kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp vi sinh

Một số ứng dụng khác của phép thử tác dụng của thuốc trên động vật Phương pháp thử trên động vật còn được áp dụng để kiểm nghiệm nhiều loạidược phẩm có tính chất đặc biệt như: Phép t

Bài 9 KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

3 Áp dụng được các qui trình kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học của Dược điển Việt Nam 4 trong kiểm tra chất lượng thuốc.

NỘI DUNG

1 ĐẠI CƯƠNG

Trong ngành Dược sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra chấtlượng thuốc: phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp hoá lý…Các phương pháp phân tích hoá học, hoá lý, vật lý…tiến hành nhanh, chínhxác nhưng chỉ áp dụng được với các thuốc có thành phần hoá học đã biết Một sốthuốc có yêu cầu về kiểm tra hiệu lực tác dụng hoặc những đặc tính riêng biệt như:hiệu lực và độ an toàn của vaccin, độc tính bất thường của thuốc từ dược liệu, yếu

tố gây sốt của một số loại thuốc… những tiêu chuẩn này không thể xác định đượcbằng phương pháp hoá học hay hoá lý mà phải dùng phương pháp sinh học

1.1 Nguyên tắc

Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc: So sánhhiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất thử với chất chuẩn tương ứngtrong cùng một điều kiện và thời gian thí nghiệm

Hai loại thử nghiệm được áp dụng nhiều trong kiểm nghiệm thuốc là:

- Kiểm nghiệm thuốc bằng các phương pháp thử trên động vật

- Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật

1.2 Chất chuẩn

Trong thử nghiệm sinh học chất chuẩn là một yếu tố quan trọng để đánh giáchất lượng mẫu thử Chất chuẩn được chia làm 2 loại:

- Chất chuẩn gốc: Là những chất đồng nhất có độ tinh khiết cao Chất chuẩn

gốc thường được sản xuất tại các Viện nghiên cứu quốc gia hoặc quốc tế riêng vềchất chuẩn sinh học

- Chất chuẩn thứ cấp: Cũng là chất có độ tinh khiết cao, có hoạt tính sinh học

được xác định theo chất chuẩn gốc quốc tế tương ứng

Chất chuẩn phải được bảo quản trong các ống thuỷ tinh ở nhiệt độ thích hợptuỳ theo mẫu (thường ở nhiệt độ <50C) trong điều kiện khô, tránh ánh sáng

1.3 Đánh giá kết quả

Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài và phụ thuộc vàonhiều yếu tố như tính chất đáp ứng của sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm ,các điều kiện thử nghiệm Các yếu tố này thường không ổn định Vì vậy, kết quả

thử nghiệm sinh học phải được đánh giá bằng toán thống kê Độ chính xác của phépthử được thể hiện bằng giới hạn tin cậy.

2.KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ TRÊN ĐỘNG VẬT

2.1 Đặc điểm chung

2.1.1 Nguyên tắc

Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử trên động vật dựa trên sự đáp ứng củađộng vật thí nghiệm đối với các chế phẩm thử khi đưa vào cơ thể động vật mộtlượng thuốc nhất định theo qui định của từng chuyên luận

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm phải đồng đều, thuần khiết về nòi giống, không nhiễmbệnh, không có thai và được nuôi dưỡng đầy đủ Mỗi thí nghiệm có nhu cầu khácnhau về giống, trọng lượng, tuổi của động vật Chất lượng của động vật quyết định

độ chính xác của phép thử

2.1.3 Phương pháp thử nghiệm

- Phương pháp in-vivo: là phương pháp nghiên cứu trên động vật sống ở trạngthái sinh lý bình thường của chúng Đánh giá kết quả dựa trên sự thay đổi các thôngsố: nhiệt độ cơ thể, nhịp tim, điện tâm đồ, điện não đồ, sự thay đổi huyết áp, phản

xạ hệ thần kinh hoặc tỷ lệ sống, chết… của động vật thí nghiệm để xác định tácdụng và chất lượng của thuốc

- Phương pháp in-vitro: thử tiến hành trên các cơ quan cô lập của động vậtnhư: tim, tử cung, ruột, máu…gọi là thử invitro

- Phương pháp ex-vivo: là phương pháp nghiên cứu được tiến hành trên những

bộ phận hay cơ quan được lấy ra khỏi sinh vật tuy vậy vẫn đảm bảo sự hoạt độngcủa cơ quan đó như lúc trong cơ thể sống

Độc tính bất thường của thuốc được xác định bằng cách theo dõi số chuột sống

và chết trong thời gian 48 giờ sau khi cho chuột một liều thuốc qua đường dùngtheo qui định

Phạm vi áp dụng

Thí nghiệm này thường được áp dụng để thử độc tính của các thuốc đông dược

có dược liệu độc như: ô đầu, phụ tử, mã tiền…hay các chế phẩm đông dược mới

Động vật thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, cân nặng 18 - 22 g, chưa dùng vào thí nghiệm,nếu là chuột cái phải không có thai hoặc đang cho con bú, được chăn nuôi trongđiều kiện bình thường

Chuẩn bị dung dịch thử:

Hoà tan mẫu thử trong dung dịch natri clorid 0,9% hoặc nước cất tiêm (nếuthử theo đường tiêm) hoặc phân tán đều mẫu thử trong nước cất (nếu thử theođường uống) để thu được dung dịch hoặc hỗn dịch có chứa lượng chất cần thử phùhợp với mức liều qui định trong chuyên luận riêng

Nếu có chuột chết, làm lại thử nghiệm với 10 chuột khác, dùng chuột có thể trọng

19  1 g Sau 48 giờ, nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu

2.2.2 Thử chất gây sốt

 Nguyên tắc

Thử chất gây sốt là một phương pháp sinh học để kiểm tra chất lượng thuốctiêm, thuốc tiêm truyền tĩnh mạch bằng cách đánh giá sự tăng thân nhiệt thỏ sau khitiêm tĩnh mạch dung dịch vô khuẩn của chất cần kiểm tra

Các thuốc tiêm truyền, thuốc tiêm có thể tích từ 15ml trở lên thì yêu cầu bắtbuộc phải thử chất gây sốt

 Lựa chọn động vật thí nghiệm

Dùng thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, cả 2 giống, cân nặng không dưới 1,5kg,nuôi dưỡng bằng thức ăn không có chứa kháng sinh và thỏ không có dấu hiệu giảmcân trong quá trình thử nghiệm Không dùng để thử nghiệm nếu:

(a) Thỏ mới được dùng thử chất gây sốt có kết quả âm tính trong vòng 3 ngàytrước đó, hoặc

(b) Thỏ đã được dùng thử chất gây sốt có kết quả dương tính trong vòng 3tuần

 Khu vực lưu giữ động vật

Thỏ được nuôi giữ riêng từng con trong khu vực yên tĩnh, có nhiệt độ ổn định.Cho thỏ nhịn ăn từ đêm trước khi thử, không cho uống nước trong quá trình thử.Tiến hành phép thử trong phòng yên tĩnh, không có tiềng ồn, nhiệt độ phòng chênhlệch không quá 3oC so với khu vực nuôi giữ, hoặc thỏ phải được lưu giữ ở điều kiệnphòng thí nghiệm trong khoảng ít nhất 18 giờ trước khi thử nghiệm

 Dụng cụ thí nghiệm

- Dụng cụ, bơm và kim tiêm: Tất cả các dụng cụ, bơm và kim tiêm phải được

rửa sạch và tráng nước cất, sấy ở nhiệt độ 250oC trong 30 phút hoặc 200oC trong 1giờ

- Hộp/ giá giữ thỏ: Các hộp/ giá giữ thỏ cho trường hợp đo nhiệt độ bằng thiết

bị điện được thiết kế để giữ ở cổ con vật nhưng không được chật quá, phần cơ thểcòn lại được thoải mái để thỏ có thể ngồi ở tư thế bình thường Không giữ thỏ bằngcác loại kẹp hoặc giá có thể gây đau hoặc khó chịu cho con vật Thỏ phải được chovào hộp hoặc giá ít nhất 1 giờ trước khi thử và giữ ở đó trong suốt quá trình thửnghiệm

- Nhiệt kế: Nhiệt kế hoặc thiết bị điện dùng để ghi nhiệt độ có độ chính xác

0,1oC và được đưa vào trực tràng của thỏ với độ sâu 5cm Độ sâu của nhiệt kế trongtrực tràng phải giống nhau giữa các thỏ Nếu dùng thiết bị điện, đầu đo nhiệt độphải được đặt trong trực tràng trong suốt quá trình thử

Thử nghiệm sơ bộ

Chỉ nên tiến hành thử sơ bộ với những thỏ lần đầu tiên được dùng thử chất gâysốt

Trong vòng một đến 3 ngày trước khi kiểm tra mẫu thử, tiêm tĩnh mạch tai10ml/ kg thỏ dung dịch natri clorid 0,9% không có chất gây sốt, đã làm ấm đếnkhoảng 38o5 trước khi tiêm Ghi nhiệt độ thỏ, bắt đầu ít nhất 90 phút trước khi tiêm

và tiếp tục trong 3 giờ sau khi tiêm Không dùng những thỏ có nhiệt độ thay đổi quá0,6oC vào thử nghiệm chính thức

Thử nghiệm chính thức

Mỗi mẫu được thử trên một nhóm 3 thỏ

Chuẩn bị và tiêm mẫu thử: Mẫu thử có thể được hòa tan trong một dung môi

không có chất gây sốt, dung dịch natri clorid 0,9% hoặc một chất lỏng được quiđịnh trong chuyên luận riêng Làm ấm dung dịch thử lên khoảng 38o5 trước khitiêm Tiêm chậm dung dịch thử vào tĩnh mạch tai thỏ trong khoảng thời gian khôngquá 4 phút, trừ khi có chỉ dẫn gì khác trong chuyên luận riêng Lượng mẫu thử đượctiêm sẽ thay đổi tùy theo chế phẩm cần kiểm tra và được qui định trong chuyên luậnriêng Thể tích tiêm trong khoảng 0,5 – 10ml/ kg thể trọng thỏ

Theo dõi nhiệt độ và xác định đáp ứng

Ghi nhiệt độ thỏ 30 phút một lần, ít nhất 90 phút trước khi tiêm và tiếp tục 3giờ sau khi tiêm Theo dõi nhiệt độ trước khi tiêm, không dùng vào thử nghiệm nếu:

- Thỏ có chênh lệch nhiệt độ ≥ 0,2oC giữa 2 lần ghi liên tiếp, hoặc

- Thỏ có nhiệt độ ban đầu cao hơn 39o8 hoặc thấp hơn 38oC, hoặc

- Nhiệt độ của 3 thỏ trong cùng nhóm khác nhau quá 1oC

“Nhiệt độ ban đầu” của mỗi thỏ là trung bình của 2 giá trị nhiệt độ ghi đượccách nhau 30 phút, xác định trong khoảng 40 phút ngay trước khi tiêm dung dịchthử “Nhiệt độ tối đa” của mỗi thỏ là nhiệt độ cao nhất ghi được cho thỏ đó trongvòng 3 giờ sau khi tiêm Chênh lệch giữa “nhiệt độ ban đầu” và “nhiệt độ cao nhất”được gọi là đáp ứng Khi chênh lệch là âm, kết quả được coi là đáp ứng bằng 0

Đánh giá kết quả:

Đầu tiên thử trên một nhóm 3 thỏ, tùy thuộc vào kết quả thu được, thử thêmlần lượt từng nhóm 3 thỏ khác cho đến khi tổng cộng 4 nhóm, nếu cần Nếu tổngđáp ứng của nhóm đầu tiên không vượt quá số ghi trong cột 2 của bảng dưới đây,thì mẫu thử đạt yêu cầu Nếu tổng đáp ứng vượt quá số ghi trong cột 2 nhưng khôngvượt quá số ghi trong cột 3 thì lặp lại phép thử trên nhóm khác như đã nêu ở trên.Nếu tổng các đáp ứng lớn hơn số ghi trong cột 3 thì mẫu thử không đạt yêu cầu

Số thỏ Mẫu thử đạt nếu tổng đáp ứng

không vượt quá

Mẫu thử không đạt nếu tổngđáp ứng vượt quá

2.2.3 Một số ứng dụng khác của phép thử tác dụng của thuốc trên động vật

Phương pháp thử trên động vật còn được áp dụng để kiểm nghiệm nhiều loạidược phẩm có tính chất đặc biệt như: Phép thử histamine, phép thử chất hạ áp, phépthử xác định độc tố thần kinh tồn dư trong vaccin bại liệt sống, xác định hiệu lựcvaccine dại theo phương pháp Habel, xác định hiệu lực vaccine dại theo phươngpháp NIH…

3.KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ TRÊN VI SINH VẬT

3.1 Đặc điểm chung

Nguyên tắc: Đánh giá tác dụng ức chế của chế phẩm mang thử trên các chủngVSV gây bệnh

- Kiểm soát giới hạn tiểu phân trong không khí

- Kiểm soát số vi sinh vật trong không khí

- Trang bị đầy đủ dụng cụ thí nghiệm, trang thiết bị nuôi cấy vi sinh vật, thiết

bị hỗ trợ kiểm tra đánh giá kết quả thử nghiệm

An toàn phòng thí nghiệm sinh học

- Cần xây dựng qui tắc an toàn sinh học cho phòng thí nghiệm

- Đảm bảo tất cả qui tắc an toàn sinh phọc phải được tuân thủ nghiêm ngặt

3.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật là những chất dinh dưỡng thích hợp nhằmđảm bảo cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển

Môi trường cần có 3 điều kiện như sau: Đầy đủ chất dinh dưỡng theo yêu cầuthí nghiệm, có pH trong khoảng qui định và phải vô trùng.

3.2.1 Phân loại môi trường

Môi trường có thể được phân thành các loại khác nhau theo bản chất của thànhphần của môi trường, theo tính chất vật lý và theo công dụng

- Rắn: trong thành phần môi trường có từ 20-25% agar Môi trường rắn dùng

để phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, định lượngmật độ vi sinh vật

- Bán lỏng (bán rắn): được dùng để lên men vi sinh vật trong công nghiệp

3.2.2 Phương pháp pha chế môi trường

Khi pha chế môi trường cần tiến hành qua 6 bước sau:

3.2.2.2 Cân đong nguyên liệu:

Các nguyên liệu phải được cân đong chính xác, nhất là những hoá chất hoặcnguyên tố vi lượng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối mật, sắt…) phải được cânbằng cân phân tích

3.2.2.3 Hoà tan nguyên liệu:

Thường dùng nước cất hoặc nước khử khoáng để pha môi trường Các hoáchất được hoà tan nóng hoặc lạnh tuỳ theo tính chất của chúng Môi trường không

có thạch nên hoà tan lạnh hoặc nóng nhẹ Môi trường có thạch cần đun cho thạchtan hoàn toàn sau đó mới cho các thành phần khác vào

3.2.2.4 Điều chỉnh pH:

Khi điều chỉnh pH của môi trường nên thực hiện ở nhiệt độ 45-500C để pH ít

bị thay đổi sau khi tiệt trùng Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N thường được sửdụng để điều chỉnh pH Sau khi điều chỉnh pH, cần bổ xung nước cho đủ thể tíchban đầu

3.2.2.5 L àm trong môi trường:

Các môi trường (bao gồm các chất hoà tan) phải trong để dễ quan sát sự pháttriển của vi sinh vật Sau khi hoà tan các chất, nếu môi trường đục cần phải lọc quavải gạc hoặc giấy

3.2.2.6 Đóng ống, khử trùng:

Môi trường được cho vào ống nghiệm, bình nón hoặc bình cầu, tuỳ theo yêucầu thí nghiệm Khi đóng ống, không được để môi trường dính vào miệng ống hoặcbình

Môi trường cần phải được khử trùng ngay sau khi đóng gói Nếu để lâu, tạpkhuẩn sẽ phát triển làm hỏng môi trường

Các môi trường thông thường được khử trùng 1100C/ 30 phút hoặc 1200C/ 20phút

Môi trường có các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt, cần khử trùng ở nhiệt độ thấpbằng phương pháp Tyndall, Pasteur, hoặc dùng lọc vi khuẩn Môi trường được lấy

ra khỏi nồi hấp ngay sau khi khử trùng xong Nếu để lâu trong nồi hấp môi trường

bị chuyển mầu và giảm chất lượng

3.2.3 Pha chế môi trường từ hỗn hợp bột môi trường chế sẵn:

Hiện hay hầu hết các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật đều sử dụng môi trườngđông khô thương phẩm của các hãng chuyên nghiệp MERCK, OXOID, HIGH-MEDIA… để pha chế môi trường nhằm hạn chế biến động thành phần môi trường ởcác lần kiểm nghiệm khác nhau Việc pha chế môi trường nuôi cấy từ các môitrường đông khô này tương đối đơn giản với các bước cân, hoà tan, chỉnh pH và hấpkhử trùng

Phương pháp pha chế môi trường này được thực hiện như sau:

- Cân, đong đúng lượng môi trường đông khô theo chỉ dẫn

- Bổ sung một thể tích nước cất hoặc nước khoáng bằng nửa dung tích cầnthiết Lắc kỹ, bổ sung phần nước còn lại Nếu môi trường có agar hoặc gelatin, cầnphải gia nhiệt để làm tan môi trường

- Điều chỉnh pH môi trường Để điều chỉnh pH dùng NaOH 1N hoặc HCl 1 N

- Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa thích hợp, làm nút đậy cho cácdụng cụ chứa

- Tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp

- Kiểm tra độ vô trùng của môi trường nuôi cấy

3.2.4 Một số điểm cần lưu ý khi pha chế môi trường:

- Bảo quản sai quy định (nhiệt độ, độ ẩm, oxy hóa…) dẫn đến môi trường bịhỏng

- Sử dụng dụng cụ chứa (thủy tinh) bị nhiễm chất tẩy rửa hoặc hóa chất khác

- Trộn không đều, hòa tan chưa hoàn toàn

- Đun quá nóng hoặc tiệt trùng quá lâu: thủy phân agar, caramel hóa đường,giảm pH, tăng hoặc giảm các chất ức chế do chất màu trong môi trường chọn lọc bịmất, tạo thành các chất ức chế mới

- Xác định pH sai, dẫn đến cho quá nhiều kiềm hoặc acid

- Môi trường, hóa chất chứa chất có màu cần bảo quản tránh ánh sáng (giữ ởphòng tối, dụng cụ chứa có màu, bọc bằng giấy nâu hoặc giấy nhôm)

3.2.5 Bảo quản môi trường

- Môi trường bột khô được giữ ở 10-120C trong điều kiện khô, tránh ánh sáng

- Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4-100C trong 1-2 tháng tuỳ theothành phần môi trường

3.3 Các phương pháp khử trùng

Khử trùng là một quá trình làm cho một vật hoặc một sản phẩm không còn visinh vật sống được Khử trùng được thực hiện bằng phương pháp vật lý, hoá học.Chọn phương pháp khử trùng phụ thuộc vào tính chất lý hoá và độ bền vữngcủa môi trường

- Môi trường thường được khử trùng bằng nồi hấp ở 1200C/ 20 phút

Các môi trường thường dễ bị hỏng bởi nhiệt như môi trường có đường, sữa,bia, máu, albumin… cần khử trùng ở nhiệt độ thấp bằng các phương pháp sau:+ Khử trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall):

Môi trường được hấp 3-4 lần ở nhiệt độ không quá 1000C trong 30-40 phút,cách nhau 24 giờ Giữa hai lần hấp cho môi trường vào ủ ở 28-320C/ 24 giờ cho bàotử nảy mầm Các bào tử sống sót nảy mầm sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp theo

+ Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur):

Đun cánh thuỷ môi trường 600C/ 30 phút, hoặc 800C/ 15 phút sau đó làm lạnhđột ngột ở 100C phương pháp này không diệt được bào tử

 Phương pháp lọc:

Phương pháp lọc được dùng để khử trùng các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt.Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc  0,22ỡm Phần chảy quaphễu được đựng trong các dụng cụ vô trùng Thiết bị lọc và màng lọc phải được khửtrùng trước khi dùng

3.4 Một số thử nghiệm trên vi sinh vật được áp dụng trong kiểm nghiệm

3.4.1 Thử vô khuẩn

Các dụng cụ, dung môi, môi trường nuôi cấy phải được diệt khuẩn trước khidùng

3.4.1.2 Nguyên tắc

Cấy mẫu thử vào môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, nước và giữ ở điềukiện nhiệt độ thích hợp Sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu thử làm cho môitrường biến đổi trạng thái từ trong sang đục, hoặc có cặn lắng ở đáy môi trường,hoặc thay đổi màu sắc môi trường

3.4.1.3 Lựa chọn phương pháp

- Phương pháp màng lọc: chế phẩm sau khi đã được hoà loãng với dung môithích hợp lọc qua màng lọc, rồi cắt các màng lọc thành miếng nhỏ đem nhúng vàomôi trường, ủ môi trường đã cấy chế phẩm hoặc cấy màng lọc trong thời gian quiđịnh

- Phương pháp cấy trực tiếp: lấy một lượng chế phẩm đủ dùng theo qui định,cấy trực tiếp vào môi trường

Trước khi tiến hành thử phải làm sạch bề ngoài của ống (hoặc chai, lọ, bình )đựng chế phẩm bằng một chất sát khuẩn thích hợp

3.4.1.4 Chuẩn bị môi trường và dung môi

+ Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí

Môi trường thioglycolat có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng

và trong)

Môi trường thioglycolat không có thạch (dùng cho thử nghiệm những chếphẩm đặc hoặc đặc sền sệt dạng cao).

Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm mốc: Soybean - casein

Cả hai loại môi trường trên phải được pha chế và kiểm tra chất lượng theo đúngqui định

Dung môi dùng để hoà loãng

Khi những mẫu thử không ở dạng dung dịch lỏng, cần hoà loãng để thửnghiệm Chỉ được dùng làm dung môi hoà loãng là một chất lỏng bất kỳ không cótính kháng khuẩn và không tác động đến độ xốp của màng lọc Thường dùng cácdung môi sau đây:

Dung môi A: Hoà tan 1 g pepton vào nước cho vừa đủ 1 lít Lọc (hoặc ly tâm)

cho trong Điều chỉnh pH bằng 7,1  0,2 Đựng vào nhiều bình, mỗi bình khoảng

100 ml Hấp ở 1210 C trong 18 - 20 phút

Dung môi B: Như dung môi A, nhưng thêm 1 ml polysorbat 80 cho 1 lít dung

môi, dùng để hoà loãng những chế phẩm thử có lecithin

Dung môi C: isopropyl myristat

Dùng để pha loãng những chế phẩm dạng dầu hay dung dịch dầu

3.4.1.5 Tiến hành thử theo phương pháp màng lọc

Dụng cụ

Các dụng cụ dùng trong thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn gồm:

- Các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường

- Bộ lọc gồm có: Phễu lọc, giá đỡ màng lọc, bình hứng, và các phụ kiện đểghép nối; hệ thống hút chân không

- Màng lọc: Thường dùng loại có dường kính lỗ lọc khoảng 0,2 - 0,45 m.Loại màng Cellulose nitrat được dùng cho các chế phẩm dạng nước, dạng dầu vàcác dung dịch có lượng cồn thấp độ Loại màng lọc dạng cellulose acetat được dùngcho các chế phẩm dạng có nồng độ cồn cao Đặc biết đối với các chế phẩm khángsinh cần phải chọn loại màng lọc thích hợp đảm bảo không còn dư lượng khángsinh trên màng sau khi lọc

- Kéo cắt màng lọc

Lượng mẫu thử cần dùng cho một lần thử nghiệm

Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy số lượng thích hợp theo qui định ở bảng13.7.1 DĐVN 4

Kỹ thuật thử

Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ướt màng lọc Rót lên màng lọc một lượngmẫu cần thử như qui định ở bảng 1 Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gianlọc Rửa màng lọc ít nhất 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml dung môi thích hợp, vô khuẩn.Lấy màng lọc ra khỏi giá đỡ trong phễu lọc Cấy màng lọc vào môi trường bằng nhúngchìm vào loại môi trường để phát hiện nấm hoặc vi khuẩn

Khi mẫu thử có tính kháng khuẩn, rửa màng lọc ít nhất ba lần bằng cách lọc qua màng dung môi tiệt trùng đã chọn dùng cho thử nghiệm.Làm thí nghiệm kiểm tra để biết chắc chắn không còn tác dụng kháng khuẩn của mẫu thử hấp thụ trên

màng Chuyển toàn bộ màng lọc vào môi trường nuôi cấy thích hợp để phát hiện vi khuẩn, nấm mốc.

Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng, ủ môi trường thyoglycolat ở 300Cđến 350C và ủ môi trường soybean - casein ở 200C đến 250C ít nhất 14 ngày

Nếu mẫu thử là dụng cụ (bộ dây truyền, túi lọc máu ) thì dùng 100 ml dungmôi B cho chảy qua dụng cụ Hứng lấy dung môi, rót lên màng lọc đã được thấmướt bằng dung môi A, rồi làm tiếp theo kỹ thuật ghi ở mục kỹ thuật thử

3.4.1.6 Tiến hành thử theo phương pháp cấy trực tiếp

+ Lượng chế phẩm cần dùng để thử nghiệm

Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy lượng chế phẩm thích hợp theo qui định ởbảng 13.7.1 DĐVN 4

+ Lựa chọn môi trường

- Môi trường để phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí:

Môi trường thioglycolat: Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và

trong

Môi trường thioglycolat không có thạch Dùng cho thử nghiệm những chế

phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao

- Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm

Môi trường Soybean – casein:

+ Cách pha chế và kiểm tra chất lượng các môi trường

thioglycolat có thạch

Môi trường thioglycolat không có

Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên (trừ resazurin vàthioglycolat) trong cối nghiền, thêm vào một ít nước nóng, trộn kỹ, chuyển sangdụng cụ thích hợp Thêm số nước còn lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến khi tạothành dung dịch trong Thêm natri thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd 1 Nđiều chỉnh sao cho môi trường sau khi tiệt khuẩn có pH7,1  0,2 Đun nóng lạidung dịch (tránh đun sôi) Lọc (nếu cần) qua giấy lọc đã thấm ướt, rồi thêm dungdịch resazurin trộn đều Đóng vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp, hấp vôkhuẩn ở 1210C trong 18 - 20 phút Lấy ra làm nguội nhanh tới 250C, tiếp tục bảoquản ở nhiệt độ 20 - 300C, tránh ánh sáng Nếu 1/3 thể tích phía trên của ống (hoặcbình) môi trường có màu hồng, môi trường không thích hợp để thử nghiệm Có thểphục hồi lại môi trường bằng cách đun cách thuỷ cho mất màu rồi làm lạnh độtngột Nhưng chỉ sử dụng môi trường đã phục hồi này một lần, không dùng môitrường phục hồi lần 2 Các môi trường thioglycolat lỏng chỉ dùng trong khoảng 3tuần.

Cho tất cả các thành phần trên vào một dụng cụ thích hợp, đun cách thuỷ, khuấyđều đến khi thành dung dịch, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh để cho

pH sau khi tiệt khuẩn đạt 7,1  0,2 Có thể lọc (nếu cần) Phân chia vào các ốngnghiệm (hoặc bình) thích hợp Hấp tiệt khuẩn 1210C trong khoảng 18 - 20 phút Saukhi tiệt khuẩn đem làm nguội nhanh tới 250C, môi trường không được đun nóng trởlại

Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm

Môi trường Soybean - casein

Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn Đểnguội ở nhiệt độ phòng Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,1N để điều chỉnh (nếucần) cho pH sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,1 đến 7,5 Lọc (nếu cần) để cho môi trườngtrong Phân chia vào những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 1210C trong khoảng

loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc Các loại môi trường phải khôngđược có vi khuẩn, nấm mốc mọc.

Khả năng dinh dưỡng:

Cấy vào môi trường dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những loại vi khuẩn sau:

Loại hiếu khí dùng Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus subtilis ATCC 6633.

Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenes ATCC 9404.

Loại nấm dùng Candida albicans ATCC 10231.

Aspergillus niger ATCC 16404

Mỗi loại chủng chỉ thị được cấy vào loại môi trường tương ứng, rồi mang ủ ở

nhiệt độ thích hợp cho từng loại ít nhất 3 ngày đối với vi khuẩn và ít nhất 5 ngày đối với nấm mốc Trên mỗi loại môi trường, sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn mọc

tốt

Kiểm tra tác dụng ức chế ở mẫu mang thử:

Một số chế phẩm do yêu cầu của sản xuất hoặc ở những chế phẩm mới người

ta đã cho thêm chất bảo quản Loại chế phẩm này có ảnh hưởng đến sự phát triểncủa vi khuẩn, nấm mốc, nên cần phải kiểm tra tác dụng ức chế của chúng đối với vikhuẩn nấm mốc

Đối với vi khuẩn kỵ khí

Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn kỵ khí Hai ống dùng làm chứng

chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 nha bào vi khuẩn kỵ khí Clostridium sporogenes ATCC 9404 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch nha bào đã pha loãng thích hợp).

Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, rồi

cũng cấy vào mỗi ống 100 nha bào Clostridium sporogenes ATCC 9404 Đem ủ tất

cả các ống ở 30 - 350C ít nhất 7 ngày

Đối với vi khuẩn hiếu khí

Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí Hai ống dùng làm chứng

chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 tế bào vi khuẩn hiếu khí Staphylococcus aureus

ATCC 6538 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch tế bào đã pha loãng thích hợp) Hai ống cònlại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, và cũng cấy vào

mỗi ống 100 tế bào Staphylococcus aureus ATCC 6538 Đem ủ tất cả các ống ở 30

- 350C ít nhất 7 ngày

Đối với nấm mốc

Dùng 4 ống môi trường phát hiện nấm, mốc Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy

vào mỗi ống chứng này 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231 Hai ống dùng kiểm tra, cấy vào mỗi ống 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231 và

một lượng chế phẩm bằng nhau Đem ủ tất cả các ống ở 20 - 250C ít nhất 7 ngày

Đánh giá kết quả:

Nếu trong thời gian ủ, vi khuẩn, nấm mốc mọc tốt, (dễ dàng và phong phú),đối với từng loại, mọc giống nhau giữa ống kiểm tra và ống chứng: Mẫu thử không

có tác dụng ức chế

Nếu trên các ống môi trường có cấy mẫu thử, vi khuẩn, nấm, mốc mọcyếu, chậm phát triển hoặc không phát triển so với ống chứng vẫn mọc tốt: Mẫuthử có tác dụng ức chế Phải loại bỏ tác dụng ức chế.

Tác dụng ức chế của mẫu thử có thể loại bỏ được một cách có kết quả bằngcách cấy truyền nhắc lại trên một loạt môi trường mới hoặc lọc qua màng lọc vikhuẩn

đã cấy lại ít nhất 7 ngày

Trường hợp mẫu thử là băng, gạc, chỉ khâu phẫu thuật: Nếu kích thước vàhình dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100 ml môi trường tương ứng Khimẫu thử là dụng cụ (dây truyền, ống lọc máu, ) thì dùng dung môi A hoặc B (mụcchuẩn bị môi trường và dung môi) cho chảy qua để thu được ít nhất 15 ml dịch rửa,cấy vào ít nhất 100 ml mỗi loại môi trường nuôi cấy ủ và đọc kết quả như đã ghi ởtrên

3.4.1.7 Theo dõi và đánh giá kết quả

Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày phải quan sát các môi trường đã cấy mànglọc hoặc mẫu thử Nếu không thấy có vi khuẩn, nấm mốc mọc trong suốt thời gianqui định, mẫu thử được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn

Nếu có từ 1 trở lên trong số các môi trường nuôi cấy, có vi khuẩn hoặc nấmmốc mọc, cần phải:

Rà soát lại qui trình thử

Thử lại các mẫu thử nghi ngờ (lần thứ 2)

Giữ lại các môi trường có vi khuẩn, nấm mốc mọc

Tiến hành phân lập, so sánh vi khuẩn hoặc nấm trên môi trường, cấy lại với vikhuẩn hoặc nấm đã mọc ở môi trường cũ

Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) giống với tiêu bản làmlần đầu, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn

Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) khác biệt so với lần thínghiệm đầu tiên, cần thực hiện phép thử lặp lại với số lượng mẫu gấp đôi

Ở lần thử thứ ba: nếu không phát hiện thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc), mẫu thửđược coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn Nếu vẫn thấy vi khuẩn (hoặc nấm) mọc ở lầnlặp lại này, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn

3.4.2 Thử giới hạn nhiễm khuẩn

Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm,mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trongthuốc

Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn Trong khi làm thínghiệm, chú ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử

Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu vàthành phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất

Thử nghiệm sơ bộ

Tìm chất ức chế có trong thuốc:

Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trongthuốc cản trở đến khả năng phát hiện các vi khuẩn Vì vậy cần làm thí nghiệm kiểmtra trước bằng cách lấy dung dịch chế phẩm đã được pha ở nồng độ thích hợp vào

môi trường chọn lọc cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, rồi cấy vào đó 1ml canh khuẩn 24 h tuổi đã pha loãng

với dung dịch đệm phosphat pH 7,2 ít nhất tới 10-3 các vi khuẩn tương ứng Nếu vikhuẩn không mọc, thí nghiệm cần thay đổi bằng cách:

1 Giữ nguyên lượng chất mang thử nhưng tăng thể tích môi trường

2 Cho vào môi trường một lượng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp

3 Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn mang cấy có thể mọc được

Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu thử, có thể thêm vào môi trường đểtrung hoà chất ức chế các loại sau: lecithin đậu tương 0,5 %, polysorbat 20: 4 %.Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế trong lượng mẫu mang kiểm tra

đã được trung hoà

Môi trường

Môi trường nuôi cấy có thể pha theo cách dưới đây hoặc có thể dùng môitrường khô do các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp Các môi trường

tự pha chế phải hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 115oc trong 30 phút trừ khi

có những chỉ dẫn riêng đối với loại môi trường đặc biệt

Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ ẩm dưới 15% Nước và các chấtdùng trong các công thức phải tinh khiết

Môi trường lỏng casein lecithin đậu tương polysorbat

Môi trường thạch casein đậu tương

Môi trường lỏng casein đậu tương

Môi trường thạch muối - manitol

Môi trường thạch Baird - Parker

Môi trường thạch Vogel – Johnson

Môi trường thạch cetrimid

Môi trường thạch pseudomonas - fluorescin

Môi trường thạch pseudomonas - pyocyanin

Môi trường lỏng lactose

Môi trường lỏng Selenit - Cystin

Môi trường lỏng tetrathionat

Môi trường thạch xanh brilliant

Môi trường thạch xylose - lysin - desoxycholat

Môi trường thạch bismuth sulfit

Môi trường thạch - sắt - ba đường

Môi trường mac - conkey

Môi trường thạch levine - eosin - xanh methylen

Môi trường thạch Sabouraud

Môi trường thạch - khoai tây - glucose

Dung dịch đệm natri clorid – pepton ph 7,0

Môi trường nước thịt

Môi trường thạch thường

Môi trường pepton - natri clorid

Môi trường tăng sinh cho clostridia

Môi trường thạch columbia

Môi trường sulfit - lactose

Môi trường lỏng enterobacteria - mossel

Môi trường muối mật violet - red

Chuẩn bị thí nghiệm

Lấy mẫu:

Lượng mẫu cần lấy: 10ml hoặc 10g chế phẩm

Cách thử nghiệm:

Để xác định giới hạn vi khuẩn của mỗi chế phẩm phải thực hiện đầy đủ cácthử nghiệm sau:

Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được, tính ra số lượng vi khuẩn cótrong 1g hoặc 1ml chế phẩm

Đếm tổng số nấm mốc sống lại được, tính ra số lượng nấm mốc có trong 1ghoặc 1ml chế phẩm

Thử nghiệm tìm những vi khuẩn gây bệnh sau:

- Đối với chế phẩm rắn, hoà tan trực tiếp hoặc nghiền mịn chế phẩm trongbình với dung môi hoặc chất nhũ hoá thích hợp

- Đối với chế phẩm ở dạng lỏng như dung dịch thực, nhũ dịch trong nước, chấtrắn hòa tan dễ dàng và hoàn toàn trong nước , dùng dung dịch đệm phosphat ph7,2 hoặc dung dịch natri clorid 0,9% để hoà loãng

Những chế phẩm lỏng không thể hoà lẫn trong nước như dầu, kem hoặc sáp:chế tạo nhũ dịch bằng cách thêm một lượng vừa đủ tác nhân nhũ hoá vô khuẩn thíchhợp như các loại polysorbat Dùng phương pháp khuấy trộn cơ học hoặc đồng thờilàm ấm bằng nhiệt nhưng không được vượt quá 45oc để có nhũ dịch chế phẩm đồngnhất.

Các chế phẩm ở dạng khí dung - lỏng: làm lạnh bình để các khí hoá lỏng rồi

mở nắp để lấy một lượng thích hợp mang thử

Tiến hành

Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí:

Nếu chế phẩm hoà tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phươngpháp đĩa thạch Còn các chế phẩm khác dùng phương pháp hoà loãng trong ốngnghiệm

Hoà tan hoặc làm nhũ hoá 10 g hoặc 10 ml chế phẩm vừa đủ trong 100 mldung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc trong 100 ml dung môi thích hợp với từng loạichế phẩm, để được dung dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10

Đối với những chế phẩm dạng nhầy không thể lấy chính xác bằng pipet ở tỷ lệ1/10, có thể pha loãng tiếp để lấy được chính xác, nghĩa là có thể pha loãng đến tỷ

lệ 1/50 hoặc 1/100 v.v

Thực hiện thử nghiệm phát hiện chất ức chế trước khi xác định tổng số vikhuẩn hiếu khí Chế phẩm đã pha loãng phải cho ngay vào môi trường nuôi cấy màkhông được để quá 1 giờ

Dung dịch đệm pH 7,2: hoà 34g kali dihydrophosphat (kh2po4) vào khoảng

500 ml nước cất trong bình định mức 1000 ml Điều chỉnh pH tới 7,2 + 0,1 bằngcách thêm dung dịch natri hydroxyd 2% Thêm nước cất tới vạch Trộn đều, phânchia vào các bình, tiệt khuẩn, bảo quản ở lạnh Khi dùng, hoà loãng với nước cấttheo tỷ lệ 1: 800 và tiệt khuẩn

a) Phương pháp đĩa thạch

Hoà loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường trongmột hộp petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc Lấy dung dịch có độpha loãng cuối cùng cho vào 2 hộp petri, mỗi hộp 1ml Thêm vào mỗi hộp 15 - 20

ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch thường đã đun chảy

và để nguội đến 45oC Đậy hộp, trộn đều bằng cách xoay qua, xoay lại Sau đó đểyên cho thạch đông cứng ở nhiệt độ phòng Lật ngược hộp, mang ủ ở 35oC từ 24 -

48 h Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc Lấygiá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không lớnhơn 300 và tính ra số lượng khuẩn lạc trong 1g hoặc 1ml chế phẩm Nếu thấy không

có khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10khuẩn lạc trong 1 g hoặc 1 ml

b) Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm

Cho vào 14 ống nghiệm cỡ thông thường, mỗi ống 9,0 ml môi trường lỏngcasein đậu tương Lấy một dãy 12 ống chia thành 4 lô, mỗi lô 3 ống dùng một lô 3ống để kiểm tra

Thêm vào lô 1 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống a) 1 g (hoặc1 ml) chế phẩm

Bảng 1: Tổng số vi khuẩn trong chế phẩm.

số mg (hoặc l) chế phẩm cho mỗi ống

có thể có trong 1 g hoặc 1ml

3333

3210

>110011005002003

333

2

222

3210

290210150903

333

1111

3210

16012070403

333

0000

3210

95604023

Chuyển một lượng thích hợp dung dịch mẫu thử đã pha theo mục “Chuẩn bịmẫu”, (Tốt nhất là lấy một lượng dung dịch mẫu đã chuẩn bị tương đương với 1ghoặc 1ml mẫu cần thử; nếu lượng vi khuẩn có nhiều trong mẫu thử, có thể lấy lượng

dung dịch mẫu ít hơn) Mỗi mẫu thử cần 2 màng lọc, dung dịch mẫu thử đã chuẩn bịphải lọc ngay qua màng Rửa màng lọc 3 lần, mỗi lần khoảng 100ml dung dịchthích hợp như dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0 Khi cần có thể thêmchất hoạt động bề mặt như polysorbat 80 hoặc các chất khử hoạt tính của các chấtkháng khuẩn vào dung dịch dùng để rửa Cũng có thể rửa màng với số lần ít hơn,nếu thấy đủ loại hết thuốc và tác nhân ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm khỏimàng Chuyển một màng lọc lên môi trường thạch dùng phát hiện vi khuẩn Ủ ở 30°

to 35°C, theo dõi, đếm số vi khuẩn mọc trên màng Chuyển màng lọc còn lại lênmặt môi trường phát hiện nấm Ủ ở 20° to 25°C, theo dõi trong khoảng 5 ngày, đếm

số nấm mọc trên màng Nếu chắc chắn về thời gian mọc của nấm cần phát hiện thì

có thể theo dõi, đếm trong khoảng thời gian ngắn hơn Chọn đếm các đĩa có sốkhuẩn lạc cao nhất ít hơn 100 khuẩn lạc trên màng Tính số khuẩn lạc có trong 1gam hoặc 1ml mẫu thử

Mẫu thử là thuốc dạng miếng đắp thấm qua da: Chuyển vô trùng 10 miếng dánvào bình đã có sẵn 500 ml dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0, Lắc đềutrong 30 phút Lọc qua 2 màng lọc để tìm vi khuẩn và nấm mỗi màng 50ml dungdịch Tiếp tục ủ, theo dõi, đếm vi khuẩn và nấm mốc như ở trên

Thử nghiệm tìm các vi khuẩn

a) Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa

Cho chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 35 - 370C,kiểm tra vi khuẩn mọc ở môi trường Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trường,cấy lên đĩa thạch Vogel - Johnson (hoặc thạch Baird - Parker hoặc thạch manitol -muối) và môi trường thạch cetrimid Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, mang ủ Sau khi

ủ kiểm tra nếu không thấy có những khuẩn lạc với đặc tính như ghi trong bảng 2 vàbảng 3 (nêu ở phần sau) đối với từng môi trường đã sử dụng thì chế phẩm không có

Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa Nếu thấy có khuẩn lạc nghi ngờ thì tiếp tục làm các phản ứng sinh hoá của Staphylococcus aureus hoặc Pseudomonas aeruginosa như sau:

*Phản ứng coagulase (đối với Staphylococcus aureus):

Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt thạch Johnson (hoặc thạch Baird - Parket, hoặc thạch manitol - muối) thêm vào từng ốngnghiệm, mỗi ống 0,5 ml huyết tương thỏ hoặc ngựa Đem ủ 37oC, kiểm tra các ốngsau 3 giờ ủ rồi tiếp tục ủ thêm 24h Nếu thấy có đông huyết tương (ở bất kỳ mức độ

Vogel-nào), chế phẩm có Staphylococcus aureus.

Bảng 2: Đặc điểm hình thái của Staphylococcus aureus trên các môi trường lựa chọn

Môi

trường

Thạch Vogel -Johnson

Thạch manitol - muối

Thạch Baird - Parker

Khuẩn lạc màu vàngcùng với một vùngvàng xung quanh

Khuẩn lạc màu đen bóng,viền quanh bằng mộtvùng sáng rõ 2 - 5 mm

*Phản ứng oxydase và sinh sắc tố ( đối với Pseudomonas aeruginosa):