT) và sự ra hoa ở thực vật 3

1.1.1 Một số y u tố ảnh hưởng đ n sự ra hoa ở thực vật 3

1.1.2 Các nghiên cứu về gene Flowering locus T (FT) ở thực vật 4

1.2 Đặc điểm hình thái và đặc điểm di truyền của cây sắn 5

1.2.1 Đặc điểm hình thái của cây sắn 5

1.2.2 Đặc điểm di truyền của cây sắn 7

1.3 Vai trò của cây sắn 8

1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên th giới và ở Việt Nam 10

1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên th giới 10

1.4.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn ở Việt Nam 11

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 D liệu nghiên cứu 13

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

2.3 Nội dung nghiên cứu 13

2.4 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4.1 Phương pháp xác định các gene FT ở sắn 13

2.4.2 Phương pháp xác định thông tin của gene mã hóa FT ở sắn 14

2.4.3 Phương pháp phân tích cấu trúc của gene mã hóa FT ở sắn 14

2.4.4 Phương pháp xây dựng cây phân loại của FT ở sắn 15

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

3.1 K t quả xác định họ gene mã hóa FT ở sắn 16

3.2 K t quả xác định vị trí phân bố và chú giải chức năng của gene FT ở sắn 21

3.3 K t quả phân tích thành phần và cấu trúc của họ gene mã hóa FT ở sắn 25 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

1 K t luận 33

2 Đề nghị 33 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN KHÓA LUẬN 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích và sản lượng sắn của 10 nước trên th giới 11

Bảng 3.1 Thông tin cơ bản về họ gene mã hóa FT ở sắn 17

Bảng 3.2 Tóm lược về họ gene FT ở một số loại loài 20

Bảng 3.3 Vị trí phân bố và chức năng của gene mã hóa FT ở sắn 22

Bảng 3.4 Đặc điểm cơ bản của họ gene mã hóa FT ở sắn 27

Bảng 3.5 Đặc điểm cơ bản của họ gene mã hóa FT ở sắn 29

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của cây sắn 6

Hình 1.2 Bộ gene cây sắn 7

Hình 2.1 Cơ sở d liệu Phytozome 14

Hình 3.1 Vị trí phân bố của các gene FT trên NST ở sắn 23

Hình 3.2 Cấu trúc của họ gene mã hóa FT ở loài sắn đƣợc sắp x p theo cây phân loại 30

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Sắn là cây trồng quan trọng ở các nước có khí hậu nhiệt đới và là loại cây trồng có khả năng tạo được nhiều lượng carbohydrate nhất trong số các cây lương thực [10-tr.35] Tổ chức Nông lương thế giới (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) đã xếp cây sắn là cây lương thực quan trọng thứ tư sau lúa gạo, ngô và lúa mì ở các nước đang phát triển Ở Việt Nam, cây sắn đã và đang trở thành loại cây trồng được ưu tiên nghiên cứu phát triển trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Với hàm lượng tinh bột cao, sắn có thể được sử dụng làm lương thực cũng như chế biến thức ăn chăn nuôi Ngoài ra, sắn cũng là một nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp nhiên liệu tái tạo hiện nay Các hướng nghiên cứu chính gần đây tập trung vào nhận dạng, phân loại giống, chọn giống bằng xử lý đột biến và bằng chỉ thị phân tử Tuy nhiên, để nâng cao sản lượng, chất lượng và tăng lợi nhuận thì một trong những trở ngại lớn nhất trong công tác lai giống hiện nay là xử lý ra hoa tập

trung ở sắn [4-tr.35]

Về bản chất, quá trình ra hoa được quy định bởi các yếu tố di truyền, ngoài ra còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như nhiệt độ, thời gian chiếu sáng [20-tr.37] Trong đó, hầu hết các gene quy định khả năng ra hoa được chứng minh

có liên quan đến 6 chu trình là xuân hóa (vemalization), quang chu kỳ (photoperiod), đồng hồ sinh học (circadian clock), nhiệt độ (temperature), hóc môn gibberellin, tuổi (age) và tự điều khiển (autonomous) [22-tr.37]

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện với mục đích hiểu rõ hơn về các gene liên quan đến khả năng ra hoa của sắn từ đó giúp nâng cao sản lượng, chất lượng

sắn Đặc biệt quan tâm tới các gene locus quy định ra hoa T (Flowering locus T,

FT) do các gene này có vai trò quan trọng đối với sự ra hoa của thực vật theo con

đường quang chu kì và xuân hóa Do vậy, việc tìm hiểu rõ về họ gene liên quan đến khả năng ra hoa giúp nhà khoa học có thể điều khiển được quá trình giao phấn theo

ý muốn và nắm được nguyên lý trong giai đoạn sinh trưởng và sinh thực ở cây trồng

Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Định danh và phân tích cấu

trúc của họ gene liên quan đ n khả năng ra hoa của sắn (Manihot esculenta

Crantz)”

2 Mục đích nghiên cứu

Kết quả của nghiên cứu này sẽ cung cấp dữ liệu quan trọng để định danh và phân tích cấu trúc của các gene liên quan đến khả năng ra hoa ở loài sắn

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định các gene liên quan đến khả năng ra hoa ở loài sắn Nội dung 2: Phân tích thông tin của gene mã hóa FT ở loài sắn

Nội dung 3: Phân tích cấu trúc của các gene liên quan đến khả năng ra hoa ở loài sắn

Nội dung 4: Thiết lập cây phân loại của gene FT ở loài sắn

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của nghiên cứu nhằm cung cấp những hiểu biết cơ bản về cấu trúc

và chức năng của họ gene liên quan đến khả năng ra hoa ở loài sắn

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của nghiên cứu này sẽ cung cấp những gene ứng viên mã hóa FT ở sắn có liên quan đến khả năng ra hoa của loài nhằm phục vụ công tác chọn tạo giống nhằm nâng cao năng suất

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1 Flowering locus T (FT) và sự ra hoa ở thực vật

1.1.1 Một số y u tố ảnh hưởng đ n sự ra hoa ở thực vật

Ở thực vật có hoa, sự ra hoa là dấu hiệu thực vật chuyển từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang giai đoạn sinh trưởng sinh sản nhờ sự chuyển hướng đột ngột từ hình thành mầm chồi và lá sang hình thành mầm hoa Từ đó giúp cây trồng sớm nhanh có quả, giúp tăng sản lượng, chất lượng và tăng lợi nhuận khi trồng cây

Do vậy nếu muốn tăng năng suất, sản lượng hay lợi nhuận thì cần phải điều khiển được quá trình ra hoa ở cây trồng Quá trình ra hoa ở thực vật là một cơ chế phức tạp, về bản chất thì được quy định bởi yếu tố di truyền và các yếu tố môi trường như nhiệt độ, thời gian chiếu sáng [20-tr.37]

Ở hầu hết ở các loài thực vật bậc cao thì quá trình ra hoa chịu sự ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường Trong đó, một số yếu tố như là hàm lượng chất dinh dưỡng, nước, ánh sáng, nhiệt độ được gọi chung là các yếu tố môi trường và những yếu tố môi trường này có thể được coi là yếu tố giới hạn sinh trưởng của cây Quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật thì chịu sự ảnh hưởng, tác động qua lại giữa các yếu tố môi trường này Cụ thể, khi nhiệt độ tăng thì sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình quang hợp, hô hấp, thoát hơi nước, hấp thu nước và chất dinh dưỡng của cây trồng, làm cho tốc độ của các quá trình diễn ra nhanh hơn Ngoài ra, chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng là các chỉ tiêu quan trọng của ánh sáng ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển ở thực vật Do ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng nên một số loại cây trồng có thể không ra hoa trên một số vùng, do đó cần phải kiểm soát được thời gian chiếu sáng để cây ra hoa theo ý muốn, từ đó phục vụ nhu cầu của con người

Ngoài chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như ánh sáng, hàm lượng chất dinh dưỡng, nước, nhiệt độ thì sự ra hoa ở thực vật còn được quy định bởi yếu

tố di truyền [20-tr.37] Trong đó, các yếu tố di truyền này là yếu tố quan trọng quyết định đến sự ra hoa ở cây trồng Từ lâu trên thế giới đã có nhiều học thuyết viết về

sự ra hoa của thực vật như thuyết phát triển Klebs (1905), thuyết quang chu kì của Allard và Ganner (1920), thuyết hormone ra hoa florigen của Chailakhyan (1936)

và nhiều học thuyết khác Theo đó, hầu hết các gene quy định khả năng ra hoa được chứng minh có liên quan đến 6 chu trình là xuân hóa (vemalization), quang chu kỳ (photoperiod), đồng hồ sinh học (circadian clock), nhiệt độ (temperature), hóc môn gibberellin, tuổi (age) và tự điều khiển (autonomous) [22-tr.37]

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến ra hoa ở thực vật, trong đó yếu tố di truyền được coi là động lực hàng đầu giúp tăng năng suất và sản lượng hiện nay [14-tr.36] Ngoài ra ở sắn, một trong những yếu tố chính để nâng cao năng suất và sản lượng là nhờ sự tăng cường nghiên cứu, nhập nội, lai tạo và ứng dụng công nghệ mới trong chọn tạo và nhân giống sắn lai [7-tr.35] Tuy vậy, để xử lí ra hoa tập trung sắn thì còn gặp nhiều trở ngại trong công tác lai giống [4-tr.35]

1.1.2 Các nghiên cứu về gene Flowering locus T (FT) ở thực vật

Theo nghiên cứu, cơ chế ra hoa ở thực vật có sự tham gia trực tiếp của 3

nhóm gene chính là FT, Leafy và Suppressor of overexpression of constans 1 tr.37] Trong đó, FT là gene quan trọng được nghiên cứu ở nhiều loài thực vật như

[22-Arabidopsis thaliana [22-tr.37], lúa mì (Triticum aestivum) [40-tr.39], lúa mạch

(Hordeum vulgare) [40-tr.39] và củ cải (Raphanus sativus) [44-tr.39] Gene FT

được biểu hiện trong mô mạch của lá mầm và lá non nhưng không có trong mô phân sinh đỉnh chồi (Shoot apical meristem, SAM) là nơi xảy ra quá trình chuyển đổi hoa [43-tr.39] Qua đó, protein FT thông qua phloem (libe) sẽ được vận chuyển đến SAM [19,29] Trong đó, phloem là nơi mà ở đó các chất hữu cơ là sản phẩm của quá trình quang hợp sẽ được vận chuyển khắp thân cây nhằm tạo nguồn năng lượng để cây phát triển và kết hạt Ở đây, protein FT sẽ thúc đẩy sự ra hoa và kích hoạt các gene nhận dạng mô phân sinh hoa nhờ sự tương tác với yếu tố phiên mã cơ

bản locus quy định ra hoa D (Flowering locus D, FD)

Ở A thaliana, dựa vào sự phân lập các đột biến mất chức năng hoặc phân

tích chuyển gene mà kết quả đã phát hiện được khoảng 180 gene có liên quan đến

sự kiểm soát thời gian ra hoa Các gene có liên quan đến sự ra hoa có liên quan liên quan đến 6 chu trình chính là xuân hóa (vemalization), quang chu kỳ (photoperiod), đồng hồ sinh học (circadian clock), nhiệt độ (temperature), hóc môn gibberellin, tuổi (age) và tự điều khiển (autonomous) Các chu trình này điều chỉnh một lượng

nhỏ gene được mã hóa bởi các protein khác nhau từ đó kiểm soát thời gian ra hoa bằng các tín hiệu được thu thập từ nhiều con đường khác nhau Ngoài ra, việc phản ứng với các kích thích môi trường khác như sự cân bằng các bước sóng ánh sáng, hàm lượng chất dinh dưỡng cũng ảnh hưởng đến thời gian ra hoa [22-tr.37]

Ở củ cải để xác định được các gene liên quan đến ra hoa thì tiến hành tập trung vào 160 gene mã hóa protein, từ đó xác định được khoảng 254 gene liên quan

đến sự ra hoa ở củ cải Do đó xác định được rằng hầu hết các gene ra hoa ở A

thaliana có tương đồng với củ cải giả định (khoảng 139/160) [44-tr.39] Ngoài ra đã

nghiên cứu được một số ít gene điều khiển sự ra hoa ở lúa mì, lúa mạch [40-tr.39]

1.2 Đặc điểm hình thái và đặc điểm di truyền của cây sắn

1.2.1 Đặc điểm hình thái của cây sắn

Sắn thuộc chi Sắn (Manihot), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), bộ Sơ ri (Malpighiales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), ngành Thực vật có hạt (Rosanae)

Theo nghiên cứu của trung tâm nông nghiệp nhiệt đới quốc tế (International center for tropical agriculture, CIAT) vào năm 1993, sắn được trồng cách đây khoảng

5000 năm [46-tr.39] Ngoài ra, theo một số giả thiết thì trung tâm phát sinh của cây sắn ở vùng Đông Bắc của Brazil thuộc lưu vực sông Amazon, nơi có nhiều chủng loại sắn trồng và hoang dại [27-tr.37] Ngoài ra trung tâm phân hóa phụ có thể tại Mexico và vùng ven biển phía bắc của Nam Mỹ Cây sắn được du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỉ XVIII và được trồng ở hầu hết các vùng sinh thái từ Bắc đến Nam [13-tr.36]

Có thể phân biệt được các giống sắn khác nhau dựa vào các đặc điểm hình thái trên một số cơ quan chính như lá đỉnh, lá trưởng thành, thân, rễ [3-tr.35] Trong

đó, có một số đặc điểm về hình thái được cho là ổn định và ít thay đổi dưới tác động của ngoại cảnh, đặc trưng cho từng giống [13-tr.36]

Đặc điểm của cây sắn là có nhựa mủ Rễ sắn có 2 kiểu mọc từ hạt và từ hom Hai loại rễ này đều có thể phát triển thành củ, được tạo thành do sự phình to của các

rễ con và rễ củ tích lũy tinh bột Củ sắn dạng hình trụ hoặc hình thoi, kích thước từ

2 - 15 cm Củ sắn gồm 4 phần: phần vỏ gỗ màu nâu sẫm giúp bảo vệ tránh các tác động làm hư hại củ; phần vỏ thịt nằm trong lớp vỏ gỗ chứa nhiều glucozit khi thủy

phân giải phóng ra axit xianhiđric (Hydrocyanic acid, HCN) gây ngộ độc; phần thịt

củ chứa vitamin, chất khoáng, lipid và nhiều thành phần khác; nằm trong cùng là lõi sắn Nói chung, tùy vào từng loại giống, điều kiện canh tác và độ màu mỡ của đất

mà trọng lượng và kích thước của củ có sự thay đổi khác nhau [12-tr.36]

Thân gỗ, đơn, mọc thẳng, cao trung bình từ 2 - 3 m, đường kính thân từ 2 - 6

cm Thân cây sắn có sự phân cành, sự phân cành liên quan đến khả năng ra hoa của cây sắn Tùy từng giống và từng giai đoạn phát triển của cây mà thân cây có màu sắc khác nhau như khi non có màu xanh, đỏ tía còn khi già thì thân cây có màu vàng, vàng tía hay xám lục Hơn nữa, độ dài của thân cây được phụ thuộc vào giống cây trồng, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng [13-tr.36]

Lá đơn, chia thùy, mọc xen kẽ và xếp theo vòng, có lá kèm Số lượng lá kèm là chỉ tiêu được dùng để phân biệt các giống khác nhau [12-tr.36] Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, có hoa đực và hoa cái riêng đều cùng hình thành trên cùng một chùm hoa Số lượng hoa trên cây thay đổi tùy giống khác nhau Cây thường thụ phấn chéo nhờ gió và côn trùng Quả nang, màu nâu nhạt hay đỏ tía, hình lục giác, đường kính khoảng 1 - 1,5 cm Hạt hình trứng, có vân hoặc có những vết nâu đỏ trên nền màu kem hoặc xám nhạt Hạt sắn hình trứng, có vân hoặc những vết nâu đỏ [12-tr.36]

Hình 2.1 Đặc điểm hình thái của cây sắn

Hình 2.1 Đặc điểm hình thái của cây sắn (Nguồn: [13,12])

1.2.2 Đặc điểm di truyền của cây sắn

Sắn là cây đa bội thể phức tạp, dị hợp, có 36 nhiễm sắc thể (NST) Phổ thích nghi của sắn rộng và có khả năng giữ được các đặc tính tốt thông qua các phương pháp chọn lọc và nhân giống vô tính, do vậy thuận lợi cho công tác cải tiến giống [9-tr.35] Nghiên cứu được thực hiện trên giống sắn mô hình AM560-2 và cơ sở dữ liệu về genome được lấy từ CIAT Dựa vào phương pháp giải trình tự của genome ppWGS (whole genome shotgun) từ đó xác định được trình tự của genome của cây sắn, với kích thước của genome cây sắn ước khoảng 772 megabit (Megabyte, Mb) [16-tr.36] Tuy nhiên theo nghiên cứu mới gần đây của Bredeson và cộng sự thì đã công bố khoảng 582,25 Mb trình tự của genome sắn trên 18 NST [17-tr.36] Dù chưa đầy đủ nhưng kích thước genome này có thể đại diện cho gần như tất cả các vùng di truyền của genome và phần bị thiếu còn lại là các chuỗi trình tự lặp lại chưa được sắp xếp

Hình 2 2 Bộ gene cây sắn (Nguồn: Bredeson et al., 2016) Trong nghiên cứu gần đây về giải trình tự genome của cây sắn, tổng chiều dài của 18 NST đạt khoảng 582,25 Mb bao gồm 2001 scaffolds chưa được định danh trên các NST, trong đó scaffolds là một phần của trình tự genome được tái tạo

Hình 2.2 Bộ gene cây sắn (Nguồn: [17-tr.36])

trong kĩ thuật shotgun trên toàn bộ genome được tính từ đầu đến cuối phân tử DNA Trong scaffolds gồm những contigs và những đoạn hở (gaps) Khoảng 495,48 Mb được sắp xếp trong 40044 contigs, trong đó tỉ lệ G≡C chiếm hàm lượng khoảng 35,9% Bản sao mã protein được chứa ở trong 30003 loci, chiếm 91,8% trình tự có sẵn được xác định nhằm cung cấp dữ liệu để tiến hành lập bản đồ gene ở sắn Kết quả trên cho thấy trong quá trình sắp xếp thì có sự xuất hiện gần như toàn genome

mã hóa protein [17-tr.36]

1.3 Vai trò của cây sắn

Sắn là cây trồng có nhiều công dụng trong đời sống hằng ngày như được sử dụng làm nguồn lương thực cho con người, làm nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi và là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp Tất cả các bộ phận của cây sắn đều

có thể sử dụng vào các mục đích khác nhau Thành phần dinh dưỡng có trong củ sắn tươi có tỉ lệ chất khô 38 - 40%, tinh bột 16 - 32%, giàu vitamin B, vitamin C, calcium và các chất khoáng, nghèo lipid, muối khoáng và đạm Trong củ sắn, hàm lượng các amino acid không được cân đối, thừa arginine nhưng lại thiếu các amino acid chứa lưu huỳnh Lá sắn có hàm lượng đạm khá cao, nhiều chất bột, chất khoáng và vitamin Ngoài ra, trong lá sắn thì có chứa một lượng độc tố HCN gây nguy hại cho cơ thể Chất đạm của lá sắn có đầy đủ các amino acid cần thiết, giàu lysine nhưng thiếu methionine Sắn có tỉ lệ protein và lipid thấp, vì vậy khi sử dụng sắn làm lương thực cần chú ý bổ sung thêm thức ăn giàu đạm và lipid mới cung cấp

đủ năng lượng cho cơ thể [13-tr.36]

Củ, thân hay lá sắn đều được dùng trong chế biến vào các mục đích khác nhau Củ là nguyên liệu chính được dùng để chế biến bột sắn nghiền, sắn lát khô, tinh bột hoặc có thể dùng để ăn tươi Từ đó chế biến thành các sản phẩm công nghiệp như bột ngọt, rượu cồn, mì ăn liền, bánh kẹo, mạch nha, mì sợi, phụ gia thực phẩm cùng nhiều sản phẩm khác Ngoài ra, củ cũng được nghiền thành bột đem trộn theo tỉ lệ thích hợp với bột ngô, cám gạo để dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm Thân dùng để làm giống, làm nấm, làm củi đun, ngoài ra cũng được sử dụng trong công nghiệp cellulose Lá sắn non giàu đạm dùng làm rau xanh, có thể dùng trực tiếp để nuôi tằm, nuôi cá Ở nước ta, sắn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn

nuôi của các hộ gia đình Ngày nay, ngoài việc phối hợp sắn vào khẩu phần thức ăn hỗn hợp trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc thì quy trình ủ chua sắn củ tươi phục vụ cho chăn nuôi lợn trong gia đình cũng được áp dụng rộng rãi Ngày nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ sắn ngày càng trở nên thông dụng trong buôn bán [1-tr.35]

Không những thế, sắn còn được coi là một trong những loại nguyên liệu được dùng để sản xuất cồn sinh học Cồn được dùng để sản xuất một số loại hóa chất khác nhau như cellulose triacetate, vinyl acetate, PVC, styrene, polystyrene

Do đó, cồn sản xuất từ cây sắn sẽ giải quyết vấn nạn thiếu cồn ở nhiều quốc gia trên thế giới Có thể chế biến cồn sinh học với hiệu suất cao, cạnh tranh với các cây khác như nếu chế biến 6 kg sắn củ tươi thành 2,5 kg sắn lát, từ đó thành 2,2 kg bột sắn nghiền thì chế biến được 1 lít cồn 99,5% Do đó, nhu cầu thị trường rất lớn và giá cạnh tranh là cơ hội để phát triển sản xuất sắn [11-tr.36]

Ô nhiễm môi trường từ túi nylon không chỉ là vấn đề riêng của một quốc gia nào mà nó là vấn nạn toàn cầu Vì vậy nhiều sáng kiến sản xuất túi nylon thân thiện với môi trường đã ra đời, trong đó phải nói đến túi nylon được sản xuất từ sắn Túi nylon được sản xuất từ tinh bột sắn, khoai tây được doanh nhân ở Ấn Độ sáng chế

ra đầu tiên Sau đó, túi nylon khoai mì thân thiện với môi trường cũng được sáng chế ra ở Indonesia, chiếc túi có thành phần gồm khoai mì, dầu thực vật và nhựa hữu

cơ Gần đây, các nhà khoa học thuộc trung tâm nghiên cứu vật liệu Polyme, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nghiên cứu thành công một loại túi nylon tự hủy làm bằng bột sắn và nhựa sinh học, có tính thân thiện cao với môi trường Trong đó tỷ lệ bột sắn chiếm 35 - 40%, còn lại là nhựa phân hủy sinh học Loại túi này có độ bền

và dai hơn túi nylon thông thường với giá thành cao hơn từ 1,5 đến 2 lần Tuy nhiên, ưu điểm nổi trội của nó là sau khi phân hủy ra đất, chúng ta có thể trồng cây tại chính những khu vực này [53-tr.39]

Tóm lại, sắn có nhiều vai trò quan trọng trong cuộc sống như làm nguồn lương thực, thực phẩm đối với con người và làm nguồn thức ăn cho chăn nuôi gia súc, ngoài ra còn là nguyên liệu chế biến cồn sinh học và túi nylon sinh học thân thiện với môi trường, từ đó giúp bảo vệ môi trường Với nhiều vai trò như vậy nên

sắn đang là đối tượng cây trồng được ưu tiên nghiên cứu phát triển trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn [14-tr.36]

1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên th giới và ở Việt Nam

1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên th giới

Sắn có vai trò vô cùng lớn đối với con người, theo FAO thì sắn là cây lương thực quan trọng xếp thứ tư ở các nước đang phát triển sau ngô, lúa gạo, lúa mì Ngoài ra, sắn là cây trồng đứng thứ tư trên thế giới về cung cấp năng lượng cho con người, là cây có khả năng sản xuất lượng carbohydrate cao nhất trong số các cây lương thực Do đó mà chúng đang rất được quan tâm và được trồng ở trên 100 quốc

gia trên thế giới với các quy mô canh tác khác nhau [13-tr.36]

Về sản xuất, sản lượng sắn trên toàn thế giới trong nhiều năm trở lại đây duy trì tương đối ổn định ở mức sản lượng 250 triệu tấn Trong đó Nigeria là quốc gia đứng đầu thế giới với sản lượng sắn xấp xỉ 59,57 triệu tấn và diện tích trồng khoảng

6 triệu hecta (hectare, ha) Đứng thứ hai là Congo với sản lượng sắn xấp xỉ 34 triệu tấn và diện tích trồng sắn khoảng 4,18 triệu ha Việt Nam là nước có diện tích trồng đứng thứ tám trong bảng với hơn 569 nghìn ha và sản lượng sắn đứng thứ bảy với khoảng 10,91 triệu tấn Trong những năm gần đây, do sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp sản xuất cồn sinh học có sắn là nguyên liệu đầu vào nên sản lượng sắn đang gia tăng mạnh mẽ Sản xuất sắn bùng nổ tại các quốc gia Đông Nam Á cùng

với nhu cầu lương thực ngày càng tăng của Châu Phi [5-tr.35]

Về tiêu thụ, sắn chiếm tỉ trọng cao trong cơ cấu lương thực ở Châu Phi, bình quân khoảng 96 kg/người/năm Trong đó, Congo là nước sử dụng sắn nhiếu nhất với 391 kg/người/năm (hoặc 1123 calori/ngày) Trung Quốc hiện là nước nhập khẩu sắn nhiều nhất thế giới để làm cồn sinh học (bio ethanol), tinh bột biến tính (modify starch), thức ăn gia súc và dùng trong công nghiệp thực phẩm dược liệu Căn cứ vào

số liệu của FAO năm 2016, dưới đây là bảng thống kê về diện tích và sản lượng sắn của 10 quốc gia trên thế giới

Bảng 1.1 Diện tích và sản lượng sắn của 10 nước trên thế giới

Chú thích: Diện tích (ha), sản lượng (tấn) đều được khai thác số liệu từ FAO, 2016

1.4.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây sắn được coi là cây công nghiệp xuất khẩu có triển vọng Những năm gần đây sắn được Bộ Công thương đưa vào nhóm 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Ngoài lợi ích về giá trị kinh tế cao thì sắn còn

có giá trị lớn về an ninh lương thực, an ninh quốc phòng và xã hội do sắn được trồng chủ yếu ở các vùng miền núi, là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo, vì sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp với điều kiện sinh thái

ít thuận lợi và điều kiện kinh tế nông hộ

Về sản xuất, sắn được trồng từ Bắc tới Nam, tuy nhiên được trồng chủ yếu ở

5 vùng sinh thái là Bắc Trung Bộ, Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam

Bộ và Trung du miền núi phía Bắc Diện tích trồng sắn ở 5 vùng sinh thái này chiếm khoảng 97% diện tích trồng sắn trên cả nước, với tổng diện tích trồng sắn trên cả nước năm 2016 đạt 569,9 nghìn ha Năng suất sắn bình quân trên cả nước năm 2016 đạt 19,17 tấn/ha Trong năm 2016, tổng sản lượng sắn củ tươi trên cả nước đạt khoảng 10,91 triệu tấn, tăng 10,44% so với năm 2011 [49-tr.39]

Về tiêu thụ, năm 2016 sắn tươi tiêu thụ khoảng 14,84 triệu tấn dùng để sản xuất tinh bột sắn, thức ăn chăn nuôi, sắn lát phơi khô, cồn sinh học hoặc các sản phẩm khác Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, trong năm 2016 tổng kim ngạch xuất khẩu các mặt hàng sắn là 3,697 triệu tấn, trong đó kim ngạch xuất khẩu sắn các loại là 1,508 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu các sản phẩm từ sắn là 2,189 triệu tấn [50-tr.39]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 D liệu nghiên cứu

Hệ gene và hệ protein của giống sắn mô hình AM560-2 [17-tr.36] được cung cấp từ cơ sở dữ liệu Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov) [24-tr.37] và NCBI (Bioproject: PRJNA234389)

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2018 - 1/2019

Địa điểm nghiên cứu:

Phòng Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp

Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định các gene liên quan đến khả năng ra hoa ở loài sắn Nội dung 2: Phân tích thông tin của gene mã hóa FT ở loài sắn

Nội dung 3: Phân tích cấu trúc của các gene liên quan đến khả năng ra hoa ở loài sắn

Nội dung 4:Thiết lập cây phân loại của gene FT ở loài sắn

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp xác định các gene FT ở sắn

Để xác định được các thành viên của gene FT, sử dụng công cụ tìm kiếm

trình tự protein (Basic local alignment search tool protein, BlastP), sau đó tiến hành

bằng cách BlastP vùng bảo thủ At1G65480 vào hệ protein ở A thaliana trên cơ sở

dữ liệu của Phytozome Trong đó vùng bảo thủ At1G65480 đặc trưng cho khả năng

ra hoa ở loài sắn Bao gồm các bước:

Bước 1: Ta truy cập vào Phytozome, sau đó truy cập vào species, chọn

Manihot esculenta v6.1

Bước 2: Nhập từ khóa At1G65480 (vùng bảo thủ đặc trưng cho các loài thực vật) vào ô trống từ khóa, sau đó Enter (hình 2.1)

Hình 3.1 Cơ sở dữ liệu Phytozome

Bước 3: Xác định số lượng các gene FT

2.4.2 Phương pháp xác định thông tin của gene mã hóa FT ở sắn

Mã định danh và các thông tin chú giải của gene FT được tiến hành bằng

cách tìm kiếm BlastP trên cơ sở dữ liệu NCBI qua đó người dùng có thể thu thập các thông tin như mã định danh, vị trí phân bố của gene Cụ thể như sau:

Bước 1: Truy cập vào công cụ tìm kiếm trình tự cơ bản (Basic Local Alignment Search Tool, BLAST) là một công cụ tìm kiếm cơ bản nhằm so sánh các chuỗi sinh học, ví dụ như chuỗi amino acid của phân tử protein hay chuỗi polynucleotide của DNA, chọn BlastP

Bước 2: Nhập trình tự amino acid của các protein FT vào ô trống từ khóa, sau đó truy cập vào ô có chữ BLAST ở bên dưới

Bước 3: Xuất hiện thông tin của họ gene, tỉ lệ nào chiếm lớn nhất sau đó truy cập vào Accession

Bước 4: Xác định mã phiên mã, mã định danh protein, mã locus của họ gene FT

2.4.3 Phương pháp phân tích cấu trúc của gene mã hóa FT ở sắn

Để xác định được cấu trúc của gene mã hóa FT ở sắn, ta tiến hành đưa trình

tự mã hóa DNA (Coding DNA sequence, CDS) và bộ gen DNA (Genomic

Hình 2.1 Cơ sở dữ liệu Phytozome

deoxyribonucleic acid , gDNA) của từng gene tương ứng vào BioEdit [25-tr.37] Trong đó, CDS và gDNA của từng gene được khai thác trên cơ sở dữ liệu Phytozome và BioEdit là phần mềm được sử dụng để phân tích và so sánh trình tự sắp xếp của các chuỗi sinh học Từ đó thông qua phần mềm BioEdit mà ta có thể xác định được kích thước các gene, thành phần nucleotide trong mỗi gene Cụ thể gồm các bước sau:

Bước 1: Ta đưa trình tự CDS, gDNA của từng gene lần lượt vào phần mềm BioEdit

Bước 2: Truy cập vào sequence, sau đó chọn nucleic acid, rồi truy cập vào nucleotide composition

Bước 3: Xác định kích thước của CDS, gDNA và hàm lượng GC (%) của từng gene

Đối với số lượng các đoạn exon/intron của họ gene thì được xác định bằng công cụ hiển thị cấu trúc gen (Gene Structure Display Server, GSDS) [28-tr.37] dựa trên trình tự vùng CDS và gDNA tương ứng của từng gene mã hóa

2.4.4 Phương pháp xây dựng cây phân loại của FT ở sắn

Cây phân loại được xây dựng trên công cụ MEGA (V6.0) [32-tr.38] bằng cách sử dụng phương pháp Neighbor - Joining Trong đó có sự tham gia đóng góp

của trình tự amino acid của các thành viên họ gene FT, từ đó thiết lập nên cây phân

loại của FT ở sắn