Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm beauveria và paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠHUỲNH HỮU ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ Paecilomyces KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH HỮU ĐỨC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA

CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ

Paecilomyces KÝ SINH TRÊN

CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật

Mã số ngành: 9620112

Cần Thơ, 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH HỮU ĐỨC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA

CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ

Paecilomyces KÝ SINH TRÊN

CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật

Mã số ngành: 9620112

Cán bộ hướng dẫn: PGS TS TRẦN VĂN HAI

PGS TS Trần Văn Hai đã tận tình hướng dẫn định hướng, giúp đỡ vàtạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có cơ hội thực hiện công trình nghiên cứunày.

PGS TS Nguyễn Văn Huỳnh đã hướng dẫn thực hiện chuyên đề trongluận án

Xin gởi lời cảm ơn quý Thầy, Cô và các anh chị trong Bộ môn Bảo vệThực vật đã tận tình giảng dạy, chia sẻ những kiến thức quý báu, nhiệt tình hỗtrợ giúp tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này

Chân thành cảm ơn cô Trần Thị Thanh Thủy bộ môn Di truyền - Giốngnông nghiệp đã tận tình hướng dẫn em trong việc xử lý thống kê thí nghiệm

Gửi lời cảm ơn đến em Lê Thị Thanh Tâm đã động viên giúp đỡ tinhthần tôi trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện luận án

Gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên Tính, Trụ, Kiều, Duy Khoa, Sỷ,Giang, Tuấn, Hóa… làm việc tại phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinhhọc (NEDO) đã nhiệt tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện cho tôitrong quá trình thực hiện đề tài và tất cả những người đã từng giúp đỡ mà tôichưa liệt kê ra hết trên trang cảm tạ này

Xin thành thật biết ơn Hội đồng bảo vệ luận văn và giáo viên phản biện

đã đọc và đóng góp ý kiến quý báu để luận án được hoàn chỉnh

Chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Cần Thơ, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

HUỲNH HỮU ĐỨC

Huỳnh Hữu Đức - “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu

quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây

hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long”

Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 9.62.01.12

Tên cơ sở đào tạo: Trường Đại học Cần Thơ, 2013 - 2017

TÓM TẮT

Luận án tập trung vào các nghiên cứu cơ bản về: (1) Thu thập và định

danh các loài từ chi Beauveria và Paecilomyces bằng phương pháp truyền

thống dựa trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tửdựa trên trình tự DNA vùng ITS - rDNA; (2) Nghiên cứu một số đặc điểm sinhhọc, các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm

Beauveria và Paecilomyces đã định danh được loài; (3) Bước đầu đánh giá

hiệu lực của các chủng nấm trắng Beauveria trên sùng khoai lang Cylas

formicarius (Fabricius) và các chủng nấm tím Paecilomyces trên rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm; (4) Đánh giá

hiệu lực của hai chế phẩm nấm Beauveria và Paecilomyces ở điều kiện phòng

thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng trên ruộng khoai lang và vườn mãng cầuxiêm tại Vĩnh Long Nhằm thiết lập cơ sở dữ liệu cho các chủng nấm bản địa,cung cấp thông tin cơ bản cần thiết để chọn lựa chủng nấm có độc tính cao sửdụng trong quản lý phòng trừ dịch hại cây trồng

Kết quả phân lập và định danh đã xác định 16 chủng nấm thuộc loài

Beauveria bassiana và 14 chủng nấm thuộc loài Paecilomyces javanicus ký

sinh trên côn trùng gây hại cây trồng tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

Tản nấm của các chủng nấm B bassiana nuôi cấy trên môi trường PDA

thường có màu trắng hoặc màu trắng hơi ửng vàng khi thành thục Các chủngnấm có đặc điểm chung bởi cuống bào tử đính mọc theo hình vòng xoắn vàthành từng cụm dầy đặc của cành bào đài ngắn với một bào tử đơn có dạnghình trứng (2,61 - 2,97 x 2,35 - 2,72 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -

2,24 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m) Đối với nấm P javanicus màu sắc tản nấm thay đổi dần, ban đầu

màu trắng sau đó chuyển sang màu kem rồi đến màu tím nhạt (xám tro) khibào tử già, sự phân nhánh cuống bào tử đính dạng vòng không đều, mỗi vònggồm 2 - 3 thể bình, bào tử đính có dạng hình thoi, đôi khi hình trụ Kích thước5,01 - 5,74 x 1,51 - 1,69 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m Ngoài ra, kết quả phản ứng PCR với hai primerITS4 và ITS5 đối với hai loài này đều cho sản phẩm PCR là những băng màu

có kích thước 580 bp, giải trình tự so sánh mức độ tương đồng trình tự DNAvùng ITS-rDNA cho thấy các chủng nấm có sự tương đồng cao (96,6% đến

99,6%) so với những trình tự vùng ITS-rDNA của hai loài B bassiana và P.

javanicus đã công bố trên Genbank.

Đặc điểm sinh học của 16 chủng nấm B bassiana và 14 chủng nấm P.

javanicus cho thấy: Tỷ lệ nẩy mầm của các chủng nấm P javanicus đạt trên

94% sau 20 GSKC sớm hơn so với các chủng nấm B bassiana đạt trên 94%

sau 24 GSKC Môi trường SDAY3 và PDA luôn cho tốc độ phát triển đường

kính tản nấm nhanh và cho mật số bào tử cao, ngoài ra chủng nấm P.

javanicus còn phát triển tốt trên môi trường CDA Thời gian để các chủng nấm

B bassiana và các chủng nấm P javanicus cho mật số bào tử cao nhất là sau

14 NSKC và đạt mật số bào tử cao khoảng 107 - 108 bt/cm2 Nhiệt độ tối hảo

cho nấm B bassiana và các chủng nấm P javanicus phát triển đồng thời tạo

nhiều bào tử là từ 25o - 28oC Khi nhiệt độ tăng lên cao trên 30oC thì cả hai

loài nấm đều phát triển chậm lại hoặc không phát triển được Bào tử các chủng

nấm B bassiana và các chủng nấm P javanicus có khả năng sống sót sau khi

tiếp xúc với điều kiện nhiệt độ cao trong 8 giờ Đa số thuốc hoá học trừ nấm

bệnh có ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển và nẩy mầm của nấm B bassiana

và nấm P javanicus ở nồng độ (LKC) và (2 x LKC).

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hiệu lực của các

chủng nấm B bassiana trong phòng trừ thành trùng SKL C formicarius (Fabricius) và P javanicus trong phòng trừ thành trùng rệp sáp P.lilacinus

(Cockerell) cho thấy các chủng nấm thuộc hai loài này đều có hiệu quả cao đốivới ký chủ của chúng, đạt tỷ lệ ký sinh 90% sau 11 ngày chủng nhiễm

Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm B bassiana trong phòng trừ thành trùng SKL C formicarius (Fabricius) và chế phẩm P javanicus trong phòng trừ thành trùng rệp sáp P lilacinus (Cockerell) ở điều kiện PTN và nhà lưới thì

cả hai chế phẩm đều đạt hiệu quả cao trên 80% sau 7 - 11 ngày phun chế phẩmvới mật số bào tử chế phẩm từ 108 - 109 (bt/mL) và liều lượng chế phẩm từ 3,0

kg và 3,5 kg Kết quả đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm B bassiana và P.

javanicus trên diện hẹp ở điều kiện ngoài đồng ruộng cho thấy, khi phun

5 lần chế phẩm nấm B bassiana để phòng trừ SKL và 3 lần chế phẩm P.

javanicus để phòng trừ rệp sáp với liều lượng 3,0 kg/ha cho hiệu quả tương đương với

biện pháp sử dụng thuốc hoá học theo nông dân Vì vậy, các kết quả thu được trong

nghiên cứu này là cơ sở để khuyến cáo ứng dụng nấm ký sinh B bassiana và P.

javanicus như một tác nhân kiểm soát sinh học trong các chương trình IPM, để thay

thế các loại thuốc hóa học cũng là cơ sở cho hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnhvực đấu tranh sinh học côn trùng

Từ khoá: Beauveria bassiana, Paecilomyces javanicus, rệp sáp

Planococcus lilacinus (Cockerell), sùng khoai lang Cylas formicarius

(Fabricius) và trình tự DNA vùng ITS-rDNA

Huynh Huu Duc - “Study on morphological, biological characteristics and

efficacy of species in genus Beauveria and Paecilomyces infecting plant

herbivores harmful insects in Mekong Delta”

Educational organization: CanTho University, 2013 - 2017

THESIS ABSTRACT

The thesis objectives of the basic experiment were: (1) to collect and

identify a number of species in genus Beauveria and Paecilomyces infecting plant

herbivores harmful insects by morphological characteristics and classify the

genus differences among isolated Beauveria and Paecilomyces fungi based on the

sequences of ITS - rDNA region; (2) to study some biological characteristics,

factors affecting the growth and development of the strains of Beauveria and

Paecilomyces as identified species; (3) to evaluate the efficacy of B bassiana

isolates on sweet potato weevil Cylas formicarius (Fabricius) and P javanicus isolates on mealybug Planococcus lilacinus (Cockerell) in-vitro condition; (4) to evaluate of the efficacy of two fresh powder of B bassiana and P javanicus

fungi inoculant in in-vitro, net house and field conditions at Vinh Long province.Results of the research were to establish a database for native fungal strains, andprovide necessary basic information needed to choose the highly virulent isolatesusing in management of crops pest prevention

The result of the isolation and identification showed that sixteen

Beauveria isolates belong to one entomopathogenic Beauveria species, Beauveria bassiana and fourteen Paecilomyces isolates belong to one

entomopathogenic Paecilomyces species, Paecilomyces javanicus parasitic on insects at the Mekong Delta provinces Colonies of strains B bassiana on PDA

medium were normally white or white to pale yellow when mature Theseisolates were characterized by conidiophores consisting of whorls and denseclusters of short conidiophorous cells with one-celled ovoid (2.61 - 2.97 x 2.35

- 2.72 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m) or globose (2.24 - 2.28 x 2.23 - 2.24μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m) For the colonies of strains

P javanicus changed gradually, at first white, in age becoming cream and then

purple (ash gray) when mature, conidiophores forming verticillate brancheswith phialides in whorls of 2 to 3, conidia has fusiform shape, sometimescylindrical shape (5.01 - 5.74 x 1.51 - 1.69 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m) In addition, The ITS4 andITS5 primers, successfully amplified a fragment of approximately 580 bp from

all Beauveria and Paecilomyces isolates, the result of the sequences of ITS rDNA region reported that those both species Beauveria and Paecilomyces

-strains have a significantly considerable similarity (from 96.6% to 99.6%)compared with others on Genbank

The biological characteristics of 16 strains B bassiana and 14 strains P javanicus showed that the germination rate of strains P javanicus was over 94% at 20 hours after cultivation, earlier than the germination rate of strains B bassiana was over

94% at 24 hours after cultivation The SDAY3 and PDA medium have given thequick speed of colonies diameter and high density of conidia, furthermore strains

P javanicus can grow well when P javanicus was cultivated on CDA medium.

The time for strains B bassiana and P javanicus gave the highest spores number

at 14 days after cultivation and there are the high density of conidia about ((107

-108 conidia) x cm-2) The optimal temperature for strains B bassiana and P.

javanicus development as well as many conidia production were about 25o

-28oC When the temperature increased above 30oC, both B bassiana and P.

javanicus grew slowly or did not grow The spores of B bassiana and P javanicus were able to survive after coming in contact with high temperature

conditions during 8 hours Almost all fungicides had effected on the growth and

germination of B bassiana and P javanicus.

In laboratory conditions, the first step evaluated the efficacy of B.

Bassiana for the control of sweet potato weevil C formicarius (Fabricius) and

the efficacy of P javanicus for the control of mealybug P lilacinus The

results of experiments showed that all fungal strains were highly effective fortheir hosts and the parasitic rate was 90% at date 11th after treatment

The evaluative efficacy of parasitic fungi B bassiana for the control of sweet potato weevil C formicarius and parasitic fungi P javanicus for the control of mealybug P lilacinus were carried out in laboratory and nethouse conditions The results of using parasitic fungi B bassiana and P javanicus

showed that two parasitic fungi showed high effect over 80% after 7 - 11 daysfollowing treatment of fresh powder fungi preparation with the concentration

of spores from 108 to 109 conidia/mL and the dose of fresh powder fungiinoculant from 3.0 to 3.5 kilograms/ha The results evaluated the efficacy of

parasitic fungi B bassiana and P javanicus when experiments were carried out in the field, were sprayed five times by fresh powder fungi inoculant B.

bassiana for the control of C formicarius were spayed for the control of P lilacinus with the dose of fresh powder fungi preparation from 3.0

kilograms/ha, the results of all experiments gave equivalent effects with usingchemistry by famers’ methods Therefore, collected data in this research,which is the basis to recommend for applying successfully entomopathogenicfungi as a biocontrol agent in the IPM programmes

Key words: Beauveria bassiana, mealybug Planococcus lilacinus (Cockerell) Paecilomyces javanicus, sweet potato weevil Cylas formicarius

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

THESIS ABSTRACT v

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG x

DANH SÁCH HÌNH xiii

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT xvi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 4

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. 5

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1 Tổng quan tài liệu về hai chi nấm Beauveria và Paecilomyces 6

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu 6

2.1.2 Phân bố địa lý và sinh thái của nấm ký sinh côn trùng 7

2.1.3 Hệ thống phân loại của hai chi Beauveria và Paecilomyces 8

2.1.4 Vòng đời của Hypocreales và Entomophthorales 9

2.1.5 Phương pháp phân lập và định danh nấm ký sinh côn trùng 11

2.1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Beauveria và Paecilomyces 20

2.1.7 Sản xuất chế phẩm và công thức phối trộn 27

2.1.8 Sự suy giảm tính độc của nấm ký sinh 27

2.1.9 Khả năng phòng trừ sinh học của chi nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh gây bệnh côn trùng 28

2.2 Sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) 40

2.2.1 Phân loại và phổ ký chủ 40

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 41

2.2.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại của sùng khoai lang 41

2.2.4 Triệu chứng gây hại của sùng khoai lang 43

2.2.5 Biện pháp phòng trị sùng khoai lang trên đồng ruộng 43

2.3 Rệp sáp giả (Planococcus lilacinus Cockerell) 44

2.3.1 Phân bố và ký chủ 44

2.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh học 44

2.3.3 Tập quán sống và cách gây hại 45

2.3.4 Biện pháp phòng trị 45

2.4 Các loại thuốc bảo vệ thực vật dùng trong nghiên cứu 45

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 50

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 50

3.2 Phương Tiện Nghiên Cứu 50

3.3 Nội dung nghiên cứu 52

3.4 Phương pháp nghiên cứu 53

3.4.1 Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Beauveria và Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử 53

3.4.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Beauveria và Paecilomyces 56

3.4.3 Bước đầu đánh giá độc tính của các chủng nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm (PTN) 60

3.4.4 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện PTN 62

3.4.5 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) ở điều kiện nhà lưới 65

3.4.6 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm các chủng nấm Beauveria ký

sinh trên sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và

Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (Planococcus lilacinus

Cockerell) ở điều kiện ngoài đồng 66

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 72

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73

4.1 Kết quả nghiên cứu chi Beauveria 73

4.1.1 Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Beauveria bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học 73

4.1.2 Định danh các chủng nấm thuộc chi nấm Beauveria dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử (ITS - rDNA) 80

4.1.3 Một số đặc điểm sinh học của nấm Beauveria bassiana ký sinh trên sâu hại cây trồng. 84

4.1.4 Kết quả đánh giá hiệu lực của các chủng nấm Beauveria bassiana phòng trừ sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) 102

4.2 Kết quả nghiên cứu chi nâm Paecilomyces 115

4.2.1 Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học 115

4.2.2 Định danh các chủng nấm thuộc chi nấm Paecilomyces dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử (ITS - rDNA) 123

4.2.3 Một số đặc điểm sinh học của nấm Paecilomyces javanicus ký sinh trên một số loại sâu hại cây trồng 131

4.2.4 Kết quả đánh giá hiệu lực các chủng nấm Paecilomyces javanicus trừ rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) 148

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 161

5.1 Kết luận 161

5.2 Đề nghị 162

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 163

TÀI LIỆU THAM KHẢO 164

PHỤ CHƯƠNG 185

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Mười loại thuốc trừ nấm sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thuốc trừ nấm

3.2 Năm loại thuốc trừ nấm sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thuốc trừ nấm

3.3 Các nghiệm thức sử dụng trong đánh giá hiệu quả chế phẩm nấm

Beauveria đối với thành trùng SKL C formicarius (Fabricius) ở điều kiện

3.4 Các nghiệm thức sử dụng trong đánh giá hiệu quả chế phẩm nấm tím

Paecilomyces đối với rệp sáp P lilacinus ở điều kiện PTN 653.5 Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế

phẩm nấm trắng Beauveria trong phòng trừ SKL ở điều kiện ngoài đồng 683.6 Các nghiệm thức được bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế

phẩm nấm tím Paecilomyces sp trong phòng trừ RS ở điều kiện ngoài

4.4 Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự DNA trong vùng ITS - rDNA giữa 16

chủng nấm B bassiana được phân lập ở 7 tỉnh ĐBSCL và 10 chủng nấm

4.9 Mật số bào tử của các chủng nấm Beauveria bassiana ở các thời điểm ghi

4.14 Độ hữu hiệu của các chủng nấm B bassiana đối với thành trùng sùng

khoai lang (SKL) C formicarius ở nồng độ bào tử (5 x 108 bt/mL) trong

4.15 Tổng số thành trùng sùng khoai lang chết, tỷ lệ SKL mọc nấm trở lại 104

4.16 Độ hữu hiệu của 3 mật số bào tử (bt/mL) chế phẩm nấm trắng B bassiana

đối với thành trùng sùng khoai lang C formicarius (Fabricius) ở điều kiện

4.17 Độ hữu hiệu của 4 liều lượng chế phẩm nấm trắng B bassiana đối với

4.18 Tổng số thành trùng sùng khoai lang chết, tỷ lệ SKL mọc nấm trở lại 107

4.19 Độ hữu hiệu của 4 liều lượng chế phẩm nấm trắng B bassiana đối với

thành trùng sùng khoai lang Cylas formicarius (Fabricius) ở điều kiện nhà

4.20 Tỷ lệ thiệt hại trên củ do sùng khoai lang gây ra trên ruộng khoai lang tím

4.21 Năng suất lý thuyết khi thu hoạch khoai lang tím Nhật tại ấp Tân Qui, xã

4.22 Năng suất thực tế khi thu hoạch khoai lang tím Nhật tại ấp Tân Qui, xã

4.25 Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự DNA trong vùng ITS - rDNA giữa 14

chủng nấm Paecilomyces javanicus được phân lập ở 6 tỉnh ĐBSCL và 10

4.26 Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự DNA trong vùng ITS - rDNA giữa 8

chủng nấm Paecilomyces lilacinus được phân lập ở 6 tỉnh ĐBSCL và 10

4.27 Bảng tóm tắt kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái hai loài nấm

Paecilomyces javanicus và Purpureocillum lilacinum 129

4.29 Tỷ lệ nẩy mầm của các chủng nấm P javanicus qua các giờ quan sát. 131

4.33 Mật số bào tử của các chủng nấm P javanicus ở các thời điểm ghi nhận

4.37 Ảnh hưởng của 3 nồng độ thuốc sâu đến sự phát triển, tỷ lệ nẩy mầm và

4.38 Độ hữu hiệu của các chủng nấm P javanicus đối với thành trùng rệp sáp

Planococcus lilacinus ở nồng độ bào tử (5 x 108 bt/mL) trong điều kiện

4.39 Tổng số thành trùng rệp sáp Planococcus lilacinus chết, tỷ lệ RS mọc nấm

4.40 Độ hữu hiệu của 3 mật số bào tử (bt/mL) chế phẩm nấm tím P javanicus

đối với thành trùng rệp sáp P lilacinus (Cockerell) ở điều kiện PTN 151

4.41 Độ hữu hiệu của 4 liều lượng chế phẩm nấm tím P javanicus đối với

4.42 Tổng số thành trùng rệp sáp P lilacinus chết, tỷ lệ rệp sáp P lilacinus

4.43 Độ hữu hiệu của 4 liều lượng chế phẩm nấm P javanicus đối với thành

4.44 Hiệu lực của chế phẩm nấm tím P javanicus đối với thành trùng rệp sáp

P lilacinus gây hại mãng cầu xiêm giống Thái tại Vĩnh Long, 2017 1584.45 Năng suất lý thuyết khi thu hoạch mãng cầu xiêm giống Thái tại Vĩnh

DANH SÁCH HÌNH

2.1 Vòng đời của nấm ký sinh côn trùng của các loài thuộc bộ Hypocreales

2.2 Vòng đời của nấm ký sinh côn trùng của các loài thuộc bộ

2.3 Cấu tạo cơ quan sinh bào tử của nấm I: B alba (Limber) Saccas; II: B.

bassiana (Bals.) Vuill.; III: B brongniartii (Sacc.) Petch

A: Bộ máy mang bào tử trần với giá bào tử trần và tế bào sinh bào tử

trần; B: Các dạng tế bào sinh bào tử trần; C: Bào tử trần (De Hoog,

3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả của chế phẩmnấm B bassiana

4.1 Nấm Beauveria sp ký sinh một số loài côn trùng gây hại được thu thập

tại 7 tỉnh thành của Đồng bằng sông Cửu Long (A - B: Sùng khoai lang

Cylas formicarius Fabricius; B - C: Bọ nhảy Phyllotreta striolata

Fabricius; E: Sùng đất Lepidiota cochinchinae Brenske; F: Rệp sáp giả

Planococcus sp.; G: Rầy nâu Nilaparvata lugens Stal; H: Sâu ăn tạp

4.2 Tản nấm 16 chủng nấm thuộc chi Beauveria phân lập trên môi trường

PDA (A: Bea1(SKL-CT), B: Bea2(SKL-VL), C: Bea3(SKL-VL), D:

Bea4(SKL-VL), E: Bea5(SKL HG), F: Bea6(SKL-KG), G: Bea7

(SKL-AG), H: Bea8(BN-CT), I: Bea9(BN-HG),J: Bea10(BN-ST), K:

Bea11(SĐ-CT), L: Bea12(RSG-CT), M: Bea13(RSG-HG), N: Bea14

4.3 Cấu trúc cơ quan sinh bào tử nấm Beauveria bassiana được quan sát

4.4 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS - rDNA của các chủng phân lập

Beauveria sp., sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White et al., 1990)

(MK: maker chuẩn, A - P là ký hiệu của 16 chủng nấm Beauveria sp từ

4.5 Sơ đồ phân nhóm loài của 14 chủng nấm Beauveria bassiana phân lập

được bằng phương pháp Maximum likelihood dựa trên tình tự của vùng

ITS - rDNA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000 lần lặp lại được chỉ

trên các nhánh Các mẫu Beauveria brongniartii, Beauveria

cylindrospora và Beauveria album được xem như loài lai xa 834.6 Tốc độ phát triển trung bình của 16 chủng nấm Beauveria bassiana trên

4.7 Mật số bào tử của 16 chủng nấm B bassiana trên năm loại môi trường

4.8 Mật số bào tử của các chủng nấm Beauveria bassiana sau 10 NSKC trên

4.10 Nấm Paecilomyces spp ký sinh một số loài côn trùng gây hại được thu

thập tại 6 tỉnh thành của Đồng bằng sông Cửu Long (A - B - C - F: Rệp

sáp Planococcus lilacinus; D: Rệp sáp Crypticerya jacobsoni; E: Rệp

sáp Dysmicoccus brevipes; G: Bọ xít nhãn Tessaratoma sp.; H: Rầy

4.11 Tản nấm 22 chủng nấm Paecilomycesspp được phân lập trên môi trường

PDA (A: Pae1(RS-ST), B: Pae2(RS-ST), C: Pae3(RS-AG), D: Pae4

(RS-AG), E: Pae5(RS-TG), F: Pae6(RS-TG), G: Pae7(RS-CT), H: Pae8

(RS-CT), I: Pae9(RS-CT), J: Pae10(RS-CT), K: Pae11(RS-CT), L: Pae12

(RS-VL), M: Pae13(RS-VL), N: Pae14(RS-HG), O: Pae15(RS-CT), P:

Pae16(RS-CT), Q: Pae17(RS-CT), R: Pae18(RS-CT), S: Pae19(BXN-CT),

4.12 Cấu trúc cơ quan sinh bào tử của 14 chủng nấm Paecilomyces sp được

4.13 Cấu trúc cơ quan sinh bào tử của 8 chủng nấm Paecilomyces sp được ký

4.14 Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA của các chủng phân lập

Paecilomyces spp., sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White et al., 1990)

(MK: maker chuẩn, A - V: ký hiệu của 22 chủng nấm Paecilomyces spp.

4.15

Sơ đồ phân nhóm loài của 14 chủng phân lập P javanicus và 8 chủng P.

lilacinus phân lập được bằng phương pháp Maximum Likelihood dựa

trên tình tự của vùng ITS - rDNA Phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000

lần lặp lại được chỉ trên các nhánh Các mẫu P fumosoroseus, P.

farinosus và P marquandii được xem như một loài lai xa.

1284.16 Tốc độ phát triển trung bình của 14 chủng nấm P javanicus trên năm

4.17 Mật số bào tử của 14 chủng nấm P javanicus trên năm loại môi trường 137

dinh dưỡng tại thời điểm 15 ngày sau khi cấy.

4.18 Mật số bào tử của các chủng nấm P javanicus sau 10 NSKC trên môi

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

B bassiana Beauveria bassiana

P javanicus Paecilomyces javanicus

P lilacinus Paecilomyces lilacinus

Pur lilacinum Purpureocillum lilacinum

Rệp sáp P lilacinus Rệp sáp Planococcus lilacinus

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu

Sự phát triển tính kháng thuốc trừ sâu hóa học của côn trùng và những longại về các ảnh hưởng có hại của hóa chất đến an toàn môi trường và conngười đã tạo ra động lực mạnh mẽ cho sự nghiên cứu phát triển các tác nhân visinh vật sử dụng phối hợp với các tác nhân khác để kiểm soát côn trùng gâyhại Vì vậy, chiến lược bảo vệ cây trồng trên thế giới và tại Việt Nam đã có sựthay đổi cơ bản, người ta đã thấy rõ những mặt hạn chế của biện pháp sử dụngthuốc hóa học trong bảo vệ thực vật Mặt khác, điều kiện kinh tế xã hội ngàycàng phát triển cùng với việc thị trường xuất khẩu nông sản ngày càng được

mở rộng đã nâng cao mức yêu cầu đối với chất lượng của nông sản Từ đó, các

mô hình canh tác theo tiêu chuẩn GAP (VietGAP, EuroGAP và GlobalGAP)trên lúa, rau màu và cây ăn trái đã và đang được phát triển rất mạnh ở Đồngbằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Trong các tiền đề trên đã đặt ra những hướng

đi mới cho ngành Bảo vệ thực vật (BVTV) Việt Nam, một trong những hướng

đi đó là nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học để giảm thiểulượng hoá chất BVTV trong sản xuất nông nghiệp Ngoài ra còn có nhữngchương trình quản lý tổng hợp như IPM (Integrated Pest Management) vàICM (Integrated Crop Management) đã được ứng dụng phổ biến và rộng rãi đểquản lý phòng trừ dịch hại, trong đó đấu tranh sinh học đóng vai trò khá quantrọng để điều chỉnh sự cân bằng sinh học của quần thể

Một tập hợp đa dạng của vi sinh vật khác nhau hiện đang được xem xétnhư là các tác nhân sinh học kiểm soát côn trùng như: virus, vi khuẩn, độngvật nguyên sinh và nấm Trong đó giới nấm, theo ước tính của các nhà khoahọc có khoảng 1,5 triệu loài (Hawksworth, 2001; Mueller and Schmit, 2007;

Schmit and Mueller, 2007), với khoảng 110.000 loài được mô tả (Kirk et al.,

2008) Trong số này, 700 loài trong 90 chi được công nhận là tác nhân gâybệnh côn trùng (Roberts and Humber, 1981), và khoảng 170 sản phẩm kiểmsoát dịch hại đã được phát triển dựa trên ít nhất 12 loài nấm ký sinh côn trùng(De Faria and Wraight, 2007)

Các nghiên cứu tập trung phát triển và ứng dụng các loài ký sinh côn

trùng thuộc bộ Hyphomycetes trong đó có nấm Beauveria và Paecilomyces Nấm ký sinh gây bệnh trên côn trùng Beauveria bassiana là loài nấm được

quan tâm nghiên cứu phát triển và ứng dụng nhiều do có phổ ký chủ rộng, kýsinh gây chết nhiều loại côn trùng gây hại nông lâm nghiệp, đã và đang đượcnghiên cứu ứng dụng rộng rãi trên thế giới như là tác nhân phòng trừ sinh học

Nấm Beauveria bassiana gây bệnh trên 700 loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng

(Coleoptera), cánh nữa cứng (Hemiptera), cánh đều (Homoptera), cánh bằng(Isoptera), và sâu non của bộ cánh vẩy (Lepidoptera) (Liang, 1981; Gillespie,

1986; Inglis et al 1996; Liu et al., 2002; Phạm Thị Thùy, 2004; Nguyễn Thị Lộc và ctv., 2009; Dembilio et al 2010; Hussain et al 2009a, 2009b, 2010) Nấm B bassiana đã được nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Canada, Anh, Úc,

Nhật, Philippines, Trung Quốc… sử dụng để phòng trừ nhiều đối tượng sâuhại cây trồng như bọ hung hại mía, bọ hung hại củ cải đường, ruồi hại rễ bắpcải, củ cải… đạt kết quả tốt, đặc biệt là những loài sâu hại cây rừng như sâuróm thông, bọ hại dừa, châu chấu hại tre, mía, mối đất hại cây ăn quả, sùng hại

mía (Ferron, 1978; Rombach et al., 1988; Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn

Mão, 2004) Viện Bảo vệ Thực vật đã có một số nghiên cứu sử dụng nấm này

để phòng trừ một số đối tượng sâu hại cây trồng như rầy nâu hại lúa, châuchấu hại bắp, sâu đo xanh hại đay, bọ hại dừa trong thời gian gần đây bướcđầu đã thu được những kết quả nhất định (Phạm Thị Thùy, 2004) Hiện naynhiều nước trên thế giới đã sản xuất thành công và thương mại hóa các chế

phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana như Ostrinil, Boverin, BotaniGard, Naturalis-L, Mycotrol GHA (Nguyễn Thị Lộc và ctv, 2009; Kunimi, 2005; Kunimi, 2007) Nấm Paecilomyces spp dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân

hữu cơ, thức ăn, xác bả hữu cơ và tàn dư thực vật Chúng hiện diện ở nhữngnơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên Một số loài quan trọng trong

phòng trừ sinh học như: Paecilomyces javanicus, Paecilomyces carneus,

Paecilomyces farinosus, Pacilomyces fumosoroseus, Paecilomyces lilacinus

(CABI, 2002) Người ta đã sản xuất ra chế phẩm Pelomin để phòng trừ ngàiđục quả táo, sâu róm thông (Ferron, 1978; Trần Văn Mão, 2004) Đến nay

Nhật Bản, Mỹ, Ấn Độ và Bỉ đã sản xuất nấm Paecilomyces fumosoroseus có

khả năng thương mại hóa trên thị trường và có tên thương mại là: PreFeRal,Priority, Pae-Sin để phòng trị rệp sáp và rầy mềm (Kunimi, 2005) Nghiên cứu

ứng dụng nấm Paecilomyces đã được cấp bằng sáng chế tại Trung Quốc Chủng nấm Paecilomyces javanicus kết hợp hoạt chất Azadirachtin (tỷ lệ

100:0,05-0,25) dưới dạng bột hòa nước, huyền phù hoặc dạng nhũ dầu đểphòng trừ một số loại sâu hại cây trồng như sâu tơ, rầy phấn trắng, rầy mềm…

Việc kết hợp nấm tím Paecilomyces javanicus và hoạt chất Azadirzachtin giúp

tăng hiệu lực của nấm ký sinh đồng thời giảm lượng hoạt chất Azadirachtintrong phòng trừ sâu hại (Huang Zhen and Ren Shunxiang, 2008a, 2008b) Bêncạnh đó Huang Zhen and Ren Shunxiang (2008c) cũng đã nghiên cứu kết hợp

nấm Paecilomyces javanicus với hoạt chất Cypermethrin (100 : 0,25 - 0,56) và

Acetamiprid (tỉ lệ 100 : 1,5 - 10) dưới dạng bột hòa nước để phòng trừ sâu hại,đặc biệt là các loài chích hút, còn có tác dụng ngăn ngừa tốt các loài dịch hại

Tuy nhiên, việc sử dụng nhóm nhỏ nấm ký sinh côn trùng như là tácnhân phòng trừ sinh học có những thành công rất hạn chế Các yếu tố chịutrách nhiệm cho sự khởi đầu và phát triển của dịch bệnh ở các quần thể côntrùng là vô cùng phức tạp, liên quan đến sự tương tác giữa các tác nhân gâybệnh, côn trùng ký chủ, môi trường và thời gian Sự hiểu biết về mối tương táccủa các yếu tố trên là quan trọng, và giải thích tại sao những yếu tố hạn chếbệnh hại côn trùng phát sinh và phát triển Điều đó có thể giúp chúng ta khắcphục được những khó khăn trong việc sử dụng tác nhân kiểm soát côn trùng đểđạt được hiệu quả trong việc kiểm soát các côn trùng gây hại Ngoài ra, chúng

ta cũng thiếu một số hiểu biết cơ bản về sinh thái học, đặc tính sinh học, cấutrúc di truyền quần thể và cả định danh tới loài cho các chủng nấm hiện diện ởViệt Nam vẫn còn ít cơ sở dữ liệu và không nhiều thông tin di truyên phân tử.Gần đây, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp ích cho việcphân tích cấu trúc, thành phần và sự biến động di truyền của các cá thể trong

quần thể Bằng ứng dụng kỹ thuật phân tích rDNA của nấm Beauveria sp và

Paecilomyces spp (Isaria spp.), thì sự khác biệt di truyền, mối quan hệ di

truyền giữa các chủng nấm trong cùng một loài sẽ được nhận biết một cách dễdàng và có cơ sở hơn Trình tự vùng ITS-rDNA đã được sử dụng trong việc

xác định, định danh loài nấm từ chi Beauveria và Paecilomyces.

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và

đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh

trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long” đã

được thực hiện

Lý do lựa chọn đề tài

Tại Đồng bằng Sông Cửu Long, khoai lang và cây ăn trái chiếm diện tích

tương đối lớn Dịch hại thường xuất hiện là sùng (Cylas formicarius Fabricius) gây hại trên khoai lang và rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) gây hại

trên nhiều loại cây ăn trái (mãng cầu, sầu riêng, khóm,…) gây ảnh hưởng rấtlớn đến chất lượng sản phẩm nên nông dân đã sử dụng rất nhiều thuốc bảo vệthực vật để quản lý đối tượng trên, làm lưu tồn một lượng lớn thuốc BVTVtrong sản phẩm có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người tiêu dùng Vì thế,việc nghiên cứu các tác nhân phòng trừ sinh học để quản lý côn trùng gây hại

có hiệu quả thay thế dần thuốc BVTV là hết sức cần thiết trong thực tế sảnxuất hiện nay

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Thu thập và định danh đến loài của các chủng nấm thuộc hai chi

Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loài côn trùng gây hại tại các

tỉnh vùng ĐBSCL

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng ký sinh gây bệnh, các

yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm Beauveria

và Paecilomyces đã định danh đến loài.

Tuyển chọn các chủng nấm Beauveria có khả năng ký sinh cao sùng khoai lang C formicarius Fabricius ở điều kiện phòng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm Đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh SKL ở

điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng

Tuyển chọn các chủng nấm Paecilomyces có khả năng ký sinh cao rệp sáp P lilacinus ở điều kiện phòng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm Đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm Paecilomyces ký sinh rệp sáp P lilacinus ở điều

kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài có ý nghĩa khoa học cao vì nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng

thuộc chi nấm Beauveria và Paecilomyces có hệ thống từ thu thập các chủng

nấm ngoài tự nhiên trên các loài côn trùng gây hại nông nghiệp tại ĐBSCL,tiến đến định danh loài nấm, nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh học và đánhgiá hiệu quả của các chủng nấm phân lập Ngoài ra, đề tài còn hướng tới việcsản xuất thử nghiệm chế phẩm nấm ký sinh cho hiệu quả cao ở điều kiện ngoàiđồng để từ đó có cơ sở khuyến cáo nông dân sử dụng thay thế dần cho các loạithuốc BVTV đang sử dụng

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu chi tiết có hệ thống từ trong phòng thí nghiệm, nhàlưới đến ngoài đồng ruộng nên cung cấp nhiều số liệu khoa học về đặc điểm

hình thái, sinh học và đánh giá hiệu lực của nấm Beauveria bassiana và

Paecilomyces javanicus nhằm thiết lập những thông tin cơ bản về các chủng

nấm phân lập tại ĐBSCL Ngoài ra, kết quả của đề tài sẽ mở ra hướng quản lýphòng trừ một số loài côn trùng gây hại cây trồng theo IPM, để thay thế cácloại thuốc hóa học cũng là cơ sở cho hướng nghiên cứu tiếp theo về đấu tranhsinh học côn trùng

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.

1.4.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu chính của đề tài là thu thập các chủng nấm

Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loài côn trùng gây hại tại

ĐBSCL

1.4.2 Phạm vi nghiên cứu

Thu thập và định danh xác định các loài từ chi Beauveria và

Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học

và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử dựa trên trình tự DNA vùng ITS rDNA Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, các yếu tố ảnh hưởng đến sự

-sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces đã

định danh loài, đồng thời đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm ở điều kiệnphòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng trên ruộng khoai lang và vườn mãngcầu xiêm tại Vĩnh Long Các nghiên cứu được thực hiện từ 9/2013 đến tháng8/2017

1.4.3 Những đóng góp mới của luận án

Phân lập được 16 chủng nấm ký sinh trên côn trùng tại 7 tỉnh ĐBSCL

thuộc loài Beauveria bassiana Trong đó, tuyển chọn được hai chủng

Bb4(SKL-VL) và Bb5(SKL-HG) để sản xuất chế phẩm

Phân lập được 22 chủng nấm ký sinh trên côn trùng tại 6 tỉnh ĐBSCL

trong đó định danh được 14 chủng nấm thuộc loài P javanicus và 8 chủng nấm thuộc loài Purpureocillum lilacinum Kết quả, tuyển chọn được hai chủng

Pj6(Pl-TG) và Pj8(Pl-CT) để sản xuất chế phẩm

Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển

của nấm B bassiana và P javanicus trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Xác định một số hoạt chất hoá học trừ nấm vô hại đối với sự phát triển

của nấm B bassiana ở nồng độ thấp (½ nồng độ liều khuyến cáo) hoặc ảnh

hưởng vừa (ở nồng độ liều khuyến cáo) như Metalaxyl, Fenoxanil và

Validamycin Đối với P javanicus hợp chất Fenxanil, Kasugamycin và Picoxystrobin tỏ ra vô hại hoặc ảnh hưởng vừa Tuy nhiên, đối với nấm B.

bassiana rất dễ bị ảnh hưởng ngay cả nồng độ rất thấp (½ nồng độ liều khuyến

cáo) so với P javanicus trên cùng hợp chất thuốc hoá học trừ nấm.

Đối với chế phẩm nấm B bassiana dạng tươi để phòng trừ SKL và chế phẩm nấm P javanicus dạng tươi để phòng trừ rệp sáp P lilacinus gây hại

mãng cầu xiêm đều cho kết quả phòng trừ tốt khi sử dụng liều lượng 3 - 3,5kg/ha với mật số bào tử chế phẩm khoảng > 108 bt/gram

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan tài liệu về hai chi nấm Beauveria và Paecilomyces (Isaria)

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Từ năm 2700 trước công nguyên nhà triết học Hy Lạp Aristotle đã tìmhiểu về hiện tượng ong bị chết hàng loạt, 200 năm sau các nhà khoa học đãchứng minh được côn trùng và một số động vật không xương sống khác bịchết là do bị nhiễm một số loại vi nấm Năm 1709, Balisneri là người đầu tiên

mô tả về nấm ký sinh côn trùng, mở ra hướng nghiên cứu về bệnh lý côntrùng Đến thế kỷ 18 các nhà khoa học đã chứng minh nấm ký sinh côn trùng

là loại vi sinh vật có khả năng lan truyền bệnh từ vật chủ này sang vật chủkhác Năm 1815, Agrostino Bassi là người đầu tiên mô tả tỉ mỹ về bệnh donấm bạch cương (white muscardin) gây hại trên tằm Đến năm 1835 ông đãkhẳng định nấm bạch cương (white muscardin) là nguyên nhân chính gây rabệnh trên tằm và đưa ra biện pháp phòng trị (Phạm Thị Thùy, 2004; Luangsa-

Ard et al., 2006)

Năm 1878, nhà bác học Snoi đã tiến hành một loạt thí nghiệm cơ bản

nhằm xác định hiệu lực của nấm trắng Beauveria globulifera đối với loài bọ xít hại lúa mì Bliscus leucoptera Say Sau đó, các nhà khoa học trường Đại

học Tổng hợp Kanzac cũng đã thiết lập một trạm tuyên truyền để phổ biến vai

trò của nấm Beauveria với việc lây bệnh trên côn trùng, họ đã gửi hơn 500 kiện nấm Beauveria đến các trang trại để phòng trừ sâu hại củ cải đường

từ Châu Âu và ứng dụng phòng trừ sâu hại cây trồng (Phạm Thị Thuỳ, 2004)

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm Beauveria

bassiana đã được tiến hành từ năm 1979 và đến nay vẫn còn tỏ ra có tác dụng đối với

sâu róm thông và một số loài sâu hại cây trồng (Trần Văn Mão, 2004)

Đối với chi nấm Paecilomyces (Iaria) được phát hiện và mô tả tỉ mỹ vào

năm 1907, sau đó Clements and Shear (1931) là những người đầu tiên đề nghị

đổi tên chi Paecilomyces thành chi Isaria Đến năm 1944, nhà khoa học

Steinhaus là người đầu tiên thành lập phòng nghiên cứu về bệnh lý côn trùng

mở đường cho hướng nghiên cứu thực nghiệm về khả năng lây nhiễm bệnh và

tiềm năng ứng dụng để phòng trừ côn trùng gây hại (Nguyễn Lân Dũng, 1981;

Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn Mão, 2004) Năm 1988, McCoy et al đã ghi nhân khả năng ký sinh của các loài nấm Cordyceps sp trên xác tằm và nấm

Isaria sp (Paecilomyces sp.) trên xác ve sầu.

2.1.2 Phân bố địa lý và sinh thái của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng là một thành phần quan trọng và phổ biến của hầuhết các hệ sinh thái trên cạn Tuy nhiên, một số loài nấm ký sinh côn trùng có

thể được tìm thấy trên toàn thế giới Ví dụ như loài Beauveria bassiana được báo cáo xuất hiện tại các khu rừng nhiệt đới (Aung et al., 2008), nhưng đã

được tìm thấy ở Canada, vùng Viễn Bắc, vĩ độ 75° (Widden and Parkinson,1979) Nấm ký sinh côn trùng cũng đã được ghi nhận xuất hiện ở phía bắc của

Vùng Bắc Cực như B bassiana và Metarhizium anisopliae tại Na Uy (Klingen

et al., 2002), và B bassiana, M anisopliae và Isaria farinosa (Paecilomyces farinosus) tại Phần Lan (Vänninen, 1995) Hơn thế nữa, nấm ký sinh côn trùng

cũng được báo cáo là xuất hiện tại Bắc Cực Greenland và Nam Cực (Eilenberg

et al., 2007) Ở địa điểm này, có loài nấm đặc hữu Nam Cực Paecilomyces antarctica được phân lập từ loài bọ đuôi bật Cryptopygus antarcticus ở bán

đảo Nam Cực Ngoài ra loài nấm ký sinh phổ biến trên thế giới thuộc về các chi Beauveria, Lecanicillium, Conidiobolus và Neozygites đã được tìm thấy tại

các địa điểm ở Nam Cực, nhưng không có ký chủ là các loại động vật chân đốt

Có những nhóm nấm ký sinh côn trùng khác nhau trong các môi trườngsống khác nhau Các loài nấm kí sinh gây bệnh cho côn trùng khác nhau có thểđược tìm thấy trong đất và nhóm này khác với nhóm nấm ký sinh côn trùngtồn tại trong môi trường trên mặt đất Theo nghiên cứu của Sosnowska ở BaLan, đã phát hiện ra rằng trong đất và lớp bề mặt đất ở rừng Białowieza côntrùng bị ký sinh bởi nấm ký sinh thuộc bộ Hypocreales, nhưng bộEntomophthorales là loài ký sinh trên côn trùng sinh sống chủ yếu trên các câytầng thấp và trên tán cây rừng, còn ở các khu đồng cỏ và các quần thể cây sậythì quyền thống trị thuộc về loài nấm ký sinh gây bệnh cho nhện thuộc chi

Gibellula (Sosnowska et al., 2004) Ở vùng nhiệt đới ẩm, có hệ thống các loài

nấm gây bệnh cho côn trùng vô cùng phong phú và đa dạng và đại đa số các

loài nấm ký sinh này thuộc chi Cordyceps (Ascomycota: Hypocreales) (Evans, 1982; Aung et al., 2008.) Trong khi đó các loài khác thuộc chi Hypocreales như là Beauveria, Metarhizium và Isaria là loài nấm phổ biến được tìm thấy trên các loài côn trùng trong đất (Samson, 1974; Samson et al., 1988; Keller and Zimmerman, 1989; Tigano - Milani et al., 1993).

Nấm B bassiana xuất hiện phổ biến ở khắp mọi nơi, nhưng B bassiana

dường như lại rất nhạy cảm với những tác động xáo trộn từ việc canh tác trồngtrọt, do đó chúng bị hạn chế trong môi trường canh tác dễ bị thay đổi, nhưnglại ký sinh và tồn tại trên côn trùng gây hại phổ biến trong hệ sinh thái rừng

hơn (Rath et al., 1992; Vänninen, 1995; Quesada - Moraga et al., 2007; Sánchez - Peña et al., 2011).

Nấm Beauveria bassiana và Paecilomyces spp gây bệnh trên nhiều loài

côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), cánh nữa cứng (Hemiptera), cánhđều (Homoptera), cánh bằng (Isoptera), và sâu non của bộ cánh vẩy(Lepidoptera) (Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn Mão, 2004; Nguyễn Thị Lộc

et al., 2009; Ferron, 1978; Gillespie, 1986; Liu et al., 2002) Nấm Paecilomyces spp dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ, thức ăn, xác bả

hữu cơ và tàn dư thực vật Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trongphòng và ngoài tự nhiên Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:

Paecilomyces javanicus, Paecilomyces carneus, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces lilacinus (CABI, 2002).

Hiện nay ở Việt Nam chi Beauveria chỉ có một loài Beauveria bassiana

hiện diện trên đồng ruộng và được các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng

trong quản lý phòng trị sâu hại cây trồng (Phạm Thị Thùy và ctv., 1995; Nguyễn Thị Lộc và ctv., 2009 và Võ Thị Thu Oanh, 2010) Trần Thị Tho và

ctv (2014) đã phân lập được 7 chủng nấm Paecilomyces javanicus trên rệp sáp

giả (Icerya sp.) tại 3 tỉnh ĐBSCL gồm Cần Thơ, Sóc Trăng và Vĩnh Long.

Nguyễn Thị Thúy (2015) đã thu thập, phân lập và định danh được 18 chủng

nấm Isaria javanica ở Vườn Quốc gia Pù Mát, gồm 6 chủng ký sinh trên sâu

non bộ cánh vảy, 8 chủng ký sinh trên trưởng thành bộ cánh màng và 4 chủng

ký sinh trên trưởng thành bộ nhện lớn Mẫu vật được tìm thấy trong tàn dưthực vật chiếm 66,7%, mặt dưới lá cây chiếm 33,3%

2.1.3 Hệ thống phân loại của hai chi Beauveria và Paecilomyces

Nấm ký sinh côn trùng là nhóm các tác nhân gây bệnh cho côn trùng rất

đa dạng Có gần 700 loài thuộc khoảng 100 bộ khác nhau Mặc dù vậy, chỉ cómột vài trong số chúng đã được nghiên cứu kỹ lưỡng Hầu hết trong số chúng

đều thuộc về bộ Entomophthorales, ngành Glomeromycota và bộ Hypocreales,

ngành Ascomycota (Hibbett et al., 2007; Sung et al., 2007) Các nghiên cứu

phát sinh loài gần đây đối với nấm ký sinh côn trùng dẫn đến sửa đổi đáng kểđối với việc phân loài của nhiều loài nấm ký sinh côn trùng Clements and

Shear (1931) là những người đầu tiên đề nghị đổi tên chi Paecilomyces thành chi Isaria (Luangsa-Ard et al 2005) Theo phân loại nấm của Ainsworth (1966 và 1971) thì nấm Paecilomyces spp thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giống Paecilomyces Trong số những loài nấm thuộc ngành

phụ, lớp nấm bất toàn gây bệnh trên côn trùng có triển vọng được nhiều nước

trên thế giới nghiên cứu, đó là các chi nấm bạch cương Beauveria, chi nấm bột xanh Nomuraea, chi nấm lục cương Metarhizium, chi nấm Paecilomyces… (Phạm Thị Thùy, 2004) Gần đây, Luangsa-Ard et al (2005) đã phân tích các mối quan hệ phát sinh loài của nấm Paecilomyces và phân loài Isarioidea bằng

cách sử dụng các gen β - tubulin và ITS - rDNA và ghi nhận sự tồn tại của một

nhóm có cùng một nguồn gốc được chỉ định là nhánh Isaria, bao gồm những loài Paecilomyces sau đây: P amoeneroseus, P cateniannulatus, P.

cateniobliquus, P cicadae, P coleopterorus, P farinosus, P fumosoroseus, P ghanensis, P javanicus và P tenuipes Shimazu and Takatsuka (2010) đã so

sánh các mẫu nấm Isaria javanica phân lập từ ấu trùng bướm Lymantria

dispar, kết quả cho thấy các đặc điểm như hình dạng thể bình, chuỗi bào tử

cũng như kích thước bào tử phù hợp với các đặc điểm của nấm Paecilomyces.

Thêm vào đó, các tác giả còn so sánh trình tự DNA của các chủng nấm phân

lập và kết luận rằng Paecilomyces javanicus và Isaria javanica là cùng một

loài

2.1.4 Vòng đời của Hypocreales và Entomophthorales

Vòng đời của Hypocreales và Entomophthorales hơi khác nhau Tuynhiên, khả năng sinh tồn và lây lan trong môi trường của cả hai nhóm đều phụthuộc vào khả năng xâm nhiễm các ký chủ mà điều này luôn dẫn đến cái chếtcủa ký chủ Chu trình sống của nấm ký sinh côn trùng bao gồm giai đoạn kýsinh (từ lúc ký chủ nhiễm bệnh đến lúc ký chủ chết) và giai đoạn hoại sinh(sau khi ký chủ chết) (Hình 2.1 và Hình 2.2)

Ngược lại với các nguồn gây bệnh côn trùng khác (vi khuẩn và vi rút),những loại này thường đi vào bên trong cơ thể côn trùng thông qua thức ăn,riêng đối với nấm ký sinh côn trùng thường xâm nhiễm vào ký chủ thông qualớp biểu bì bên ngoài Quá trình xâm nhiễm bao gồm: bào tử tiếp xúc bámdính vào lớp biểu bì của côn trùng, mầm bệnh xâm nhập vào lớp biểu bì thôngqua ống mầm, nấm phát triển bên trong cơ thể côn trùng và các sợi nấm xâmchiếm các khoang máu Bào tử của nấm ký sinh côn trùng thường được phủmột lớp chất nhầy có chứa protein và glucans, điều này giúp các bào tử bám

chặt vào các lớp biểu bì của côn trùng Sự phát triển của bào tử ở một vài loàinấm ký sinh côn trùng sản sinh ra các cấu trúc đặc biệt được gọi là đĩa áp(appressoria) Các đĩa áp chịu trách nhiệm gắn các bào tử nẩy mầm vào bề mặtlớp sáp biểu bì (epicuticular) Quá trình xâm nhiễm vào lớp biểu bì của côntrùng là một kết quả của áp lực cơ học và hoạt động enzyme của ống mầm Vaitrò chính của việc xâm nhiễm này là tiết ra lần lượt các enzyme lipase,protease và chitinase Bên trong cơ thể côn trùng hầu hết nấm ký sinh côntrùng phát triển như mầm nấm men (bào tử nấm nẩy nở), cơ thể hoặc các tếbào trần sợi nấm thiếu vách tế bào Những cấu trúc này được lan truyền thôngqua các khoang máu Côn trùng chết thường là do bị tổn thương cơ học gây rabởi các sợi nấm phát triển bên trong côn trùng, hoặc do nấm ký sinh tiêt ra độc

tố giết côn trùng Beauveria, Metarhizium Paecilomyces (Isaria) và

Tolypocladium là những loại nấm thường tiết ra một loạt các độc tố giết côn

trùng ký chủ Một số trong số đó như destroxin, beauvericin, và efrapeptins đãđược mô tả đầy đủ về mặt hóa học, được biết như là nguyên nhân chính hay là

sự đóng góp của chúng vào quá trình xâm nhiễm côn trùng (Roberts, 1981;

Hajek and St Leger, 1994) Đối với Entomophthorales, có rất ít dữ liệu về việc

các loại nấm thuộc bộ này sản sinh ra các loại độc tố (Boguś and Scheller,2002)

Sau khi ký chủ chết, khuẩn ty nấm phát triển trên xác chết ký chủ trongkhoảng thời gian 2 - 3 ngày hình thành sợi nấm trên không và sau đó tạo thànhbào tử (Hình 2.1 và Hình 2.2) Trong khi bộ Hypocreales chỉ sản xuất bào tử

vô tính, thì các loài thuộc bộ Entomophthorales lại cho ra đời hai loại bào tử:

vô tính (bào tử đính sơ cấp) và hữu tính (bào tử tiếp hợp hoặc bào tử nghỉ)(Hình 2.1 và Hình 2.2) Bào tử đính của các loài thuộc bộ Hypocreales và bào

tử đính vô tính của các loài thuộc bộ Entomophthorales được sản sinh bênngoài trên bề mặt của côn trùng sau khi bị ký sinh và giết chết côn trùng Cácloài thuộc Entomophthorales và Hypocreales khác nhau về cách phát tán cácbào tử Các bào tử thuộc bộ Entomophthorales được phóng thích tích cực từxác chết côn trùng do áp lực thủy tĩnh, trong khi các bào tử thuộc bộHypocreales lại được phát tán nhờ gió Nếu các bào tử sơ cấp từ xác chết côntrùng không bám được trên một ký chủ mới thì nó sẽ nẩy mầm và hình thànhbào tử thứ cấp (một số loài cũng có thể sản sinh ra bào tử bậc ba và bậc bốn)

Đa số các loài thuộc bộ Entomophthorales đều sản sinh ra bào tử nghỉ (bêntrong xác côn trùng) Xác côn trùng có chứa bào tử nghỉ (Azygospores) banđầu gắn vào cành cây, rơi xuống đất, rồi sau đó các bào tử nghỉ ngấm vàotrong đất Dưới những điều kiện thuận lợi, các bào tử nghỉ bắt đầu nẩy mầm đểtạo thành mầm bào tử đính và có thể lây nhiễm sang ký chủ mới Các bào tử

thời gian không thuận lợi hoặc sống sót tạm thời khi không có ký chủ Theocách này nhiều loài thuộc bộ Entomophthorales đã đồng bộ hóa sự phát triểncủa chúng với sự phát triển của côn trùng Các loại nấm thuộc bộ Hypocrealescũng có thể tồn tại trong môi trường (nếu không tìm được ký chủ mới) như làxác chết của côn trùng bị nhiễm nấm hoặc bào tử trong đất (Hajek and St.Leger, 1994; Hajek and Shimazu, 1996).

Hình 2.1 Vòng đời của nấm ký sinh côn trùng của các loài thuộc bộ Hypocreales

(Anna and Karol, 2012)

Hình 2.2 Vòng đời của nấm ký sinh côn trùng của các loài thuộc bộ Entomophthorales

(Anna and Karol, 2012)

2.1.5 Phương pháp phân lập và định danh nấm ký sinh côn trùng 2.1.5.1 Phương pháp phân lập

Kiến thức cơ bản về cách xử lý ban đầu và chẩn đoán côn trùng bị nấm

ký sinh đã được mô tả bởi Lacey and Brooks (1997) Hầu hết nấm ký sinhthuộc Hyphomycetes có thể phân lập trực tiếp từ các xác chết (Goettel and

Inglis, 1997), khi côn trùng bị nhiễm nấm ký sinh gây bệnh có thể được xáccôn trùng bị nhiễm nấm và đã sinh bào tử trực tiếp lên trên một bề mặt chấtdinh dưỡng (Papierok and Hajek, 1997) Nếu bào tử hoặc sợi nấm chưa pháttriển trên bề mặt xác côn trùng bị nhiễm bệnh, có thể được ủ trong buồng ẩmnhư đĩa Petri lót giấy thấm tạo ẩm độ để khuyến khích hình thành bào tử Saukhi, xác côn trùng bị nhiễm bệnh đã hình thành bào tử, có thể đặt toàn bộ hoặcchấm nhẹ que cấy lên xác côn trùng nhiễm nấm và cấy lên môi trường chọnlọc để phân lập tác nhân gây bệnh.

Chúng ta có thể sử dụng một số loại môi trường chọn lọc có chứa chấtdiệt nấm hoặc chất kháng sinh có thể giúp nấm ký sinh côn trùng tăng trưởngnhưng ngăn cản sự phát triển của nấm hoại sinh và vi khuẩn Một số nấm kýsinh có thể được phân lập một cách gián tiếp từ đất bằng môi trường cơ thể

sống của côn trùng như ấu trùng của Galleria spp (Zimmermann, 1986), hoặc

trực tiếp ly trích dung dịch đất, kết hợp với một môi trường chọn lọc để phân

lập nấm (Beilharz et al., 1982).

Sau khi được phân lập, nhiều loại nấm, đặc biệt là nấm thuộc bộHyphomycetes, có thể được giữ trong ống nghiệm trên một số môi trường nuôicấy Bào tử và sợi nấm nên được lưu trữ trong ống cryovials có chứa nitrogen,hoặc đông khô và được lưu trữ trong các ống thủy tinh vô trùng (Humber,1997) Bào tử tươi được thu hoạch cũng có thể được bảo quản và lưu giữ trongtrong môi trường chân không và được hút ẩm ở nhiệt độ 4°C hoặc nhiệt độphòng Một số loài nấm Hyphomycete có thể được bảo quản bào tử nấm bằnggel silica ở nhiệt độ 4°C (Goettel and Inglis, 1997; Humber, 1997; Kerwin andPetersen, 1997; Papierok and Hajek, 1997)

2.1.5.2 Phương pháp định danh

a Định danh loài dựa vào đặc điểm hình thái và cấu trúc cơ quan sinh bào tử

thước bào tử, tuy nhiên phương pháp phân loại này gặp nhiều khó khăn bởi vì các loài

trong chi nấm Beauveria thường không khác biệt nhau về kích thước bào tử Bằng việc dựa vào đặc điểm hình thái, các tác giả đã mô tả được 14 loài thuộc chi Beauveria

(Phạm Thị Thuỳ, 2004), trong đó De Hoog (1972) đã mô tả rất chi tiết hình dạng của

ba loài trong chi Beauveria gồm B alba

(Limber) Saccas, B bassiana (Bals.) Vuill., B brongniartii (Sacc.) Petch dựa vào

hình dạng của bào tử đính

Khoá định danh loài thuộc chi Beauveria (theo De Hoog, 1972)

1a Tế bào sinh bào tử trần phần lớn mọc thành vòng dọc sợi nấm thẳng đứng

phần gốc 10 - 24 x 1,5 - 2,5 m, đôi khi rộng tới 3,5 m, phần ngọn dài tới

35 m rộng 1 m, gai dài 1 m B alba (Limber) Saccas

1b Tế bào sinh bào tử trần mọc rãi rác hoặc thành cụm trên giá bào tử trần

phân hoá rõ rệt 22a Bào tử hình cầu hoặc gần cầu đôi khi hình elip rộng 2 - 2,5 x 2 - 3 m Tếbào sinh bào tử trần có phần gốc hình cầu, hình bình thành cumh dầy đặc

B bassiana (Bals.) Vuill.

2b Bào tử trần phần lớn hình elip, đôi khi có dạng gần hình cầu 2,0 2,5 x 2

-4,5 m, tế bào sinh bào tử trần thon nhỏ, ít khi mọc thành cụm

B brongniartii (Sacc.) Petch

Hình 2.3 Cấu tạo cơ quan sinh bào tử của nấm I: B alba (Limber) Saccas; II: B.

bassiana (Bals.) Vuill.; III: B brongniartii (Sacc.) Petch

A: Bộ máy mang bào tử trần với giá bào tử trần và tế bào sinh bào tử trần; B: Các

dạng tế bào sinh bào tử trần; C: Bào tử trần (De Hoog, 1972)

Nấm Beauveria bassiana có màu trắng nên có tên là nấm bạch cương.

Nấm bạch cương còn gọi là nấm cứng trắng, nấm tằm vôi là loại thường gặp

trên nhiều loài sâu hại Chúng có trên 120 loài, thuộc 45 họ, 7 bộ côn trùng,

nếu kể cả sâu hại nông nghiệp chúng có thể ký sinh gần 200 loài (Trần Văn

Mão, 2004)

Bệnh nấm bạch cương thường xuất hiện trên tằm do loài Beauveria

bassiana gây nên Trên môi trường thạch, nấm bạch cương có sợi từ màu trắng

đến màu kem có pha một ít màu đỏ da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể

tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời Đặc

điểm cơ bản là thể sợi nấm màu trắng, dạng lông, sợi nấm mảnh, phân nhánh,

có vách ngăn ngang, có chiều dài khoảng 3 - 5 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m phát triển dày đặc trên môi

trường, về sau xuất hiện chi chít các cuống sinh bào tử Trên cơ thể tằm và các

côn trùng khác nấm mọc rất nhanh, sợi nấm mọc nhanh và chẳng mấy chốc đã

bao phủ kín trên bề mặt cơ thể, sợi nấm có dạng phấn trắng khi khô biến thành

màu vàng sữa Đặc điểm của loại nấm này là có sợi xốp, cuống bào tử trần

13

hình ống hoặc hình bình với chiều dài không đều nhau Trên cuống có nhữngnhánh nhỏ mang bào tử trần (Phạm Thị Thuỳ, 2004).

Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử trần đơn bào (chỉ gồm một

tế bào) không màu, trong suốt, không vách ngăn có dạng hình cầu (đường kính

1 - 4 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m) đến hình trứng (kích thước 1,5 - 5,5 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m) Bào tử trần mọc trongvòng xoắn, phát sinh từ sợi sinh dưỡng mọc thành từng đám, có cuống phình

ra Tế bào sinh bào tử trần có cuống dạng hình cầu hoặc elip, hình thoi trụ,hình cổ chai Cuống tế bào sinh bào tử trần có hình zíc zắc nhưng là mấu dạngrăng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép (Phạm Thị Thuỳ, 2004) Trong

quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria sinh ra các sợi nấm trắng và bào tử đính,

khi bào tử già thấy các giọt dịch màu vàng xuất hiện ở bề mặt tản nấm Một sốloài khác thì có thể xuất hiện giọt dịch màu đỏ trên bề mặt tản nấm (De Hoog,

1972; Kirk et al., 2001)

Tương tự, Samson (1981) khi xác định 16 mẫu Beauveria thì cũng rút ra kết luận chỉ phân biệt được hai loài B bassiana và B denso Về sau B denso được đổi tên là B brongniartii và phát hiện thêm một loài mới là B album.

Năm 1998, Glare và Inwood đã kết luận rằng sự khác biệt về hình thái của các

loài nấm trong chi Beauveria chịu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và thành

phần các chất có trong môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy Vì vậy, rất khó đểphân biệt tới loài khi chỉ dựa vào đặc điểm hình thái

Nấm Beauveria bassiana xâm nhiễm nhiều loài côn trùng gây hại cho

nông nghiệp thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera), bộ cánh cứng (Coleoptera), bộcánh màng (Hymenoptera), và cả bộ cánh nửa cứng (Hemiptera), bộ hai cánh

(Diptera) (Yoshinori và Harry, 1993) Clark et al., (1986) cho biết có thể sử dụng nấm Beauveria bassiana để diệt muỗi.

trên loài Paecilomyces variotii và được mô tả bởi đặc trưng các khuẩn ty mọc thành

đám vòng mang những bào tử đính với các thể bình mọc theo vòng xoắn lệch nhau,hình dạng thể bình có đế hình trụ hoặc bị phồng lên ở bên dưới và giảm dần thành một

cổ hẹp, bào tử thường có đặc điểm trong suốt, đơn bào, vách nhẵn mịn, và bào tử đượctạo thành chuỗi

Nấm Paecilomyces sp có tản nấm dạng thảm nhung, bó sợi có màu

trắng, hồng nhạt đến tím, có khi màu nâu vàng hoặc nâu xám, thỉnh thoảng cómàu lục nhạt (Dwayne and George, 1993) Cuống bào tử phân sinh phânnhánh, mức độ phân nhánh lớn, gốc cuống dạng phình to, phía trên nhỏ vàuống cong Cuống bình sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều Bào tử phânsinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục bề mặt nhẵn hoặc cógai (Trần Văn Mão, 2004)

Nấm Paecilomyces javanicus thu được trên loài sâu bướm ở Brazil được

mô tả vào năm 1957 (Brown and Smith, 1957), tuy nhiên ban đầu được mô tả

bởi tác giả Friederichs and Bally (1923) gọi là Spicaria javanica Luangsa-Ard

et al., 2005 mô tả và định danh như sau: Sợi nấm mềm mịn, có vách ngăn,

trong suốt, chiều ngang từ 0,5 - 2,2 µm Cơ quan sinh bào tử bao gồm cáccuống bào tử đính mọc ra từ các sợi nấm, có thể dài đến 50 µm và có đườngkính từ 1,5 - 2,5 µm hoặc các thể bình đơn lẻ mọc trực tiếp từ vách của các sợinấm Cuống bào tử tạo ra các nhánh vòng với các thể bình có 2 - 3 vòng xoắn.Kích thước thể bình 8 - 14 x 2 - 2,8µm, bao gồm đáy hình trụ, phía trên thonnhọn trên một cái cổ mỏng tách biệt Kích thước của thể bình 2 - 4,5 x 0,7 -1,4 µm Bào tử đính thường có hình dạng từ hình trụ đến hình thoi, vách mềm

mịn, trong suốt, kích thước 5 -7,4 x 1,4 - 1,7µm (Leger et al., 1986).

Hiện tại loài Paecilomyces thường được định danh theo khoá định danh loài Paecilomyces của Samson (1974) (nêu trong phụ chương)

Một số đặt điểm hình thái của nấm P javnicus được Samson ghi nhận

khi phát triển trên môi trường Malt-Agar như là, màu sắc tản nấm ban đầu cómàu trắng sau chuyển sang màu kem, rồi chuyển sang màu tím xám khi thànhthục, đường kính tản nấm đạt trên 3 cm trong 14 ngày nuôi cấy ở điều kiện

25oC Sợi nấm mịn, có vách ngăn, trong suốt, có đường kính 0,5 - 2,2 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m.Cành bào đài mọc ra trực tiếp từ sợi nấm có thể dài đến 50 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m Trên cành bàođài hình thành các điểm sinh thể bình, tại mỗi điểm có khoảng 2 - 3 thể bình cókích thước từ 8 - 14 x 2 - 2,8 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m và thon dần ở đỉnh, bào tử đính được hìnhthành tại đỉnh của thể bình, bào tử có dạnh hình trụ, đôi khi là hình thoi, mịn,trong suốt, kích thước từ 3,2 - 5,6 x 1,6 -2,8 μm) hoặc hình cầu (2,24 - 2,28 x 2,23 -m (Samson, 1974)

Các tác giả Shimazu and Takatsuka (2010) tại Viện nghiên cứu các sảnphẩm lâm nghiệp và rừng của Nhật Bản đã phân lập thành công loài nấm

Isaria javanica trên ấu trùng loài bướm đêm Lymantria dispar Cuống bào tử

phân nhánh dạng vòng ngang mang các thể bình Bào tử cấu thành dạng chuỗitrên các thể bình, bào tử có dạng hình thoi hoặc hình ôvan với kích thướcchiều dài và đường kính lần lượt là 3,0 - 4, 3 - 6,3 µm × 1,4 - 2, 0 - 3,2 µm

Bào tử của nấm P javanicus thường có kích thước nhỏ hơn khi mọc trên môi trường agar, kích thước 3,0 - 3,5 x 1,2 - 1,7 µm (Leger et al., 1986).

b Định danh loài nhờ vào sự hỗ trợ của kỷ thuật sinh học phân tử

 Đặc điểm di truyền của nấm ký sinh côn trùng

Phương pháp PCR đã cung cấp một công cụ nhanh và mạnh để khuếchđại các vùng cụ thể trên DNA dùng trong việc phân loại các vi sinh vật (Hirsch

et al., 2000; Atkins et al., 2003) Phương pháp tách chiết DNA khá đơn giản

và nhanh chóng dựa vào bộ kít cơ bản cho phép ly trích đủ lượng

DNA nguyên chất để dùng cho phản ứng khuếch đại PCR Phương pháp PCRthông thường là một phương pháp trực tiếp dùng để xác định các loại nấm

(Atkins et al., 2003) Hơn nữa, kết hợp với các kỹ thuật công nghệ sinh học đã

được ứng dụng rộng rãi trong việc định danh nấm, dựa vào cơ sở dữ liệu ởmức độ DNA, protein, hoặc enzyme Nguồn dữ liệu nghiên cứu được tập hợpdưới dạng dữ liệu mở cho phép các nhà nghiên cứu sử dụng kết quả để sosánh, đánh giá và ứng dụng trong việc phân loại định danh Đối với nấm

Beauveria và Paecilomyces giải trình tự vùng ITS - rDNA đã được nhiều tác

giả sử dụng để phân nhóm và xác định đặc điểm di truyền của các loài nấm

Beauveria bassiana và Paecilomyces spp (Isaria spp.) thu thập ngoài tự nhiên

(Martin and Rygiewicz, 2005; Micheal et al., 2005; Talaei et al., 2002; Võ Thị

sinh vật (Van De Peer et al., 1996).

Phân tích so sánh về thông tin chuỗi gen ARN ribosom (rDNA) có thểđược sử dụng để làm rõ mối quan hệ tiến hóa tự nhiên trên một phạm vi phân

loại rộng (Pace et al., 1986) Gen RNA ribosome (rDNA) thường tồn tại như

một sự lặp lại song song bao gồm các vùng mã hóa, mà những vùng này đượcbảo tồn ở các mức độ khác nhau, cũng như vùng trung gian chênh lệch khác.Những vùng trung gian này, hay chuỗi trung gian sao chép nội bộ (ITS), đã

được sử dụng rộng rãi trong phương pháp phân loại nấm (Bowman et al., 1992; Hibbett, 1992; Driver et al., 2000)

Hình 2.4 Sơ đồ vùng trình tự ITS - rDNA của vi nấm và các primer.

Vùng ITS là vùng có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thườngđược sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh, tuy nhiên phần lớn các sosánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong

cùng loài (Guarro et al., 1999) Ở đầu 5’ của 18S và đầu 3’ của 28S có một

vùng được gọi là vùng phiên mã bên ngoài (external transcribed spacer - ETS).Giữa 18S và 5.8S, giữa 5.8S và 28S lần lượt là 2 vùng bảo tồn bên trong(interal transcribed spacer 1 - ITS1 và interal transcribed spacer 2 - ITS2).Giữa các bản sao của gene rDNA có một vùng được gọi là intergenic spacer(IGS) thường biến đổi ngay cả trong cùng một loài, là dấu hiệu nhạy cảm của

sự thay đổi tiến hóa (Nguyễn Thị Lang, 2002; Bruns et al., 1991; Bruns et al., 1992; Marilena et al., 2003 và Martin và Rygiewicz, 2005)

Việc phân loại các loại nấm này dựa trên các đặc điểm hình thái cùng vớiviệc xác định rõ ràng cấp độ loài thường mang tính khách quan và rất khókhăn Ngoài ra, những khác biệt về hình thái được quan sát thấy có thể là sảnphẩm của các đột biến đơn giản hoặc các tác động từ môi trường nuôi cấy, do

đó việc phân loại này không phải lúc nào cũng đáng tin cậy Đặc điểm hìnhthái của một số loài nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng hoặc một số loài nấm

ký sinh trong chi nấm Beauveria và Paecilomyces có thể bị nghi ngờ khi so

sánh giữa phương pháp phân loại cổ điển với việc phân loại dựa trên phân tích

các đặc điểm di truyền (Tigano - Milani et al., 1995a; Tigano - Milani et al.,

1995b; Cantone and Vandenberg, 1998; Glare and Inwood, 1998) Những hạnchế của các kỹ thuật phân loại truyền thống chỉ ra rằng chúng ta cần phải pháttriển các phương pháp phân tích hiện đại thay thế để trợ giúp trong việc phânloại các loại nấm (Inglis and Tigano - Milani, 2006) Hiện nay, các kỹ thuậtphân tích sinh học phân tử ngày càng phát triển nên việc so sánh dựa trên trình

tự nucleotide được xem là cơ sở quan trọng để nhận biết sự khác biệt giữa các

cá thể có hình thái giống nhau bởi vì các trình tự khác biệt này ít bị thay đổi

bởi điều kiện ngoại cảnh (Guarro et al., 1999).

Vùng ITS được nhận thấy là rất hữu ích trong việc giải quyết một số khó

khăn trong việc phân loại chi nấm Beauveria và Paecilomyces theo phương

pháp cổ điển và xác định lại việc phân loại của một số chủng nấm phân lậpđược, trong đó mức độ biến đổi cao giữa các thể phân lập được nhận ra trước

đó dựa trên phân tích các marker DNA khác nhau (Tigano - Milani et al., 1995a; Tigano - Milani et al., 1995b; Hegedus and Khachatourians, 1996; Huang et al., 2002; Michael et al., 2005).

Hiện tại, các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền trong chi nấm

Beauveria đều sử dụng phương pháp giải trình tự nucleotide để phân tích Việc

phân tích mối quan hệ di truyền thường dựa vào đa hình vùng ITS, sự khácbiệt trên vùng rDNA, có thể phân nhóm được các loài trong chi nấm

Beauveria theo nguồn gốc địa lý và theo hình dạng bào tử (Hegedus and

Khachatourians, 1996; Huang et al., 2002; Michael et al., 2005).

Theo nghiên cứu phân loại dựa vào vùng ITS - rDNA của Inglis andTigano (2006) thì dữ liệu phân tích ITS ủng hộ giả thuyết cho rằng chi

Paecilomycesis có tính đa ngành, điều này đã được đề xuất trước đó bằng cách

sử dụng dữ liệu rDNA (Obornik et al., 2001) và hỗ trợ cho sự phân chia hình thái của chi thành hai nhóm Nhóm Paecilomyces, với các loài Paecilomyces

variotii, ưa nhiệt có cấu trúc giống nhau đối với Talaromyces và Byssochlamys, có liên quan đến lớp Plectomycetes trong ngành Ascomycota.

Nhóm Isarioidea, với các loài P farinosus, là loài ưa nhiệt vừa phải, chủ yếu

là nấm ký sinh côn trùng và có cấu trúc giống nhau với bộ Clavicipitales tronglớp Pyrenomycetes thuộc ngành Ascomycota (Mugnier, 1998; Samson, 1974)

Nguồn gốc của nấm Beauveria là từ nấm Clavicipitaceous hoặc

Pyrenomycetes, tuy nhiên dựa vào vùng SSU rRNA (Small Subunit Ribosomal

RNA) thì nguồn gốc phát sinh loài trong chi Beauveria cùng nguồn gốc xuất phát từ Sordariomycetes (Hypocreales: Clavicipitaceae) (Clarkson et al., 1998; Bidochka et al., 2002; Stephen, 2005) Một số nghiên cứu khác của Stephen (2005) về nguồn gốc và sự phân ly của Beauveria là dựa trên các vị trí tương

đồng của các introns, trình tự không mã hóa Từ phân tích vùng ITS tác giả đã

rút ra kết luận là mối quan hệ giữa Beauveria và kiểu giới tính của nấm

Cordyceps, như là mối quan hệ của Cordyceps militaris đối với Beauveria và

vị trí của nấm Cordyceps scarabaeicola trong chi Beauveria là cùng một nhánh với Beauveria caledonica.

Một số nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các tiểu đơn vị lớn và nhỏcủa gen rRNA đã chỉ ra sự đa dạng về nguồn gốc tự nhiên của chi

Paecilomyces (Obornik et al., 2001; Inglis and Tigano, 2006) Luangsa-Ard et

al (2005) đã phân tích các mối quan hệ phát sinh loài của Paecilomyces phần

loài Isarioidea bằng cách sử dụng các gen β- tubulin và ITS - rDNA và ghi

nhận sự tồn tại của một nhóm có cùng một nguồn gốc được chỉ định là nhánh

Isaria, trong đó bao gồm các loài sau: I amoenerosea, I cateniannulatus, I cateniobliquus, I cicadae, I farinosa, I fumosorosea, I ghanensis, I javanica, và I tenuipes Chi này một thời gian dài trước đây bị áp đặt đồng

nghĩa với chi Paecilomyces Gams et al (2005) đề nghị bảo tồn chính thức tên

Isaria với chủng I farinosa là loài đặc trưng đã được chính thức chấp nhận.

Nghiên cứu phát sinh loài dựa trên nhiều vị trí gen độc lập đưa đến sự phân tán

loài của Paecilomyces phân loài Isarioidea giữa Cordycipitaceae, Clavicipitaceae và Ophiocordycipitaceae của bộ Hypocreales (Luangsa-Ard et

al., 2005; Sung et al., 2007) Một số loài trong hai chi nấm này bị loại khỏi cả

hai chi Paecilomyces và Isaria và đang chờ chuyển vào chi vô tính thích hợp (Sung et al., 2007).

Sử dụng gen 1 - alpha (EF1 - α) và vùng bảo tồn bên trong (ITS) các) và vùng bảo tồn bên trong (ITS) cácvùng ITS1 và ITS2 (ITS1 - 5.8S - ITS2), các chuỗi được sử dụng để mô tả đặc

tính và xác định các chủng phân lập Isaria, cũng như để nghiên cứu các mối

quan hệ phát sinh loài trong số các chủng phân lập này và nấm có liên quankhác từ Hypocreales Các đặc tính phân tử, được thực hiện bằng PCR - RFLPcủa các gen EF1 - α) và vùng bảo tồn bên trong (ITS) các và ITS1 - 5.8 - ITS2, hữu ích cho việc giải quyết các

chủng phân lập đại diện của Isaria fumosorosea, Isaria farinosa và Isaria

tenuipes để xác nhận nguồn góc phân loại học của nấm Các phân tích phát

sinh loài cho thấy 3 nhánh tương ứng với 3 họ Hypocreales Chi Isaria được xác nhận là đa ngành và thuộc họ Cordycipitaceae, các loài Isaria chẳng những có liên quan đến loài vô tính của Beauveria, Lecanicillium, và

Simplicillium, mà còn liên quan đến loài hữu tính như Cordyceps và Torrubiella Vì vậy, các gen EF1 - α) và vùng bảo tồn bên trong (ITS) các và ITS1 - 5.8S - ITS2 được phát hiện là

các công cụ mạnh mẽ để cải thiện trong việc phân loài dựa vào đặc tính, nhận

dạng, và mối quan hệ phát sinh loài của loài Isaria và các nấm ký sinh gây bệnh trên côn trùng khác (Celeste et al., 2013).

Các mối quan hệ phát sinh loài của Paecilomyces bộ phận loài

Isarioidea được Luangsa-Ard et al (2005) phân tích bằng cách sử dụng gen β

- tubulin và ITS - rDNA Các phân tích cẩn trọng tối đa cho thấy rằng bộ phậnnày không tạo thành một nhóm phân loại tự nhiên và đa ngành trong Hypocreales Tuy

nhiên, đã phát hiện được một nhóm, được xem là nhánh Isaria, đơn ngành, bao gồm những loài Paecilomyces sau đây: P amoeneroseus, P cateniannulatus, P.

cateniobliquus, P cicadae, P coleopterorus, P farinosus, P fumosoroseus, P ghanensis, P javanicus và P tenuipes Một số loài trong số chúng có sinh sản hữu

Shimazu and Takatsuka (2010) sử dụng phương pháp giải trình tự ITS

-rDNA đã xác định được nấm Paecilomyces javanicus từ ấu trùng của loài

Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae) ở Nhật Bản.

2.1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm

Beauveria và Paecilomyces

2.1.6.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và phương pháp nuôi cấy

đến sinh trưởng và phát triển của nấm Beauveria và Paecilomyces

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và pháttriển, nếu môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc Nấm bạchcương khi nẩy mầm cần rất nhiều chất dinh dưỡng, nếu để trong nước cất thìchúng nẩy mầm rất ít hoặc nẩy mầm rất chậm Nấm bạch cương nẩy mầm tốttrong môi trường có đường mía và peptone (Trần Văn Mão, 2004)

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm ký sinh côn trùng sinhtrưởng và phát triển Nếu môi trường không tốt sẽ ảnh hưởng đến sự phát triểncủa nấm vì trong quá trình nẩy mầm để hình thành bào tử nấm cần các nguồn

C, N, các nguyên tố vi lượng C++, Zn++, K++, Mg++ để phát triển và duy trì độ

pH Kết quả nghiên cứu đã xác định môi trường Sabouraud bổ sung thêmkhoáng chất là môi trường nhân giống nấm ký sinh côn trùng tốt nhất (Phạm

Thị Thùy và ctv., 1995)

Theo Nguyễn Thị Lộc và ctv (2009) môi trường PDA là môi trường sơ

cấp thích hợp để nhân giống cấp 2, môi trường có thành phần 80% cám, 20%trấu và 59% nước là môi trường thích hợp để sản xuất sinh khối nấm

Beauveria bassiana đạt 1,87 x 109 bt/gram.

của Beauveria bassiana tốt nhất trên môi trường PDA ở độ sâu 2 mm (Chase et

al.,1986) Nấm được nuôi trên môi trường có thêm urea, acid - aminoacetic,

asparagine, NaNO3 và NH4Cl sẽ có độc tính cao và để kích thích sự phát triển của

Beauveria bassiana cần phải sử dụng các nguyên tố vi lượng như MnSO4, FeSO4,ZnSO4, CaCl2, Na2B4O4 (Võ Thị Thu Oanh, 2010; Phạm Thị Thùy, 2004; Rombach,1989)

Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc lựa chọn môi trường phù hợp để

phân lập nấm Chase et al (1986) dùng môi trường bột yến mạch để phân lập

Beauveria bassiana Tại Thụy Điển, Baath (1991) sử dụng môi trường chứa

Cu2+ để phân lập nấm ký sinh côn trùng sống trong đất

Theo Jenkins and Goettel (1997) bào tử được tạo ra trên môi trường cóhàm lượng pepton và dịch trích nấm men là 10 - 12 gr/lít cho khả năng gây

bệnh cao nhất Sự tích trữ bên trong của bào tử chồi Beauveria từ môi trường

có lượng carbon và nitrogen bị giới hạn nhưng khả năng tồn tại sẽ lâu hơn khi

sử dụng môi trường cơ bản Vogel Khi nuôi trên môi trường rắn và bán rắn

nấm Beauveria tạo thành 3 loại bào tử là bào tử chồi (blastospore), bào tử đính

(aerial) và bào tử chìm trong môi trường Tùy theo loại môi trường mà tạo raloại bào tử, bào tử chồi sẽ được tạo ra nhiều hơn bào tử đính trong môi trườnggiàu dinh dưỡng (pepton - dextrose broth) (Võ Thị Thu Oanh, 2010)

Theo Kamp and Bidochka (2002) có sự khác biệt về tốc độ phát triển củasợi nấm và tỷ lệ của bào tử nẩy mầm theo thời gian nuôi cấy trên môi trườngdinh dưỡng Sự khác biệt này phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng của môitrường theo thời gian nuôi cấy ngắn hoặc dài Tuy nhiên Veen and Ferron

(1966) sự nẩy mầm của bào tử nấm B bassiana có tỷ lệ giống nhau và không

phụ thuộc vào loại môi trường nuôi cấy

Trong quá trình nẩy mầm để hình thành bào tử nấm B bassiana cần các

nguồn C, N Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau.Môi trường thích hợp nhất cho nấm phát triển là môi trường có chứa chitin làmnguồn carbon, nếu bổ sung thêm chất chitin và glucose thì trong quá trình nuôi

cấy, nấm B bassiana sẽ thu được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần chitin

trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loài nấm, nó giúp cho sựphát triển và hình thành bào tử đính (Conidiospore) và bào tử chồi(Blastospore) (Phạm Thị Thùy, 2004)

Trong các loại đường nói chung, đường glucose luôn là nguồn carbon

khá tốt cho các loài nấm Nấm B bassiana sử dụng glucose trong đường đơn

khá tốt, nhưng xylose lại rất kém; trong đường đôi chúng sử dụng đường mía

và đường maltose khá tốt nhưng đường lactose lại rất kém; trong đa đườngchúng sử dụng tinh bột rất tốt, nhưng đường cục lại rất kém; đối với cellulosehầu như chúng không sử dụng Trong axit chúng sử dụng axit hữu cơ (lactic)rất kém nhưng sử dụng glycerin (3 cacbon và 6 cacbon) lại rất tốt (Trần VănMão, 2004)

Nấm B bassiana không những yêu cầu về nguồn cacbon mà còn yêu cầu nitơ hữu cơ và vô cơ Trong nitơ vô cơ nấm B bassiana sử dụng tốt NO3 -

hơn

là NH4 +

P là nhân tố quan trọng làm tăng sản lượng nấm bạch cương Trong

giai đoạn sinh trưởng hàng loạt sợi nấm, B bassiana rất cần C, N, nhưng đến

khi sợi nấm đứt ra thì nhu cầu C, N giảm dần, nhu cầu đối với P tăng lên (TrầnVăn Mão, 2004)

Về phương pháp nuôi cấy theo các tác giả Rombach (1989); Jenkins vàPrior (1993) thì sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất nấm sẽ thuđược kết quả tốt, vì trong nuôi cấy chìm, người ta đã xác định được khả năng

sinh bào tử chồi và lượng sinh khối B bassiana là rất cao.

Sản xuất sinh khối bào tử nấm bằng phương pháp nuôi cấy lỏng là một