Đa dạng di truyền và thụ phấn chéo loài dầu song nàng (dipterocarpus dyeri pierre) ở khu bảo tồn thiên nhiên văn hóa đồng nai, tỉnh đồng nai

Phạm vi nghiêncứu của đề tài này chúng tôi tập trung đánh giá mức độ đa dạng di truyền và thụphấn chéo trong quần thể Dầu Song nàng ở rừng nhiệt đới núi thấp Mã Đà VĩnhCửu, Đồng Nai trên

Nguyễn Văn Nhị

“Đa dạng di truyền và thụ phấn chéo loài Dầu Song

nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) ở Khu Bảo tồn

Thiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai, tỉnh Đồng Nai”

Luận văn thạc sĩ: Sinh học thực nghiệm

Hà Nội, 11/2018

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Đặt vấn đề 1

Mục tiêu, nội dung, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về họ Dầu và loài Dầu Song nàng 4

1.1.1 Tổng quan về họ Dầu (Dipterocarpaceae) 4

1.1.2 Loài Dầu Song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) 7

1.1.3 Đa dạng di truyền và thụ phấn chéo trong quần thể và loài 9

1.1.4 Quản lý và bảo tồn 12

1.2 Tổng quan về ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử 13

1.2.1 Quần thể và tính đa dạng di truyền của quần thể 13

1.2.2 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường được dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật 15

1.2.3 Kỹ thuật RAPD 16

1.2.4 Kỹ thuật RFLP 17

1.2.5 Kỹ thuật AFLP 17

1.2.6 Kỹ thuật SSR 17

1.2.7 Kỹ thuật ISSR 19

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

1.4 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 21

CHƯƠNG II ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Địa điểm nghiên cứu 23

2.2 Vật liệu nghiên cứu 23

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu DNA 23

2.2.2 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu di truyền loài Dầu Song nàng 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 25

2.3.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 26

2.3.3 Phương pháp điện di 28

2.3.3.1 Điện di trên gel agarose 28

2.3.3.2 Điện di gel Polyacrylamide 28

2.4 Phân tích số liệu 29

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 31

3.2 Đánh giá hiệu quả chỉ thị SSR 31

3.3 Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Dầu Song nàng 34

3.3.1 Tần số allele trong quần thể cây trưởng thành và cây con 34

3.3.2 Đa dạng di truyền loài Dầu Song nàng 37

3.3.3 Phân tích AMOVA 43

3.4 Kết quả phân tích thụ phấn chéo ở cây trội và quần thể 44

3.5 Một số giải pháp bảo tồn loài Dầu Song nàng 46

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

Tài liệu tiếng Việt 53

Tài liệu tiếng Anh 56

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Ảnh cây và quả Dầu Song nàng 7Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số từ vỏ cây một số mẫu Dầu Song nàng 31Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đa hình với cặp mồi Dipt02 (A) và

Dipt08 (B) MK: marker 50 bp; SN1, 2, ,14:mẫu 32

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide các cặp mồi SSR dùng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.2 Công thức pha đệm rửa (washing buffer) 10 ml 25

Bảng 2.3 Công thức pha đệm tách chiết (CTAB) 10 ml 26

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 2.5 Chu kỳ phản ứng PCR 27

Bảng 3.1 Số allele và các giá trị PIC, PD, Rp, MI cho 8 locus đa hình 33

Bảng 3.2 Tần số allele cho mỗi locus của cây trưởng thành và cây con 35

Bảng 3.3 Đa dạng di truyền loài Dầu Song nàng 39

Bảng 3.4 Đa dạng di truyền của một số loài thuộc chi Dầu ở Việt Nam 42

Bảng 3.5 Phân tích AMOVA của loài Dầu Song nàng 43

Bảng 3.6 Thông số sinh sản của Dầu Song nàng 44

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Nội dung, chi tiết

1 AMOVA Variance components in the analysis of molecular

variance

2 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

3 ISSR Interal simple sequence repeat

5 PCR Polymerase Chain Reaction

6 PD Discrimination power

7 PIC Polymorphic Information Content

8 RAPD Random Amplified Polymorphism DNA

9 RFLP Restriction fragment length Polymorphism

10 RP Resolving power

11 SSR Simple sequence repeat

12 FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

họ Dầu còn đem lại nhiều loại sản phẩm có giá trị khác phục vụ đời sống con người

như nhựa chai (Shorea guiso), nhựa cứng (Neobalanocarpus sp., Hopea sp.), nhựa

mủ (Dipterocarpus costatus), mỡ bơ (Shorea robusta), camphor (Dryobalanops

aromatica), tannin (Dipterocarpus tuberculatus, Hopea odorata) Cronquist (1981)

[35] phân chia họ Dầu (Dipterocarpaceae) thành 3 phân họ gồm Dipterocarpoideae,Pakaraimoideae và Monotoideae Việt Nam có trên 40 loài cây họ Dầu thuộc 6 chi

(Anisoptera, Hopea, Parashorea, Vatica, Dipterocarpus, Shorea), hầu hết là loài

bản địa và đặc hữu [12] Do giá trị thương mại và nhu cầu của người dân địaphương, các loài cây họ Dầu bị khai thác quá mức Số lượng cây cho mỗi loàikhông nhiều Nơi sống của chúng bị thu hẹp và suy giảm Trong những năm 1980

và 1990, do khai thác quá nhanh bởi người dân địa phương và các doanh nghiệplâm nghiệp, cùng với nơi sống của loài Dầu bị thu hẹp và phân cắt Do đó, việcđánh giá mức độ đa dạng di truyền và môi trường sống của các loài Dầu được xemxét như là công việc ưu tiên trong hoạt động bảo tồn

Dầu Song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) phân bố khá rộng ở rừng nhiệt

đới Đông Nam Bộ và Tây Nguyên, bao gồm Khu bảo tồn Thiên nhiên - Văn hóaĐồng Nai, rừng phòng hộ Tân Phú, Vườn Quốc gia Cát Tiên (Đồng Nai), VườnQuốc gia Bù Gia Mập (Bình Phước), Lò Gò – Xa Mát (Tây Ninh), khu Bảo tồnThiên nhiên Bình Châu - Phước Bửu (Bà Rịa - Vũng Tàu) và một số tỉnh khác ở

Tây Nguyên và đảo Phú Quốc (Kiên Giang) Loài này nằm trong Sách Đỏ Thế giới[59] và Việt Nam [3] cần phải được bảo vệ: CR A1 cd, B1 + 2C Phạm vi nghiêncứu của đề tài này chúng tôi tập trung đánh giá mức độ đa dạng di truyền và thụphấn chéo trong quần thể Dầu Song nàng ở rừng nhiệt đới núi thấp Mã Đà (VĩnhCửu, Đồng Nai) trên cơ sở phân tích 8 cặp mồi chỉ thị Microsatellite để khám phábản chất di truyền và hạt giống tốt đáp ứng được yêu cầu chất lượng cây giốngphục vụ công tác bảo tồn và phát triển bền vững.

Mục tiêu, nội dung, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Mục tiêu của đề tài:

+ Xác định được đa dạng di truyền và thụ phấn chéo loài Dầu Song nàng

(Dipterocarpus dyeri Pierre) ở Khu bảo tồn Thiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai, tỉnh

- Nội dung nghiên cứu

+ Phân tích đa dạng di truyền loài Dầu Song nàng trên cơ sở phân tích 8 cặpmồi Microsatellite

+ Xác định các thông số thụ phấn chéo loài Dầu Song nàng ở Khu bảo tồnThiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai

+ Đề xuất một số phương án bảo tồn loài cây họ Dầu và loài Dầu Song nàng

- Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

Khoa học: Kết quả nghiên cứu là dẫn liệu khoa học di truyền loài và tuyển

chọn cây trội đáp ứng được chất lượng cây giống phục vụ công tác bảo tồn và phụchồi loài

Kinh tế - xã hội: Các cây trội sẽ được tuyển chọn có nhiều đặc tính đáp ứng

cho công việc phục hồi loài Các cây giống từ các cây trội được tuyển chọn đáp ứngyêu cầu như cây khỏe, phát triển nhanh, sức đề kháng tốt với dịch bệnh và có khảnăng thích nghi với biến đổi của môi trường, giảm chi phí nhân giống

Cơ chế chính sách: Các nhà quản lý có cách nhìn khoa học hơn và từ đó

đưa ra các giải pháp phục hồi hữu hiệu loài đang bị đe dọa trên phạm vi toàn quốc

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về họ Dầu và loài Dầu Song nàng

1.1.1 Tổng quan về họ Dầu (Dipterocarpaceae)

Họ Dầu một số tài liệu tiếng Việt gọi là Họ Hai cánh có danh pháp khoa học

là Dipterocarpaceae, thuộc Bộ Bông Malvales được cho là có lịch sử tiến hóakhoảng 70 triệu năm, từ cuối Đại Trung sinh hoặc đầu Kỷ Đệ tam và hình thànhgiới hạn phân bố ổn định vào cuối Kỷ Đệ tam

Họ Dầu có khoảng 17 chi và khoảng 580 - 680 loài cây thân gỗ chủ yếu ởcác rừng mưa nhiệt đới vùng đất thấp với quả có hai cánh Các chi lớn nhất là

Shorea (196-360 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatica (60-65

loài) [3] Nhiều loài là các loại cây nổi bật trong các cánh rừng, thông thường cóthể cao tới 40 - 70 m và có đường kính 2 - 3 m

Họ này nói chung được chia thành ba phân họ:

- Monotoideae: 3 chi, 30 loài

+ Marquesia có nguồn gốc ở châu Phi

+ Monotes có 26 loài, phân bố rộng khắp ở châu Phi đại lục và đảoMadagascar

+ Pseudomonotes có 1 loài (Pseudomonotes tropenbosii), nguồn gốc ở vùng

Amazon thuộc Colombia

- Pakaraimoideae: Chứa một loài duy nhất là Pakaraimaea roraimae, được

tìm thấy ở vùng cao nguyên Guiana ở Nam Mỹ

- Dipterocarpoideae: Phân họ lớn nhất, chứa 13 chi và 470 - 650 loài Khuvực phân bố bao gồm Seychelles, Sri Lanka, Ấn Độ, Đông Nam Á, New Guinea,nhưng chủ yếu ở miền tây Malesia Tại đây chúng tạo thành quần thể thống lĩnh

trong các cánh rừng vùng đất thấp Phân họ Dipterocarpoideae có thể chia thành hainhóm [27], [55]:

+ Nhóm Valvate - Dipterocarpi (Anisoptera, Cotylelobium, Dipterocarpus,

Stemonoporus, Upuna, Vateria, Vateriopsis, Vatica) Các chi trong nhóm này có

các lá đài hoa có nắp (mở bằng mảnh vỏ) trong quả, các mạch đơn độc, các ốngnhựa phân tán

+ Nhóm Imbricate - Shoreae (Balanocarpus, Hopea, Parashorea, Shorea).

Các chi trong nhóm này có các lá đài hoa lợp (gối lên nhau) trong quả, các mạchnhóm lại, các ống nhựa trong các dải

Theo Danh lục các loài thực vật ở Việt Nam [1] Họ Dầu ở Việt Nam(Dipterocarpaceae) gồm 6 chi, 42 loài và 3 phân loài Trong đó chi Vên vên

(Anisoptera) có 2 loài: chi Dầu (Dipterocarpus) có 11 loài và 2 phân loài; chi Sao (Hopea) có 11 loài; chi Chò chỉ (Parashorea) có 2 loài; chi Sến mủ (Shorea) có 8 loài; chi Táu (Vatica) có 8 loài và 1 phân loài.

Theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005) Việt Nam có hơn 40 loài và 1 phân loài

thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) Trong đó: chi Vên vên (Anisoptera) có 1 loài; chi Dầu (Dipterocarpus) có 12 loài và bổ sung loài Dầu cát (D condorensis) so với Danh lục thực vật Việt Nam Chi Sao (Hopea) có 11 loài trong đó không nhắc đến loài Sao xanh (H helferi) như trong Danh lục thực vật Việt Nam và bổ sung thêm một loài chưa định danh chính xác là Sao đá (Hopea sp); chi Chò chỉ (Parashorea)

có 2 loài: chi Sến mủ (Shorea) có 8 loài và chi Táu (Vatica) có 8 loài với 1 phân loài Theo tác giả các loài Sao đá (Hopea sp), Dầu cát (D condorensis) được ghi nhận thực sự tồn tại ở Việt Nam trong khi các loài khác là Sao xanh (H helferi), Kiền kiền nhẵn (A scaphula) không chắc chắn tồn tại ở Việt Nam [12].

Về tình trạng bảo tồn hiện tại có 23 loài được ghi nhận mức bị đe dọa theoIUCN (2001) trong đó 2 loài rất nguy cấp (CR) có 3 loài nguy cấp (EN) và 18 loài

sẽ nguy cấp (VU) Theo Sách đỏ Việt Nam (2007) có 11 loài được xếp hạng đe

dọa Trong đó có 1 loài rất nguy cấp (CR), 5 loài nguy cấp (EN) và 5 loài sẽ nguycấp (VU) [2].

Về phân bố các loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố trong các sinh cảnhrừng khô cây họ dầu, rừng mưa mùa thường xanh, nửa rụng lá hoặc rừng kín mưamùa thường xanh ẩm

Cây họ Dầu có nhiều giá trị kinh tế Là nguồn cung cấp gỗ quan trọng củavùng Đông Nam Á cho tiêu thụ nội địa và xuất khẩu Gỗ các loài cây họ Dầu được

sử dụng vào các công trình xây dựng như làm dầm, xà nhà, khung cửa, cầu thang,sàn nhà … gỗ được xử lý có thể còn được dùng làm cầu tàu, tà vẹt đường sắt… Cây

họ Dầu còn cho các sản phẩm ngoài gỗ như: nhựa, camphor, mỡ bơ, tanin, tinh dầu.Nhựa chiết xuất từ các loài cây họ Dầu được dùng vào công nghiệp sản xuất sơn,vécni, sơn mài

1.1.2 Loài Dầu Song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre)

Dầu Song nàng có tên khoa học là Dipterocarpus dyeri Pierre, thuộc chi Dầu

(Dipterocarpus)

Hình 1.1 Ảnh cây và quả Dầu Song nàng

Dầu Song nàng là loài cây gỗ lớn, cao 30 – 40 m, đường kính đạt trên 150

cm, thân thẳng, tròn đều, dáng thân đẹp Là một trong những loài cây gỗ có kíchthước lớn nhất của rừng tự nhiên nước ta Tán lá hình nón, phân cành cao Vỏ ngoài

xù xì, bong thành những mảnh nhỏ

Lá đơn mọc cách, phiến lá hình bầu dục thuôn, lá có kích thước to, dài 16 –

25 cm (có khi tới 50 cm) đỉnh nhọn, gốc tù hay hình tim, đầu có mũi dài đến 1 cm

Ở cây non lá có lông, nhất là trên các gân mặt dưới Mặt trên lá cây trưởng thànhhoàn toàn nhẵn; gân bên 18 - 31 đôi, nổi rõ ở mặt dưới Lá kèm dài 15 – 20 cm,rộng 2 – 4 cm, có màu đỏ nhạt ở trong, có lông ở ngoài

Cụm hoa chùm đơn mọc ở nách lá, có lông, dài 10 – 18 cm, mang 6 - 8 hoakhông cuống, nhị 30 Quả hình nón, thuôn, dài 4 cm, rộng 2,8 cm với 5 cạnh nổi rõ.Hai cánh lớn dài 20 – 23 cm, rộng 3 – 4 cm Quả chín vào cuối tháng 3 đầu tháng 4

Dầu Song nàng có phân bố ở Việt Nam, Lào và Campuchia Vùng phân bốchính ở nước ta bao gồm Kon Tum, Gia Lai, các tỉnh Nam Bộ là Bình Phước, ĐồngNai, Tây Ninh, Bà Rịa - Vũng Tàu, và đảo Phú Quốc (Kiên Giang) Cây sống trongcác kiểu rừng thường xanh ưa ẩm, có kích thước lớn nên thường chiếm tầng caonhất của rừng và có khả năng mọc thành quần tụ ưu thế.

Gỗ của Dầu Song nàng phân biệt lõi và giác Lõi màu nâu đỏ, cứng, tỷ trọngđạt 0.8; dễ chế biến Được dùng để đóng thuyền đi sông, đồ dùng và khai thác lấy nhựa

Hiện nay không còn tìm thấy rừng tự nhiên có tỷ lệ Dầu Song nàng cao.Nguyên nhân có thể do loài này đã từng là đối tượng khai thác nhiều ở các vùngrừng miền Nam nên dẫn đến nguồn tài nguyên di truyền của loài đã bị cạn kiệt Quảcủa loài thường mất sức nảy mầm nhanh do có chứa dầu, không chịu được khô hạnnên nhiều khi hạt rụng nhiều mà không thể tái sinh Theo “Sách đỏ Việt Nam” [3]Dầu Song nàng được xếp vào loại VU A1c,d + 2c,d với tình trạng nơi cư trú đang

bị tàn phá và thu hẹp, cây bị khai thác mạnh, có xu hướng bị tiêu diệt ở từng vùnglớn Với hiện trạng nêu trên, cần thiết phải có các biện pháp bảo vệ loài Dầu Songnàng tại các khu rừng cấm, khu bảo tồn thiên nhiên và phát triển các khu rừnggiống để bảo tồn nguồn gen của loài

1.1.3 Đa dạng di truyền, thụ phấn chéo trong quần thể và loài

Dẫn liệu phân tích đa dạng di truyền quần thể và loài cho phép các nhà khoahọc hiểu biết rõ hơn về quá trình sinh thái và tiến hoá của các loài này và góp phầnhoạch định chiến lược bảo tồn hữu hiệu Bởi vì kết quả này cho phép tìm hiểu mức

độ đa hình và đa dạng di truyền tại lô cút liên quan đến biến đổi của môi trườngsống của loài và yếu tố nào xác định sự phân bố di truyền trong quần thể Phân tích

đa dạng di truyền có thể biết hậu quả của quá trình sinh thái và tiến hoá liên quanđến thay đổi kích thước quần thể, mối quan hệ giữa các ổ sinh thái và mức độ đadạng di truyền ở mức độ quần thể và loài Sự thay đổi kích thước quần thể có thểđược xác định bởi biến đổi của môi trường Sự cạnh tranh giữa các loài, dãy phân

bố địa lý thường là kết quả không gian hạn chế của lịch sử phát tán hay giới hạn vềsinh lý phát triển và sinh sản Những vấn đề này có thể được giải quyết thông quacác kết quả nghiên cứu Phần lớn các loài thực vật thường bị đe doạ liên quan đếnkích thước quần thể nhỏ và cô lập Barrettt và Kohn (1991) [28] đã tập trung vàohậu quả di truyền trong quần thể nhỏ Tác giả đã chỉ ra rằng mất tính đa dạng ditruyền xảy ra khi kích thước quần thể nhỏ liên quan đến sự suy giảm về số alleleđặc biệt các allele hiếm và dẫn đến giảm hệ số gen dị hợp tử trong quần thể Tácgiả cũng phân tích nguyên nhân mất tính đa dạng di truyền là kết quả của quá trìnhthụ phấn cận noãn trong quần thể nhỏ và cô lập Kết quả này sẽ làm giảm khả năngthích nghi của quần thể với môi trường sống của chúng Phân tích isozym trongquần thể thực vật bởi Beardmore (1983) [30] cũng khẳng định giả thiết này Rấtnhiều công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền trên cơ sở phân tích đóng góp rấtlớn vào hoạch định chính sách cho công tác bảo tồn loài, đặc biệt các loài quý hiếmđang có nguy cơ tuyệt chủng [26], [29], [36] Tác giả giải thích mất tính đa dạng ditruyền liên quan đến mất allele hiếm trong quần thể nhỏ và một số quần thể xuấthiện hệ số thụ phấn cận noãn cao

Các cây họ Dầu ở Châu Á thường có kích thước cây nhỏ hoặc lớn, có bạnh

vè Thân cây có nhựa Lá đơn mọc cách, có lá kèm phát triển để bảo vệ chồi Hoa

tự hình chùy, có nhiều chum Cánh hoa dài hơn lá đài và có lông Đài có 3 hoặc 5

lá và phát triển thành cánh trên quả Hoa lưỡng tính Bao phấn thường có 2 túiphấn Buồng trứng có 3 ngăn, mỗi ngăn chứa 2 noãn Theo Kostermans (1985)[49], các cây họ Dầu ở Châu Á thường có 15 nhị và xếp thành 2 vòng trong (5) vàvòng ngoài (10) Vòi nhị ngắn, phẳng Bao phấn thường có 4 ngăn Để bảo tồn vàquản lý các loài cây Dầu, các thông tin về đặc điểm sinh thái và đa dạng di truyền ở

cả 2 mức độ quần thể và loài là cần thiết, và đóng vai trò quan trọng góp phần đưa

ra các giải pháp bảo tồn một cách phù hợp Nghiên cứu ảnh hưởng của khai thácchọn dẫn đến mật độ thấp trong tự nhiên đã làm tăng khả năng thụ phấn cận noãn

của nhiều loài cây Dầu như Shorea megistophylla ở Sri Lanka [53], Drybalanops

aromatica [54], Shorea curtisii và Dryobalanops aromatica [70], Neobalanocarpus heimii [56], Shorea leprosula [46] và S curtisii [58] ở rừng nhiệt đới Malaysia Số

lượng quả của loài S siamensis được sản sinh ở nơi sống bị tác động mạnh thấp

hơn ở nơi ít bị tác động [40] Kitamura et al (1994) [49] đã đề cập đến mức độ thụ

phấn chéo là cao (82%) của loài Dryobalanops aromatica ở Brunei Sự phân cắt

nơi sống ảnh hưởng đến khả năng thụ phấn của một số loài cây Dầu đã được phân

tích cho loài Vateriopsis seychellarum [44], Shorea javanica ở Sumatra [61] và

Vateria indica ở Ấn Độ [47] Các tác giả đã chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di

truyền xảy ra liên quan đến số lượng cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơisống bị suy giảm Hệ số thụ phấn cận noãn cao cũng là yếu tố làm suy giảm tính đadạng di truyền Suy giảm (phân cắt nơi sống, số lượng cá thể thấp) có thể hạn chếmức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyềnkhác nhau giữa chúng

Ở Việt Nam, phần lớn các công trình nghiên cứu chủ yếu về phân loại và khu

hệ thực vật Nguyễn Tiến Bân (2003) [1] đã tổng kết các kết quả nghiên cứu về

thực vật và xuất bản tập sách “Danh lục các loài thực vật Việt Nam” NguyễnHoàng Nghĩa (2005) [12] đã đưa ra danh sách 42 loài cây Dầu đã được tìm thấy ởViệt Nam Trên cơ sở điều tra hiện trạng loài, các nhà khoa học đã đưa ra danh sáchcác loài cây Dầu đang bị đe doạ [12], [3], đặc biệt Sách Đỏ Việt Nam, 2007 [3],được xuất bản bởi Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Viện Khoa học vàCông nghệ Việt Nam và đưa ra một số biện pháp bảo tồn nguyên vị và chuyển vị.Rất ít công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể và loài thực vật, đặc biệtcác loài cây Dầu (Dipterocarpaceae) Nguyễn Đức Thành và cộng sự (2007) [21] đãđiều tra mức độ đa hình di truyền của 17 loài Dầu ở Việt Nam bằng 7 chỉ thị RAPD

và 4 cặp mồi lục lạp (trnD-trnT, trnH-trnK, psbC-psbS và trnM-rbcL) và chỉ rarằng hệ số đa dạng di truyền dao động từ 0,18 đến 0,58 Nguyễn Đức Thành vàcộng sự (2009) [22] đã điều tra đa dạng di truyền của loài Sao mạng (Hopeareticulata Tardicu) bằng chỉ thị RAPD và một số gen lục lạp và chỉ ra mức độ đadạng di truyền thấp Nguyễn Thị Hải Hồng và cộng sự (2012) [9] nghiên cứu 41

mẫu lá Dầu rái (D alatus) thu thập từ 10 tỉnh thuộc 3 vùng sinh thái lâm nghiệp

Việt Nam bằng 18 chỉ thị RAPD Nguyễn Minh Tâm và cộng sự (2014) [68], VũĐình Duy và cộng sự (2013) [4] đã đánh giá mức độ đa dạng di truyền của loài Dầu

rái (Dipterocarpus alatus) ở một số tỉnh Đông Nam Bộ trên cơ sở sử dụng 9 cặp

mồi microsatellite và chỉ ra mức độ đa dạng di truyền bị ảnh hưởng bởi quá trìnhphân cắt nơi sống và mật độ cá thể trong mỗi quần thể Sự trao đổi di truyền giữacác quần thể cao (>1) thường xuất hiện giữa các quần thể có khoảng cách địa lýtrong cùng một khu vực (tỉnh), chẳng hạn giữa các quần thể ở vườn Quốc gia CátTiên, Mã Đà và rừng đặc dụng Tân Phú thuộc tỉnh Đồng Nai, có hệ số trao đổi ditruyền lớn hơn 1; trong khi đó giữa các quần thể ở Mã Đà (Đồng Nai), Lò Gò-XaMát (Tây Ninh), Bù Gia Mập (Bình Phước), có hệ số trao đổi di truyền < 1 Kết

quả nghiên cứu về đa dạng di truyền giữa các quần thể của loài Sao đen (Hopea

odorata) cũng cho kết quả tương tự [23] Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 11

loài Dầu thuộc chi Dầu (Dipterocarpus) sử dụng gen lục lạp (matK) đã chỉ ra các

loài trong cùng một chi có quan hệ mật thiết với nhau [6] Nguyễn Thị PhươngTrang và cộng sự (2014) [23] cũng đã phân tích đa dạng di truyền của 3 loài dầu

sao, Sao hòn gai (Hopea chinensis), Sao hải nam (H hainanensis) và Sao mặt quỷ (H mollissima) dùng 3 vùng gen rcbL, psbA-trnH và matK và chỉ ra sự khác biệt di

truyền giữa 3 loài Sao là rất thấp từ 0,2 đến 0,6

là điều khiển thành phần di truyền cho mỗi loài trong mỗi đơn vị quản lý để duy trì,phục hồi tài nguyên di truyền tự nhiên Các tác giả đã lưu ý rằng đa dạng di truyềntrong những đơn vị quản lý bị ảnh hưởng bởi những điều kiện bên ngoài thông qua

“ô nhiễm vật liệu di truyền” và áp lực chọn lọc tự nhiên bị thay đổi do các hoạt

động của con người Tác động tiềm năng từ “ô nhiễm” này phụ thuộc vào mức độkhác nhau của tần số allele và tính thích nghi môi trường trong mỗi đơn vị quản lý.

Rõ ràng, bảo tồn nguyên vị có thể được sử dụng như là nơi sống cho nâng cấp vàchuyển vị rất cần thiết để phục hồi nơi sống của loài

Đối với một số loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam, phần lớn cácloài cây họ Dầu đều được bảo vệ trong các khu bảo tồn thiên nhiên và vườn Quốcgia Đây là bước đầu tiên trong công tác bảo tồn, tuy nhiên để bảo tồn và quản lýhữu hiệu các loài này đặc biệt các loài Dầu đang bị đe dọa, các giải pháp bảo tồnchuyển vị là cần thiết và cấp bách Do đặc tính sinh học của hầu hết các cây họ Dầutrong tự nhiên thường ra hoa sau một số năm và số lượng hạt nẩy mầm không cao,

do vậy chi phí triển khai chương trình nhân giống khá lớn Hiện nay, để triển khaichương trình này, thường dựa vào đặc điểm hình thái của cây mẹ (cây trội), câybiểu hiện tính trạng biến dị di truyền, đảm bảo tính thụ phấn tự do, giảm thiểu khảnăng thụ phấn cận noãn Hơn nữa, cũng cần lưu ý đến tập tính côn trùng trong quátrình thụ phấn đối với cây họ Dầu

1.2 Tổng quan về ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử

1.2.1 Quần thể và tính đa dạng di truyền của quần thể

Quần thể là tập hợp một nhóm cá thể của một loài Quần thể là đơn vị tiếnhóa của loài trong tự nhiên Các quần thể khác nhau của cùng một loài được đặctrưng bởi mật độ cá thể, kiểu phân bố và đặc biệt là kích thước của quần thể

Kích thước quần thể là số lượng cá thể của quần thể Trong đó, kích thướctối thiểu là số lượng cá thể ít nhất mà quần thể cần có để duy trì và phát triển vềkích thước tối đa là giới hạn cuối cùng mà quần thể có thể đạt được để phù hợp vớikhả năng cung cấp nguồn sống của môi trường Kích thước của quần thể phụ thuộcvào mức sinh sản, mức tử vong và sự phát tán của cá thể trong quần thể

Đa dạng sinh học là thuật ngữ thể hiện tính đa dạng của các thể sống, loài vàquần thể, tính biến động di truyền giữa chúng và tất cả sự tập hợp phức tạp củachúng thành các quần xã và hệ sinh thái Đa dạng sinh học là kết quả của quá trìnhtiến hoá tự nhiên trải qua hàng triệu năm, bao gồm cả 3 mức độ hệ sinh thái, loài và

di truyền

Đa dạng di truyền thể hiện đa dạng về nguồn gen và genotype của mỗi loài

Đa dạng di truyền cho phép cá thể và loài thích nghi được với những biến đổi bấtlợi của môi trường sống và có khả năng tự phục hồi trong môi trường sống củachúng Như vậy, đa dạng di truyền được đề cập đến như là mức độ đa hình ditruyền của mỗi cá thể trong suốt thời gian sống của nó, hoặc được phản ánh bởi sốallele của quần thể tại một địa điểm và thời gian cụ thể hoặc số allele của một loàitrong một phạm vi phân bố địa lý và lịch sử tồn tại của nó

Nơi sống của mỗi loài được thiết lập trong quá trình hình thành loài Phân cắtxảy ra khi nơi sống bị chia nhỏ và bị cô lập với nhau bằng ma trận các cảnh quankhác không giống ban đầu và không phù hợp cho sự tồn tại của loài Như vậy, phâncắt tạo nên sự phá vỡ nơi sống Tác nhân gây ra phân cắt bao gồm mở rộng đấtnông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, xây dựng khu dân cư vàkhai thác khoáng sản Phân cắt đe doạ đến tính thống nhất sinh thái đã được hìnhthành trong lịch sử phát triển loài và là một trong những nguyên nhân gây ra sựtuyệt chủng

Suy giảm diện tích nơi sống ảnh hưởng đến kích thước quần thể và phân bốlại các mảnh nơi sống còn lại sẽ ảnh hưởng đến sự phát tán của loài Hậu quả củaquá trình phân cắt thường làm suy giảm chức năng hệ sinh thái và cuối cùng mấtnơi sống Các quần thể nhỏ và bị cô lập trong các mảnh nơi sống còn lại dễ bị tổnthương và ít có khả năng thích nghi khi điều kiện môi trường sống của chúng bịthay đổi Tất nhiên, hậu quả sẽ dẫn đến mất tính đa dạng di truyền ở cả 2 mức độquần thể và loài và cuối cùng nhiều loài bị đe dọa tuyệt chủng

1.2.2 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường được dùng trong nghiên cứu

đa dạng di truyền ở thực vật

Sinh học phân tử (molecular biology) là môn khoa học nghiên cứu giới sinhvật hay các hiện tượng sinh vật ở mức độ phân tử Kỹ thuật sinh học phân tử lànhững kỹ thuật sinh học liên quan đến đơn vị di truyền ở cấp độ phân tử (là cácphân tử DNA hoặc ARN) Trong những năm gần đây, các kỹ thuật nghiên cứu sinhhọc không ngừng phát triển, là cơ sở cho các ứng dụng trong nông nghiệp, y học vàsức khỏe con người Công nghệ sinh học hiện đại mà nền tảng là kỹ thuật sinh họcphân tử ngày càng có nhiều ứng dụng trong thực tiễn, phục vụ đời sống con người.Đặc biệt đối với lĩnh vực nghiên cứu phân loại thực vật Việc sử dụng các chỉ thịDNA để nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại đã và đang được nhiều nhà khoahọc trên thế giới tập trung nghiên cứu và đã có nhiều đóng góp đáng kể

Nghiên cứu đa dạng di truyền là nghiên cứu tiến hành để đánh giá mức độ đadạng về mặt di truyền giữa các cá thể hoặc giữa các quần thể của mỗi loài Kết quảnghiên cứu về đa dạng di truyền có thể được sử dụng để phân loại cá thể, hoặc quầnthể so với cá thể hoặc quần thể khác Đây là sự xác định khoảng cách gần, xa tươngđối về mặt di truyền giữa các cá thể hoặc giữa các quần thể nghiên cứu Đa dạng ditruyền được đánh giá dựa trên số lượng hay phần trăm đa hình của gen/locus trongquần thể, số lượng allele trong mỗi gen/locus đa hình và tỉ lệ các locus dị hợp tửtrên cá thể

Đánh giá đa dạng di truyền thường được tiến hành ở mức độ phân tử nhờ sửdụng các kỹ thuật như phân tích allozyme và kỹ thuật DNA Các kỹ thuật này xácđịnh được sự biến đổi trực tiếp và chỉ ra rõ ràng mức độ biến đổi di truyền hiện hữutrong loài và quần thể mà không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường

Xác định đa dạng di truyền nhờ chỉ thị phân tử thể hiện rất nhiều ưu việt sovới các phương pháp khác như cho thấy sự khác biệt di truyền ở mức độ phân tử

một cách cụ thể, chính xác và cho kết quả nhanh Có thể sử dụng DNA nhân hoặcDNA bào quan (ti thể, lục lạp) để phân tích đa dạng di truyền.

Các kỹ thuật chỉ thị DNA được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 80 của thế

kỷ XX và phát triển nhanh chóng trở thành lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân

tử Các chỉ thị DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chọn lọc Các kỹthuật chỉ thị DNA được xây dựng để phát triển các chỉ thị DNA cho nghiên cứu đadạng di truyền, phát sinh loài, phân loại, đánh dấu và xác định gen; cho chọn lọcnguồn gen và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

Các chỉ thị di truyền là các chỉ thị thể hiện sự khác biệt giữa các cơ thể hoặccác loài khác nhau Các chỉ thị này không thể hiện cho các gen mục tiêu mà chỉ làdấu hiệu hoặc như là “cờ đánh dấu” Chỉ thị di truyền bao gồm cả chỉ thị hình thái

và chỉ thị phân tử (isozyme, protein, DNA) Tất cả chỉ thị di truyền đều chiếm một

vị trí đặc biệt trong nhiễm sắc thể (NST) và được gọi là locus Các chỉ thị di truyềnthường liên kết với gen và được di truyền theo qui luật di truyền

Các kỹ thuật như AFLP (đa hình các đoạn nhân chọn lọc), RFLP (đa hình độdài các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các đoạn được nhân bản ngẫu nhiên),SSR (DNA vệ tinh hay trình tự lặp lại đơn giản), cpSSR (trình tự lặp lại đơn giảngenome lục lạp), giải mã trình tự gen,… thường được dùng để đánh giá đa dạng ditruyền, nhận dạng các đoạn DNA hoặc các trình tự đặc trưng cho loài

1.2.3 Kỹ thuật RAPD

RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA): Đa hình các đoạn DNAđược khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Welsh và cộng sựhoàn thiện năm 1991 Phương pháp này sử dụng cùng một số mồi ngẫu nhiên (mồingẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide gồm khoảng 8 đến 20 Nucleotide) để thựchiện phản ứng PCR nhằm nhân các đoạn DNA đặc trưng của các mẫu nghiên cứu.Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được

gồm các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc Khi bộ gencủa các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nhân được các đoạnkhác biệt nhau [5], [14].

1.2.4 Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction fragment length Polymorphism): Đa hình chiều dài cácđoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn) Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của cácenzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt đượcbằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từngphân tử DNA Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thường được

sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gene của các cá thể, cácloài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồngốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật [5], [14]

1.2.5 Kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), được hiểu là

sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2enzyme cắt giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứngkhuếch đại (PCR) Kỹ thuật này được Vos và cộng sự phát triển vào năm 1995 vàngay lập tức trở thành 1 công cụ hữu ích để nhận biết nhiều lô cút trong sự đa hìnhDNA mà không cần biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng Phương phápnày có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữacác quần thể với nhau

1.2.6 Kỹ thuật SSR

Chỉ thị SSR (simple sequence repeat) hay còn gọi là vi vệ tinh(Microsatellite), là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1– 6 bp Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở

động vật và thực vật Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lượng các nucleotide trongmỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại

có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn Thông thường có cáckiểu lặp lại:

- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau

- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một sốnucleotide khác

- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau

Thông thường các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễmsắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chũng giữ vai trò quan trọng trongviệc điều hòa phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, gópphần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào

và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở

cả động vật và thực vật

Phương pháp xác định đa hình SSR là nhờ sự nhân bội từ DNA tổng số của

hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặplại Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn DNA nhờphản ứng PCR Kích thước sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằngđiện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thểrất nhỏ (2 bp) Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác định mối quan

hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệchặt chẽ đến năng suất, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng

Thuận lợi to lớn của phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượnglớn sự đa hình Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locusđược kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm phântích mối quan hệ di truyền SSR là marker đồng trội do đó dị hợp tử có thể dễ dàngđược xác định trong quá trình thực nghiệm tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự

hiệu quả và độ chính xác của những phép toán di truyền quần thể dựa trên nhữngmarker này so với những marker khác như RAPD và AFLP Hơn nữa, việc xácđịnh dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dònggen trở nên dễ dàng hơn Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer chi phícao liên quan đến trình tự mồi chính xác cho loài quan tâm không hề có sẵn.

1.2.7 Kỹ thuật ISSR

Kỹ thuật ISSR (interal simple sequence repeat) là kỹ thuật phân tích dựa trênviệc nhân bản đoạn DNA nằm giữa 2 vùng lặp đơn giản Với ISSR, mồi là nhữngđoạn lặp đơn giản Nguyên lý của phương pháp này là khuếch đại những đoạn trình

tự nằm giữa 2 đầu lặp đơn giản Bộ gen của sinh vật bậc cao có nhiều đoạn DNAlặp lại, các đoạn lặp thường có kích thước ngắn (vài nucleotide), số lần lặp lại làđặc trưng cho mỗi loài, mỗi giống Ví dụ, ở lúa có khoảng gần 1000 lần lặp lại trật

tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trật tự GATA/CTAT Nhiều loài cây một lámầm như ngô, lúa… lặp lại đoạn CGG/GCC

Phân tích ISSR sử dụng mồi bổ trợ với các vùng microsatellite nên còn gọi làMP-PCR có thể kế thừa mở rộng từ các phân tích microsatellites khác để tăng khảnăng lặp lại và giảm tính đa hình so với RAPD Các chỉ thị RAPD, ISSR đượcdùng nhiều trong lập bản đồ, phân tích di truyền, chọn giống ở thực vật [68]

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hai thông số được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền quần thể là tỉ

lệ phần trăm lô cút đa hình (P) và hệ số gen di hợp tử (H) Nhiều công trình nghiêncứu đã sử dụng hệ số H để đánh giá tầm quan trọng của gen dị hợp tử trong quầnthể tự nhiên Năm 2000 Lee và cộng sự đã phân tích đa dạng di truyền loài

Dryobalanops aromatica từ Peninsular Malaysia để bảo tồn đa dạng di truyền và

lập sơ đồ cây phát sinh Sự đa dạng di truyền của loài được đánh giá dựa trênallozyme đánh dấu trên 10 quần thể tự nhiên và hai quần thể rừng trồng Thông số

đa dạng di truyền của mỗi locus đa hình tương ứng bằng 4,1 và 2,5 tỷ lệ các locus

đa hình bằng 77,1 % và dự kiến tỷ lệ dị hợp tử bằng 0,459 % Nghiên cứu cũng chỉ

ra các quần thể rừng trồng có mức độ đa đạng di truyền cao [54]

Những kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là cơ sở cho biết nguồngốc phát sinh và mối quan hệ di truyền giữa các quần thể Nghiên cứu đa dạng di

truyền loài Dryobalanops aromatica Gaertn (Dipterocarpaceae) ở bán đảo

Malaysia sử dụng 9 cặp mồi SSR đã được tiến hành bởi Lim và cộng sự (2002)[55] Kết quả cho thấy tỉ lệ dị hợp tử He kỳ vọng cao (0,709) với các giá trị từ0,684 đến 0,735 Hầu hết các quần thể nghiên cứu đều cho thấy có chỉ số ổn địnhcao của các thể đồng hợp tử Điều này có thể cho thấy quá trình giao phối cận huyếtdiễn ra với tỉ lệ cao giữa các cá thể có quan hệ gần Một phân tích đa dạng di truyền

đã chỉ ra rằng 93,3 % đa dạng di truyền quan sát được là bên trong các quần thể và6,7 % (GAT=0,067) là khác biệt giữa các quần thể với nhau Kết quả nghiên cứu vềkhoảng cách di truyền giữa các quần thể cho thấy 4 quần thể tự nhiên của loài ở bờbiển phía đông bán đảo Malaysia có thể là một quần thể duy nhất trong quá khứgần đây Quần thể ở bờ biển phía tây bán đảo Malaysia có nguồn gốc từ các quầnthể bờ biển phía đông [55]

Một nghiên cứu được công bố năm 2015 của Fifi Gus Dwiyanti và cộng sựđược đăng trên tạp chí Forestry Agriculture nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể

chi Dryobalanops Gaertn (Dipterocarpaceae) bằng chỉ thị SSR sử dụng bảy mồi đa

hình được phân tích trong 46 quần thể tự nhiên gồm 6 loài còn sống sót trong tựnhiên với 700 cá thể phân bố ở phía Tây Malaysia Kết quả nghiên cứu cho thấy sự

đa dạng gen trung bình ở mức độ loài dao động từ 0,392 đối với rappa đến 0,635 đối với aromatica Giá trị FST dao động từ 0,165 đối với keithii đến 0,283 trong

beccarii và tất cả các giá trị FST khác đều lớn hơn không đáng kể Những kết quảnày cho thấy dòng gen giữa các quần thể đã được hạn chế và trôi dạt di truyền sâu

đã xảy ra trong tất cả các loài Đối với loài phân bố hẹp như keithii và rappa là hai

loài đặc hữu của đảo Borneo có xu hướng và mức độ đa dạng di truyền thấp so với

các loài phổ biến như aromatica [39].

1.4 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Các cây họ Dầu phân bố ở trong rừng mưa nhiệt đới đồi núi thấp ở ViệtNam Mặc dù có số lượng không lớn trong số hàng nghìn cây gỗ ở Việt Nam, songcác loài cây họ Dầu đóng một vai trò đặc biệt quan trọng Nhựa từ cây họ Dầu cóthể được phân chia thành hai nhóm: nhựa dầu (nhựa lỏng hoặc dầu gỗ) và nhựa rắn.Nhựa lỏng thu thập từ các loài Dipterocarpus được sử dụng rộng rãi hơn so vớinhựa rắn Nhựa lỏng và nhựa rắn từ những cây họ Dầu khác có thể được pha trộnvới nhau để thắp sáng, trám thuyền, y học cổ truyền hoặc sơn Nhựa lỏng là mộtnguồn thu nhập quan trọng của nhiều cánh rừng có thể kéo dài tới sáu tháng trongnăm [12] Hiện nay việc khai thác nhựa đã bị cấm vì kỹ thuật đốt lỗ cây Dầu đểkích thích sự tiết dịch của nhựa có nguy cơ gây cháy rừng Tuy nhiên việc khai tháctrái phép gỗ cây họ Dầu có xu hướng gia tăng

Ngoài các loài cây họ Dầu đang là loại cây gỗ quan trọng được sử dụng trongcông nghiệp Hiện tại gỗ Dầu được sử dụng đều được khai thác từ rừng tự nhiên.Theo đánh giá của các chuyên gia lâm nghiệp, trong những năm trở lại đây các loàicây họ Dầu đã bị khai thác mạnh khiến cho nhiều khu phân bố bị thu hẹp, số cá thểđang trên nguy cơ bị tuyệt chủng và nguồn tài nguyên đang bị cạn kiệt

Do giá trị của cây họ Dầu cao nên đã được nhiều nhà khoa học trong vàngoài nước nghiên cứu Theo Ashton (1982) chỉ ra rằng cây Dầu rái

(Dipterocarpus alatus) mọc thành cụm ở ven sông và chỉ tái sinh sau những trận lụt

lớn [27]

Từ tổng quan nghiên cứu phân tích bên cho thấy, đến nay chưa có công trìnhnào nghiên cứu một cách có hệ thống về tiến hóa phân tử hay cấu trúc di truyền củacác loài Dầu Song nàng ở Việt Nam Các nghiên cứu trước đây về loài chủ yếu chỉ

nghiên cứu tổng quát và mang tính chất mô tả hoặc có phân tích đa dạng di truyềncủa một vài quần thể của loài trong nghiên cứu với các loài khác Vì vậy, việcnghiên cứu chi tiết, đầy đủ về đa dạng di truyền loài là rất cần thiết để bảo tồn vàphát triển bền vững loài Dầu Song nàng.

CHƯƠNG II ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại Khu bảo tồn Thiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai,tỉnh Đồng Nai, độ cao 129 m, tọa độ 11o12’ Bắc và 107o09’ Đông Đây là khu rừngđặc dụng có diện tích tự nhiên khá nhất nước ta, với hệ sinh thái đặc trưng ĐôngNam Bộ Khu rừng này được thiết lập năm 2004 trực thuộc Ủy ban nhân dân tỉnhĐồng Nai, với 3 di tích lịch sử như căn cứ Trung ương cục Đông Nam Bộ, Khu ủymiền Đông Nam bộ và Địa đạo Suối Linh

2.2 Vật liệu nghiên cứu.

2.2.1 Thu thập và bảo quản mẫu DNA

Tại Khu bảo tồn Thiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai, số lượng cá thể Dầu Songnàng khá lớn, ước tính khoảng 500 cây, chủ yếu là cây trưởng thành Số cây nhỏchưa trưởng thành (dbh<20 cm), thường có số lượng cá thể không đáng kể Khôngthấy cây tái sinh ở tầng mặt đất và cây bụi Tuy nhiên, loài này phân bố khá tậptrung, rất dễ phân biệt Loài Dầu Song nàng tập trung thành các “láng dầu” với mật

độ cá thể cao 58 cá thể/ha, Phần lớn là các cá thể trưởng thành, đường kính từ 35đến 98 cm (65,7 cm), đường kính tán 6,95 m (5 - 15 m)

Để phân tích đa dạng di truyền loài Dipterocarpus dyeri Pierre ở Khu bảo

tồn Thiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai, mẫu vỏ thân của 37 cây trưởng thành đượcthu thập ngẫu nhiên Trong số đó 9 cây mẹ (cây trội) được thu quả chín vào tháng 4

và tháng 5 Hạt được gieo tại vườn giống của Trung tâm lâm nghiệp Biên Hòa Lácây con được sử dụng để xác định mức độ thụ phấn chéo của mỗi cây mẹ và quầnthể Mẫu vỏ cây và lá cây non được bảo quản trong silicagel trước khi chuyển đến

phòng thí nghiệm Tổng số 97 mẫu lá cây con từ 9 cây trội được sử dụng để phân tích thụ phấn chéo ở mức độ cá thể cây trội và quần thể.

2.2.2 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu di truyền loài Dầu Song nàng

Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: (Dipt 01, Dipt 02,Dipt 03, Dipt 04, Dipt 07, Dipt 08, Shc 02, Shc 07) được tham khảo từ các nghiêncứu về đa dạng di truyền của Isagi 2002, Terauchi 1994 [71] và Ujino 1998 [61]

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide các cặp mồi SSR dùng trong nghiên cứu

2 Dipt 02 (GA) 17

F-5’-AGTTTTATACATCACCGCCAA-3’

112 56oC R-5’-GAAGCCCCTAAGAATTAACCTGA-3’

3 Dipt 03 (GA) 24

F-5’-ACAATGAAACTTGACCACCCAT-3’

226 56oC R-5’-CAAAAGGACATACCAGCCTAGC-3’

4 Dipt 04 (AG) 15

F-5’-TAGGGCATATTGCTTTCTCATC-3’

214 55oC R-5’-CTTATTGCAGTCATCAAGGGAA-3’

7 Dipt 08 (GA) 6

F-5’-ATGCTTACCACCAATGTGAATG-3’

170 55oC R-5’-CTCGCAGCAGAACAACTTTCTA-3’

8 Shc 07

(CT) 8 C

169 55oC

A(CT) 5

CACC F-5’-ATGTC CATGT TTGAG TG-3’

C(CTC R-5’-CATGG ACATA AGTGG AG-3’

A) 3 CT(

CA) 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách từ các mẫu lá theo phương pháp của Doyle và Doyle

1987 [37] Có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số

a Dung dịch đệm dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Công thức pha đệm rửa (washing buffer) 10 ml

STT Tên hoá chất Nồng độ gốc Nồng độ làm Lượng pha

Bảng 2.3 Công thức pha đệm tách chiết (CTAB) 10 ml

TT Tên hoá chất Nồng độ gốc Nồng độ làm việc Lượng pha

2.3.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR

2.3.3 Phương pháp điện di

2.3.3.1 Điện di trên gel agarose

Điện di là phương pháp được sử dụng trong cả phân tích định tính và địnhlượng mẫu DNA DNA là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, khi đặt trongmôi trường có điện trường các phân tử DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển

từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước

Gel agarose là loại gel thông dụng, phổ biến, thao tác đơn giản, thường được

sử dụng để phân tích những đoạn DNA có kích thước khoảng 0,5–20 kb Gel được

đổ trên một giá thể nằm ngang [54]

Chúng tôi thực hiện điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR trên gelAgarose 1%, sử dụng đệm TAE 1X, nhuộm gel bằng GelRedTM Nucleic Acid gelStain trên thiết bị điện di của hãng Biorab

2.3.3.2 Điện di gel Polyacrylamide

Điện di sản phẩm PCR trên gel Polyacrylamide 5 % trong 40 ml dung dịchđệm TAE 1X, nhuộm bằng GelRedTM Nucleic Acid gel Stain và chụp ảnh trên máysoi gel của hãng CLEARVER

Các bước tiến hành pha nông độ gel polyacrylamide như sau:

- Chuẩn bị dung dịch: 30 % acrylamide (gồm bis-acrylamide), TBE 1X, 10

% ammonium persulphate

- Lau sạch hai tấm kính dùng làm khuôn gel và miếng đệm bằng KOH/methanol hoặc ethanol Xử lý bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịch silicon đểngăn gel dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khuôn saukhi điện di xong

- Tính toán thể tích của các dung dịch dùng để tạo gel polyacrylamide trên cơ

sở kích thước tấm kính, độ dày của miếng đệm

- Bổ sung 35 µl TEMED vào mỗi 100 ml dung dịch tạo gel polyacrylamide,trộn hỗn hợp bằng cách vortex Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính Gắnnhanh lược vào, tránh bọt khí ở lược (giếng) Đỉnh của răng lược phải hơi cao hơnmép gel Nếu cần, bổ sung một ít dung dịch tạo gel để làm đầy mép gel.

- Cho phép acrylamide polymer hóa trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ trongphòng, bổ sung thêm dung dịch tạo gel nếu thấy gel co vào nhiều

- Sau khi polymer hóa hoàn toàn, rút lược cẩn thận, tháo băng dính ra khỏiđáy khuôn gel Gắn khuôn gel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằngđệm TBE 1X, dùng pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel

- Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm loading dye 6X Đặtmẫu vào trong giếng bằng micropipette

- Đưa bản gel vào bể điện di và chạy trong khoảng 20 phút Soi gel dưới đènUV

2.4 Phân tích số liệu

Hiệu quả của mỗi cặp mồi được phân tích thông qua các chỉ số được mô tảbởi Prevost & Wilkinson (1999) [60]:

+ PIC (Polymorphism Information Content - Hệ số đa hình),

PIC= 1- ∑ fi2 (fi: tần số allele)

+ RP (Resolving power - đặc điểm và chỉ ra khả năng khác nhau của các cặp

Rp=∑(1-(2 x (0.5-Pi)) (Pi: tần số chứa band i)

+ PD (Discrimination power - khả năng khác biệt giữa các cặp cá thể),

PD=1-∑Pi2

+ MI (Marker index - chỉ số đa dạng trung bình của các băng đa hình)

Để xác định tính đa dạng di truyền bao gồm số allele cho một locus (NA), sốallele hữu hiệu cho một locus (NE), hệ số gen dị hợp tử quan sát (HO) và gen dị hợp

và giữa các quần thể được thực hiện ở mức ý nghĩa p=0,05 và phân tích AMOVA(variance components in the analysis of molecular variance) nhằm xác định sự khácbiệt di truyền giữa các quần thể nghiên cứu được phân tích trên phần mềm Arlequin3.1 [38].

Phần mềm MLTR (Ritland, 2002) được sử dụng để xác định các thông số vềthụ phấn bao gồm hệ số thụ phấn chéo đa locus (tm), hệ số thụ phấn chéo một locus(ts), hệ số tự thụ phấn (s), hệ số tương quan hai thế hệ (rpm và rps), và hệ số thụ phấncận noãn (F) ở cây trội

Tách chiết DNA là bước đầu tiên và rất quan trọng trong nghiên cứu sinhhọc phân tử nói chung Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA từ

tế bào Điều quan tâm là thu nhận được DNA ở trạng thái nguyên vẹn không bịphân hủy, không lẫn tạp chất để có nguồn nguyên liệu chất lượng tốt cho các thínghiệm tiếp theo Các mẫu vỏ cây Dầu Song nàng được tách chiết theo phươngpháp CTAB DNA tổng số của 37 mẫu vỏ thân cây trưởng thành và 97 cây giống từ

9 cây trội Dầu Song nàng đã được tách chiết thành công với lượng DNA cao vàtinh sạch Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 1% cho thấy DNA tổng

số thu được khá tốt, DNA không bị gãy (Hình 3.1) Kết quả đo OD cho chỉ số

OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 (chỉ số cho biết dungdịch DNA có độ tinh khiết cao)

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số từ vỏ cây một số mẫu Dầu Song nàng 3.2 Đánh giá hiệu quả chỉ thị SSR

Sản phẩm PCR-SSR được điện di trên gel Polyacrylamide 5 % để phân tích

đa hình DNA của mẫu nghiên cứu được trình bày ở Hình 3.2 Kết quả điện di của 8cặp mồi SSR đều cho các băng đa hình Hình ảnh các băng vạch xuất hiện trên bảnđiện di sau đó được chụp trên máy soi gel của hãng CLEARVER Mã hoá các phổ

A B

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đa hình với cặp mồi Dipt02 (A) và

Dipt08 (B) MK: marker 50 bp; SN1, 2, ,14:mẫu

Với 8 cặp mồi microsatellite đã xác định 35 allele khác nhau với kích thướcdao động từ 114 bp đến 286 bp 8 locus nghiên cứu đều cho kết quả đa hình vớiloài Dầu Song nàng nghiên cứu Số allele trung bình 4,4 cho một locus, dao động

từ 3 ở locus Dipt 01 đến 5 ở 4 locus Dipt 02, Dipt 04, Dipt 07 và Dipt 08 Các giátrị PIC, PD và RP đã được xác định cho 8 locus đa hình (Bảng 3.1) Hệ số PIC(Polymorphic Information Content) phản ánh khả năng cho đa hình của các cặpmồi SSR Hệ số PIC của cặp mồi nào cao thì khả năng cho đa hình càng cao trongphân tích đa dạng di truyền của các đối tượng nghiên cứu và ngược lại