Đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha grushv )

Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS - sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng.. K

o0o

NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

o0o

NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Nguyễn Thị Phương Trang

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tận tình của TS Nguyễn Thị Phương Trang Tác giả xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới sự hướng dẫn của cô

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tác giả

đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình về nhiều mặt của Ban lãnh đạo Viện ST & TNSV,cán bộ phụ trách đào tạo của Viện, của TS Đặng Tất Thế, trưởng phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn

Chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp, ThS Nguyễn Giang Sơn, TS Hồ Thị Loan, TS Phạm Thế Cường, ThS Lê Thị Mai Linh

đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, chỉ bảo những bước đi ban đầu trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học

Cuối cùng, tác giả cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới những người thân trong gia đình đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Luận văn được hoàn thành từ nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài hợp tác song phương của Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS Nguyễn Thị Phương Trang làm chủ nhiệm, mã số VAST.HTQT.Nga.10/15-16

Tác giả xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất

kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng

Ngày tháng năm 2018

Học viên thực hiện

( Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Thị Hồng Mai

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.) 3

1.2 Tổng quan về sâm ngọc linh 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái 3

1.2.2 Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh 5

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh 5

1.2.4 Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh 7

1.2.5 Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam 9

1.3 Phương pháp luận và cách tiếp cận 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 16

2.3.2 Lựa chọn mồi SSR 17

2.3.3 Phân tích số liệu SSR 18

2.3.4 Thiết kế mồi đọc trình tự 19

2.3.5 PCR khuếch đại gen 20

2.3.6 Điện di trên gel agarose 21

2.3.7 Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST 21

2.3.8 Đọc trình tự gen 21

2.3.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 23

3.2 Lựa chọn mồi SSR 23

3.3 Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh 25

3.4 Kết quả khuếch đại gen từ các cặp mồi đặc hiệu 30

3.5 Kết quả phân tích trình tự gen – đặc điểm phân tử của các vùng gen rbcL, rpoB, ITS và 18S của loài sâm ngọc linh 32

3.6 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS - sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng 47

3.7 Kết quả so sánh khả năng phân loại sâm ngọc linh đối với các loài chi Panax khác của ba vùng gen nghiên cứu 50

3.8 Kết quả đăng ký mã số các vùng gen nghiên cứu trên ngân hàng gen 55

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN CỦA TÁC GIẢ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

Fragment Length Polymorphism)

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CBOL Consortium for the Barcode of Life

Amplified Polymorphic DNA)

Length Polymorphism)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền 17

Bảng 2.2 Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen 20

Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu 22Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên phân tích 4 chỉ thị SSR 26Bảng 3.2 Kết quả so sánh các Nu sai khác trên vùng gen rbcL (gồm rbcLa và rbcLc) giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax 37

Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền gen rbcL giữa loài sâm ngọc linh (phía trên

bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 44 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền gen rpoB giữa loài sâm ngọc linh ( phía trên

bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 44

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền vùng gen ITS giữa loài sâm ngọc linh 45(phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh

với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 45

Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền mồi 18S giữa loài sâm ngọc linh (phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1% 22 Hình 3.2 Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4

mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481

23

Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S bằng điện di

trên gel agarose 1%

30

Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc bằng điện di

trên gel agarose 1%

30

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với các loài

Panax trên ngân hàng gen

35

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với các loài

Panax trên ngân hàng gen

36

Hình 3.8 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với các loài

Panax trên ngân hàng gen

39

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các loài

Panax trên ngân hàng gen

41

Hình 3.10: Sơ đồ hình cây (NJ) mối quan hệ di truyền của sâm ngọc

linh với 9 loài khác trong chi Panax dựa trên phân tích trình tự vùng

gen ITS và rbcL

48

Hình 3.12 Kết quả so sánh phân loại chín loài chi Panax dựa trên so

sánh từng vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) và sự kết hợp của chúng

53

Hình 3.13 Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài thuộc chi

Panax phân tích dựa trên sự kết hợp trình tự gen rbcL và ITS

54

MỞ ĐẦU

Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) đã được xác định

là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen, được xếp vào một trong bốn cây sâm quý nhất trên thế giới do có chứa nhiều thành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất khoáng vi lượng hơn hẳn những loài sâm khác Tuy nhiên, việc khai thác quá mức và phá hủy vùng phân bố tự nhiên đã dẫn đến sự tuyệt chủng ngoài tự nhiên của sâm ngọc linh Hiện loài này chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảo tồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum Sâm ngọc linh đã được đưa vào sách

đỏ Việt Nam, danh lục của IUCN và Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính phủ Ngành Y tế đã hướng chọn sâm ngọc linh làm cây thuốc xây dựng sản phẩm quốc gia về dược liệu Ngày 18/7/2012, chính phủ đã có Quyết định số 936/QĐ-TT phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển kinh tế - xã hội vùng Tây Nguyên đến năm 2020, trong đó phát triển cây sâm ngọc linh trở thành cây đặc sản quốc gia Những nghiên cứu về di truyền quần thể giúp các nhà khoa học và các nhà chiến lược có cái nhìn tổng thể về thực trạng di truyền của các quần thể sâm ngọc linh, từ đó có những chiến lược hợp lý trong việc bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử còn giúp xác định được những sai khác về

mặt di truyền của loài sâm ngọc linh so với các loài Panax khác, làm cơ sở

cho việc phân loại và giám định các mẫu sâm ngọc linh

Xuất phát từ tình hình thực tế này, luận văn tập trung nghiên cứu đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và Kon Tum, đồng thời kiểm tra sự sai khác di truyền của bốn vùng gen gồm hai

vùng gen nhân: 18S, ITS và hai vùng gen lục lạp: rbcL và rpoB của mẫu sâm ngọc linh, so sánh với một số loài Panax khác

khác trên cơ sở giải mã trình tự vùng gen rbcL, rpoB, 18S và ITS, đặc điểm

phân tử của các vùng gen này, đồng thời so sánh khả năng phân loại của

bốn vùng gen nói trên trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh với một số

loài Panax khác

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật thông tin về hiện trạng di truyền của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum

Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học giúp cho công tác bảo tồn và chọn giống có những chiến lược hợp lý trong công tác bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam

Kết quả của luận văn góp phần chọn lọc được vùng gen hữu hiệu (chỉ thị phân tử) cho công tác nghiên cứu khoa học và phân loại loài sâm ngọc linh của Việt Nam

Nội dung nghiên cứu

- Lựa chọn mồi SSR phù hợp với loài sâm ngọc linh của Việt Nam

- Đánh giá đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại tỉnh Quảng Nam và Kon Tum bằng kỹ thuật SSR

- Kiểm tra đặc điểm phân tử của bốn vùng gen rpoB, ITS, rbcL và

18S, so sánh khả năng phân loại của bốn vùng gen này trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh của Việt Nam; đăng ký số hiệu genbank

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.)

Chi sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Toàn

bộ chi sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài (thứ -var.) [21] Sự phân bố của chi Panax L trên thế giới cho thấy chúng chỉ

xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của

Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài Panax quinquefolius và Panax trifoliatus) Vùng Đông Bắc Á có 2 loài Panax ginseng và Panax japonica Trung tâm phân bố của chi Panax L có thể từ

vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam) Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn

toàn tự nhiên Hai loài nhập trồng là Panax notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và Panax pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có

nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài

gần gũi nào đó) Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi sâm (Panax L.) của thế giới Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (Panax notoginseng; Panax

quinquefolius và Panax trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi

Panax L là loài sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) ở miền Trung của Việt

Nam, tại 14°15’ vĩ độ Bắc Chính vì vậy sâm ngọc linh được coi là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam [12]

1.2 Tổng quan về sâm ngọc linh

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)[36] là cây thân thảo,

sống nhiều năm Thân rễ có đường kính 3.5cm, không có rễ phụ dày dự trữ, đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 5cm Thân cao từ 40 cm – 60 cm, rỗng, lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6) Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7 – 12 cm (ít khi 15 cm) Lá

chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 – 14 cm, rộng 3 – 5

cm, đầu lá thường nhọn, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều [12], [14], [25] (Hình 1.1)

Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh

(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)

Sinh thái: Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20 - 25°C, ban đêm 15 - 18°C, sâm ngọc linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm [25]

Công dụng: Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con [25]

Sinh học: Vào đầu tháng giêng hàng năm, cây sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành, từ tháng

4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả, tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9 Khi quả chín, vỏ quả chuyển từ màu xanh sang vàng lục rồi đỏ cam với chấm đen lớn chiếm 1/4 đến 1/5 xuất hiện ở đỉnh quả (Hình 1.2)

Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín

(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac - ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)

Vào khoảng cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12 Ngay trong quá trình tàn lụi, từ đầu mầm thân rễ nằm sát hoặc dưới mặt đất hình thành một chồi thân mới Các chồi này tồn tại dưới dạng chồi ngủ trong suốt 3-4 tháng mùa đông và sẽ mọc lên vào mùa xuân năm sau để tiếp tục một chu trình sinh trưởng phát triển mới Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi Phải ít nhất từ 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi [2], [12] Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm

1.2.2 Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh

Cho đến nay, sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên trung phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có và quan trọng nhất là núi Ngọc Linh Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã Mường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà Cang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam) [12] Cây sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm

1970 cũng là sâm ngọc linh Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của

nó thì sâm ngọc linh đã có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang) Cả 2 khối núi này đều có độ cao trên 1.500 m Điểm phát hiện có sâm ngọc linh mọc tự nhiên đều vào khoảng 1.800 - 2.200 m [5], [25], [21]

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh

1.2.3.1 Tầm quan trọng và giá trị của sâm ngọc linh

Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài

của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm

vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như nhân

sâm (Panax ginseng); giả nhân sâm (Panax pseudoginseng); tam thất (Panax notoginseng) và sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

[6], [3], [9], [21] Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống

Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu vết thương,… [2], [3], [6], [11], [21] Theo quan điểm hóa phân loại và dược lý học, những công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế

giới đã chia các loài thuộc chi Panax thành 2 nhóm chính:

Nhóm 1: gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: nhân sâm

(Panax ginseng), sâm mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển

và chứa các Saponin có khung thuộc nhóm dammaran

Nhóm 2: gồm các loài mọc hoang như Panax japonicas, Panax zingiberensis, Panax stipuleanatus,… với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển

theo hướng nằm ngang, chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [3]

Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm ngọc linh

có 52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố Khi so sánh với nhóm sâm

trồng (nhóm 1) có giá trị trên thế giới như nhân sâm (Panax ginseng), sâm

mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… thì thành phần

saponin của sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượng lại cao hơn nhiều [3], [11]

1.2.3.2 Thành phần hóa học của sâm ngọc linh

Từ năm 1974 – 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu nhân

sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium)

Kết quả là bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong

Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng [13] Chi tiết hơn nữa, trong Panax vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane

(7.58%), trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ saponin của axit oleanolic[13] Điều này trái với quy luật chung là thông thường các cây nhân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin của axit oleanolic và saponin nhóm damarane [8], [11] Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được một lượng lớn majonozit R2 và ocotillol

saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4.34%)

gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao nhất có trong các

loài chi Panax [16] Ocotillol saponin đã trở thành một hợp chất cần chú ý có

thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học vì nó có thể ảnh hưởng đến một

số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis Sự có mặt của

damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho sâm ngọc linh khác với nhân sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol trong nhân sâm Triều Tiên Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân sâm của Việt Nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so với nhân sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26% trong nhân sâm triều tiên [9] Ngoài những saponin nói trên, trong nhân sâm của Việt Nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [11]

Như vậy, sâm ngọc linh không những đặc biệt về mặt phân bố (là loài duy

nhất có phấn bố tại 14°15’ vĩ độ Bắc, giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi

Panax L.) mà còn độc đáo về cấu tạo hoá học bởi tuy là loài sâm thuộc nhóm

2 với bộ phận thân rễ thuộc dạng khí sinh, phát triển theo hướng nằm ngang nhưng thành phần hoá học lại chứa các saponin chủ yếu thuộc nhóm dammaran (giống các loài sâm của nhóm 1), đặc biệt hơn lại có chứa một số saponin đặc trưng mà các loài sâm khác trên thế giới không có

1.2.4 Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh

Ở Việt Nam, cho đến nay, các công trình khoa học nghiên cứu về sâm ngọc linh khá đa dạng, ngoài những nghiên cúu cơ bản tập trung vào điều tra, phân loại, xác định vùng phân bố thì cũng đã có nhiều nghiên cứu về

thành phần hoá học, thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan, giải mã hệ gen lục lạp…có thể liệt kê một số các công trình đáng chú ý như sau:

- Trần Lê Quân và cs (2002): tách chiết, majonoside R2, Triterpen

Saponin từ cây sâm việt nam (Panax vietnamensis) và thử nghiệm hoạt tính

bảo vệ gan Nghiên cứu cho thấy cao chiết MeOH của củ sâm việt nam có hoạt tính bảo vệ gan in vitro trên mô hình gây độc cho tế bào gan bằng D-galactosamine (D-GaLN)/yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-anpha) Nguyễn Thị Thu Hương và cs (1999): nghiên cứu về tác dụng dược lý của sâm việt nam, trong đó tập trung vào tác dụng kích thích miễn dịch chống căng thẳng, trầm cảm [48], [5], [11], [18]

- Nguyễn Thới Nhâm và cs (1993) Nghiên cứu về dược liệu học và hoá học cây sâm Việt Nam [16]

- Loạt công trình của PGS.TS Dương Tấn Nhựt (2010, 2011, 2014, 2015) về nhân giống vô tính Sâm ngọc linh [13], [14]

- Cụm công trình của Viện Dược Liệu trong khuôn khổ chương trình bảo tồn nguồn gen đã khoanh vùng được khu vực phân bố, đặc điểm sinh thái, hình thái, lập bản đồ quy hoạch vùng trồng sâm (các tác giả, Lê Minh Thảo [8], [18],…)

- Phan Kế Long và cs (2014) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh giá sự sai khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh và mẫu sâm thu được tại Phong Thổ Lai Châu, cũng dựa trên trình tự gen matK và ITS, mẫu sâm thu tại Lai Châu

đã được xác định tên khoa học là Panax vietnamensis var fuscidiscus, là một thứ của loài Panax vietnamensis [9, 40]

- Nguyễn Thị Phương Trang và cs (2011) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh gía mối quan hệ di truyền của loài sâm việt nam, sâm lai châu với các

loài khác trong chi Panax [22] Hay nhóm nghiên cứu của Đặng Tất Thế,

Nguyễn Thị Phương Trang (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật) thực hiện một số hợp tác nghiên cứu với nhóm nghiên cứu của Viện sỹ Yuri Zhuralev và TS Galina D Reunova (Viện Sinh học thỗ nhưỡng Viễn Đông,

Viện Hàn Lân khoa học Liên Bang Nga) về phân bố và di truyền của loài sâm việt nam và sâm nga bằng kỹ thuật AFLP và SSR [34, 35]

- Trong đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền chi sâm, nhóm nghiên cứu của Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu, và cs (2016) đã thực hiện “Đánh giá

di truyền quần thể loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai) bằng chỉ

thị ISSR Nhóm nghiên cứu của GS Nông văn Hải (2017) (Viện nghiên cứu

hệ gen-Viện Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu về giải

mã hệ gen lục lạp sâm ngọc linh Nhóm nghiên cứu của TS Lê Hùng Lĩnh (2017)-(Viện Di truyền Nông nghiệp) thực hiện nghiên cứu nuôi cấy mô và

xác định gen lục lạp đặc hiệu của một số loài trong chi Panax

1.2.5 Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam

Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là tam thất (Panax notogineng) và nhân sâm (Panax ginseng) [5] Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là sâm

vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng) và đặc biệt sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), huyện Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên

1500 m Tuy nhiên, hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên do tình trạng khai thác cạn kiệt trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp Hiện, sâm ngọc linh đã được đưa vào danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006

về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo Sách đỏ Việt Nam (2007), sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala, c, d, BI + 2b, c,

e [1] Sâm ngọc linh chủ yếu tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng

khoảng 10 hecta [6] Tuy nhiên, với quyết định số 936/QĐ-TT ngày 18/7/2012 của thủ tướng chính phủ thì kế hoạch đến năm 2020, diện tích trồng sâm ngọc linh sẽ được tăng lên đến khoảng 200ha

1.3 Phương pháp luận và cách tiếp cận

Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA, đặc biệt đối với lĩnh vực phân loại học và di truyền phân tử Việc sử dụng các chỉ thị DNA để định danh loài đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và đã có nhiều đóng góp, phát hiện đáng kể [10], [17], [22], [24], [27], [30], [40], [41], [42], [53] Xác định loài bằng chỉ thị DNA có độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi mà những quan sát hình thái, sinh trưởng, phát triển chưa đủ cơ sở để phân biệt Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) của thế giới đã lưu giữ trên 70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotide Đây là nguồn dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là: (1) số liệu

về trình tự các nucleotide rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự nucleotide đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa các cha mẹ và con cái ; (3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…; và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra [10]

Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực

vật và vi sinh vật [37] Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam Sâm ngọc linh là loài dược liệu quý có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch và ngăn ngừa ung thư… Đến nay quần thể sâm ngọc linh tự nhiên bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới có nguy cơ cạn kiệt do nhu cầu sử dụng loại dược liệu này ngày càng cao Công tác bảo tồn và phát triển bền vững loại dược liệu này

ở Việt Nam trở nên cần thiết và cấp bách Vì vậy, nghiên cứu đánh giá tính đa dạng di truyền, làm cơ sở cho công tác bảo tồn nguồn gen cho loài sâm ngọc linh cần được tập trung thực hiện Bên cạnh đó, việc phát triển bộ mã vạch phân

tử cũng cần được nghiên cứu để giúp góp phần phân loại/giám định chính xác sâm ngọc linh và các loài sâm khác thuộc chi nhân Sâm

1.3.1 Phương pháp phân loại học phân tử

1.3.1.1 Ưu điểm của việc ứng dụng nghiên cứu phân tử trong phân loại học

Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất hiện nay trong việc xác định mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự DNA, bởi vật liệu di truyền

là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và chế biến DNA chiết từ bất cứ bộ phận nào đều mang cùng thông tin di truyền DNA chiết thì ổn định và có thể giữ ở -20°C trong thời gian dài (khoảng 3-5 năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích, đặc biệt chỉ cần sử dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả [8], [12], [26]

1.3.1.2 Sử dụng hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật

Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae), chúng có chứa DNA riêng DNA lục lạp có từ 102 – 104 bản sao trong mỗi tế bào Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyl) và là nơi thực hiện quá trình quang hợp của cây Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế

hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại

học phân tử đánh giá chúng là sự tích lũy của các đột biến theo thời gian, do vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hóa giữa các loài Hệ gen lục lạp (cpDNA) thực chất là một phân tử DNA dạng vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp lại Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hóa cho các protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein này Vùng DNA không mã hóa trên hệ gen lục lạp là rất ít

Hệ gen lục lạp có kích thước từ 120 kb – 220kb, kích thước này thay đổi

do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau, tách hệ gen lục lạp thành

2 vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC) Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào DNA nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng 3 lần so với DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại [45] Các nghiên cứu cấu trúc phân tử hệ gen lục lạp ở hầu hết các loài thực vật bậc cao cho thấy tỷ lệ thay thế trong hệ gen lục lạp thấp hơn rất nhiều

so với hệ gen nhân và chúng cũng có mức tái tổ hợp rất thấp, di truyền theo một dòng [54] Một số vùng gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên

cứu hệ thống học phân tử thực vật hiện nay bao gồm: matK, rbcL, psbA – trnH, rpoB,… tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận [29]

1.3.1.3 DNA barcoding và ứng dụng của nó

DNA barcoding là đoạn DNA ngắn (thường từ 200-500 bp) đặc trưng cho loài/nhóm loài, dễ khuếch đại và bền vững Hiện nay DNA barcoding đã được

sử dụng rất nhiều trong phân loại và giám định các loài động thực vật Phương pháp này dựa trên nguyên tắc so sánh các vùng trình tự DNA ngắn có tốc độ tiến hóa nhanh để định loại các loài Phương pháp này có thể áp dụng cho tất

cả các đối tượng sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật…

Ở thực vật, các vùng DNA mã vạch được sử dụng để phân loại thường là

các trình tự thuộc hệ gen lục lạp và hệ gen nhân…[39]; [55]; [10] Trên thế giới việc sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân biệt các loài đã phổ biến và thông dụng từ những thập niên 90 của thế kỷ trước Một số vùng gen nhân và

lục lạp thường dùng trong phân loại/giám định thực vật gồm ITS, 18S, matK, rbcL, rpoB, psbA – trnH …[29]; [38], [40]; [42]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 vùng gen lục lạp gồm rbcL, rpoB và 2 vùng gen nhân gồm 18S và ITS để đánh giá khả năng phân biệt loài sâm ngọc linh với một số loài Panax khác

- RbcL là vùng gen đệm trong lục lạp dài khoảng 1500 bp mã hoá cho

protein Rubico Protein này có 8 tiểu phần lớn (55 kDa) và 8 tiểu phần nhỏ (12 kDa) giống nhau Các tiểu phần lớn được mã hóa bằng gen lục lạp

(rbcL), còn các tiểu phần nhỏ mã hóa bằng gen nhân Riêng đối với tảo nâu

và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hóa cho tiểu phần nhỏ Các gen

rbcL ở thực vật bậc cao không có intron Các gen này được dùng nhiều

trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại [29]

- rpoB là một vùng gen nhỏ nằm trong lục lạp, đây được coi là vùng

gen mang nhiều vị trí Nu dễ biến đổi Nghiên cứu của nhóm CBOL gợi ý

dùng gen rpoB cho các phân biệt ở cấp độ loài và dưới loài [29]

- 18S-rDNA là vùng gen giải mã cho tiểu phần RNA ribosome, vùng gen nằm trong nhân tế bào, có kích thước khoảng 1900 Nu Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S

và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa

gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau [29]

1.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể bằng kỹ thuật phân tử

Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đa dạng di truyền và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài trong tự nhiên

có vai trò quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồn loài một cách hữu hiệu Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảm tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến quá trình phân cắt nơi sống [27]; [28]; [26]; [33]; [29] Các tác giả này đã chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng

cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt Hệ số thụ phấn cao giữa các cá thể có quan hệ cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tính

đa dạng di truyền Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau giữa chúng Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự phát triển mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn Để nghiên cứu

đa dạng di truyền quần thể và loài bằng kỹ thuật DNA có các phương pháp chủ yếu như RAPD, AFLP, RFLP, ISSR,

Một trong những kỹ thuật mới nhất để nghiên cứu đa dạng di truyền ở cấp

độ loài và quần thể là kỹ thuật SSR vì các chỉ thị SSR có tính đa hình cao, đặc hiệu cho từng loài nghiên cứu Kỹ thuật này đã được áp dụng nhiều trong các nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền và mối quan hệ sinh sản trong các quần thể [20], [26]

Kỹ thuật SSR

Kỹ thuật SSR hay còn gọi là kỹ thuật microsatellite là những trình tự

nucleotide đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh Phương pháp truy tìm các phân đoạn DNA đơn giản lặp lại do Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử năm 1989 [37] Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặp lại, các đoạn dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài Các chuỗi lặp lại này thường từ 1- 6 nucleotide Bản chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh

ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu vùng lặp lại Giá trị của SSR là do nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp genome và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR Cho đến nay kỹ thuật này đang được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật; thực vật [30]

Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện SSR

là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao Đây là chỉ thị phân tử giúp tránh được các nhầm lẫn trong phân tích genome và là một loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài Nhược điểm của chỉ thị SSR là quá trình thiết kế mồi tốn kém và hầu như mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tổng số 60 mẫu lá sâm ngọc linh thu ngẫu nhiên từ 25 cây sâm tại vườn sâm Tăc-ngo, xã Trà Linh, tỉnh Quảng Nam và 35 mẫu sâm thu tại Măng ri, Kon Tum (Hình 2.1) Các mẫu thu được được giữ trong phòng bì giấy và bảo quản trong silicagel cho đến khi sử dụng

Hình 2.1 Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 12/2016 - 07/2018

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Các mẫu lá sâm ngọc linh được thu tại Quảng Nam và Kon Tum được bảo quản trong silicagen cho đến khi thực hiện các nghiên cứu phân tử

Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle

(1987) [32], có cải tiến thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và di

truyền bảo tồn gồm các bước sau:

Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá thu được Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng

cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn, cho vào ống eppendorf 2ml

Bước 2: Bổ sung 800 l đệm rửa (Tris-HCl 100mM, EDTA 5mM, NaH2PO4

0,5 %) vào ống eppendorf chứa mẫu, vortex tạo thành dịch đồng nhất Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần)

Bước 3: Bổ sung 800l đệm tách chiết (NaCl 1,5M, Tris-HCl 100mM, EDTA 20mM, CTAB 4 %) wotex tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ 1 giờ 30 phút ở

650C thỉnh thoảng trộn đều Lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Bước 4: Bổ sung 800l chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều tạo

sang ống eppendorf 1,5ml mới (lặp lại bước này 2 lần)

Bước 5: Bổ sung 1 lần thể tích isopropanol đảo đều để ở tủ -200

C 1 giờ Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa

Bước 6: Rửa tủa bằng ethanol 70 % Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40

C

Bước 7: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng Hoà tan DNA trong 50-100 l TE

Bước 8: Bổ sung 3l RNase(10mg/ml), ủ ở 370C trong 1 giờ

Bước 9: Bổ sung 2 lần thể tích ethanol 100% (lạnh), đảo nhẹ để trong tủ -200

C trong 30 phút Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi, thu tủa

Bước 10: Rửa tủa bằng ethanol 70% Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40

C

TE DNA tổng số được kiểm tra độ sạch và hàm lượng DNA bằng điện di

thực hiện PCR

2.3.2 Lựa chọn mồi SSR

Nhóm nghiên cứu của GS Kim Joonki tại trường đại học Kongju, Hàn Quốc đã phát hiện được 642 vùng lặp microsatellite trên toàn bộ vùng gen loài

Nhân sâm hàn quốc (Panax ginseng), đã chọn được 251 vùng khác nhau và đã

thiết kế được 90 cặp mồi SSR để nhân những vùng microsatellite này Kết quả nghiên cứu đã chọn ra 11 cặp mồi SSR cho kết quả đa hình [42] (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền

bắt cặp

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 11 cặp mồi SSR này để nghiên cứu tính đa dạng di truyền cho 2 quần thể sâm ngọc linh của Việt Nam Phản ứng nhân dòng các đoạn microsatellite có kích thước trong khoảng 100 –300 bp được thực hiện với cặp mồi đánh dấu huỳnh quang một chiều xuôi

2.3.3 Phân tích số liệu SSR

Dẫn liệu di truyền được ghi nhận trên cơ sở sự có mặt hoặc vắng mặt của các đỉnh (peak) DNA thu được hoặc băng vạch DNA trên bản điện di Các thông số xác định đa dạng di truyền trong quần thể bao gồm tần số allen cho một lô cút (A), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) và hệ số giao giao phấn cận noãn (Fis) được tính toán bằng phần mềm GenAlex Đặc điểm di truyền quần thể được phân tích dựa trên các số liệu thu được

Các chỉ số thống kê F của Wright (1969) được dùng để đánh giá sự phân bố allen trong và giữa các quần thể, trong đó Fis là hệ số dư thừa gen đồng hợp tử trong quần thể, Fit là hệ số sai khác trong quần thể và Fst là hệ

số sai khác giữa các quần thể trong loài Giá trị trao đổi di truyền giữa các quần thể (Nm) được xác định theo công thức: Nm = (1 – Fst) / 4Fst

dạng di truyền trong và giữa các quần thể đối với mỗi lô cút đa hình, trong

đó Ht là giá trị đa dạng di truyền tổng số, Hs là giá trị đa dạng di truyền trong mỗi quần thể, Dst và Gst là giá trị khác nhau về di truyền giữa các quần thể và hệ số đa dạng di truyền được xác định bởi công thức:

Dst = Ht – Hs và Gst = Dst/Ht [41]

Sự sai khác di truyền giữa các quần thể được đánh giá theo tần số alen sử dụng chỉ số khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền của Nei’s (1972) Xác định cấu trúc di truyền ở cả hai mức độ quần thể và loài của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại hai điểm Quảng Nam và Kon Tum trên cơ sở phân tích bốn lô cút gen bằng chỉ thị SSR Các thông số đa dạng di truyền sẽ được xác định bằng phần mềm GenAlex và FSTAT bao gồm số alen cho mỗi lô cút, tỉ lệ phần trăm lô cút đa hình, tần số gen dị hợp tử quan sát và lý thuyết

được sử dụng để đánh giá sự sai khác giữa tần số gen dị hợp tử quan sát và lý thuyết Các chỉ số thống kê F của Wright (1969) cũng được sử dụng để đánh giá sự phân bố alen trong và giữa các quần thể Mức độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể sử dụng các tham số thống kê của Nei (1987) để phân tích đối với mỗi lô cút đa hình Nghiên cứu mối quan hệ sinh sản giữa các cá thể trong quần thể và giữa các quần thể của loài trên cơ sở xác định hệ số thụ phấn cận noãn Chỉ số thụ phấn chéo trong mỗi quần thể cũng được xác định Nghiên cứu không gian phân bố di truyền trong quần thể liên quan đến khoảng cách di truyền, hệ số di truyền tương đồng và mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể Điện di phân tách trên máy điện di mao quản ABI Prizm 3100 Các phân đoạn SSR sau đó được phân tích bằng phần mềm Genscan v 3.7 Tất cả các thông số trên được tính toán và phân tích bằng phần mềm GenAlex và FSTAT Phân tích mức độ tiến hoá và mối quan hệ

2.3.4 Thiết kế mồi đọc trình tự

Trình tự các cặp mồi sử dụng được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ nằm ở hai đầu của vùng gen nghiên cứu Các mồi được thiết kế sao cho đạt được tỷ

lệ phổ biến cho các loài thuộc chi Panax Gen rbcL dài khoảng 1500 bp được chia thành 2 đoạn gen gồm rbcLa và rbcLc, mỗi đoạn gen dài khoảng 600 bp Các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế trên cơ sở trình tự rbcLa; rbcLc; rpoB; 18S; ITS của các loài trong chi Panax trên Genbank [29] Trình tự 5 cặp mồi

đặc hiệu được dùng để khuếch đại gen được thể hiện bảng 2.2

Bảng 2.2 Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen

2.3.4 PCR khuếch đại gen

Nhân bản vùng gen rbcLa; rbcLc; rpoB; 18S; ITS dài khoảng từ 500 bp

đến 700 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế trên cơ sở trình

tự rbcLa; rbcLc ; rpoB; 18S; ITS của các loài trong chi Panax trên Genbank

[29] Phản ứng nhân gen được thực hiện trong thể tích là 25µl với các thành

Taq polymerase 5u/l: 0,5l; 10 ng/l DNA mẫu: 2l; primer (10pmol mỗi mồi xuôi hoặc ngược): 1,25l, H2O khử ion: 7µl Chu trình nhiệt của mỗi phản ứng PCR: (1) 950C 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ lặp lại: 950

C 30 giây;

540C 1phút; 720C 1phút Cuối cùng là 720C 10 phút để kết thúc phản ứng và

2.3.5 Điện di trên gel agarose

DNA tổng số sau khi được tách và các sản phẩm PCR thu được được

điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

2.3.6 Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST

Trình tự DNA thu được sau khi được hiệu chỉnh ở định dạng file fasta (.fas) sẽ được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ BLAST [57] Công cụ này cho phép bước đầu định danh đến mức

độ loài của các trình tự thu được bằng cách xác định các trình tự tương đồng với trình tự này trong cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen Bằng cách tìm kiếm những trình tự có điểm số bắt cặp cao giữa chuỗi truy vấn và các chuỗi trong

cơ sở dữ liệu sử dụng phương pháp tìm kiếm đơn giản, trên cơ sở phương pháp phỏng đoán, công cụ BLAST tìm những trình tự tương đồng thông qua phát hiện các đoạn bắt cặp ngắn theo từng bộ 3 nulceotide gối lên nhau giữa trình tự cần truy vấn và trình tự có sẵn trong cơ sở dữ liệu Tiếp đó, nếu mỗi

bộ 3 này đạt tới một ngưỡng T tối thiểu được tính toán bằng ma trận điểm (scoring matrix), chúng sẽ được đưa vào sắp xếp thẳng hàng (alignment) bởi thuật toán được sử dụng trong công cụ BLAST BLAST sẽ cho ra kết quả các trình tự tương đồng được thể hiện ở dạng bảng đi kèm với thông tin của trình tự trên ngân hàng gen cùng với các chỉ số tương đồng (ident), độ dài của chuỗi trình tự được bắt cặp ở dạng phần trăm (query cover), điểm số bắt cặp giữa 2 trình tự Trình tự nào có điểm số tương đồng cao hơn sẽ có mức

độ giống nhau cao hơn Dựa vào chỉ số tương đồng của các trình tự, chúng tôi sẽ đưa ra kết quả giám định loài cho các mẫu vật nghiên cứu

2.3.7 Đọc trình tự gen

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản

ứng giải trình tự trực tiếp với các mồi rbcLa, rbcLc; rpoB; 18S, ITS, sử

dụng Bigdye terminator cycler và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer Hình ảnh các đỉnh (peak) của trình tự DNA các

mẫu nghiên cứu được phân tích và ghép nối bằng phần mềm chromasPro

[58], so sánh bằng phần mềm MEGA7 [51]

2.3.8 Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Mối quan hệ di truyền của các loài được thể hiện bằng cây phát sinh chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, được xây dựng dựa trên sự giống và khác nhau của các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ thể Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về cấu trúc DNA giữa các loài Các taxon được nối với nhau trên cây thể hiện mối quan hệ di truyền Phương pháp Neighbor – Joining (NJ) là phương pháp tạo cây thường được sử dụng Phương pháp NJ do Naruya Saitou và Masatoshi Nei đưa ra vào năm 1987 [54] Kiểm tra và ghép nối các đoạn gen và so sánh sự khác nhau về vị trí các nucleotide giữa các loài/thứ thuộc

chi Panax và 01 loài ngoài nhóm (Bảng 2.3) trên cơ sở trình tự nucleotide của gene rbcLa; rbLc;18S; rpoB; ITS được thực hiện bởi phần mềm

ChromasPro (Technelysium Pty Ltd) [58] Thành phần base (%) vùng gen

rbcLa;rbcLc;18S; rpoB; ITS của các loài nghiên cứu, sự khác nhau giữa

các cặp loài trên cơ sở phân tích theo mô hình Kimura 2 tham số và sơ đồ hình cây mối quan hệ di truyền theo hai phương pháp: NJ và MP được tiến hành trên phần mềm MEGA7 [51] và Paup [53]

Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số

Lá của các mẫu sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và Kom Tum được

nghiền trong nitơ lỏng (-196°C) thành dạng bột mịn Khoảng 100 mg bột

nghiền được dùng để tách DNA tổng số Kết quả sau đó được điện di kiểm

tra trên gel agarose 1% (Hình 3.1)

Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1%

Kết quả điện di (hình 3.1) cho thấy vạch DNA thu được khá rõ,

vạch DNA thể hiện trên bảng gel điện di sắc gọn, chứng tỏ chúng tôi đã

thực hiện tách chiết DNA tổng số của sâm ngọc linh khá tốt, DNA tổng

số thu được ít bị đứt gãy

3.2 Lựa chọn mồi SSR

Mười mẫu sâm ngọc linh trong số 60 mẫu thu được được thử

nghiệm tính đa hình đối với 11 cặp mồi SSR đặc hiệu thiết kế cho sâm

hàn quốc (Panax ginesng) (bảng 2.1) Phản ứng nhân dòng các đoạn

microsatellite được thực hiện với cặp mồi đánh dấu huỳnh quang một

59oC trong 30’’, 72o

C trong 40’’; 72oC trong 10’ với tổng số 35 chu trình Kiểm tra kết quả bằng phần mềm Gene Marker

Kết quả thử nghiệm cho thấy trong số 11 mồi thử nghiệm, chỉ có 4 mồi gồm PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG -1481 cho kết quả đa hình, các mồi còn lại hoặc không xuất hiện băng vạch, hoặc xuất hiện băng nhiễu, không đặc hiệu Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn 4 cặp mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481 để phân tích tính đa hình di truyền cho 60 mẫu sâm thu được từ 2 quần thể sâm ngọc linh của Việt Nam tại Quảng Nam và Kon Tum

Một vài hình ảnh các peak thu được khi phân tích 4 cặp mồi SSR được trích dẫn ở hình 3.2

Hình 3.2 Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4 mồi

PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481

3.3 Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh

Các thông số xác định đa dạng di truyền trong quần thể bao gồm tần số allen cho một lô cút (A), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), hệ

số gen dị hợp tử mong đợi (He) và hệ số giao giao phấn cận noãn (Fis) được tính toán bằng phần mềm GenAlex (Bảng 3.1)

Kết quả phân tích 60 mẫu sâm ngọc linh thu từ 2 quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum cho thấy 25 mẫu sâm ngọc linh

từ quần thể Quảng Nam phân tích trên 4 cặp mồi SSR đã thu được tổng số 525 alen, trung bình mỗi mẫu cho 21 alen Mồi PG - 29 cho 8 alen với kích thước lần lượt là 91, 97, 100, 103, 106, 112, 115 và 118

bp Mồi PG - 668 cho tổng số 5 alen với kích thước các băng lần lượt

là 89, 95, 104, 107 và 110 bp Mồi PG - 1419 cho tổng số 6 alen với các kích thước là 95, 97, 103, 105, 107 và 111 bp Mồi PG - 1481 cho

2 alen với kích thước là 101 bp và 105 bp, tuy nhiên alen 101 bp xuất hiện với tần suất áp đảo (85%), alen 105 bp chỉ xuất hiện ở 9 mẫu trên tổng số 25 mẫu của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam

Như vậy, tần số phân bố của các allen thu được ở 4 locus (PG - 29; PG- 688; PG - 1419; PG - 1481) là không đồng đều Trong đó locus

PG - 29 có tính đa hình cao nhất và locus PG - 1481 có tính đa hình thấp nhất thể hiện ở 2 vạch (101 bp và 105 bp) (Bảng 3.1)

Tất cả 4 lô cút SSR đều là đa hình cho quần thể sâm ngọc linh ở tỉnh Quảng Nam Như vậy, quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam đang duy trì mức độ đa dạng di truyền khá tốt, có giá trị bảo tồn cao Đối với quần thể sâm tại Kon Tum, 35 mẫu sâm ngọc linh thu được đã cho tổng số 665 alen Trong 4 mồi là PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG - 1481 số alen (A) nhận được lần lượt là 8 alen; 5 alen; 6 alen và 1 alen Mồi PG - 29 cho nhiều alen nhất (8 alen), mồi PG -

1481 cho kết quả đơn hình với một vạch duy nhất; trung bình mỗi

locus có 5 alen Tần số alen (Allele frequency) xuất hiện ở nhiều nhất

là ở locus PG - 29 là 0,0119; 0,0357; 0,6786; 0,0476; 0,0357; 0,1190; 0,0238; 0,0476 và thấp nhất ở locus PG - 1481 là 1,000 Mồi PG - 668

và PG - 1419 có kích thước băng dao động trong khoảng 89 bp đến

110 bp, tần số allen dao động từ 0,0114 tới 0,6705 Ở locus PG - 668 quan sát được mức độ đồng hợp tử khá cao nhưng chưa hoàn toàn lấn

át các tổ hợp gen dị hợp tử Số lượng alen quan sát được ở locus PG -

668 cũng thấp hơn so với 3 locus PG - 29; PG - 1419 và PG - 1481 Điều này có thể sự cách ly và phiêu bạt di truyền phần nào đã làm giảm tỉ lệ các tổ hợp gen dị hợp Các phân tích chỉ ra rằng ở bốn locus nghiên cứu có sự đa hình khá lớn, tuy nhiên tần số phân bố của các allen không đồng đều, số lượng allen có tần số xuất hiện có ý nghĩa chỉ ở mức trung bình thấp Đây có thể là kết quả của quá trình cách ly

và chọn lọc không đều đã làm giảm tần số xuất hiện của một số allene hiếm hay không có ưu thể trong tiến hóa

Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên phân tích 4 chỉ thị SSR

Locus A ne Alleles

(bp)

Allele frequency

Ghi chú: A: Số alen; ne: Số allen hiệu quả; Ho : hệ số dị hợp tử; H e : Hệ số dị hợp tử mong đợi; Fis là giá

trị giao phối cận huyết

Chỉ số số alen có ý nghĩa (Ne) của bốn locus PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG - 1481 lần lượt là 2,073; 1,944; 2,821; 1.000, như vậy số alen

có ý nghĩa (Ne) dao động từ 1,0 đến 2,821 (trung bình là 1,959), trong

đó hơn một nửa là các alen hiếm với tỷ lệ rất thấp (0,05) Tiếp theo là tần

số di hợp tử quan sát (Ho) trung bình mỗi locus là 0,466 (dao động từ 0 đến 0,884 tuỳ theo từng locus) cao nhất là cao nhất ở locus PG - 1419 là 0,645 Ở 4 locus PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG - 1481 tần số dị hợp

tử quan sát (Ho) có trùng bình mỗi locus đa hình là 0,621 Tần số dị hợp

tử mong đợi (He) của bốn locus PG - 29; PG - 688; PG - 1419; PG -

1481 cao nhất ở locus PG - 1419 là 0,645 và thấp nhất ở locus PG - 1481

là 0,000, tần số dị hợp trung bình của mỗi locus là 0,412 Như vậy trung bình tần số dị hợp tử mong đợi (He) mỗi locus thấp hơn tần số dị hợp tử quan sát (Ho) mỗi locus (He = 0,412 < Ho = 0,466) Điều đó chứng tỏ hai quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và Kon Tum đều đang duy trì được tần số dị hợp tử tương đối khả quan

Ở mức độ quần thể, quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam cho thấy

tần số alen cao hơn so với quần thể sâm ngọc linh ở Kom Tum (AR = 2,27 >

AR = 2,05) Tần số alen di hợp tử quan sát được (Ho) của quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam là 0,49 và ở Kon Tum là 0,43 Tần số dị hợp tử mong đợi (He) ở hai quần thể này lần lượt là 0,42 và 0,4 Như vậy quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam có tần số dị hợp tử mong đợi (He) cao hơn tần số dị hợp tử mong đợi của quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum (0,42 > 0,4) Tần số alen di hợp tử quan sát được (Ho) của quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam cũng cao hơn tần số dị hợp tử mong đợi so với quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum (0,49 > 0,43) Như vây, có thể kết luận cả hai quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum đều đang duy trì được tần số dị hợp tử tương đối cao, hiện tượng tự thụ phấn chưa ảnh hưởng đến cấu trúc di truyền quần thể của cả hai quần thể này, tuy nhiên quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam thể hiện mức độ đa dạng và tần số dị hợp tử cao hơn so với quần thể sâm ngọc linh tại Kon Tum

Tuy vậy, các kết quả phân tích thu được cũng cho thấy mặc dù có

sự đa hình khá lớn ở bốn locus nghiên cứu nhưng tần số phân bố của các alen không đồng đều, số lượng alen có tần số xuất hiện có ý nghĩa chỉ ở mức trung bình thấp Đây có thể là kết quả của quá trình cách ly

và chọn lọc không đều đã làm giảm tần số xuất hiện của một số alen hiếm hay không có ưu thể trong tiến hóa, điều này cho thấy rất có thể quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon tum thực chất ban đầu

có nguồn gốc từ một quần thể chung, sau đó bị phân ly tạo thành hai quần thể riêng biệt nên vẫn tồn tại một số alen hiếm nhưng với tần số rất nhỏ

Về chỉ số tự thụ phấn Fis, khi giá trị Fis > 0.1 thì khả năng quần thể đã có hiện tượng giao phấn cận noãn xảy ra, khi giá trị Fis < 0 thì khả năng quần thể chưa xảy ra hiện tượng giao phấn cận noãn; còn khi giá trị 0 < Fis < 0,1 thì quần thể chưa xảy ra hiện tượng thoái hóa hay

tỷ lệ tần số alen di hợp tử quan sát được là tương đối cân bằng Kết quả phân tích chỉ số Fis của hai quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam

và Kon Tum ở nghiên cứu này đều cho giá trị hệ số cận noãn (Fis) nhỏ hơn 0 (cụ thể, giá trị Fis của 2 quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam

và Kon Tum lần lượt là - 0,12 và – 0,09) Kết quả này phản ánh hệ số gen đồng hợp tử ở các quần thể này đều thấp hơn so với tỷ lệ alen dị hợp tử quan sát được, nghĩa là chưa xuất hiện hiện tượng thoái hóa di truyền hay nói cách khác chưa xảy ra sự tự thụ phấn trong quần thể hay việc tự thụ phấn giữa một số cá thể trong quần thể chưa làm ảnh hưởng đến tần số alen dị hợp tử tổng số của quần thể Quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam có hệ số cận noãn (Fis) nhỏ hơn hệ số cận noãn (Fis) ở quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum (- 0,12 < - 0,09), điều

đó cho thấy tỷ lệ tự thụ phấn ở các cá thể trong quần thể sâm ngọc linh

ở Quảng Nam thấp hơn so với Kon Tum, kết quả phân tích alen dị hợp

và tần số đa dạng alen ở quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam cũng cao hơn so với quần thể sâm ngọc linh ở Kon Tum

Nhìn chung, các kết quả thu được trong nghiên cứu này đều cho thấy các giá trị Ho, He của hai quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và Kon Tum đều cao hơn so với các kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền

quần thể của loài sâm mỹ (Panax quinquefollius) và loài nhân sâm (Panax ginseng) [48] Điều đó chứng tỏ loài sâm ngọc linh của Việt

Nam đang có được một nguồn gen phong phú với tỷ lệ locus đa hình cao Kết quả thu được từ phân tích AMOVA cũng đã chỉ ra rằng mức độ sai khác di truyền trung bình được tìm thấy ở hai quần thể sâm ngọc linh

ở Quảng Nam và Kon Tum trung bình là 85,175 % Sự khác biệt di truyền xảy ra trong quần thể sâm ngọc linh ở Quảng Nam và Kon Tum

có thể là kết quả của sự khai thác, mua bán và sử dụng tràn lan với số lượng lớn trong nhiều năm, việc khai thác quá mức đã dẫn đến sự mất mát alen trong quần thể gây ra sự khác biệt di truyền cao trong quần thể sâm Sự khác biệt di truyền lớn nếu xảy ra trong quần thể cũng là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra sự phân ly di truyền Để khắc phục hiện tượng này thì một trong những biện pháp đưa ra là cần phải có những biện pháp bổ sung alen nhằm nâng cao tính đa dạng trong

di truyền, rút ngắn khoảng cách khác biệt di truyền giữa các cá thể trong quần thể

Tuy đây mới là những phân tích bước đầu nhưng kết quả cho thấy tỷ

lệ dị hợp trong 2 quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum đủ đảm bảo cho quần thể sâm ngọc linh phát triển Tuy nhiên trong nghiên cứu này, hai quần thể sâm ngọc linh mà chúng tôi thực hiện thu mẫu là hai quần thể sâm thuộc sự quản lý của UBND xã Trà Linh, huyện Nam Trà My và UBND xã Măng ri, huyện Tu Mơ Rông, các cây sâm ở đây hầu hết đều là những cây được di thực từ tự nhiên, quy tập về trồng tại đây nên hầu như vẫn giữ được tính đa dạng cao Tuy nhiên nếu sau thời gian dài trồng tập trung như hiện nay mà không có sự bổ sung thêm cây mới hay nói cách khác là bổ sung nguồn gen mới thì khả năng mất đi tính đa dạng của quần thể này là chắc chắn xảy ra

3.4 Kết quả khuếch đại gen từ các cặp mồi đặc hiệu

Bốn vùng gen chúng tôi sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền

của loài sâm ngọc linh với một số loài khác trong chi Panax cũng như