NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT AMYLASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE

oryzae...14 Bảng 2: Ảnh hưởng của bột ngô tới sinh tổng hợp amylase chủng Asp.oryzea ...15 Bảng 3: Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các amylase...15 Bảng 4: Ảnh hưởng của pH c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH SÁCH BẢNG v

TÓM LƯỢC vi

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU .1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Cấu trúc phân tử của amylase 3

2.1.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng 3

2.1.2 Hoạt lực của amylase 7

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của amylase 7

a Nồng độ cơ chất 7

b Nồng độ enzyme 9

c Nhiệt độ 10

d pH môi trường 11

e Các chất kìm hãm 12

e Các chất hoạt hóa 13

2.2 Sản xuất amylase từ vi sinh vât 13

2.2.1 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật 13

2.2.2 Các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp amylase 15

a Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng 15

b Ảnh hưởng của acid amin 16

c Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng 16

e Ảnh hưởng của pH nguyên liệu 17

f Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy 17

2.3 Kỹ thuật sản xuất amylase từ vi sinh vật 18

2.3.1 Sơ đồ kỹ thuật sản xuất chế phẩm amylase từ Asp oryzae 19

2.3.2 Thuyết minh quy trình 19

2.4 Một số ứng dụng của amylase trong thực phẩm 22

2.4.1 Sản xuất rượu 22

2.4.2 Sản xuất bia 22

2.4.3 Sản xuất bánh mì 22

2.4.4 Sản xuất bánh kẹo 23

2.4.5 Sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường 23

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Vật liệu 25

3.2 Đối tượng nghiên cứu 24

3.3 Dụng cụ, hóa chất 24

3.4 Phương pháp thí nghiệm 26

3.4.1 Qui trình thí nghiệm tham khảo 26

3.4.2 Thí nghiệm 26

KẾT QUẢ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành amylase 30

4.2 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sự tạo thành amylase 38

CHƯƠNG V KẾT LUẬN 51

CHƯƠNG VI KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Cơ chế tác dụng của α- amylase lên tinh bột 4

Hình 2: Tác dụng của glucoamylase lên tinh bột 6

Hình 3: Tác dụng của amylase lên tinh bột 6

Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzym 8

Hình 5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase 9

Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng 9

Hình 7: Ảnh hưởng của nồng độ amylase đến thời gian phản ứng 10

Hình 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme 10

Hình 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng của amylase 11

Hình 10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme 11

Hình 11: Ảnh hưởng của pH đến thời gian phản ứng của enzyme 12

Hình 12: Máy đông khô 25

Hình 13: Máy phân tích ẩm 25

Hinh 14: Thiết bị đo mật độ quang 25

Hình 15: Máy đo pH 25

Hình 16: Tủ úm 25

Hình 17: Sơ đồ qui trình công nghệ tham khảo 26

Hình 18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính amylase riêng 32

Hình 19: Đồ thị biểu diễn hoạt tính amylase tổng 34

Hình 20: Đồ thị biểu diễn hoạt tính glucoamylase riêng 36

Hình 21: Đồ thị biểu diễn hoạt tính glucoamylase tổng 38

Hình 22: Đồ thị biểu diễn hoạt tinh amylase riêng 41

Hình 23: Đồ thị biểu diễn hoạt tinh amylase tổng 44

Hình 24: Đồ thị biểu diễn hoạt tính glucoamylase riêng 47

Hình 25: Đồ thị biểu diễn hoạt tính glucoamylase tổng 50

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh tổng hợp các amylase bởi nấm mốc Asp

oryzae 14

Bảng 2: Ảnh hưởng của bột ngô tới sinh tổng hợp amylase chủng Asp.oryzea 15

Bảng 3: Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các amylase 15

Bảng 4: Ảnh hưởng của pH cám đến sinh tổng hợp amylase 17

Bảng 5 Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase của Asp oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt 18

Bảng 6: Thành phần của cám mì và cám gạo 20

Bảng 7: Thời gian nuôi cấy thích hợp của Asp oryzae 21

Bảng 8: Khối lượng môi trường và ẩm nuôi cấy 28

Bảng 9: Ẩm nuôi cấy và khối lượng môi trường thu được 29

Bảng 10: Hoạt tính amylase riêng (đv/g) 31

Bảng 11: Hoạt tính amylase tổng (đv) 33

Bảng 12: Hoat tính glucoamylase riêng (đv/g) 35

Bảng 13: Hoạt tính glucoamylase tổng 37

Bảng 14: Hoạt tính amylase riêng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy 39

Bảng 15: Hoạt tính α- amylase riêng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy .39

Bảng 16: Hoạt tính amylase riêng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy 39

Bảng 17: Hoạt tính amylase riêng 40

Bảng 18: Hoạt tính amylase tổng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy 41

Bảng 19: Hoạt tính amylase tổng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy 42

Bảng 20: Hoạt tính amylase tổng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy 42

Bảng 21: Hoạt tính amylase tổng 43

Bảng 22: Hoạt tính glucoamylase riêng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy .44

Bảng 23: Hoạt tính glucoamylase riêng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy 45

Bảng 24: Hoạt tính glucoamylase riêng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy.45 Bảng 25: Hoạt tính glucoamylase riêng 46

Bảng 26: Hoạt tính glucoamylase tổng trung bình theo độ ẩm môi trường nuôi cấy .47

Bảng 27: Hoạt tính glucoamylase tổng trung bình theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy 48

Bảng 28: Hoạt tính glucoamylase tổng trung bình theo pH môi trường nuôi cấy 48 Bảng 29: Hoạt tính glucoamylase tổng 49

TÓM LƯỢC

Amylase là enzyme được sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm như rươu, bia, bánh mì, kẹo… Amylase được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó sản xuất từ vi sinh vật có nhiều thuận lợi và thu được hoạt tính khá cao

Tên đề tài thực hiện nghiên cứu nghiên cứu sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae

tiến hành nghiên cứu hoạt tính enzyme thu được với hai thí nghiệm,

- Thí nghiệm 1 khảo sát thành phần môi trường: 75% cám + 20% trấu + 5% bột, 75% cám + 15% trấu + 10% bột; bột bổ sung: bột bắp, bột gạo, bột năng

và thời gian nuôi cấy: 30 giờ, 40 giờ, 50 giờ, 55 giờ, tiến hành với 2 lần lặp lại

- Thí nghiệm 2 khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy gồm nhiệt độ nuôi cấy: 25oC, 30oC, 35oC; độ ẩm: 50%, 55%, 60%; pH: 4,5, 5, 5,5 tiến hành với 2 lần lại

Kết quả:

- Thí nghiệm 1: hoạt tính amylase thu được cao nhất trên môi trường nuôi cấy có thành phần 75% cám + 20% trấu + 5% bột với bột bổ sung là bột gạo trong thời gian nuôi cấy là 50 giờ

- Thí nghiệm 2: điều kiện môi trường nuôi cấy tốt nhất để có hoạt tính amylase cao nhất là môi trường có độ ẩm 55%, pH bằng 5 và nhiệt độ nuôi cấy là

30oC

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường

Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ

XX đến nay Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước Việt Nam là một trong những nước có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme Tuy nhiên, công nghệ enzyme của ta chưa thực sự phát triển Trong tương lai, đây sẽ là một trong những ngành công nghiệp được đầu tư phát triển rộng rãi bởi những ứng dụng và tính tiện lợi của nó trong nhiều lĩnh vực của sản xuất và đời sống

Sản xuất enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với động vật và thực vật

đó là:

- Tốc độ sinh sản vi sinh vật rất mạnh

- Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao

- Vi sinh vật là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công nghiệp

- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẽ tiền và dễ kiếm

- Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau

Cùng với những ứng dụng phổ biến và quan trọng của amylase thì việc tạo ra nguồn amylase là rất cần thiết Amylase tồn tại trong động vật, thực vật và vi sinh vật Ở động vật, amylase có trong tuyến nước bọt và tuyến tụy Ở thực vật, amylase thu nhận từ hạt nẩy mầm trong đó từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng để sản xuất bia Hiện tại, sản xuất amylase từ vi sinh vật là một phương

pháp phổ biến, dễ thực hiện Các chủng vi sinh vật thường sử dụng như Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus niger…

Với tiềm năng như vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase từ vi sinh vật, cụ thể là nghiên cứu trên đối tượng

vi nấm Aspergillus oryzae để thu amylase với số lượng nhiều, hoạt độ cao và giá

thành rẻ…phục vụ sản xuất

Amylase được ứng dụng khá rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Do đó, nghiên cứu sản xuất enzyme amylase, ta có thể cải tiến được nhiều qui trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm hoặc rút ngắn được thời gian sản xuất

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzea sản xuất amylase chịu ảnh hưởng

của nhiều yếu tố với những mức độ khác nhau Nội dung nghiên cứu trong đề tài này:

- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi đến quá trình sản xuất amylase

- Xác định thời điểm vi sinh vật sản sinh ra amylase nhiều nhất

- Khảo sát điều kiện môi trường (nhiệt độ, pH, độ ẩm) ảnh hưởng đến sự sản sinh ra enzyme amylase

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Amylase là một enzyme rất thông dụng Nó có cả trong thực vật, động vật và vi sinh vật Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột từ đại mạch nẩy mầm Các tác giả đã dùng rượu đề kết tủa

nó trong dịch chiết malt và thu được enzyme ở dạng bột, đồng thời đặt tên là diastase (xuất phát từ tiếng Hi Lạp có nghĩa là phân giải) Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase

Amylase thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharid với sự tham gia của nước Amylase thuỷ phân tinh bột, dextrin, glycogen thành glucose, maltose và dextrin Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau:

α- amylase, β- amylase, glucoamylase (γ- amylase), olgo-1,6- glucosidase trinase…)

(dex-2.1 Cấu trúc phân tử của amylase

2.1.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng

α- amylase (α- 1,4 glucan- 4- glucanhydrolase, EC 3.2.1.1)

Đặc tính:: α- amylase có nguồn gốc khác nhau có thành phần acid amin khác

nhau, mỗi loại α- amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, khá giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và acid aspartic Tâm hoạt động chứa các nhóm -COOH và -NH2

α- amylase là một metaloenzyme, trong phân tử đều chứa từ 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, song không ít hơn 1- 6 nguyên tử gam Ca/mol Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α- amylase mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 2, 3 của enzyme Ngoài duy trì cấu hình hoạt động của enzyme, Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α- amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân huỷ bởi các enzyme phân giải protein

α- amylase kém bền trong môi trường acid nhưng bền nhiệt hơn so với các loại enzyme khác Tất cả α- amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại nặng như Cu2+, Hg2+ α-amylase của động thực vật và vi sinh vật được hoạt hoá bởi các ion đơn hoá trị,

từ nguồn thực vật thì nó lại được hoạt hoá bởi ion hoá trị II

Cơ chế tác dụng: α- amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 glycoside ở bất

kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa Do đó, được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme)

Quá trình thủy phân này trãi qua nhiều giai đoạn:

- Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số cơ chất bị thuỷ phân nhanh tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh

- Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hoá) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thuỷ phân tiếp tục tạo ra các tetra-, trimaltose Các chất này bị thuỷ phân rất chậm bởi α- amylase cho tới disaccharide và monosacharide Dưới tác dụng của α- amylase, amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm 6- 7 gốc glucose Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩm các maltotetrose, maltotriose, maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thuỷ phân

của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose

Tác dụng của α- amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α– amylase không phân cắt được liên kết α-1,6 glucoside ở chổ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng cũng là 72% maltose, 19% glucose, các dextrin phân tử thấp và các izomaltose 8% Cơ chế tác

dụng của α- amylase lên tinh bột được trình bày ở Hình 1

Hình 1: Cơ chế tác dụng của α- amylase lên tinh bột

β- amylase (α- 1,4- glucan- maltohydrolase, EC 3.2.1.2)

Đặc tính : β- amylase là một albumin Tâm xúc tác của nó chứa các nhóm –SH và

nhóm –COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin β- amylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) có ái lực với các liên kết α-1,4 glucoside cách đầu không khử của mạch một liên kết α-1,4 glucoside

β- amylase hiện diện phổ biến trong thực vật, rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion Cu2+,Hg2+, urea, iođoacetamie, iodin, ozon pH tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β- amylase là 4,6 còn trong dung dịch nấu (không sôi)

là 5,6

β- amylase chịu nhiệt kém hơn α- amylase nhưng bền với acid hơn, bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC, nhiệt độ tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β- amylase là 40- 50oC, song trong dịch nấu là 60- 65oC

Cơ chế tác dụng : β- amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α-1,4 glucoside trong tinh bột, glycogen và polysaccharid phân cắt tuần tự từng gốc maltose từ đầu không khử

β- amylase phân cắt 100% amylose thành maltose và 54-58% amylopectin thành maltose

Quá trình thuỷ phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng Mỗi nhánh ngoài có từ 20-26 gốc glucose sẽ tạo thành được 10-13 phân tử maltose Khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β- amylase ngừng tác dụng còn lại là dextrin, α-dextrin cho màu tím

đỏ với iodine, độ nhớt của dung dịch giảm chậm

γ- amylase (α-1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3)

Đặc tính : là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thuỷ phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 glucoside lẫn α-1,6 glucoside

Enzyme này mang nhiều tên gọi khác nhau: glucoamylase, amyloglucosidase, taka- amylase Bac, γ- amylase, maltulase

Khi thuỷ phân, glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucoside trong polysaccharide, tách lần lượt từng gốc glucose một từ đầu không khử Ngoài thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside và α-1,6 glucoside, γ- amylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 glucoside và α-1,3 glucoside (Sawaskia 1960, Ueyama

và cộng sự,1965, Watanabe, Fukimbara 1965, 1966)

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, amylopectin, dextrin cuối, panose, isomaltose và maltose tới glucose (Azarova 1981; Jerebtxov, Pankratov,1977; Dobrolinxkaia, Rodzevit, 1974; Logina Karpukhina, 1978) Các

cơ chất có cấu tạo phân nhánh (amylopectin, glucogen, β-dextrin) bị glucoamylase tấn công với vận tốc khá lớn Cơ chế tác dụng của glucoamylase được trình bày

trong Hình 2

Amylose

Hình 2: Tác dụng của glucoamylase lên tinh bột

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5- 5,5 và nhiệt độ 50oC Nó bền với tác dụng của acid hơn các α- amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi ion Ca2+ Cơ chế tác dụng chung của amylase được mô tả trong Hình 3

Hình 3: Tác dụng của amylase lên tinh bột

Amylopectin

2.1.2 Hoạt lực của amylase

Khi sử dụng bất kỳ một chế phẩm enzyme nào cũng cần biết rõ hoạt lực xúc tác của nó Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn Các chế phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa nhiều loại enzyme amylase Vì vậy, hoạt lực tổng hợp của chúng phản ánh tác dụng của tất cả các amylase có trong chế phẩm Do tính đa dạng của enzyme, đặc trưng của cơ chất sử dụng, nên phương pháp xác định hoạt độ của enzyme cũng rất khác nhau Để xác định hoạt độ của các amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:

Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên

hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch giảm dần

Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod Khi có amylase thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod

Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên

cơ chất Hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau:

- Hoạt độ của enzyme α- amylase theo Rukhliadeva dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu quang phổ sẽ tính được hoạt độ của enzyme Đơn vị hoạt độ của α- amylase là lượng enzyme chuyển hóa được một gam tinh bột tan thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong một giờ

- Hoạt độ glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến glucose Muốn xác định được cần đo được lượng glucose tạo thành Glucose trong hỗn hợp các đường thường được xác định bằng các phương pháp đặc hiệu Đơn vị hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở 30oC và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương pháp Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và

pH tương tự làm giải phóng được 1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucooxydase)

- Hoạt độ đường hóa phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột đến các đường khử Đơn vị hoạt độ đường hóa là lượng chế phẩm enzyme trong 1 giờ ở 30oC và pH thích hợp làm phân giải được 1 gam tinh bột thành đường khử khi mức độ thủy phân cơ chất không vượt 30%

- Hoạt độ maltose đặc trưng cho khả năng thủy phân maltose tới glucose của chế phẩm enzyme Đơn vị hoạt độ maltose là lượng chế phẩm enzyme phân giải được 1 gam maltose tới glucose trong vòng 1 giờ ở 30oC, độ thủy phân maltose trong phản ứng này không vượt quá 30%

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của amylase

a Nồng độ cơ chất

Phản ứng khi có enzyme xảy ra ba giai đoạn:

Giai đoạn đầu enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng

ba giai đoạn khác biệt:

- Ở giai đoạn đầu, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ

thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

- Ở giai đoạn kết tiếp tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ

thuộc vào nồng độ cơ chất

- Ở giai đoạn tiếp theo, nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng theo Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thểcó tốc độ phản ứng cao hơn được (Hình 4)

Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzym

Trong Hình 5, ta thấy sự phụ thuộc tuyến tính của thời gian phản ứng vào nồng độ

cơ chất theo chiều hướng tăng nồng độ cơ chất sẽ kéo dài thời gian phản ứng thuỷ phân của amylase

Hình 5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase

b Nồng độ enzyme

Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng

Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa của gen Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với lượng

Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng

Thời gian phản ứng của amylase sẽ giảm nếu như nồng độ amylase tăng lên theo

Hình 7: Ảnh hưởng của nồng độ amylase đến thời gian phản ứng

Nhiệt độ ứng với vận tốc enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tuỳ thuộc vào nguồn gốc của chúng Sự phụ thuộc

của vận tốc phản ứng vào nhiệt độ được biểu diễn trên Hình 8

Đại lượng biểu thị cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme là

hệ số nhiệt Q10 Hệ số này càng lớn, phản ứng khó xảy ra ở nhiệt độ thường

Hệ số Q10 của phản ứng enzyme là 1- 2

Hệ số Q10 của phản ứng hóa học là 2- 3

Từ hệ số Q10 có thể tính được năng lượng hoạt hóa của phản ứng enzyme

Hình 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme

Hình 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng của amylase

Ở Hình 9, ta thấy nhiệt độ tăng cao thì thời gian phản ứng càng rút ngắn Tuy nhiên, ở một nhiệt độ giới hạn nào đó thì phản ứng sẽ chậm lại do sự biến tính dần protein của enzyme với nhiệt, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì enzyme không hoạt động nữa

d pH môi trường

Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH môi trường; mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích

Hình 10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme

pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính;

chỉ có một số ít có pH tối thích trong vùng acid hay kiềm mạnh (Hình 10)

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme

Do đó tốc độ của phản ứng enzyme sẽ tăng dần đến giá trị cực đại và sau đó sẽ giảm dần Đa số enzyme bền ở pH 5÷ 9 Độ bền của enzyme sẽ tăng nếu có mặt cơ chất và coenzyme hoặc Ca2+…

Đối với amylase, pH hoạt động tối thích nằm trong khoảng 5,8- 6,0 ở đây thời gian

thủy phân của nó thấp nhất (Hình 11)

Hình 11: Ảnh hưởng của pH đến thời gian phản ứng của enzyme

e Các chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất vật lý của chúng

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm một số chất như những ion kim loại Ca2+, Mg2+, …, các chất vô cơ, hữu cơ và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào

Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch Phản ứng enzyme [E] và chất kìm hãm [I] nhanh chóng đạt đến cân bằng:

K1

Như vậy phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau:

có cấu trúc phức tạp làm nhiệm vụ chuyển hydro, các chất có khả năng phá vỡ một

số liên kết trong phân tử tiền enzyme, các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme

2.2 Sản xuất amylase từ vi sinh vât

2.2.1 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật

Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình enzyme liên quan mật thiết với nhau Quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ của enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường Hai quá trình này không phải bao giờ cũng trùng khớp nhau về thời gian, nhất là trong phương pháp nuôi chìm

Ở một số vi sinh vật, quá trình tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là quá trình tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng sinh khối Trong trường hợp này, sinh tổng hợp amylase kết thúc ở pha logarit Cùng đồng thời với sự ngừng sinh trưởng và bắt đầu pha ổn định tiếp sau khi nuôi

Bac subtilis, Bac slearother mophillus

Tuy nhiên, theo nhiều tác giả, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng Trong trường hợp này sinh trưởng của vi sinh vật hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực

tự phân tế bào là quá trình độc lập do điều kiện sinh trưởng

Nồng độ tinh bột và nguồn carbon khác nhau cũng có ảnh hưởng đến sự tao thành

các enzyme riêng biệt của hệ enzyme amylase khi nuôi chủng Asp.oryzae Ảnh

hưởng này được trình bày trong Bảng 1

Bảng 1: Ảnh hưởng của cơ chất đến sinh tổng hợp các amylase bởi nấm mốc Asp oryzae

Hoạt độ của enzyme amylase,

glucosidase Nuôi Asp oryzae trong môi trường có chứa bột ngô cũng tạo nhiều

amylase ngoại bào (Bảng 2)

Bảng 2: Ảnh hưởng của bột ngô tới sinh tổng hợp amylase chủng Asp.oryzea

Hàm lượng bột

ngô trong môi

trường (%)

Hoạt độ amylase đv/100ml

pH môi

trường (%)

Hoạt độ amylase đv/100ml

pH môi trường

(Nguy ễn Đức Lượng và ctv, 2004)

2.2.2 Các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp amylase

a Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng

Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào vi sinh vật Trong môi trường lên men nitơ thường được bổ sung dưới dạng muối nitrat, các hợp chất amon hoặc một số chất có nguồn gốc vi sinh vật Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường bị acid hoá, quá trình dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và

ức chế tổng hợp α- amylase Fenikxova và cộng tác viên đã tiến hành thí nghiệm với NH4H2PO4 và thấy rằng sinh tổng hợp α- amylase giảm đi 10 lần mà sự tạo

thành glucoseamylase hầu như không bị ảnh hưởng Kết quả thể hiện ở Bảng 3

Bảng 3: Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các amylase

Hoạt độenzyme sau 6 ngày nuôi đv/100ml

ưu của carbon và nitơ (C:N) cho sự sinh tổng hợp amylase là 10:1÷ 40:1 Nói cách khác hàm lượng C trong môi trường phải 10- 40 lần hơn hàm lượng nitơ

b Ảnh hưởng của acid amin

Acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme Acid amin có ảnh hưởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase do các nguyên nhân sau:

Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ, và là nguồn năng lượng Nhiều vi sinh vật có thể đồng hoá trực tiếp acid amin (Kônvalov, 1967)

Một số acid amin riêng lẽ (acid glutamic, acid aspatic…) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi acid amin cụ thể là sinh tổng hợp nhiều acid amin khác trong quá trình chuyển amine hóa (Araiet và ctv, 1968)

Nhiều acid amin tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như acid pantotenic, biotin, acid folic,… các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn Ngoài

ra có những nhân xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật

phụ thuộc vào sự có mặt của acid amin trong môi trường nuôi

Acid amin có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme Một số acid amin kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các amylase, một số thì ức chế quá trình này, một số thì không có ảnh hưởng gì cả Chẳng hạn, sự tổng

hợp α- amylase khi nuôi chủng Asp awamori 78-2 được kích thích bởi hai acid

amin là acid glutamic và tyrosine Sự tổng hợp glucoamylase được tăng cường bằng 4 acid amin: acid glutamic, tyrosine, acid aspatic và β- alanine

c Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng

Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật

Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi Khi đó sự tổng hợp α- amylase bị ức chế hoàn toàn, còn lượng glucoamylase giảm xuống hàng chục lần (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu của muối này cho sinh tổng hợp α- amylase và glucoamylase là 0,05%, thiếu muối này không ảnh hưởng đến sự tạo thành oligo-1,6- glucosidase (Silov, 1967)

Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic acid phospholipide) và nhiều coenzyme (adenosine-phoshat, thiamine), đồng thời để phosphoril hóa glucid trong quá trình oxy hoá sinh học Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác, do vậy mà tăng cường tổng hợp các enzyme amylase

Các muối phosphate thường được dùng với nồng độ cao tới 0,15M Hoạt độ α- amylase và oligo-1,6- glucosidase tăng khi có 0,1% KH2PO4, còn hoạt độ glucoamylase tăng cực đại khi có 0,2% muối này

Calcium cần cho sự tổng hợp và ổn định α- amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzyme này Nó còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease (Hsiu, 1964) Muốn tích lũy nhiều α- amylase cần có lượng Ca trong môi trường là 0,01- 0,05%

Lưu huỳnh kích thích tạo amylase (S có trong thành phần các acid amin quan trọng như methionine, cystein, cystine) Lưu huỳnh với hàm lượng 0,07g/ml môi trường

là thích hợp nhất cho Asp oryzae 3-9-15 tạo amylase (300-350 đv/100ml) Giảm

hàm lượng lưu huỳnh tới 0,004% thì hoạt lực amylase giảm xuống hai lần

Ngoài Ca2+, trong phân tử α- amylase của Bac subtilis còn có chứa ion Zn2+ Zn2+

có mặt trong enzyme của α- amylase của Bac subtilis

Coban có tác dụng kích thích tổng hợp amylase Trong tế bào có khoảng 50 tỷ protein, song chỉ có một số nguyên tử coban, trong tế bào có thể giảm tới một nguyên tử coban, nhưng tế bào vẫn còn sống, còn nếu tế bào không có coban thì tế bào sẽ chết (Purmal, 1963)

Magan, đồng, thuỷ ngân kìm hãm sinh tổng hợp ở vi sinh vật pH môi trường

e Ảnh hưởng của pH nguyên liệu

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi Tuy nhiên pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ

tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo enzyme (Bảng 4)

Bảng 4: Ảnh hưởng của pH cám đến sinh tổng hợp amylase

phẩm đv/g Môi trường

Các chất làm

ẩm cám mì tới

độ ẩm 60%

Trước thanh trùng

Sau thanh trùng

Mốc thành phẩm

6,1 6,7 6,8 6,1 6,0

6,4 6,7 6,8 6,1 6,0

25,0 27,3 24,7 10,4 8,7

Đối với Asp Awamori pH ban đầu là 6,3 thì nấm mốc tạo α- amylase cực lớn Nếu

pH ban đầu là 3 thì nấm sợi sẽ tạo nhiều oligo-1,6- glucosidase và α- 1,4-

amyloglucosidase, còn pH là 7,4 thì sinh tổng hợp cả Bac sublilis enzyme đều

giảm (Grigorev, 1968) Đối với vi khuẩn pH tốt nhất để tạo enzyme là 6,6- 7,4

f Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58- 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong quá trình nuôi Độ ẩm mà tăng quá 55- 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50- 55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tao amylase Sự thay đổi độ ẩm của môi

trường nuôi cấy đến hoạt độ của amylase thể hiện trong Bảng 5

Bảng 5 Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase của Asp

(*): đv/g canh trường khô (Nguy ễn Đức Lượng và ctv, 2004)

2.3 Kỹ thuật sản xuất amylase từ vi sinh vật

Amylase vi sinh vật được sản xuất dưới nhiều dạng khác nhau như dạng thô, dạng tinh khiết cao, dạng tinh thể Tuy nhiên, chúng đều được sản xuất bằng hai phương pháp nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu Amylase có thể sản xuất từ nhiều nguồn

nấm mốc và vi khuẩn Trong đó Asp oryzae là chủng nấm mốc được sử dụng phổ

biến để sản xuất amylase

Asp oryzae thuộc lớp nang khuẩn Ascomycetes, bộ cúc khuẩn Plectascales, họ Aspergillaceae, giống Aspergillus Là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo

thân quả hoặc cuống bào tử đính Bào tử đính là tập hợp của những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế bào lớn Các nang quả phình to ở nang trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục hoặc hình chuỳ được gọi là túi định Tử túi định có vô vàn những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối của các

mầm này gọi là các bào tử đính Aspergillus oryzae có bào tử đính màu vàng hoa

cau

2.3.1 Sơ đồ kỹ thuật sản xuất chế phẩm amylase từ Aspergillus oryzae

Etanol

2.3.2 Thuyết minh quy trình

Từ môi trường nuôi cấy bề mặt, chủng nấm mốc Asp oryzae được nuôi cấy trên

môi trường cám mì, cám gạo đã được tiệt trùng, sau đó enzyme trích ly bằng nước

và lọc, dùng ethanol để kết tủa amylase, tiếp tục ly tâm và sấy kết tủa thu được chế phẩm và có thể nghiền nhỏ đem sử dụng dần

Thành phần môi trường nuôi cấy

Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo amylase bằng phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo Cám mì và cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các

chất khác Thành phần của cám mì và cám gạo được trình bày ở Bảng 6

Bảng 6: Thành phần của cám mì và cám gạo

Hàm lượng (%) Thành phần

1

6 0,3 3- 4 10,3

0,09

1 0,16 0,94

20 10- 14

10- 15 8- 10

37- 59

Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng đến hoạt lực của amylase, nên dùng cám tốt, mới, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, cấu tử được đưa vào có thể là chất làm xốp môi trường hoặc làm giàu thêm các chất sinh trưởng mà cám không có đủ, thường là mầm mạch (15- 20%), trấu (2- 25%), mùn cưa (5- 10%) Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử vi sinh vật khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường

sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai Nuôi cấy Asp oryzae bằng phương pháp

bề mặt trên môi trường cám gạo… có bổ sung thêm một số dinh dưỡng đặc trưng khác như N, P, Ca, Mg…

Nhiệt độ nuôi

Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm ba thời kỳ: Thời kỳ trương và nẩy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10- 11giờ đầu, đối với vi khuẩn 3- 4 giờ) Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí trong phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng không thấp hơn 23- 30 oC Độ ẩm tương đối của không khí là 96- 100 %

Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4- 18 giờ) Ở giai đoạn này nấm mốc phát triển rất mạnh tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn Kết quả là trong sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37- 40oC, đôi khi cao hơn đến 47oC

Vì vậy, phải hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho nấm mọc đều và đẹp

Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10- 20 giờ) Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh Các enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) Trong một

ngày đầu ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất và thứ hai, Asp oryzae chỉ tạo được có

7,5- 8%, trong 12 giờ sau, hoạt lực của α- amylase tăng 9- 12 lần, hoạt lực đường hóa tăng hai lần và hoạt lực của oligo-1,6-glucosidase tăng lên 10 lần Nhiệt độ tối thích cho nấm mốc sinh trưởng là 28- 30oC

Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn: tùy thuộc vào tính chất sinh lý của

từng chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất cứ lúc nào thấy cần thiết Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì làm giảm hoạt lực của enzyme Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi có thể tích lũy amylase cực đối với các chủng nấm mốc như sau:

Bảng 7: Thời gian nuôi cấy thích hợp của Asp oryzae

Chiết tách enzyme người ta dùng nước (25- 28oC) và lọc, sau đó tủa enzyme bằng ethanol Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme làm giảm khả năng tan của nước bao quanh enzyme Dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường, đẩy một lượng nước lớn Vì vậy các enzyme, cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước dung môi sẽ tủa và lắng xuống Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ pH, lực hút ion của dung dịch và tính chất enzyme của protein Để tránh mất hoạt tính của enzyme, tất cả phải làm lạnh xuống 3- 5oC Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa lắng xuống phải ly tâm ngay Dùng ethanol kết tủa có nồng độ 60- 70% hoặc có thể dùng aceton 60% và giữ pH 5,5- 5,6 bằng (NH4)2SO4 (600g/lít)

Ly tâm

Là quá trình tách vật rắn ra khỏi dung dịch Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận enzyme, dung dịch này chứa enzyme ngoại bào Phần lớn enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan Như vậy, khi tiến hành ly tâm, dung dịch tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô vì ngoài enzyme trong dung dịch còn có nước,

protein không hoạt động và các chất hòa tan khác Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh (3- 5oC)

Sấy kết tủa

Dịch enzyme sau khi ly tâm, ở trạng thái này enzyme rất dễ biến tính vì còn nhiều nước Để dễ bảo quản, ta tiến hành sấy kết tủa enzyme ở nhiệt độ < 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5- 8%

Nghiền và bảo quản

Sau khi sấy, enzyme được nghiền mịn thành dạng bột cho vào bao bì kín, bảo quản

2.4.2 Sản xuất bia

Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng amylase có trong mầm đại mạch để thuỷ phân tinh bột Nguyên liệu chính là đại mạch nẩy mầm loại tốt Khác với rượu ở đây mức độ đường hoá trong nguyên liệu thấp hơn Cần có dextrin chưa đường hoá làm cho bia có hương vị Việc chuyển hoá tinh bột và các nước chiết của nguyên liệu này do amylase đảm nhiệm Do đó trong quá trình dịch hoá và đường hoá thì enzyme có ý nghĩa và vai trò quan trọng bậc nhất Việc bổ sung amylase vào trong quá trình sản xuất bia để làm tăng hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn Do đó, việc sử dụng amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: Giảm tổn thất tinh bột và các chất hoà tan khi cho hạt nẩy mầm, làm tăng hiệu suất

chất hoà tan lên 0,6 % (tức là tiết kiệm được 0,9 % đại mạch)

Giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như gạo, bắp những nguyên liệu này không nẩy mầm

Giảm chi phí lao động cho sản xuất malt

Tất cả các yếu tố trên làm cho giá bia giảm xuống

tham gia thuỷ phân tinh bột để tạo thành đường Nhờ đó nấm men Saccharomyces cerevisase sẽ dể dàng chuyển hoá chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể tích bánh tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh Việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong sản xuất bánh mì ngọt

2.4.4 Sản xuất bánh kẹo

Sử dụng amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy Các enzyme này hoạt động làm tăng đường khử và acid amin Đường khử và các acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hoá- khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn

2.4.5 Sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường

Công nghệ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển mạnh trên thế giới nhất là Châu Âu và Châu Mỹ Theo phương phát này, phôi bắp sẽ được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme

sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hoà tan vào nước

Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α- amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hoá, các enzyme này giúp quá trình đường hoá được dễ dàng Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu:

Bao gồm cám, trấu, bột gạo, bột bắp, bột năng

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Nấm sợi Aspergillus oryzae lấy từ viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh

học trường ĐH Cần Thơ

3.3 Dụng cụ, hóa chất

- Các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật, khay

- Máy hút chân không, máy xay khô

- Tủ ấm

- Máy đo pH, đo độ ẩm

- Máy đo mật độ quang

- Một số dụng cụ và thiết bị khác

Địa điểm tiến hành thí nghiệm: phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ

Hình 12: Máy đông khô Hình 13: Máy phân tích ẩm

Hinh 14: Thiết bị đo mật độ quang Hình 15: Máy đo pH

Hình 16: Tủ úm

Hóa chất: dung dịch tinh bột, amoni sulfat, dung dịch đệm acetate, thuốc thử Fehling I, II, dung dịch iod, dung dịch Na2S2O3, acid sulfuric 25%, dung dịch KI 30%, acid HCl 0,1N

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự sinh tổng hợp enzyme amylase

của nấm Asp oryzae trên môi trường theo phương pháp nuôi cấy bề mặt với thành

phần môi trường gồm cám, trấu và bột gạo, tinh bột, bột bắp Và khảo sát hoạt tính của α- amylase theo Rukhliadeva, glucoamylase theo phương pháp vi lượng của V.Y Rodzevich, O.P Korenbiakina

Nuôi cấy vi sinh vật

Thu nhận môi trường sau nuôi cấy

Nghiền mịn

Amylase thô Nguyên liệu môi trường

Sấy lạnh

- Mục đích: xác định thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp để sản xuất amylase có hoạt tính và sản lượng cao nhất

- Nguyên liệu: cám, trấu, bột gạo, tinh bột, bột bắp

- Tiến hành thí nghiệm

+ Chuẩn bị mỗi mẫu 50g, hấp thanh trùng và chuẩn pH, ẩm độ

+ Nhân tố A: thành phần trường nuôi

Bảng 8: Khối lượng môi trường và ẩm nuôi cấy

( Ẩm nc: ẩm nuôi cấy, KLMT snc: khối lượng môi trường sau nuôi cấy)

Ẩm nuôi cấy tương ứng với khối lượng môi trường sau nuôi cấy thu được thể hiện

ở Bảng 8

Kết quả tối ưu được chọn làm cơ sở cho thí nghiệm sau

b) Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự tạo thành amylase

- Mục đích: xác định điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển và

tạo thành amylase của Asp oryzae

- Tiến hành thí nghiệm:

+ Chuẩn bị mỗi mẫu 100g, hấp thanh trùng

+ Nhân tố D: nhiệt độ nuôi

+ Nhân tố F: độ ẩm của môi trường

trường F (Bảng 9) Thu enzyme và khảo sát hoạt độ

+ Chỉ tiêu theo dõi: hoạt tính amylase thu được

Bảng 9: Ẩm nuôi cấy và khối lượng môi trường thu được

Nhiệt độ 35oC Nhiệt độ 30oC Nhiệt độ 25oC

pH Ẩm nc

(%)

KLMT snc (g)

Ẩm nc (%) KLMT snc

(g)

Ẩm nc (%)

KLMT snc (g)

CHƯƠNG IV

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

Quá trình tạo enzyme của nấm mốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố, mỗi yếu tố có những ảnh hưởng riêng đối với lượng cũng như hoạt tính enzyme tạo thành Các yếu tố bao gồm thời gian, thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH, độ ẩm,…Nấm mốc được cấy vào môi trường nuôi đã được thanh trùng, sau thời gian nuôi cấy, thu môi trường và thử hoạt tính amylase tạo thành Kết quả khảo sát các yếu tố này thể hiện như sau:

4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khác nhau và thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành amylase

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách nuôi cấy nấm mốc trên môi trường khác nhau sau đó thu sản phẩm và thử hoạt tính

Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi, các loại bột bổ sung và thời gian nuôi cấy được thể hiện ở các bảng 10, 11, 12, và 13

Hoạt tính amylase riêng

Ở Bảng 10, hai kiểu môi trường nuôi cấy A1 và A2 thu được enzyme có hoạt tính

amylase riêng trung bình tương đương khác biệt không có ý nghĩa thống kê Và từ

Hình 18, ta thấy trên kiểu môi trường nuôi cấy A1 và A2 hoạt tính enzyme tăng

dần khi thời gian nuôi cấy tăng từ 30 đến 50 giờ và giảm dần đến 55 giờ Môi trường bổ sung bột bắp và bột gạo cho hoạt tính cao nhất ở 50 giờ, trong khi bột năng cho hoạt tính cao nhất ở 40 giờ Như vậy, 50 giờ là thời điểm nấm môc sinh enzyme cho hoạt tính cao nhất

Hoạt tính amylase riêng cao nhất thu được trên kiểu môi trường A1, bổ sung bột gạo với thời gian nuôi cấy 50 giờ (87,1677 đv/g) khác biệt ở mức ý nghĩa 5% so với các nghiệm thức khác Trong khi đó, bột năng bổ sung vào kiểu môi trường A2 nuôi cấy ở 30 giờ có hoạt tính enzyme thấp nhất (39,3395 đv/g) Các nghiệm thức

còn lại làm thành những nhóm khác biệt ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 10 và Hình 18)

Bảng 10: Hoạt tính amylase riêng (đv/g)

30_A1 30_A2 40_A1 40_A2 50_A1 50_A2 55_A1 55_A2

Thời gian nuôi cấy (giờ) và kiểu môi trường

Hình 18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính amylase riêng

Tương tự, hoạt tính amylase tổng (bằng tích của hoạt tính α- amylase riêng nhân với khối lượng môi trường thu được sau nuôi cấy) được tính toán và thể hiện ở

Bảng 11 và Hình 19

So sánh hai giá trị hoạt tính tổng trung bình cao nhất nuôi cấy trên hai kiểu môi trường A1 và A2 trong cùng thời gian nuôi cấy là 50 giờ, kiểu môi trường A1 sau nuôi cấy cho hoạt tính tổng cao hơn với sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%

Hoạt tính enzyme tăng nhanh theo thời gian đầu từ 30 đến 50 giờ nuôi cấy và đạt giá trị cực đại ở giờ thứ 50 trên môi trường A1 là giá trị hoạt tính cao nhất, sau đó giảm dần đến 55 giờ Môi trường hoạt tính tổng cao nhất ở giờ thứ 40 trên môi trường A1 rồi giảm nhanh