Nghiên cứu phân lập nấm rễ nội cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất trồng ngô và sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh hữu cơ

Liệu có sự liên quan giữa đa dạng AMF và năng suất cây trồng khác nhau ở mỗi vùng miền?chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhiz

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN

CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài: “Nghiên cứu phân lập nấm rễ nội cộng sinh

Arbuscular Mycorrhiza trong đất trồng ngô và sản xuất chế phẩm

phân bón vi sinh hữu cơ”

Mã số đề tài: QG 16.35

Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Hoàng Yến

Hà Nội 2018

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

1.1 Tên đề tài: “Nghiên cứu phân lập nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhiza trong đất

trồng ngô và sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh hữu cơ”

1.2 Mã số: QG 16.35

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT Chức danh, học vị, họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

2 Nguyễn Thị Hồng Nhung Thạc sĩ Thành viên tham gia chính

4 Nguyễn Thị Anh Đào Cử nhân Thành viên tham gia

1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh ọc

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ ngày 04 tháng 01 năm 2016 đến 04 tháng 01 năm 2018

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng… năm…

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ ngày 04 tháng 01 năm 2016 đến tháng 03 năm 2018

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý

kiến của Cơ quan quản lý)

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 200 triệu đồng

PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo này sẽ được đăng trên tạp chí khoa học ĐHQGHN sau khi đề tài được nghiệm thu), nội dung gồm các phần:

1 Đặt vấn đề

Nấm rễ nội cộng sinh (AMF-Arbuscular Mycorrhizal Fungi) là một nhóm nấm có lợi trong đất

và sống cộng sinh trong rễ của thực vật bậc cao, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng như hệ sinh thái AMF được phát hiện từ ít nhất 400 triệu năm trước,

và có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển và sinh sản của cả thực vật và nấm AMF được xem là nhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của cây trồng, chúng được tìm thấy trong hầu hết các sinh cảnh trên toàn thế giới và trong khoảng 90% các loài thực vật (Walker C, 1987) Mặc dù là nội cộng sinh bắt buộc nhưng giữa nấm và thực vật được được coi là mối quan hệ

“Hội sinh”, do nó mang lại lợi ích cho cả vật chủ và nấm Trước hết, nấm nhận được các sản phẩm quang hợp từ thực vật bằng cách sống cố định trong rễ của chúng và sau đó phát triển mạng lưới hệ sợi nấm trong vùng bầu rễ để tạo thuận lợi cho việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và

cung cấp các chất có lợi khác cho vật chủ, cạnh tranh với các vi khuẩn trong đất khác, đồng thời giúp thực vật tăng khả năng lấy nước và chất dinh dưỡng như phốt pho, lưu huỳnh, nitơ và các vi chất dinh dưỡng từ các sợi nấm tạo ra ngoài vùng rễ Ngoài ra sự cộng sinh của nấm còn giúp cây trồng có khả năng chống chịu được sự khô hạn,đề kháng với một số tác nhân gây bệnh (Morton, J.B and Benny, 1990)

Cây ngô là nhóm cây chủ lực của Việt Nam sau lúa, tuy nhiên không có nhiều nghiên cứu về đa dạng AMF trong đất trồng ngô ở Việt Nam cũng như mối tương quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành phần loài củaAMF Do vậy, việc nghiên cứuđa dạng sinh học AMF trong đất trồng ngôở những vùng khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác nhau, tìm được những loài ưu thế, loài đặc hữu, tìm hiểu sự liên quan giữa đa dạng AMF với các loại đất trồng khác nhau Liệu

có sự liên quan giữa đa dạng AMF và năng suất cây trồng khác nhau ở mỗi vùng miền?chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhiza

trong đất trồng ngô và sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh hữu cơ” với các mục tiêu sau:

2 Mục tiêu

- Phân lập được một số chủng nấm rễ nội cộng sinh trong rễ cây ngô

- Lựa chọn được môi trường thích hợp để sản xuất in vitro nấm rễ cộng sinh

- Đưa ra được quy trình nhân nuôi nấm rễ nội cộng sinh hiệu quả dùng cho sản xuất phân sinh học

3 Tổng quan các vấn đề nghiên cứu

3.1 Khái niệm nấm rễ cộng sinh

Nấm rễ cộng sinh (Mycorrhiza) là một nhóm nấm có lợi sống cộng sinh với rễ thực vật, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển và sinh sản của thực vật Đây được xem là nhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của cây trồng, được tìm thấy ở hầu hết các sinh cảnh trên thế giới

và trong khoảng 90% các loài thực vật

Hình 1.1: Nấm rễ cộng sinh

3.2 Phân loại nấm rễ cộng sinh

Có ba loại nấm rễ: Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza), nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza) và nấm rễ nội - ngoại cộng sinh (Ectoendomycorrhiza)

 Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza)

Nấm rễ ngoại cộng sinh là sợi nấm bao quanh rễ dinh dưỡng chưa hóa gỗ, không xuyên qua mô

tế bào mà chỉ kéo dài giữa các vách tế bào Đặc trưng cơ bản của chúng là:

- Trên bề mặt dinh dưỡng hình thành một màng nấm (mantle) do các sợi nấm đan chéo nhau

- Giữa các tế bào tầng vỏ rễ hình thành một mạng lưới do thể sợ nấm sinh trưởng mà thành gọi là lưới Hartig (Hartig net)

- Do tác dụng của nấm rễ, bộ rễ ngắn to, giòn và có mà sắc khác nhau, tán rễ và biểu bì không

có lông hút, bề mặt màng có nhiều sợ nấm kéo dài ra

Nói chung, nấm rễ ngoại cộng sinh không có hình dạng và màu sắc nhất định nhưng rất dễ nhận biết bằng mắt thường Tính đa dạng thể hiện trên loài cây chủ và nấm rễ khác nhau

Hình 1.2: Nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ ngoại cộng sinh

 Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza)

Nấm rễ nội cộng sinh là nhóm cộng sinh bắt buộc với thực vật và thuộc ngành Glomeromycota

Thể sợi nấm có thể xuyên qua tế bào và rễ cây chủ, không biến đối hình thái, bề mặt rễ không hình thành màng nấm chỉ có các sợi lưa thưa, lông hút vẫn giữ nguyên Tuy nhiên, thể sợ nấm vẫn kéo dài giữa gian bào, nhưng không hình thành mạng lưới Hartig Sợi nấm xuyên qua vách

tế bào vào trong hình thành vòi hút Những loại này rất khó nhận biết bằng mắt thường

Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là: nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và nấm nội cộng sinh có màng ngăn (SEM) Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì

rễ có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular)

 Nấm rễ nội - ngoại cộng sinh (Ectoendomycorrhiza)

Loại nấm rễ này mang đặc trưng của hai loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng như sinh lý

3.3 Lịch sử nghiên cứu

Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên được Frank - nhà bệnh cây lâm nghiệp người Đức đưa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ) Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác

biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous

và Orchid, từng được gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae

Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của hình thức cộng sinh này Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V) Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thường được quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A) Do vậy, tên gọi “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) được hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này

Những nghiên cứu sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nấm AMF, còn sự hình thành thể V không thấy có mặt ở tất cả nấm nội cộng sinh Do vậy, loại hình cộng sinh này còn có tên gọi là “Arbuscular Mycorrhiza” tuy nhiên tên này vẫn chưa hoàn toàn thống nhất

Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 được tổ chức tại Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này Do vậy, trong các tài liệu được công bố sau này, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt

là AMF) đã được thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” bắt đầu từ năm 2008

3.4 Phương pháp nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh AMF

3.4.1 Phương pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh dựa vào quan sát hình thái bào tử

Để phân loại được nấm rễ nội cộng sinh, trước hết chúng ta cần phân lập được chúng, phương pháp sàng ướt và lọc qua màng (Gerdemann, 1963) đã được sử dụng Trên cơ sở đó, nhóm tác giả Daniel và Skipper, 1982 và tiếp sau đó tác giả Tommerup, 1992 đã cải tiến thành phương pháp sàng ướt, với các kích cỡ màng khác nhau: 250µm, 100µm và 45µm (wet sieving) kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) Bào tử AMF sau khi phân lập được phân loại dựa vào hình thái, kích thước theo khóa phân loại của Monton, 1988; Schenck và Pertez, 1990

Lịch sử hình thành hệ thống phân loại AMF trước hết phải kể đến việc hình thành chi

Endogone năm 1808 Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả năm 1844 Đến năm 1849,

tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có

rất ít đặc điểm chung Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phương pháp nhận biết tất

cả các loại bào tử của AMF

Năm 1959, Moss (nhà Giải phẫu thực vật) và Bowen (nhà Sinh thái học) đã đưa ra hệ thống mô tả dựa trên cấu trúc vách tế bào, màu sắc và đặc điểm tế bào chất Tuy nhiên, khi áp

dụng phương pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra rằng nhóm Endogone có số lượng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh là Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) Với hệ thống phân loại của

Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Ấn Độ đã phân lập từ đất

vườn ươm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh (Endogone)

Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đưa 5 loài AMF ra khỏi chi Sclerocystics để

hình thành chi mới Scutellospora, đến năm 1987 Walker cũng đề xuất như trên Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này được đặt trong

bộ mới Glomales Thông thường, việc phân loại nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc

điểm hình thái và cấu trúc của các loại bào tử Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang áp dụng dựa trên cơ sở hệ thống phân loại của Morton và Benny đưa ra vào năm 1990 và được hoàn chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó

Năm 1998, Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscular mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan - ACT) đề nghị công nhận 2 chi mới là Glomites và Jimtrappea Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT thường được sử dụng ở các nước Châu Á

Năm 2008, Shipra Singh và cộng sự tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là

Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là Archacospora và Paraglomus

Hiện nay, đặc điểm của nhóm nấm rễ nội cộng sinh đã được thống nhất đặc trưng là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của rễ , có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lưới Hartig Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng ngăn (SEM) Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular)

3.4.2 Phương pháp phân loại AMF dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử

Các loài AMF khác nhau thường xuất hiện trong cùng một rễ Do vậy, việc phân loại bằng hình thái học trở nên cực kỳ khó khăn Khoảng 160 loài AMF đã được mô tả bằng các đặc

điểm hình thái học của bào tử theo tạp trí Vesicular Arbuscular Mycorrhiza (INVAM) quốc tế [81] Tuy nhiên, trong tự nhiên, có sự khác biệt lớn về hình thái bào tử thậm chí trong một số loài AMF [74] và nhiều AMF chỉ có thể tái sinh sản mà không tạo ra bào tử [40] Phương pháp phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử là quá trình cần thiết trong việc phân loại và định danh nấm rễ nội cộng sinh mà không phụ thuộc vào các tiêu chí hình thái

Trình tự gen ARNr vùng ITS là trình tự đã được sử dụng rộng rãi trong phân loại bằng

kỹ thuật sinh học phân tử cho các loại nấm thông dụng.Trình tự này có mức độ biến đổi cao, đặc biệt là trong các loài AMF, sự biến đổi giữa các loài là vô cùng lớn, ngay cả trong cùng một loài, ở các bào tử khác nhau thì Do đó, sẽ rất khó để tìm ra các ITS đặc trưng cho tất cả AMF

Ngày nay, trong số ít các nghiên cứu đoạn 18S, 28S/D1D2 và ITS được sử dụng để phân loại AMF, thì trình tự 18S vẫn là trình tự được dùng phổ biến cho nhóm nấm này (Schnbeck và

cs 1990, Reader 2000) rRNA là công cụ thích hợp cho việc nhận dạng và nghiên cứu phát sinh loài trong Các gen rRNA đã được sử dụng trong phần lớn các nghiên cứu về sinh học phân tử của AMF và cho kết quả tương đồng với cách phân loại về hình thái bào tử (Morton và Benny, 1990) Phản ứng khuếch đại PCR chọn lọc phụ thuộc nhiều vào tính đặc hiệu của mồi do vậy đã

có nhiều nỗ lực nghiên cứu để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho AMF Tuy nhiên, rất khó để có thể khuếch đại chính xác các trình tự từ một số nhóm AMF đã được mô tả gần đây và do đôi khi chúng khuếch đại nhầm sang DNA của các sinh vật khác Các mồi PCR cho các phân nhóm nhỏ hoặc các gen mục tiêu của AMF tương đối dễ thiết kế và đã được sử dụng thành công trong một

số nghiên cứu (Gamper and Leuchtmann, 2007) Vì vậy để nghiên cứu toàn diện về cấu trúc của toàn bộ hệ gen AMF và đa dạng sinh học đòi hỏi các mồi PCR phải đặc hiệu cho tất cả AMF, và vẫn còn đang trong quá trình hoàn thiện Việc thiết kế mồi đòi hỏi một trình tự mới khi các thông tin của các trình tự AMF mới được cập nhật vào ngân hàng gen Nghiên cứu của Jaikoo Lee và cộng sự, cặp mồi AML1 và AML2 khuếch đại gen 18S của rARN được công bố dùng để phát hiện và nhận dạng AMF Trình tự mồi PCR đã được chứng minh có độ đặc hiệu tốt hơn và bao phủ được tất cả các loài AMF đã được biết đến (Jaikoo et al, 2008))

3.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng xâm nhiễm vào vật chủ

Để đánh giá được khả năng xâm nhiễm nẫm vào vật chủ, người ta đã sử dụng phương pháp tính

toán số lượng bào tử xâm nhiễm vào rễ cây trồng IP (inoculum potential) IP được tính toán từ

tổng số bọng nấm trong rễ hoặc số điểm sợi nấm bám vào rễ cây, theo công thức tính:

IP ꞊ (N × W × K ) + S Hoặc IP ꞊ (L × N) + S Đối với nấm sản sinh bào tử trong rễ, nhưng lại có ít bào tử hay không có bào tử, công thức tính toán là:

IP ꞊ (N × W× K) ꞊ (L × N) + S

Trong đó, N: Số lượng bọng bào tử hoặc/ và bào tử trong rễ và số điểm nối kết giữa sợi nấm và

rễ W: trọng lượng rễ, K: chiều dài rễ trong 1 đơn vị trọng lượng của rễ, L: chiều dài của rễ; S=

số lượng bào tử sống sót trong 1 lần nuôi cấy Theo công thức này thì đối với 1 cây có chiều dài

rễ trung bình từ 150-200 cm, và có khoảng 9-25 bào tử/ cm chiều dài rễ, thì IP tính toán được vào khoảng 2000-8000 (Liu và Lua 1994)

3.5 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh đối với thực vật

3.5.1 Khả năng huy động nước và các chất dinh dưỡng

Hệ sợi nấm cộng sinh phát triển xung quanh vùng rễ giúp làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, tăng khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng của cây trồng Đối với các chất dinh dưỡng kém di động (như ion phốt phát, đồng, kẽm…), cây trồng hút các ion này nhanh hơn khả năng khuyếch tán của chúng trong dung dịch đất nên thường hình thành vùng hẹp cạn kiệt xung quanh

rễ Khi đó, hệ sợi nấm nhanh chóng dài ra, vượt qua vùng cạn kiệt để đến với nơi có dinh dưỡng

dễ phân giải Do có đường kính nhỏ hơn so với lông hút của rễ, sợi nấm có thể len lỏi khắp nơi trong đất, kể cả các lỗ hổng rất nhỏ mà rễ không qua được để thu nhận chất dinh dưỡng cung cấp cho cây Ví dụ, như trong trường hợp phốt pho bị cố định chặt, sợi nấm cộng sinh sẽ tiếp cận và tiết ra các axít hữu cơ để sau đó có thể đổi chỗ cho phốt pho (bị hút chặt bề mặt bởi hydroxide kim loại) bằng phản ứng trao đổi, hoà tan oxide kim loại, tạo phức kim loại trong dung dịch, do vậy ngăn chặn được sự kết tủa của phốt phát kim loại Nấm cộng sinh Mycorrhiza còn giải phóng phốt pho vô cơ thông qua khoáng hoá chất hữu cơ (thuỷ phân hợp chất ester phốtphát hữu cơ) Các hình thức cộng sinh ở Ericoid Mycorrizha và Ectomycorrizha còn có vai trò quan trọng trong việc khoáng hoá nitơ Chỉ cần một lượng nhỏ AMF có thể huy động dinh dưỡng từ khối lượng lớn xác thực vật có tỷ lệ C/N cao (hàm lượng lignin và tannin cao) (Gerdemann, 1975; Schonbeck và Dehne, 1989, Brundrett 1996, Vamerali và cs 2003, Song và cs 2010, )

3.5.2 Thu nhận hợp chất cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza

Dòng cacbon có thể chỉ theo một chiều từ cây xuống AMF hoặc cũng có thể theo chiều ngược lại do AMF tự phân giải hợp chất giàu cacbon ở đất Dòng chảy cacbon từ cây xuống đất không làm cây trồng thiếu hụt cacbon vì khi AMF xâm nhiễm vào rễ cây sẽ kích thích quá trình quang hợp hoạt động mạnh lên nhiều lần (trừ trường hợp ánh sáng quá yếu) Trong hệ sinh thái, dòng chảy cacbon xuống nấm và đất mang lại nhiều lợi ích, trong đó: sợi AMF sản sinh ra các enzyme thủy phân (như protease, phosphatase…) có vai trò quan trọng trong quá trình khoáng hoá chất hữu cơ và huy động chất dinh dưỡng cho cây trồng Sợi nấm kéo dài làm tăng liên kết với các hạt đất, cải thiện cấu tượng đất, thông thường có đến 1 – 20 m sợi nấm/gam đất Tạo nên cộng đồng vi sinh vật vùng rễ Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độ phì nhiêu của đất (Zajicek và cs 1986, Wang và cs 2008, Zhang và cs 2014, )

3.5.3 Tăng sức chống chịu của cây trồng trong điều kiện bất lợi của môi trường

Ở cây nho, nước đóng vai trò rất quan trọng, nên việc thiếu hụt nước tưới gây ảnh hưởng rất lớn lên chất lượng của quả nho Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chủng nấm rễ lên cây nho trồng trong điều kiện thiếu nước cho thấy, việc bổ sung nấm rễ giúp nho cải thiện tình trạng hút nước và chất dinh dưỡng Thêm vào đó, khi môi trường đất bị nhiễm mặn và bị nhiễm kim loại nặng, nấm rễ sẽ hấp thu các kim loại năng hoặc muối và tích trữ chúng trong các túi vesicles bên trong rễ cây và có thể lưu trữ các ion muối như natri, clorua và các kim loại nặng (Goussous và Mohammad, 2009, Haijilou và cs 2010, Sajedi và cs 2006, Schonbeck và Dehne 1989, ) Trong môi trường đất khô nấm rễ giúp cây hấp thu nước bằng cách tăng cường tốc độ thoát hơi nước so với những cây không có nấm rễ cộng sinh Tác dụng của nấm trong vùng khô hạn biểu hiện chủ yếu là làm tăng tính chịu hạn của cây và tăng nhanh tốc độ truyền nước trong cây Trước đó, vào năm 1982, Berea và cộng sự lại cho rằng tác dụng của nấm rễ là cải thiện kết cấu đất và nâng cao lượng nước trong đất từ đó làm tăng khả năng hấp thu nước cho cây

3.5.4 Giúp cây chống chịu với bệnh hại

Nấm cộng sinh ở rễ cây có tác dụng bảo vệ cây chống lại một số vi sinh vật cây bệnh như

Phytophthora infestans (một loài tảo tương tự nấm), do Phytophthora infestans không thể xâm

nhập qua hệ sợi nấm để lọt vào rễ Ngoài ra, nấm còn giúp ngăn chặn cơ học sự xâm nhập của nguồn bệnh bằng cấu trúc sợi đan xen trong rễ cây, sản sinh các hợp chất kháng sinh (antibiotic), cạnh tranh dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh, góp phần làm tăng sức đề kháng cho cây chủ Nấm rễ giúp cây trồng kháng được một số nguồn bệnh trong đất, tiết ra hệ thống đối kháng (induce plant systemic resistance) ngăn cản sự tấn công do một số vi khuẩn và nấm gây hại từ

trong đất, giúp chống lại bệnh bạc lá sớm trên cây cà chua do Alternaria solani gây ra thông qua

kích thích hoạt động của β-1,3-glucanase, chitinase, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) và lipoxygenase (LOX) có trong lá cà chua Năm 2003, Salem đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nấm rễ và vi khuẩn vùng rễ cà chua lên sự ức chế với bệnh đốm lá của cây Kết quả cho thấy,

khi chủng nấm rễ kết hợp với vi khuẩn Pseudomonas làm tăng khả năng ức chế sự phát triển của

bệnh và tăng năng suất cà chua Song và cs, 2010 đã kết luận rằng, sự cộng sinh của nấm rễ đối với cây bắp giúp cho cây tiết ra hợp chất 2,4-dihydroxy-7-methoxy-2 H-1,4-benzoxazin-3(4 H)-

one (Hx) đối kháng với bệnh cháy bìa lá do nấm Rhizoctonia solani và giúp cây bắp tăng trưởng 3.5.5 Hấp thu lân

Deressa và Schenk (2008) nghiên cứu về cây hành tím Allium CepaL và báo cáo rằng cây hành tím là loài thực vật có hệ thống rễ ngắn, không phân nhánh và mọc cạn trên bề mặt đất do

đó bộ rễ của cây hành tím không thể hút được đầy đủ nguồn dưỡng chất trong đất đặc biệt là lân (P) và kết quả là năng suất của hành bị giảm Nhờ có mối quan hệ cộng sinh với nấm rễ, cây

hành có thể chống chịu được với điều kiện bất lợi của môi trường và gia tăng năng suất củ Trong canh tác hành tím theo truyền thống thì năng suất của củ hành tím có tương quan rất lớn với sự cộng sinh của nấm rễ

3.6 Một số nghiên cứu về đa dạng sinh học và sử dụng AMF trên thế giới

3.6.1 Nghiên cứu về đa dạng AMF

Khi nghiên cứu số lượng AMF trong đất, Schuybert và cộng sự đã nhận thấy rằng: có sự thay đổi về số lượng bào tử AMF trên các loại đất khác nhau Đồng thời với những nghiên cứu

về phân loại, tách bào tử, cấu trúc AMF thì ảnh hưởng của AMF đối với sự sinh trưởng của cây

cũng được quan tâm từ rất sớm Khi nhiễm 3 loài Gigaspora margarita, Glomus macrocarpum

và Glomus caledonium cho cây dâu tây, đã làm tăng đáng kể sinh khối và hàm lượng phốt pho trong cây, trong đó, Gigaspora margarita có hiệu quả kích thích mạnh hơn 2 loài còn lại Năm

1982, Dehne cũng phát hiện tác dụng kích thích sinh trưởng của AMF trên cây hành và cây ngô

Đến năm 1989, nghiên cứu khác còn phát hiện thêm bên cạnh khả năng tăng sinh khối, tăng tỷ lệ thân/rễ thì việc nhiễm AMF còn làm tăng hoạt động của enzyme nitrogenase và tăng mức độ đồng hoá phốtpho của các cây họ đậu Ngoài ra, Schonbeck và cs còn cho thấy: Thông qua hoạt động trao đổi chất của mình, AMF có ảnh hưởng đến Pyrophotphat (PPi) trong cây chủ, điều này cho thấy tác dụng rất lớn của AMF đối với toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của cây chủ

Năm 1983, Hayman đưa ra kết luận số lượng bào tử AMF trong đất là chỉ tiêu quan trọng

để đánh giá mức độ ưu thế của loài Trong đó ở đất canh tác, số lượng loài và số lượng bào tử nhiều hơn trong đất tự nhiên Mặt khác theo Friese thì AMF không dễ phát tán nên tầng đất canh tác là vị trí tốt nhất để xác định số lượng bào tử

Năm 1989, Schonbeck đã phân lập được 15 loài thuộc 3 chi khác nhau là: Glomus, Sclerocystis, Acaulospora trong đất vùng rễ của cây nho và 7 loài thuộc chi Glomus trong đất

vùng rễ của cây táo Trong đất trồng trọt thường xuyên (đất trồng lúa nước, đậu, lúa mỳ và nhiều loại cây trồng khác) luôn có số lượng bào tử AMF cao hơn nhưng thành phần loài của AMF lại thấp hơn so với trong đất tự nhiên Về khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh của AMF, Schonbeck và Dehne, 1989 đã nghiên cứu trên 11 loại cây trồng phổ biến là đậu, lúa mạch, lúa mì, cà rốt, ngô, hành, thuốc lá, cà chua, dưa chuột, rau diếp, hồ tiêu đã nhận thấy, chúng làm giảm 40% các bệnh ở rễ thường gặp trên các loại cây chủ này Kết quả nghiên cứu về mối quan hệ giữa AMF với các vi sinh vật vùng rễ, cho thấy sự có mặt AMF đã làm tăng đáng kể

lượng vi khuẩn tổng số (đặc biệt là nhóm Pseudomonas)

Năm 1991, tác giả Friese và Koske cho rằng tất cả bào tử của AMF đều được phán tán một cách thụ động với những nhân tố tích cực là gió và động vật Nhưng theo MacMahon và

Warner thì ở những vùng khô hạn, gió là nhân tố quan trọng nhất tạo ra sự lây nhiễm tự nhiên của AMF Còn với những nơi ẩm ướt, động vật lại là nhân tố đóng vai trò chủ yếu

Ở Trung Quốc, năm 2008 Wang và cs đã nghiên cứu đa dạng AMF từ 90 mẫu đất nông nghiệp (trồng ngô, lúa mì hoặc cam ngọt) ở vùng tìm được 30 loài AMF

3.6.2 Nghiên cứu về tình tình sử dụng AMF

Năm 1963, tác giả Gerdemann đã sử dụng đất không khử trùng như một cách lây nhiễm AMF và đã chứng minh được rằng cây trồng sẽ phát triển nhanh khi có mặt AMF Năm 1959, trong một báo cáo khoa học khác đã chỉ ra rằng, việc nhiễm AMF làm tăng sinh trưởng của cây táo con từ chồi Cho đến năm 1968, Gerdemann tiến hành thí nghiệm trên cây ngô và yến mạch cũng cho kết quả tương tự Tuy nhiên, những nghiên cứu về AMF này mới chỉ tập trung vào vấn

đề ảnh hưởng của chúng đối với sinh trưởng cây trồng mà chưa đề cập nhiều đến giá trị AMF đã mang lại cho cây chủ

Năm 1968, những nghiên cứu về AMF và ảnh hưởng của chúng đối với thực vật mới được tiến hành sâu rộng trên nhiều lĩnh vực nông lâm nghiệp khi các công bố về mối qua hệ cộng sinh giữa AMF và cây trồng (cả invitro và invivo) được công bố: AMF không chỉ làm tăng khả năng sinh trưởng, phát triển của cây trồng mà còn có thể làm tăng khả năng hấp thu khoáng (như phốtpho, đồng, kẽm…) trong đất; làm giảm mức độ “sốc” của cây khi đất bị nhiễm mặn, đất quá ẩm, nhiệt độ đất cao và nhiều nguyên nhân khác

Năm 2000, tác giả Ted cũng chỉ ra kết quả tương tự khi nghiên cứu khả năng chống bệnh

ở các cây nhiệt đới có AMF (giảm 30 - 45% các tác nhân gây bệnh)

Năm 2002, bằng thực nghiệm, Bali và cộng sự, đã chứng minh hiệu quả của AMF đối với

bệnh héo cây bông do nấm Fusarium gây ra Đối với bệnh ở rễ gây ra bởi tuyến trùng, AMF có

thể cải thiện sức sống của cây chủ, từ đó hạn chế những thiệt hại về sản lượng, đặc biệt với những vùng đất có hàm lượng P2O5 thấp và cây được nhiễm AMF trước khi bị nhiễm tuyến trùng Như vậy, AMF có thể làm giảm nguồn bệnh hoặc giảm ảnh hưởng của bệnh ở rễ có nguyên nhân do nấm và tuyến trùng gây ra Tuy nhiên, tác dụng của AMF không thể hiện rõ đối với bệnh ở lá và bệnh do virus

Trong nhiều năm qua, nấm nội cộng sinh AMF đã được nghiên cứu phổ biến rộng rãi ở khắp mợi nơi trên thế giới vì rằng việc sử dụng AMF trong nông nghiệp xanh không những làm tăng năng suất cây trồng mà còn giúp hạn chế gây ô nhiễm môi trường và đảm bảo sức khỏe con người so với việc sử dụng phân bón hóa học

3.6.3 Tình hình sử sụng AMF vào canh tác ngô

AMF có thể nội cộng sinh với 90-95% thực vật trên cạn là vật chủ của chúng, trong đó bao gồm các cây lương thực, cây nông nghiệp và các loại cây trồng có giá trị Ngô là loại cây

nông nghiệp trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới, chiếm tỉ trọng lớn trong số các cây lương thực chính và cũng là một vật chủ quan trọng của AMF Vì vậy có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa nấm rễ nội cộng sinh trong đất trồng ngô ở các nước trên thế giới Ngô là loại cây thích hợp với việc sử dụng hàm lượng P cao 5-20kg P/ha, trồng trong đất pha cát Để cây có thể

sử dụng P tốt hơn, việc sử dụng MAF, đặc biệt là AMF bản địa giúp chúng thâm nhập vào hệ rễ tốt hơn Phương thức, cách thức bổ sung AMF cũng đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công bố cho rằng bổ sung AMF trong giai đoạn phát triển trong giai đoạn sớm của ngô giúp việc hấp thu P sớm hơn, tăng cao năng suất cây trồng Hơn nữa, MAF có thể giúp cây hấp thu P và Zn

ở khoảng < 15cm

Việc bổ sung AMF vào đất chuyên canh ngô đóng vai trò quan trọng cho sự bền vững hệ sinh thái đất cũng như năng suất cây trồng Nếu trong vùng đất chuyên canh ngô, không bổ sung AMF trong một khoảng thời gian dài mà chỉ bổ sung phân bón hóa học NP sẽ làm giảm số lượng bào tử cũng như thành phần AMF bản địa Năm 2013, Mobasser và Tavassoli đã nghiên cứu ảnh hưởng của nấm AMF tồn tại trong đất trồng ngô trong điều kiện khô hạn ở vùng Goharkouh - Iran cho thấy khi xử lý đất trồng ngô với 140kg AMF/ha và không xảy ra khô hạn (điều kiện lý tưởng) thì số lượng hạt, năng suất sinh học, năng suất hạt và chỉ số thu hoạch là cao nhất Tuy nhiên, hàm lượng protein sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi bón 80 kg AMF/ha và gây hạn hán tại thời điểm hoa cái nở được 20 ngày Vamerali và cs, (2003) đã chỉ ra rằng, nếu ủ hạt ngô cùng AMF trước khi trồng sẽ tăng năng suất ngô bởi vì AMF giúp vận chuyển nước và chất dinh dưỡng tốt hơn sẽ giúp quá trình quang hợp tốt hơn và làm tăng năng suất cây trồng Sajedi và Madani, (2006) cho rằng, trồng ngô có sử dụng AMF tăng năng suất cây trồng trong cả điều kiện đầy đủ nước và điều kiện khô hạn Hajilau và cs, 2010 cho thấy, sử dụng AMF có thể làm tăng năng suất hạt 5%

3.7 Tình hình nghiên cứu AMF ở Việt Nam

Ở Việt Nam AMF đã được nghiên cứu từ những năm 1976 đến nay và đã đạt được một

số kết quả nghiên cứu quan trọng

Nghiên cứu đầu tiên của Nguyễn Sỹ Giao (1976) là về sự có mặt của nấm ngoại cộng sinh ở rễ cây thông Nghiên cứu sử dụng nấm cộng sinh thuần chủng để tạo rễ nấm cho cây thông con, kết quả cho thấy sự vượt trội về chiều cao và đường kính của những cây được nhiễm nấm so với công thức đối chứng là 20 - 30%, đồng thời đã sử dụng nấm nội cộng sinh để phòng bệnh vàng còi ở thông con và cũng đạt được những kết quả nhất định

Năm 1998, Phạm Quang Thu và cộng sự tiếp tục nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, trong đó được 37 loài nấm (thuộc 9 họ và 7 bộ) cộng sinh với 3 loài thực vật (thông nhựa

Pinus merkussi, thông đuôi ngựa Pinus massoniana và thông caribe Pinus caribaea) Công trình

này được coi như sự khởi đầu lại cho những nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, đặc biệt

trên đối tượng cây lâm nghiệp Kết quả không chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần loài nấm

mà còn đi sâu hơn trong việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm nấm cộng sinh, ứng dụng rộng rãi trong gieo ươm cây con ở keo và bạch đàn Đây là một mốc quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh vì đã chủ động được nguồn nấm lây nhiễm thông qua các chế phẩm sinh học Giá trị của nghiên cứu này còn được thể hiện trong thực tiễn sản xuất tại tỉnh Vĩnh Phúc, sử dụng chế phẩm nấm cộng sinh đã cải thiện đáng kể tình hình sinh trưởng của cây trồng ở nhiều vùng đất đồi Về mối quan hệ giữa AMF với cây dược liệu, nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc thu thập mẫu bào tử nấm cộng sinh

Năm 2004, Trần Văn Mão đã nghiên cứu hiệu quả của nấm VA - Mycorrhiza chủ yếu là

nấm Glomus, về khả năng hấp thu dinh dưỡng P Hàm lượng P trong tế bào rễ cây bắp có sự cộng sinh của nấm VA - Mycorrhiza tăng 35% đối với các loài nấm Glomus mosseae và 98% đối với loài nấm Glomus fasciculatum Hàm lượng P được tích luỹ trong rễ bắp ở dạng hỗn hợp phân

tử P hữu cơ và acid hoà tan Hàng ngày P được di chuyển đến các bộ phận của cây bắp theo phương pháp động lực học, và phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng của cây

Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Sức và cộng sự, khi tiến hành nghiên cứu

“Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) và quần thể vi sinh vật trong đất trồng

bưởi đặc sản Đoan Hùng, Phú Thọ” đã phát hiện sự có mặt của AMF trong tất cả các mẫu thu thập được nhưng tỷ lệ xâm nhiễm thấp chỉ đạt mức 3/5, khả năng nảy mầm của các bào tử nấm rễ bưởi thấp (chỉ đạt 16%) Trong một nghiên cứu khác, các tác giả đã sử dụng 3 loại cây ký chủ (ngô, cao lương, lúa mạch) và 3 chủng AMF để nhân bào tử và đưa ra kết luận: Khi nhân bào tử nhờ cây ký chủ, mỗi loài cây ký chủ thích hợp cho một chủng nấm, riêng cao lương không thích hợp dùng làm cây ký chủ để nhân nhanh bào tử AMF, thời gian thu bào tử tốt nhất là 25 - 40 ngày sau khi cây ký chủ mọc Các kết quả nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh (2005, 2007) trên cây họ đậu cũng cho một số kết quả khả quan ban đầu Ngoài ra, nhiều nghiên cứu còn cho thấy AMF có thể cộng sinh vào các thực vật dược liệu, trên đất trồng chè, đất trồng bưởi Đoan Hùng

Nghiên cứu mới đây của Phạm Quang Thu và Lê Quốc Huy về ảnh hưởng của chế phẩm AMF dùng cho cây trồng rừng cho thấy: sau 1 năm bón nhiễm chế phẩm AM đã làm tăng trưởng Keo tai tượng, Keo lá tràm từ 16,29 - 34,14% tùy từng loài và tùy từng địa điểm Bên cạnh đó , sau một năm bón nhiễm chế phẩm AM, môi trường đất có xu hướng cải thiện về số lượng vi sinh vật đất tổng số, đặc biệt số lươ ̣ng bào tử AM trong đất tại hiện trường Đoàn Hùng tăng ma ̣nh đa ̣ t

492 bào tử /100 gam đất, cao hơn đối chứng 112%

Năm 2012, Trần Thị Như Hằng và cộng sự đã nghiên cứu đa dạng AMF trên cây lúa và

cây cà chua và đã tìm thấy 5 chi: Scutellospora, Glomus, Acaulospora, Gigaspora, và

Entrophospora Trong đất và rễ cam tại Quỳ Hợp - Nghệ An, Nguyễn Thị Kim Liên và CS

(2012) đã điều tra từ từ 60 mẫu đất và rễ cam và đã phân lập được 16 loài AMF thuộc 6 chi:

Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystis, Glomites và Gigaspora Sự phân bố của

AMF ở các tầng đất khác nhau từ 0-20cm, 20-40cm, 40-60cm cho thấy có sự khác biệt rất lớn

về sự phân bố của AMF giữa các giống cam và giữa các tầng phẫu diện Nghiên cứu còn cho thấy có sự xâm nhiễm trở lại của AMF trên cây cam con, cây cam con được bổ sung bào tử AMF

có chiều dài rễ và số lượng rễ lớn hơn so với cây đối chứng

Trần Thị Dạ Thảo và cs (2012) nghiên cứu sự cộng sinh của nấm Mycorrhizae trên 90 mẫu đất cây ngô vùng Đông Nam Bộ (Vũng Tàu, Tây Ninh và Đồng Nai) cho thấy sự phân bố bào tử AMF thay đổi tùy theo từng vùng đất trồng ngô và ảnh hưởng bởi đặc điểm lý hóa, tính

chất đất và cơ cấu cây trồng Glomus, Acaulospora, Gigaspora, và Scutellospora là các chi nấm

hiện diện chủ yếu ở trên các mẫu đất trồng ngô nghiên cứu

Đỗ Thị Xuân và cs (2016) nghiên cứu khảo sát sự xâm nhiễm và sự hiện diện các bào tử nấm rễ nội cộng sinh (AM) trong đất vùng rễ và rễ cây bắp, mè

và ớt được trồng trên đất phù sa ở thành phố Cần Thơ Kết quả cho thấy rễ bắp, mè và ớt có sự xâm nhiễm của nấm rễ Sự hiện diện của nấm rễ ở rễ cũng như số lượng bào tử trong đất vùng rễ của cây bắp cao nhất và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với cây mè và ớt Định danh được bốn chi nấm là

Acaulospora, Entrophosphora, Glomus, Gigaspora và ba chi nấm chưa

được định danh; hai chi Acaulospora và Glomus được tìm thấy ở cả ba mẫu đất vùng rễ của bắp,

mè và ớt

Võ Thị Tú Trinh và Trương Minh (2017) khảo sát sự hiện diện của bào tử nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong mẫu rễ và đất vùng rễ của cây bắp, mè, ớt được trồng ở thành phố Cần Thơ, Sóc Trăng, Đồng Tháp, Vĩnh Long và Hậu Giang có pH từ 3,64 - 5,80, đất thịt pha sét, trên các ruộng bắp khoảng 40 ngày tuổi cho thấy tất cả các mẫu đất và rễ đều có sự hiện diện nấm rễ (vesicular arbuscular mycorrhiza - VAM) cộng sinh Tỷ lệ xâm nhiễm của nấm trong rễ bắp tương quan thuận với giá trị pH đất (từ 3,6 - 5,8) tại vùng trồng bắp Đa dạng AMF

thuộc về ba chi: Glomus, Acaulospora và Entrophospora Các bào tử thuộc chi Glomus và Acaulospora hiện diện ở tất cả các mẫu đất trồng bắp thu thập từ năm tỉnh trên, chi Entrophospora chỉ hiện diện trong mẫu đất thuộc hai tỉnh Cần Thơ và Sóc Trăng

Ở Việt Nam, những nghiên cứu trên chủ yếu tập trung vào phân lập, phân loại và đánh giá thành phần các loài nấm rễ trên các cây nghiên cứu Tuy nhiên, trong các nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Phạm Quang Thu và Lê Quốc Huy thì đã nghiên cứu phát triển chế phẩm AMF cho cây lâm nghiệp, trong đó chú trọng đến cây thông và cây bạch đàn

Mặc dù, AMF có quá nhiều lợi ích, song sản phẩm thương mại từ chúng chưa được phổ biến rộng rãi trên thị trường bởi vì có quá nhiều khó khăn trong các kỹ thuật nuôi cấy nhân giống bào tử AMF Đặc biệt là phương pháp phân lập bào tử AMF Do vậy việc nghiên cứu tìm kiếm phương pháp phân lập bào tử để thu nhận nấm AMF, đồng thời đánh giá thành phần loài, mối tương quan và sự đa dạng về nấm AMF ở các khu vực là cần thiết và có ý nghĩa khoa học

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm rễ nội cộng sinh được phân lập từ các mẫu đất đã được thu thập từ các cánh đồng ngô của các xã tại Duy Tiên - Hà Nam và Thường Tín - Hà Nội

4.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học

Thời gian nghiên cứu: 01/2016- 11/2017

4.3 Vật liệu và trang thiết bị

dưỡng

6,9 25,5 Đất cứng, ướt, giàu

dinh dưỡng N06 6,5 26,4 Đất cát, khô 6,5 28,1 Đất xốp, ướt, giàu dinh dưỡng N07 6,7 31,3 Đất cát, ướt 6,6 24,8 Đất phù sa pha cát, tơi xốp N08 6,5 31,4 Đất cát, ướt 6,5 27,9 Đất phù sa pha cát, tơi xốp N09 6,8 33,6 Đất cát, ướt 6,8 27 Đất phù sa pha cát,

tơi xốp N10 6,5 24,5 Đất cát, ướt 6,5 25,5 Đất phù sa pha cát,

vàng nhạt N13 6,7 31,3 Đất phù sa pha cát, khô 8 20,6 Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N14 6,5 30,1 Đất phù sa pha cát, khô 8 22,8 Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N15 6,5 30,5 Đất phù sa pha cát, khô 8 21,8 Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt

4.3.2 Dụng cụ

- Nồi khử trùng – Hirayama (Nhật)

- Kính hiển viAxio Plan II (Zeiis, Đức)

- Máy ly tâm (Sigma 3k30, Anh)

- Tủ cấy (Nuare, America)

- Finne Pipettes 200-1000 ml (Thermo, Mỹ)

Bước 2: Đổ chất lỏng qua sàng thô (500 μm.) để loại bỏ các phần lớn các chất hữu cơ Thu chất lỏng đi qua sàng Rửa sàng dưới vòi nước để tất cả các vật liệu nhỏ đã lọt qua

Bước 3: Khuấy đảo nhẹ nhàng các hạt trong chất lỏng đã đi qua sàng thô và cho phép các hạt nặng hơn lắng xuống trong vài giây

Bước 4: Tiếp tục lọc qua sàng 250 μm

Bước 5: Rửa vật liệu giữ lại trên sàng để đảm bảo rằng tất cả các vật liệu có kích cỡ nhỏ hơn 250 μm đã đi qua sàng

Lưu ý: có thể sử dụng sàng có kích thước khác nhau (100 μm, 50 μm) để sàng và lặp lại

các bước như ở trên để lấy bào tử có kích thước mong muốn

Bước 6: Chuyển phần vật chất dư lại trên sàng ở các kích cỡ khác nhau phía trên vào dung dịch đường nồng độ 30-50%

a Cách 1- Tinh sạch AMF bằng kháng sinh:

Cho bào tử AMF vào dung dịch chloraphenicol 0,04%

Lắc dung dịch spore hai lần và để yên trong hai phút

Dùng pipet hút dung dịch bào tử lại trong dung dịch kháng sinh (1% gentamycin sµlfate + 2% streptomcyin sulfate)

Lắc đều và để yên trong hai phút

Hút bào tử sang nước cất nguyên chất, để ở 4oC cho đến khi sử dụng

b Cách 2- Tinh sạch AMF bằng hóa chất:

Khử trùng bề mặt bằng natri hypochlorit 0,5% trong 5 phút bằng phương pháp tương tự như trên Rồi trộn lại các bào tử trong nước cất vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ 4oC cho đến khi

của Đại học West Verginia (http://www.invam.caf.wvu.edu/) và Schen& Pertez (1998) Cách pha dung dịch Melzer:

Bước 1: Hoà tan 1,5g KI đến 20ml nước cất

Bước 2: Hòa tan 0,5g I2 trong dung dịch từ bước 1

Bước 3: Hoà tan 20g clorrat hydrat trong dung dịch từ bước 2

4.4.5 Phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử

a Tách ADN

Sau khi phân lập, các bào tử AMF được tinh sạch bằng nước cất vô trùng (3 lần), nước muối NaCl 0,01% (3 lần), dung dịch kháng sinh chloraphenicol 0,04%, (1% gentamycin sulfate + 2% streptomcyin sulfate) (3 lần) và cuối cùng là ethanol 70% (3 lần)

Hút từng bào tử đơn độc vào ống eppendorf, dùng đầu côn phá vỡ bào tử

Bổ sung 70µl đệm phá vỡ tế bào (100mM Tris-HCl (pH=8.0), 20 mM Na2EDTA, 0.5 M NaCl và 1% sodium dodecylsµlfat)

Sau đó thêm 70µl CI (hỗn hợp chloroform: isoamylacohol = 24:1); li tâm thường 15000 vòng/ 5 phút Lặp lại 2 lần bước này

Hút ra 70µl dịch phía trên lớp huyền phù ra 1 ống eppendorf mới Thêm 70µl isopropanol và 7µl sodium acetate 3M rồi bảo quản mẫu ở -20°C trong 2 giờ Sau đó mẫu được tiến hành ly tâm lạnh 15000 vòng/15 phút để thu lấy kết tủa

Thêm 500µl ethanol 70%, li tâm lạnh 15000 vòng/15 phút ( lặp lại bước này 2 lần) Loại bỏ cồn, để khô tự nhiên Thêm 50µl MQ để trong tủ -20oC dùng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

b Khuếch đại ADN

Nhân đoạn ARN 18S dùng cặp mồi NS1 (5‟-GTA GTCATA TGC TTG TCT C-3‟) và

NS4 (5‟-CTT CCG TCAATT CCT TTA AG-3‟) (White và cộng sự 1990) Tiếp theo đó

chúng tôi tiến hành PCR lồng (nested RCR) bằng mồi AML1 (5‟-ATC AAC TTTCGA TGG TAGGAT AGA-3‟) và AML2 (5‟-GAACCC AAA CAC TTT GGT TTC C-3‟) đặc hiệu cho AMF để nhân đoạn gen AML của chúng (Lee và cs 2008).DNAr được khuếch đại trên máy GeneAmo PCR System 9700 (Appiled Biosystems), với các chu trình nhiệt như sau: đầu tiên ADN bị biến tính thành sợi đơn ở 94oC trong 3 phút, sau đó ADN được nhân đoạn ở 35 vòng, chu trình nhiệt như sau: (1) giai đoạn biến tính ADN thành sợi đơn ở 94oC trong vòng

30 giây, (2) giai đoạn bắt cặp- các cặp mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của ADN đích:

50oC trong 60 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ được nâng lên ở 72oC trong 1 phút nhiệt độ thích hợp cho enzyme Taq polymerase hoạt động; kết thúc nhân đoạn ADN: nâng nhiệt độ lên

72oC trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt độ này

 Thành phần phản ứng PCR :

e Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Quá trình điện di các sản phẩm của phản ứng PCR được thực hiện trên thạch agarose trong đệm TAE Đun tan 0,8 % agarose trong dịch TAE (1x) (dung dịch 50x TAE: 2 ml; nước cất: 98 ml; agarose:0,8g) để ấm, đổ vào khuôn đã cắm lược, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di Lấy 1µl dung dịch dye, trộn đều với 3 µl mẫu, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch ethidium bromua (nồng độ 0,5µl/ml) 20 phút, vớt ra quan sát Quan sát

trên máy soi gel

Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu bằng máy quang phổ bước sóng 280/260 Mẫu đạt tỉ lệ quanh chỉ số 1.8 là mẫu sạch

f Phân tích trình tự gen

Trình tự ADNr của AML được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động (3100 Avant, ABI, Mĩ) Kết quả đọc trình tự được so sánh với các trình tự của các loài đã được xác định trong

ngân hàng gen bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov) Cây phả hệ được xây dựng

bằng phần mềm Clustal X phiên bản 1.8 và NJ-tree (White, 1990)

4.4.6 Bảo quản AMF

Bảo quản AMF trên các điều kiện môi trường khác nhau, nhiệt độ (4oC, -20oC và -80oC) thời gian (01 tuần, 02 tuần, 03 tuần, 01 tháng, 02, 03, 04, 05, 06 và 07 tháng)

Các loại MT bảo quản:

+ MTBQ 1: 12% skimmied milk, 7% trehalose, 1% natri glutamate Khử trùng 121oC trong 15 phút

+ MTBQ2: MSR có bổ sung 10% glycerol Khử trùng 121oC trong 15 phút

+ MTBQ3: Trehalose 5%+ Glycerol 10% Khử trùng 121oC trong 15 phút

+ MTBQ4: Nước + Glycerol 10% Khử trùng 121oC trong 15 phút

4.4.7 Nhân nuôi AMF trên cây ngô ở quy mô phòng thí nghiệm

• Bước 1: Ngâm xơ dừa trong nước 30 phút

• Bước 2: Khử trùng những hạt xơ dừa bằng nồi hấp tiệt trùng

• Bước 3: Các hạt ngô giống F1 được làm sạch bằng nước cất vô trùng (3 lần), nước muối NaCl 0,01% (3 lần), dung dịch kháng sinh chloraphenicol 0,04%, (1% gentamycin sulfate + 2% streptomcyin sulfate) (3 lần) và cuối cùng là ethanol 70% (3 lần)

• Bước 4: Gieo hạt giống ngô vào hạt xơ dừa, tưới nước đã khử trùng mỗi ngày

• Bước 5: Sau khi hạt ngô nảy mầm 4 ngày thì chuyển sang trồng vào các loại bình khác nhau, ở các điều kiện khác nhau

Các loại môi trường dùng để nhân nuôi AMF trong cây ngô trong phòng thí nghiệm:

Đất cát Đất giàu dinh dưỡng Xơ dừa

• Bước 8: Nhuộm rễ ngô bằng xanh Trypan

4.4.8 Đánh giá khả năng xâm nhiễm AMF vào cây ngô ngoài đồng ruộng

•Bước 1- 4 thực hiện tương tự như nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

•Bước 5: Sau khi hạt ngô nảy mầm 4 ngày thì chuyển sang trồng vào hộp nhựa chứa 1000g cơ chất Chăm sóc, quan sát sự trưởng thành của cây ngô

•Bước 6: Thu hoạch cây ngô sau 5 tuần nuôi cấy Đếm số lượng AMF trong rễ và trong 100g đất trồng ngô

• Bước 7: Nhuộm rễ ngô bằng xanh Trypan

Khả năng lây nhiễm nấm vòa rễ cây (IP) được tính từ tổng số các bào tử tấn công vào tế bào rễ ngô, các điểm nối kết giữa rễ ngô và sợi nấm và các bào tử AMF tạo ra từ rễ Công thức được tính như sau (Liu and Luo, 1994):

IP = (N x W x K) + S Trong đó,

N = số lượng túi hoặc bào tử trong rễ hoặc điểm vào của sợi nấm

W = trọng lượng gốc

K = chiều dài gốc trên đơn vị trọng lượng của rễ

S = số lượng bào tử xuất hiện trong gốc

2.4.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của AMF lên sự nảy mầm của hạt

Để xác định hiệu quả của việc chủng AMF đối với sự nảy mầm của ngô trong ống nghiệm trong bốn ngày, làm theo các bước sau

• Bước 1: Các hạt ngô giống F1 được làm sạch bằng nước cất vô trùng (3 lần), nước muối NaCl 0,01% (3 lần), dung dịch kháng sinh chloraphenicol 0,04%, (1% gentamycin sµlfate + 2% streptomcyin sulfate) (3 lần) và cuối cùng là ethanol 70% (3 lần)

• Bước 2: Đưa hạt giống ngô F1 vào giấy vô trùng, để khô

• Bước 3: Gieo 20-30 hạt / đĩa Petri có lót giấy ẩm vô trùng

• Bước 4: Cho 100ml nước vô trùng vào mỗi đĩa Petri

• Bước 5: Hạt ngô F1 đã được tiêm với 50 AMF trên đĩa Petri thử nghiệm, đĩa đối chứng không

có AMF

4.4.10 Đánh giá hiệu quả sử dụng AMF vào sự phát triển của ngô ngoài đồng ruộng

- Lựa chọn môi trường, điều kiện thích hợp nhất cho khả năng hình thành AMF trong các bình

cơ chất ở phần 4.4.5

- Quan sát sự sinh trưởng, phát triển của cây sau 5- 6 tuần nuôi cấy, thu toàn bộ phần cơ chất +

rễ ngô trong mỗi bình

- Để khô tự nhiên, trong 2-3 ngày, nghiền nhỏ cơ chất, tạo thành chế phẩm

- Bón vào mỗi gốc ngô 100g cơ chất, phần đối chứng không bón

- Chăm sóc, quan sát sự sinh trưởng, phát triển của cây ngô, sự hình thành hoa, bắp ngô

- Thu hoạch ngô sau 8 tuần chăm sóc; Cân đo khối lượng cây ngô, số lượng lá, bắp ngô

5 Tổng kết kết quả nghiên cứu

5.1 Phân lập AMF và đa dạng AMF dựa vào số lượng bào tử

AMF phân bố rộng rãi trong lòng đất, từ bề mặt phía trên đến độ sâu 2,2 m (Zajieck và cộng

sự, 1986) Tuy nhiên, theo các nghiên cứu khác, 70-85% các bào tử được tìm thấy ở lớp đất bề mặt 3-10 cm (Jakobsen và Nielsen, 1983, Thompson, 1991) Vì vậy khi lấy mẫu, tiến hành loại

bỏ lớp đất 3cm ở phía trên để tránh ảnh hưởng của các yếu tố (ánh sáng, nhiệt độ, vv) làm ảnh hưởng đến mật độ, cấu trúc quần thể nấm AMF Tại mỗi địa điểm lấy mẫu, thu khoảng 500 g đất xung quanh rễ ngô

Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập AMF từ 15 mẫu đất trồng ngô ở Hà Nội và 15 mẫu khác ở Hà Nam Từ 30 mẫu đất đã phân lập được 3179 mẫu bào tử AMF bằng cách sàng lọc ướt (Brown 2015) và tách đơn bào tử (Choi và cs 1999) Trong đó, 693 bào tử thu được từ mẫu đất ở Hà Nội, 2486 bào tử thu được ở 15 mẫu ở Hà Nam Kết quả trong Bảng 5.1, Hình 5.1

6,9 25,5 Đất cứng,

ướt, giàu dinh dưỡng

116,33 ±3,14

N10 6,5 24,5 Đất cát, ướt 87,33 ± 5.24 6,5 25,5 Đất phù sa pha cát, tơi

166,67 ± 1,36

Hình 5.1 Số lượng trung bình các bào tử AMF phân lập được ở

Giá trị SD trong đất trồng ngô Hà Nội và Hà Nam tương đồng với một số nghiên cứu khác từ đất trồng lúa, cà chua, cam ở Hà Nội và Nghệ An; SD trung bình/100g đất cà chua là 173 bào tử AMF và trong đất trồng lúa là 181 bào tử AMF [8] Tuy nhiên khi so với một số nghiên cứu khác trên thế giới, chẳng hạn Zhao và cộng sự (2003) nghiên cứu sự đa dạng của AMF trong rừng mưa nhiệt đới của Xishuangbanna, Tây Nam Trung Quốc thì mật độ bào tử SD trung bình

là 675

Trong một số nghiên cứu khác (Medeiros và cs 1994, Giovannetti 2000, Dạ Thảo 2012,

Tú Trinh và Dương Minh 2017) cho thấy sự phân bố AMF trong đất trồng ngô còn thay đổi theo

pH đất, số lượng AMF tăng dần đều từ pH 4-6 Trong nghiên cứu này của chúng tôi, các mẫu đất thu thập có pH từ 6-8, sự phân bố của AMF tương đối lớn ở các mẫu đất cát có độ pH từ 6,5 đến 6,8 và độ ẩm từ 14,5 đến 26,3 Với mẫu thu thập tại Hà Nội, số lượng AMF thường là 10-35 bào tử/100g mẫu đất Tuy nhiên, con số này tăng vọt khi phân lập ở các mẫu đất cây ngô trồng trên

Số lượng bào tử

đất cát, ví dụ mẫu HN 6 (đất cát khô, 77,0 ± 3,31 bào tử/ 100g đất), HN 7 (đất cát ướt, 86,2 ± 1,0 bào tử/ 100g đất), đáng chú ý là HN 8 (đất cát ướt, 102,1 ± 3,2 bào tử/ 100g đất) Với mẫu thu thập tại Hà Nam, mật độ AMF trung bình 165,72 bào tử/100g đất phân lập, tuy nhiên trên mẫu N04- đất cát ẩm, mật độ bào tử trung bình là 304,00 bào tử/100g đất

Hình 3.2 Đa dạng các bào tử AMF ở các mẫu đất khác nhau

3.2 Đa dạng AMF dựa vào tần suất xuất hiện

Sau khi phân lập các bào tử AMF từ 30 mẫu đất trồng ngô ở Hà Nội và Hà Nam, chúng tôi tiến hành phân loại chúng dựa vào quan sát hình thái Vì AMF cộng sinh bắt buộc chúng không thể phát triển trên môi trường thạch như các loại nấm khác Do đó, chúng tôi trực tiếp xác định các loài AMF ngay sau khi phân lập các AMF bào tử từ các mẫu đất Mỗi bào tử AMF đã được quan sát thấy sau khi nhuộm chất phản ứng của Melzer dưới kính hiển vi và dựa trên kích thước, hình dạng, màu sắc, cấu trúc vách theo các mô tả và hình ảnh được cung cấp Bảo tàng giống Quốc tế về Mycorhiza Fungi (http: //invam.caf.wvu.edu), kết quả được trình bày ở Bảng 5.2

15 mẫu đất lấy từ rễ và gốc cây ngô thu thập ở đất Thường Tín - Hà Nội, bằng phương

pháp phân tích hình thái, chúng tôi phân loại chúng vào 8 chi, 14 loài: Acaulospora (3 loài): A capsicula, A amellea, A rehmii; Cetraspora (1 loài): C pellucida; Dentiscutata (1 loài): D reticulata ; Glomus (3 loài): G ambisporum, G intraradices, G macrocarpum; Gigaspora (4 loài): G albida, G decipiens, G gigantea, G margarita; Racocetra (1 loài): R gregaria; Rhizophagus (2 loài): R clarus, Rhizophagus sp; Septoglomus (01 loài): S constrictum Trong

đó, Acaulospora; Dentiscutata; Gigaspora; Glomuslà những chi chiếm ưu thế, tần suất xuất hiện lần lượt là 13,40%; 15,46%; 40,42%; 13,40% Gigaspora decipiens, Gigaspora gigantean, Glomus macrocarpum và Acaulospora longula là những loài chiếm ưu thế, tần suất xuất hiện

lần lượt là: 20,62 %; 13,6 %; 11,34 % và 11,34 % (Bảng 5.2)

Bảng 5.2 Phân loại nấm rễ nội cộng sinh và tần suất xuất hiện của chúng

Số lần xuất hiện

Tần suất xuất hiện (%)

Số lần xuất hiện

Tần suất xuất hiện (%)

Từ 15 mẫu đất lấy từ rễ và gốc cây ngô thu thập ở đất Duy Tiên– Hà Nam, bằng phương pháp phân tích hình thái, chúng tôi phân loại chúng vào 8 chi, 18 loài, trong đó có 3 chi, 10 loài

có hình thái bào tử khác với các chi/ loài đã biết - chúng được cho rằng có thể đây sẽ là những đơn vị phân loại AMF mới Tuy nhiên, để khẳng định điều này cần nhiều các thí nghiệm khác

Đa dạng AMF từ đất trồng ngô Hà Nam cụ thể như sau: Acaulospora (6 loài): A morrowiae, A gerdemanii, A longula; Acaulospora sp 1, Acaulospora sp 2, Acaulospora sp 3, Dentiscutata (2 loài): D reticulata, Dentiscutata sp.; Glomus (1 loài): Glomus sp.; Gigaspora (3 loài): G decipiens, G gigantea, G margarita; Rhizophagus (2 loài): R clarus, Rhizophagus sp và ba chi

được cho là mới, các chi này có hình dạng không giống với các mô tả AMF trước mà nhóm tác

giả đã biết Acaulospora, Gigaspora, là những chi chiếm ưu thế, tần suất xuất hiện của chúng theo thứ tự lần lượt là: 37 %; 29,1 % Gigaspora decipiens và G gigantean là những loài chiếm

ưu thế, tần suất xuất hiện lần lượt là: 11,8% và 12,6% Kết quả này khá tương đồng so với các nghiên cứu trước đó của Dạ Thảo (2012), Võ Thị Tú Trinh và Dương Minh (2017) cho rằng

Acaulospora, Gigaspora và Glomus là những loài AMF chiếm ưu thế trong đất trồng ngô ở

miềm nam Việt Nam Hay nghiên cứu của Trần Thị Như Hằng và cộng sự (2012) và Nguyễn Thị

Kim Liên và cộng sự (2012) cũng cho rằng Acaulospora, Gigaspora và Glomus là những loài

AMF chiếm ưu thế trong đất trồng cà chua, mía và cam ở Việt Nam

Đa dạng AMF trong nghiên cứu này của chúng tôi lớn hơn rất nhiều so với một số nghiên cứu tương tự trước đó tại Việt Nam đã được công bố: Trần Thị Dạ Thảo (2012) phân lập AMF từ 80 mẫu đất tại Vũng Tàu, Đồng Nai và Tây Ninh đã phát hiện được 4 chi AMF chủ

yếu: Glomus, Acaulospora, Gingaspora và Scutellospora Hay trong nghiên cứu của Đỗ Thị

Xuân và cs (2016) về đa dạng AMF trên đất trồng bắp, mè, ớt ở Cần Thơ chỉ phân lập được 7

chi: Acaulospora, Gingaspora, Glomus, Entrosphora và 3 chi chưa phân loại được Đa dạng

nấm rễ nội cộng sinh trên rễ cây ngô cao hơn so với một số loại cây lương thực khác (lúa, cà chua) ở Việt Nam Chẳng hạn năm 2012 Trần Thị Như Hằng và cộng sự đã nghiên cứu đa dạng

AMF trên rễ cây lúa và cây cà chua, các tác giả đã phát hiện được 5 chi: Scutellospora, Glomus, Acaulospora, Gigaspora và Entrophospora Hay trong một nghiên cứu về đa dạng AMF trên rễ

cây cam ở Quỳ Hợp, Nghệ An, từ 60 mẫu đất, các tác giả cũng chỉ phát hiện được 6 chi:

Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystis, Glomites and Gigaspora), 16 loài Tuy

nhiên so với cá nghiên cứu khác trên thế giới thì sự đa dạng AMF trong nghiên cứu của chúng tôi còn khá khiêm tốn: Zhang và cs 2003 đã tìm được 47 loài AMF từ đất khô hạn hay Wang và cộng sự (2008) đã tìm được 33 loài AMF từ đất ngập mặn, Zhao và cộng sự (2003) tìm được 5 chi, 27 loài AMF từ rừng mưa nhiệt đới Xishangbanna,

5.3 Đa dạng AMF trong đất trồng ngô Hà Nội và Hà Nam dựa vào mật độ loài trong đất trồng ngô

Bảng 5.3 Khả năng phân bố của AMF trong đất (mật độ loài (SR))

TT

Mẫu

Loài AMF xuất hiện Giá trị SR

Hình 5.3 Mật độ loài AMF ở đất trồng ngô Hà Nội và Hà Nam

Sự phân bố về mật độ loài (RS) của 15 loài AMF trong 15 mẫu đất trồng ngô Hà Nội thể hiện trong bảng 2 cho thấy mật độ loài thay đổi từ 1-7 loài/mẫu (trung bình là 3,6 loài), trên các mẫu đất cát

Hà Nội 6; 8; 9 SR là từ 5- 7 Sự phân bố về mật độ loài (RS) của 15 loài AMF trong 15 mẫu đất trồng ngô Hà Nam là từ 6-15 loài/mẫu (trung bình là 8,73 loài), trong khi đó trên mẫu đất cát khô Hà Nam 1; 3; 4; 6; 7 SR là từ 10-15

Từ các kết quả của nghiên cứu này có thể nhận định rằng đặc điểm điều kiện tự nhiên ảnh hưởng đến tính đa dạng thành phần loài của AMF trong vùng sinh khái nghiên cứu giữa Hà Nội và Hà Nam khác nhau dẫn đến thành phần loài ở Hà Nam cao hơn hẳn so với Hà Nội

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến mật độ bào tử và sự phong phú của loài trong một khu hệ nấm rễ, chẳng hạn như tính thời vụ, các yếu tố hình thái, sự phụ thuộc vào cây chủ, tuổi cây chủ, khả năng hình thành bào tử của AMF, và sự phân bố bào tử nấm AMF trong đất, mật độ bào tử nấm AMF liên kết với các cây khác nhau ở các địa điểm khác nhau

3.4 Bảo quản AMF và lựa chọn AMF sau bảo quản

Từ 3179 bào tử AMF phân lập được từ 30 mẫu đất trồng ngô tại Hà Nội và Hà Nam, chúng tôi đã lựa chon 50 chủng để tiến hành bảo quản chúng ở 4 loại môi trường khác nhau (MTBQ1, MTBQ2, MTBQ3 và MTBQ4), các môi trường này đều là các môi trường bảo quản tốt cho vi nấm tại các Bảo tàng giống chuẩn trên thế giới Fungi (http: //invam.caf.wvu.edu) Kiểm tra hình thái của các bào tử đã lựa chọn theo thời gian bảo quản từ 1-6 tháng, tại các nhiệt

Số lượng

độ khác nhau: 4, 20 và -80 (oC), chúng tôi nhận thấy rằng các bào tử AMF nấm vẫn có đảm bảo được cấu trúc, hình dáng và mầu sắc ban đầu (Bảng 5.4)

Đánh giá khả năng xâm nhiễm lại cây chủ sau 6 tháng bảo quản bằng phương pháp kiểm tra khả năng nảy mầm của hạt Chúng tôi nhận thấy khả năng xâm nhiễm vào cây chủ của chúng giảm đi đáng kể sau 6 tháng bảo quản Các loài có TSXH thấp (≤ 10%), sau 6 bảo quản khả năng xâm nhiễm lại cây chủ của chúng giảm đi đáng kể, còn lại 30-55% so với đối chứng (bào tử AMF vừa phân lập) Đặc biệt chi New AMF 3 không còn khả năng xâm nhiễm sau 6

tháng bảo quản Trong khi đó một số loài có có TSXH cao như Gigaspora decipiens, Gigaspora

gigantean khả năng lây nhiễm lại vật chủ khá cao sau thời gian 6 tháng bảo quản (80-87%)

(Bảng 5.4) so với đối chứng Căn cứ vào tần suất xuất hiện, vào số lượng bào tử phân lập và khả năng xâm nhiễm vào vật chủ của AMF sau thời gian bảo quản chúng tôi đã lựa chọn 4

chủng: Gigaspora decipiens, Gigaspora gigantean, vì vậy các chủng này được dùng cho các thí

nghiệm sau

Bảng 5.4 Bảo quản 50 chủng AMF để bảo quản và kiểm tra khả năng xâm nhiễm vật chủ sau

thời gian bảo quản

STT Tên loài

Số lượng chủng AMF bảo quản

Hình thái bào tử AMF sau các thời gian bảo quản khác nhau

(tháng) Khả năng

nhiễm (%)

Hà Nội

Hà Nam 1 2 3 4 5 6

STT Tên loài

Số lượng chủng AMF bảo quản

Hình thái bào tử AMF sau các thời gian bảo quản khác nhau

(tháng) Khả năng

nhiễm (%)

Hà Nội Nam Hà 1 2 3 4 5 6

N Bào tử còn nguyên sau thời gian bảo quản

Hình 5.4 Ảnh hưởng của AMF lên sự nảy mầm của mầm hạt ngô

5.5 Phân loại dựa vào phương pháp sinh học phân tử

Phân loại nấm AMF tồn tại trong rễ cây là việc làm khó và tốn kém, ở hầu hết các nghiên cứu trước đó các tác giả đều nghiên cứu đa dạng AMF dựa vào phân tích hình thái: Zhao và cs (2003), Trần Thị Như Hằng và cs (2012), Trần Thị Dạ Thảo (2012), Lê Thị Thủy (2012), Đỗ Thị Xuân và cs (2016), Võ Thị Tú Trinh và Tuyết Minh (2017),… trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn một số bào tử của các chi AMF có tần suất xuất hiện cao:

Acaulospora longispora AMF4, Glomus macrocarpum AMF15, Gingaspora decipens AMF13

và Gigaspora gigantean AMF14 ở cả 2 địa điểm nghiên cứu để phân loại chúng dựa vào phân

tích trình tự gen ARN 18S đoạn AML1/AML2 Trước tiên các bào tử AMF này được tách riêng từng bào tử đơn độc, tinh sạch, sau đó dùng hạt thủy tinh và đệm để phá vách tế bào tách chiết DNA của chúng Rồi nhân gen 18S bằng mồi NS1-NS4, sau đó tiếp tực PCR lồng đoạn gen AML1/AML2 (Lee và cs 2008) Kết quả giải trình tự gen của 04 chủng AMF nghiên cứu được trình bày trên Hình 5.5

Hình 5.5 Cây chủng loại phát sinh của các chủng AMF nghiên cứu và các loài có mối quan hệ

họ hàng gần dựa vào phân tích trình tự 18S Giá trị Bootstrap value > 50% được thể hiện trên

cây Bar 0.01 Phân tích trình tự gen dựa vào phân tích trình tự đoạn 18S của AMF38, AMF42, AMF50

và AMF52 cho thấy: AMF14 nằm trên cùng một nhánh với Glomus macrocarpum, giá trị bootstrap cao- 91% AMF4 nằm trên cùng một nhánh với Unculture Acaulospora và Acaulospora longula với giá trị bootstrap 57-74%

Phân tích chủng loại phát sinh còn cho thấy AMF13 và AMF14 có họ hàng gần gũi với

nhau và với Gingaspora marganita AMF13 và AMF14 nằm trên cùng nhánh nhỏ với giá trị Bootstrap 99%; nhánh nhỏ này nằm trên cùng cụm với G marganita, giá trị bootstrap là 52%

Tuy nhiên số liệu trình tự AMF trên NCBI hiện giờ chủ yếu chỉ là các unculture fungus, do AMF là các chủng nấm nội cộng sinh bắt buộc trong cây chủ Việc phân tích chúng chủ yếu dựa

vào clone gen từ mẫu cây chủ

5.6 Nhân nuôi AMF trong phòng thí nghiệm

5.6.1 Nhân nuôi AMF trong xơ dừa

Xơ dừa ngâm nước, khử trùng, để nguội, bổ sung hạt ngô đã làm sạch và ngâm qua đêm, sau đó tiêm 05 bào tử AMF vào mỗi hạt ngô Quan sát sự nảy mầm, phát triển của hạt trong vòng

Paraglomus occultum KP144314 Diversispora epigaea X86687AMF14

93 Acaulospora cavernata AJ306442

Acaulospora laevis Y17633 Acaulospora spinospora Z14004

01 tuần Kết quả được thể hiện trên Bảng 3.5 và Hình 3.6

Bảng 5.5 Ảnh hưởng của các loại AMF lên sự phát triển của ngô trên xơ dừa

Loại bào tử G.decipien G.gingatea

Glomus macrocarpum

Hình 5.6 Ảnh hưởng của AMF lên sự phát triển của ngô khi nuôi trên xơ dừa

Trong số 4 loại AMF bổ sung vào quá trình nuôi ngô trên xơ dừa cho thấy cả 4 loại AMF

đều kích thích cây chủ sinh trưởng, phát triển, tuy nhiên Acaulospora longula là loài có khả năng

xâm nhiễm vật chủ tốt nhất, có thể tăng kích thước chiều cao cây chủ nhiều nhất, gấp 4,5 lần so với đối chứng

5.6.2 Nhân nuôi AMF vào cây ngô đã trồng trực tiếp trong cốc nhựa 100g cơ chất

Chuẩn bị 100g cơ chất môi trường nuôi cấy nấm rễ nội cộng sinh trong phòng thí nghiệm (MT1, MT2, MT3, MT4,MT5), khử trùng 121oC, 15 phút, để nguội, cho vào cốc nhựa Sau đó bổ sung mỗi cốc 02 hạt ngô đã khử trùng bề mặt, bổ sung lượng nước đủ ẩm mỗi ngày Sau 5 ngày

tiêm 05 bào tử AMF Acaulospora longuta vào mỗi gốc cây Tiếp tục chăm sóc và quan sát sinh

trưởng, phát triển của cây Thu cây, kiểm tra trọng lượng cây, rễ và đếm số lượng bào tử Kết quả được trình bày trên Bảng 5.6 và Hình 5.7

Bảng 5.6 Nhân nuôi AMF trên cốc nhựa trong phòng thí nghiệm

No Trọng lượng cây (g) Khối lượng rễ (g) Số bào tử AMF/ cốc

tử AMF như mong muốn

5.6.3 Nghiên cứu phương pháp nuôi AMF trong Port culture

Chuẩn bị Port culture:

- Thu vỏ chai lavie 350ml;

- Cắt đôi vỏ chai;

- Úp ngược phần trên của chai vào phần dưới chai;

- Phần dưới bổ sung khoáng là môi trường MSR;

- Phần trên dùng để 350g cơ chất (đã khử trùng), trồng ngô có bổ sung AMF

Nhân nuôi AMF vào portculture:

Chuẩn bị các môi trường nuôi cấy nấm rễ nội cộng sinh trong phòng thí nghiệm (MT1, MT2,

MT3, MT4, MT5), khử trùng 121oC, 15 phút, để nguội, cho vào Port culture đã chuẩn bị ở phần trên 350g cơ chất Chuyển bầu ngô xơ dừa đã bổ sung AMF được 01 tuần sang portculture đã chuẩn bị ở trên Quan sát sự phát triển của cây ngô sau 5 tuần nuôi cấy, thu hoạch cây và AMF trong portculture Nghiên cứu ảnh hưởng của AMF lên sự phát triển của cây về chiều cao và trọng lượng thân ngô Kết quả được trình bày trên Bảng 5.7, Hình 5.8, 5.9

Bảng 5.7 Ảnh hưởng của AMF lên chiều cao và trọng lượng khô của cây

P Trọng lượng khô của cây (g); H Chiều cao cây (cm)

Kết quả trên Bảng 5.7 và Hình 5.8, 5.9 cho thấy A longula, Glomus macrocarpum khi được

nuôi trên môi trường MT5 là môi trường có thành phần dinh dưỡng gồm đất cát: đất giàu dinh dưỡng: xơ dừa với tỉ lệ 1: 1: 1 là môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Chiều cao cây 55-57 cm (tăng 57,14-62,86% so với đối chứng), trọng lượng cây 5,9-6,9 g (tăng 78,79-109,1% so với đối chứng) Trên môi trường MT2 (đất cát: đất giàu dinh dưỡng: xơ dừa với tỉ lệ 2: 1: 1), khi đó chiều cao thân của cả 2 loại ngô là 53cm, trọng lượng khô đạt 3,7-4,7g/ cây

Hình 5.8 Ảnh hưởng của các môi trường và các loại bào tử khác nhau lên chiều cao ngô

(cm) sau 5 tuần nuôi cấy

Hình 5.9 Ảnh hưởng của các môi trường và các loại bào tử khác nhau lên trọng lượng ngô

(g) sau 5 tuần nuôi cấy Sau 5 tuần nuôi cấy AMF trên các môi trường nuôi cấy khác nhau sau 5 tuần, chúng tôi tiến hành thu bào tử có trong portculture, kết quả được thể hiện trên Bảng 5.8 và Hình 5.10

Bảng 5.8 Số lượng bào tử AMF sau 5 tuần nuôi cấy ở các môi trường khác nhau

Hình 5.10 Số lượng bào tử AMF

hình thành sau 5 tuần nuôi cấy

Hình 5.11 Nhân nuôi AMF trong portculture: Trái có bổ sung AMF, Phải: Không bổ sung

AMF

So sánh kết quả đạt được giữa việc nuôi AMF trong cốc nhựa và AMF trên portculture

sẽ thấy việc nuôi trong portculture chiếm ưu thế về cả số lượng bào tử và chất lượng cây trồng Nếu nuôi trong cốc nhựa ở trên AMF chỉ đạt 120- 132 bào tử / 100g cơ chất, tương đương với số AMF ngoài tự nhiên trên cây chủ trường thành Trong khi đó, nếu nuôi trên

portculture thì số lượng bào tử AMF đạt gấp 2-3 lần nuôi trong cốc Bào tử A longula đạt

652 AMF/100g cơ chất, tiếp đến là G gingatea, số lượng bào tử đạt 548 AMF/100g cơ

chất Con số này gấp 3-7 lần so với số AMF phân lập được từ đất trồng ngô trưởng thành ở Nam Định và Hà Nội

5.6.4 Quy trình nhân nuôi AMF

Từ các kết quả trên, chúng tôi đưa ra được quy trình nhân nuôi nấm rễ nội cộng sinh như sau:

25oC, 1 tuần

Sấy khô, đóng gói chế phẩm B7:

Bào tử AMF

Mô tả quy trình:

Bước 1: Hoạt hóa AMF

Các bào tử AMF được lưu trữ trong glycerol -80oC được cho ra ngoài, để vào tủ lạnh

4oC trong 24h, sau đó để vào tủ ấm37oC trong 6h tiếp theo thì có thể đem ra sử dụng

Bước 2: Làm sạch hạt giống ngô

Các hạt ngô giống F1 được làm sạch bằng nước cất vô trùng (3 lần), nước muối NaCl 0,01% (3 lần), dung dịch kháng sinh chloraphenicol 0,04%, (1% gentamycin sulfate + 2%

streptomcyin sulfate) (3 lần) và cuối cùng là ethanol 70% (3 lần)

Bước 3:Nuôi hạt ngô giống vào bầu

Hạt giống ngô sau khi được làm sạch để loại bỏ tạp nhiễm, được đưa vào nuôi trong bầu ngô có cơ chất là xơ dừa, bầu ngô này được ngâm trong nước, sau đó vớt ra, giữ trong buồng

ẩm 70%

Bước 4: Bổ sung AMF vào bầu ngô để AMF cộng sinh vào rễ non của hạt ngô trong quá trình hạt ngô nảy mầm Quan sát sự cộng sinh của AMF vào rễ ngô trong 01 tuần, ở nhiệt độ

25 oC

Bước 5: Chuyển bầu ngô vào môi trường trồng ngô MT5 đã lựa chọn

Chuyển bầu ngô đã có nấm cộng sinh vào môi trường trồng ngô thích hợp (Môi trường MT5 gồm đất cát: đất dinh dưỡng: xơ dừa tỉ lệ 1:1:1 ).Tiếp tục trồng cây ngô đã có sự cộng sinh của AMF ở nhiệt độ 25oC trong 5 tuần

Bước 7:Thu bầu ngô, kiểm tra AMF trong bầu ngô

Thu bầu ngô, kiểm tra số lượng AMF trong bầu ngô bằng phương pháp sàng ướt kết hợp với tách bào tử đơn độc Số lượng bào tử đạt > 200 AMF/100g đất là đạt yêu cầu

Bước 8: Sấy khô, đóng gói chế phẩm:

Chế phẩm được để khô tự nhiên và đóng gói trong túi hút chân không Kiểm tra chất lượng chế phẩm theo thời gian

5.7 Nhân nuôi AMF ngoài đồng ruộng

Ba loại bào tử AMF đã lựa chọn ở trên được tiến hành nhân nuôi trong các loại hộp xốp

và đưa ra ngoài đồng ruộng, đánh giá khả năng xâm nhiễm của AMF vào rễ cây chủ sau 4 tuần nuôi cấy Kết quả thể hiện trên Bảng 5.13-5.16