Đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha grushv )

Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các loài 41 Panax trên ngân hàng gen Hình 3.10: Sơ đồ hình cây NJ mối quan hệ di truyền của sâm ngọc 48 linh với 9 loài khác trong chi Pan

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

o0o NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

o0o NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Nguyễn Thị Phương Trang

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại phòng Hệ thống học phân tử và Ditruyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoahọc và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tận tìnhcủa TS Nguyễn Thị Phương Trang Tác giả xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắctới sự hướng dẫn của cô

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tác giả

đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình về nhiều mặt của Ban lãnhđạo Viện ST & TNSV,cán bộ phụ trách đào tạo của Viện, của TS Đặng TấtThế, trưởng phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn

Chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp, ThS NguyễnGiang Sơn, TS Hồ Thị Loan, TS Phạm Thế Cường, ThS Lê Thị Mai Linh

đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, chỉ bảo những bước đi ban đầu tronglĩnh vực nghiên cứu khoa học

Cuối cùng, tác giả cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới nhữngngười thân trong gia đình đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ trong suốtquá trình hoàn thành luận văn

Luận văn được hoàn thành từ nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài hợp tácsong phương của Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS.Nguyễn Thị Phương Trang làm chủ nhiệm, mã số VAST.HTQT.Nga.10/15-16.Tác giả xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu thuthập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất

kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào Những thông tin tham khảo trong khóaluận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng

Ngày tháng năm 2018

Học viên thực hiện

( Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Thị Hồng Mai

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU .v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.) .3

1.2 Tổng quan về sâm ngọc linh 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái 3

1.2.2 Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh 5

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh 5

1.2.4 Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh 7

1.2.5 Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam 9

1.3 Phương pháp luận và cách tiếp cận 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu .16

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu .16

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 16

2.3.2 Lựa chọn mồi SSR 17

2.3.3 Phân tích số liệu SSR 18

2.3.4 Thiết kế mồi đọc trình tự 19

2.3.6 Điện di trên gel agarose 21 2.3.7 Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST 21

2.3.8 Đọc trình tự gen 21 2.3.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 21

23

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 23 3.2 Lựa chọn mồi SSR 23 3.3 Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂNCỦA TÁC GIẢ 58

59

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

AFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (AmplifiedFragment Length Polymorphism)

bp base pair

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CBOL Consortium for the Barcode of Life

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

ME Phương pháp Minimum Evolution Method

MP Phương pháp Maximum Parasimony Method

NJ Phương pháp Neighbor Joining

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)RAPD Đa hình các đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên (Random

Amplified Polymorphic DNA)RFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment

Length Polymorphism)SSR Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats)

UPGMA Unweighted Pair Group Method Analysis

VQG Vườn Quốc Gia

22Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên phântích 4 chỉ thị SSR 26Bảng 3.2 Kết quả so sánh các Nu sai khác trên vùng gen rbcL (gồm rbcLa vàrbcLc) giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax 37

Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền gen rbcL giữa loài sâm ngọc linh (phía trên

bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 44

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền vùng gen ITS giữa loài sâm ngọc linh 45 (phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên

phải) so sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh 4

Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín 4

Hình 2.1 Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh 15

Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1% 22

Hình 3.2 Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4 23

mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481 Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S bằng điện di 30

trên gel agarose 1% Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc bằng điện di 30

trên gel agarose 1% Hình 3.5 Ví dụ về hình ảnh các peak trong giải trình tự 31

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với các loài 35

Panax trên ngân hàng gen Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với các loài 36

Panax trên ngân hàng gen Hình 3.8 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với các loài 39

Panax trên ngân hàng gen Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các loài 41

Panax trên ngân hàng gen Hình 3.10: Sơ đồ hình cây (NJ) mối quan hệ di truyền của sâm ngọc 48

linh với 9 loài khác trong chi Panax dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS và rbcL Hình 3.11 Thứ tự ghép nối các đoạn gen nghiên cứu 50

Hình 3.12 Kết quả so sánh phân loại chín loài chi Panax dựa trên so 53

sánh từng vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) và sự kết hợp của chúng. Hình 3.13 Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài thuộc chi 54

Panax phân tích dựa trên sự kết hợp trình tự gen rbcL và ITS.

MỞ ĐẦU

Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) đã được xác định

là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen, đượcxếp vào một trong bốn cây sâm quý nhất trên thế giới do có chứa nhiềuthành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất khoáng vi lượng hơnhẳn những loài sâm khác Tuy nhiên, việc khai thác quá mức và phá hủyvùng phân bố tự nhiên đã dẫn đến sự tuyệt chủng ngoài tự nhiên của sâmngọc linh Hiện loài này chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảotồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum Sâm ngọc linh đã được đưa vào sách

đỏ Việt Nam, danh lục của IUCN và Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chínhphủ Ngành Y tế đã hướng chọn sâm ngọc linh làm cây thuốc xây dựng sảnphẩm quốc gia về dược liệu Ngày 18/7/2012, chính phủ đã có Quyết địnhsố

936/QĐ-TT phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển kinh tế - xã hội vùngTây Nguyên đến năm 2020, trong đó phát triển cây sâm ngọc linh trở thànhcây đặc sản quốc gia Những nghiên cứu về di truyền quần thể giúp các nhàkhoa học và các nhà chiến lược có cái nhìn tổng thể về thực trạng di truyềncủa các quần thể sâm ngọc linh, từ đó có những chiến lược hợp lý trongviệc bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam.Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử còn giúp xác định được những sai khác về

mặt di truyền của loài sâm ngọc linh so với các loài Panax khác, làm cơ sở

cho việc phân loại và giám định các mẫu sâm ngọc linh

Xuất phát từ tình hình thực tế này, luận văn tập trung nghiên cứu đặcđiểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và KonTum, đồng thời kiểm tra sự sai khác di truyền của bốn vùng gen gồm hai

vùng gen nhân: 18S, ITS và hai vùng gen lục lạp: rbcL và rpoB của mẫu sâm ngọc linh, so sánh với một số loài Panax khác.

Mục tiêu cụ thể:

- Xác định đặc điểm di truyền quần thể của hai quần thể sâm ngọc linh thutại tỉnh Quảng Nam và Kon Tum

- Đánh giá mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài Panax

khác trên cơ sở giải mã trình tự vùng gen rbcL, rpoB, 18S và ITS, đặc điểm

phân tử của các vùng gen này, đồng thời so sánh khả năng phân loại củabốn vùng gen nói trên trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh với một số

loài Panax khác.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhậtthông tin về hiện trạng di truyền của quần thể sâm ngọc linh tại QuảngNam và Kon Tum

Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học giúp cho công tác bảo tồn vàchọn giống có những chiến lược hợp lý trong công tác bảo tồn và phát triểnbền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam

Kết quả của luận văn góp phần chọn lọc được vùng gen hữu hiệu(chỉ thị phân tử) cho công tác nghiên cứu khoa học và phân loại loài sâmngọc linh của Việt Nam

Nội dung nghiên cứu

- Lựa chọn mồi SSR phù hợp với loài sâm ngọc linh của Việt Nam

- Đánh giá đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tạitỉnh Quảng Nam và Kon Tum bằng kỹ thuật SSR

- Kiểm tra đặc điểm phân tử của bốn vùng gen rpoB, ITS, rbcL và

18S, so sánh khả năng phân loại của bốn vùng gen này trong việc phân biệtloài sâm ngọc linh của Việt Nam; đăng ký số hiệu genbank

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.)

Chi sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Toàn bộ chi sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài (thứ -var.) [21] Sự phân bố của chi Panax L trên thế giới cho thấy

chúng chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biểnphía Đông của Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada

(có 2 loài Panax quinquefolius và Panax trifoliatus) Vùng Đông Bắc Á có

2 loài Panax ginseng và Panax japonica Trung tâm phân bố của chi Panax

L có thể từ vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc củaViệt Nam Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là VânNam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam) Ở đây đang có tới 7 loài và thứ

(dưới loài) mọc hoàn toàn tự nhiên Hai loài nhập trồng là Panax

notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và Panax pseudoginseng (không tìm thấy

trong hoang dại nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc làkết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó) Đây có thể coi là trung

tâm phân bố của chi sâm (Panax L.) của thế giới Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (Panax notoginseng; Panax quinquefolius và Panax trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L là loài sâm ngọc linh (Panax

vietnamensis) ở miền Trung của Việt Nam, tại 14°15’ vĩ độ Bắc Chính vì

vậy sâm ngọc linh được coi là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam[12]

1.2 Tổng quan về sâm ngọc linh

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)[36] là cây thân thảo,

sống nhiều năm Thân rễ có đường kính 3.5cm, không có rễ phụ dày dự trữ,đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kínhđến

5cm Thân cao từ 40 cm – 60 cm, rỗng, lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5,

6) Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7 – 12 cm (ít khi 15 cm) Lá

chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 – 14 cm, rộng 3 –

5 cm, đầu lá thường nhọn, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá

có răng cưa nhỏ đều [12], [14], [25] (Hình 1.1)

Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh

(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)

Sinh thái: Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp vớinhiệt độ ban ngày từ 20 - 25°C, ban đêm 15 - 18°C, sâm ngọc linh có thểsống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm [25]

Công dụng: Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài racũng có thể dùng lá và rễ con [25]

Sinh học: Vào đầu tháng giêng hàng năm, cây sâm xuất hiện chồi mới saumùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành, từtháng

4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả, tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéodài đến tháng 9 Khi quả chín, vỏ quả chuyển từ màu xanh sang vàng lục rồi

đỏ cam với chấm đen lớn chiếm 1/4 đến 1/5 xuất hiện ở đỉnh quả (Hình 1.2)

Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín

(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac - ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)

Vào khoảng cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lạimột vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12.Ngay trong quá trình tàn lụi, từ đầu mầm thân rễ nằm sát hoặc dưới mặt đấthình thành một chồi thân mới Các chồi này tồn tại dưới dạng chồi ngủtrong suốt

3-4 tháng mùa đông và sẽ mọc lên vào mùa xuân năm sau để tiếp tục mộtchu trình sinh trưởng phát triển mới Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ

mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi Phải ít nhất từ 3 nămtuổi tức trên củ có một sẹo mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 nămtuổi [2], [12] Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ củasâm

1.2.2 Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh

Cho đến nay, sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên trungphần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có và quan trọng nhất là núiNgọc Linh Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xãMường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã TràCang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam) [12] Câysâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm

1970 cũng là sâm ngọc linh Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của

nó thì sâm ngọc linh đã có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằngthuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang) Cả 2 khối núi nàyđều có độ cao trên 1.500 m Điểm phát hiện có sâm ngọc linh mọc tự nhiênđều vào khoảng 1.800 - 2.200 m [5], [25], [21]

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh

1.2.3.1 Tầm quan trọng và giá trị của sâm ngọc linh

Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài

của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm

vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như nhân

sâm (Panax ginseng); giả nhân sâm (Panax pseudoginseng); tam thất

(Panax notoginseng) và sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

[6], [3], [9], [21] Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống

Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở QuảngNam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thầndược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốmnặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máuvết thương,… [2], [3], [6], [11], [21] Theo quan điểm hóa phân loại vàdược lý học, những công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế

giới đã chia các loài thuộc chi Panax thành 2 nhóm chính:

Nhóm 1: gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: nhân sâm

(Panax ginseng), sâm mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax

notoginseng),… có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển

và chứa các Saponin có khung thuộc nhóm dammaran

Nhóm 2: gồm các loài mọc hoang như Panax japonicas, Panax

zingiberensis, Panax stipuleanatus,… với bộ phận thân rễ dưới đất phát

triển theo hướng nằm ngang, chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhómolean [3]

Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả,đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm ngọc linh

có 52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấutrúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố Khi so sánh với nhóm sâm

trồng (nhóm 1) có giá trị trên thế giới như nhân sâm (Panax ginseng), sâm

mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… thì thành phần

saponin của sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượnglại cao hơn nhiều [3], [11]

1.2.3.2 Thành phần hóa học của sâm ngọc linh

Từ năm 1974 – 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu

nhân sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax

quinquefolium) Kết quả là bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã

phát hiện trong Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số

di chuyển) và mầu sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax

ginseng [13] Chi tiết hơn nữa, trong Panax vietnamensis có hàm lượng cao

nhất saponin kiểu damarane

(7.58%), trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏsaponin của axit oleanolic[13] Điều này trái với quy luật chung là thôngthường các cây nhân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượngsaponin của axit oleanolic và saponin nhóm damarane [8], [11] Cũng là lầnđầu tiên trên thế giới, người ta chiết được một lượng lớn majonozit R2 và

ocotillol saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất này đã

chiếm 4.34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao nhất

có trong các loài chi Panax [16] Ocotillol saponin đã trở thành một hợp

chất cần chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học vì nó có thể

ảnh hưởng đến một số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis.

Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho sâm ngọclinh khác với nhân sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấyocotillol trong nhân sâm Triều Tiên Năm 1994, Nguyễn Minh Đức cònchứng minh nhân sâm của Việt Nam có hàm lượng saponin damarane caonhất (12 - 15%) so với nhân sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponinnhiều nhất (49%) so với

26% trong nhân sâm triều tiên [9] Ngoài những saponin nói trên, trongnhân sâm của Việt Nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin,gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [11]

Như vậy, sâm ngọc linh không những đặc biệt về mặt phân bố (là loàiduy nhất có phấn bố tại 14°15’ vĩ độ Bắc, giới hạn cuối cùng về phía Nam

của chi Panax L.) mà còn độc đáo về cấu tạo hoá học bởi tuy là loài sâm

thuộc nhóm

2 với bộ phận thân rễ thuộc dạng khí sinh, phát triển theo hướng nằm ngangnhưng thành phần hoá học lại chứa các saponin chủ yếu thuộc nhómdammaran (giống các loài sâm của nhóm 1), đặc biệt hơn lại có chứa một sốsaponin đặc trưng mà các loài sâm khác trên thế giới không có

1.2.4 Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh

Ở Việt Nam, cho đến nay, các công trình khoa học nghiên cứu về sâmngọc linh khá đa dạng, ngoài những nghiên cúu cơ bản tập trung vào điềutra, phân loại, xác định vùng phân bố thì cũng đã có nhiều nghiên cứu về

thành phần hoá học, thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan, giải mã hệ gen lụclạp…có thể liệt kê một số các công trình đáng chú ý như sau:

- Trần Lê Quân và cs (2002): tách chiết, majonoside R2, Triterpen

Saponin từ cây sâm việt nam (Panax vietnamensis) và thử nghiệm hoạt tính

bảo vệ gan Nghiên cứu cho thấy cao chiết MeOH của củ sâm việt nam cóhoạt tính bảo vệ gan in vitro trên mô hình gây độc cho tế bào gan bằng D-galactosamine (D-GaLN)/yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-anpha) Nguyễn Thị Thu Hương và cs (1999): nghiên cứu về tác dụng dược lý củasâm việt nam, trong đó tập trung vào tác dụng kích thích miễn dịch chốngcăng thẳng, trầm cảm [48], [5], [11], [18]

- Nguyễn Thới Nhâm và cs (1993) Nghiên cứu về dược liệu học vàhoá học cây sâm Việt Nam [16]

- Loạt công trình của PGS.TS Dương Tấn Nhựt (2010, 2011, 2014,2015) về nhân giống vô tính Sâm ngọc linh [13], [14]

- Cụm công trình của Viện Dược Liệu trong khuôn khổ chương trìnhbảo tồn nguồn gen đã khoanh vùng được khu vực phân bố, đặc điểm sinhthái, hình thái, lập bản đồ quy hoạch vùng trồng sâm (các tác giả, Lê MinhThảo [8], [18],…)

- Phan Kế Long và cs (2014) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh giá sựsai khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh và mẫu sâm thu được tại PhongThổ Lai Châu, cũng dựa trên trình tự gen matK và ITS, mẫu sâm thu tại Lai

Châu đã được xác định tên khoa học là Panax vietnamensis var fuscidiscus,

là một thứ của loài Panax vietnamensis [9, 40].

- Nguyễn Thị Phương Trang và cs (2011) đã sử dụng vùng gen ITS đểđánh gía mối quan hệ di truyền của loài sâm việt nam, sâm lai châu với các

loài khác trong chi Panax [22] Hay nhóm nghiên cứu của Đặng Tất Thế,

Nguyễn Thị Phương Trang (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật)thực hiện một số hợp tác nghiên cứu với nhóm nghiên cứu của Viện sỹ Yuri

1 0Zhuralev và TS Galina D Reunova (Viện Sinh học thỗ nhưỡng ViễnĐông,

Viện Hàn Lân khoa học Liên Bang Nga) về phân bố và di truyền của loàisâm việt nam và sâm nga bằng kỹ thuật AFLP và SSR [34, 35].

- Trong đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền chi sâm, nhóm nghiêncứu của Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu, và cs (2016) đã thực hiện “Đánh

giá di truyền quần thể loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai) bằng

chỉ thị ISSR Nhóm nghiên cứu của GS Nông văn Hải (2017) (Viện nghiêncứu hệ gen-Viện Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu

về giải mã hệ gen lục lạp sâm ngọc linh Nhóm nghiên cứu của TS LêHùng Lĩnh (2017)-(Viện Di truyền Nông nghiệp) thực hiện nghiên cứu nuôi

cấy mô và xác định gen lục lạp đặc hiệu của một số loài trong chi Panax

1.2.5 Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam

Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là tam thất (Panax notogineng) và nhân sâm (Panax ginseng) [5] Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), tam thất hoang (Panax

stipuleanatus Tsai et Feng) và đặc biệt sâm ngọc linh (Panax vietnamensis

Ha & Grushv.) là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam, có phân bố

tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), huyệnNam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi NgọcLinh độ cao trên

1500 m Tuy nhiên, hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên dotình trạng khai thác cạn kiệt trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làmrẫy nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp Hiện, sâm ngọc linh đã đượcđưa vào danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khaithác và sử dụng vì mục đích thương mại (Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày31/03/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm),theo Sách đỏ Việt Nam (2007), sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala,

c, d, BI + 2b, c, e [1] Sâm ngọc linh chủ yếu tập trung tại 2 điểm bảo tồn làChốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược

1 0Liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổngdiện tích trồng

khoảng 10 hecta [6] Tuy nhiên, với quyết định số 936/QĐ-TT ngày18/7/2012 của thủ tướng chính phủ thì kế hoạch đến năm 2020, diện tích trồng sâm ngọc linh sẽ được tăng lên đến khoảng 200ha.

1.3 Phương pháp luận và cách tiếp cận

Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được ápdụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng ditruyền quần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tíchDNA, đặc biệt đối với lĩnh vực phân loại học và di truyền phân tử Việc sửdụng các chỉ thị DNA để định danh loài đang được nhiều nhà khoa học trênthế giới tập trung nghiên cứu và đã có nhiều đóng góp, phát hiện đáng kể[10], [17], [22], [24], [27], [30], [40], [41], [42], [53] Xác định loài bằngchỉ thị DNA có độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi

mà những quan sát hình thái, sinh trưởng, phát triển chưa đủ cơ sở để phânbiệt Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) của thếgiới đã lưu giữ trên 70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotide Đây lànguồn dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn

lý do chính là: (1) số liệu về trình tự các nucleotide rất có giá trị trong việcxác định các đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậcloài và dưới loài; (2) số liệu trình tự nucleotide đảm bảo độ chính xác caonên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, nghiên cứu ditruyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền

ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa các cha mẹ và con cái ;(3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác loài, quần thể chođến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấyhiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…; và (4) kết quả nghiêncứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trườnghay con người gây ra [10]

Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang

là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện cácloài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về

11tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loàiđộng thực

vật và vi sinh vật [37] Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đanggóp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảotồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giớicũng như ở Việt Nam Sâm ngọc linh là loài dược liệu quý có tác dụng tăngcường hệ miễn dịch và ngăn ngừa ung thư… Đến nay quần thể sâm ngọclinh tự nhiên bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới có nguy cơ cạn kiệt do nhu cầu

sử dụng loại dược liệu này ngày càng cao Công tác bảo tồn và phát triểnbền vững loại dược liệu này ở Việt Nam trở nên cần thiết và cấp bách Vìvậy, nghiên cứu đánh giá tính đa dạng di truyền, làm cơ sở cho công tác bảotồn nguồn gen cho loài sâm ngọc linh cần được tập trung thực hiện Bêncạnh đó, việc phát triển bộ mã vạch phân tử cũng cần được nghiên cứu đểgiúp góp phần phân loại/giám định chính xác sâm ngọc linh và các loài sâmkhác thuộc chi nhân Sâm

1.3.1 Phương pháp phân loại học phân tử

1.3.1.1 Ưu điểm của việc ứng dụng nghiên cứu phân tử trong phân loại học

Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất hiện nay trong việc xácđịnh mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự DNA, bởi vật liệu ditruyền là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít

bị ảnh hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảoquản và chế biến DNA chiết từ bất cứ bộ phận nào đều mang cùng thông tin

di truyền DNA chiết thì ổn định và có thể giữ ở -20°C trong thời gian dài(khoảng 3-5 năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích, đặcbiệt chỉ cần sử dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả [8], [12], [26]

1.3.1.2 Sử dụng hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật

Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae),chúng có chứa DNA riêng DNA lục lạp có từ 102 – 104 bản sao trong mỗi

tế bào Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyl) và là nơi thực hiện quátrình quang hợp của cây Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho phân loại

ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền

12cho thế hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao Hệ gen lục lạp được các nhàphân loại

học phân tử đánh giá chúng là sự tích lũy của các đột biến theo thời gian, dovậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hóa giữa các loài Hệ gen lục lạp(cpDNA) thực chất là một phân tử DNA dạng vòng, sợi đơn, mỗi genthường không lặp lại Không giống như các gen nhân, các gen lục lạpchỉ mã hóa cho các protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máybiểu hiện những protein này Vùng DNA không mã hóa trên hệ gen lục lạp

là rất ít

Hệ gen lục lạp có kích thước từ 120 kb – 220kb, kích thước này thayđổi do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau, tách hệ gen lục lạpthành

2 vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC) Mặc dù phần lớn DNA lục lạpđều mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vàoDNA nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp Các gen lục lạp có tốc độ độtbiến thấp hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng

3 lần so với DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trongnghiên cứu phân loại [45] Các nghiên cứu cấu trúc phân tử hệ gen lục lạp ởhầu hết các loài thực vật bậc cao cho thấy tỷ lệ thay thế trong hệ gen lục lạpthấp hơn rất nhiều so với hệ gen nhân và chúng cũng có mức tái tổ hợp rấtthấp, di truyền theo một dòng [54] Một số vùng gen lục lạp thường được sửdụng trong nghiên cứu hệ thống học phân tử thực vật hiện nay bao gồm:

matK, rbcL, psbA – trnH, rpoB,… tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp

thường có mức độ biến đổi không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận [29]

1.3.1.3 DNA barcoding và ứng dụng của nó

DNA barcoding là đoạn DNA ngắn (thường từ 200-500 bp) đặc trưngcho loài/nhóm loài, dễ khuếch đại và bền vững Hiện nay DNA barcoding đãđược sử dụng rất nhiều trong phân loại và giám định các loài động thực vật.Phương pháp này dựa trên nguyên tắc so sánh các vùng trình tự DNA ngắn

có tốc độ tiến hóa nhanh để định loại các loài Phương pháp này có thể áp

các trình tự thuộc hệ gen lục lạp và hệ gen nhân…[39]; [55]; [10] Trên thếgiới việc sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân biệt các loài đã phổbiến và thông dụng từ những thập niên 90 của thế kỷ trước Một số vùng gennhân và lục lạp thường dùng trong phân loại/giám định thực vật gồm ITS,

18S, matK, rbcL, rpoB, psbA – trnH …[29]; [38], [40]; [42].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 vùng gen lục lạp gồm rbcL,

rpoB và 2 vùng gen nhân gồm 18S và ITS để đánh giá khả năng phân biệt

loài sâm ngọc linh với một số loài Panax khác.

- RbcL là vùng gen đệm trong lục lạp dài khoảng 1500 bp mã hoá cho

protein Rubico Protein này có 8 tiểu phần lớn (55 kDa) và 8 tiểu phần nhỏ(12 kDa) giống nhau Các tiểu phần lớn được mã hóa bằng gen lục lạp

(rbcL), còn các tiểu phần nhỏ mã hóa bằng gen nhân Riêng đối với tảo nâu

và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hóa cho tiểu phần nhỏ Các gen

rbcL ở thực vật bậc cao không có intron Các gen này được dùng nhiều

trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại [29]

- rpoB là một vùng gen nhỏ nằm trong lục lạp, đây được coi là vùng

gen mang nhiều vị trí Nu dễ biến đổi Nghiên cứu của nhóm CBOL gợi ý

dùng gen rpoB cho các phân biệt ở cấp độ loài và dưới loài [29].

- 18S-rDNA là vùng gen giải mã cho tiểu phần RNA ribosome, vùnggen nằm trong nhân tế bào, có kích thước khoảng 1900 Nu Các genDNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đadạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắpxếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internaltranscribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của

ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Nhìn chung các đơn vịrDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn

14trên nhiễm sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA

là từng đơn vị trong hệ thống đa

gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cáchphối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khácbiệt giữa các loài khác nhau [29].

1.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể bằng kỹ thuật phân tử

Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đadạng di truyền và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài trong tự nhiên

có vai trò quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồnloài một cách hữu hiệu Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảmtính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đếnquá trình phân cắt nơi sống [27]; [28]; [26]; [33]; [29] Các tác giả này đãchỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng

cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt Hệ số thụ phấncao giữa các cá thể có quan hệ cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tính

đa dạng di truyền Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi ditruyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhaugiữa chúng Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sựphát triển mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sựsống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóngđược ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnhvực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn Để nghiên cứu

đa dạng di truyền quần thể và loài bằng kỹ thuật DNA có các phương phápchủ yếu như RAPD, AFLP, RFLP, ISSR,

Một trong những kỹ thuật mới nhất để nghiên cứu đa dạng di truyền ởcấp độ loài và quần thể là kỹ thuật SSR vì các chỉ thị SSR có tính đa hìnhcao, đặc hiệu cho từng loài nghiên cứu Kỹ thuật này đã được áp dụng nhiềutrong các nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền và mối quan

hệ sinh sản trong các quần thể [20], [26]

Kỹ thuật SSR

Kỹ thuật SSR hay còn gọi là kỹ thuật microsatellite là những trình tự

nucleotide đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotidengắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh Phương pháp truy tìm các phân đoạnDNA đơn giản lặp lại do Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thịphân tử năm 1989 [37] Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặplại, các đoạn dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài Các chuỗi lặp lại nàythường từ 1- 6 nucleotide Bản chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh

ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợvới trình tự gần kề hai đầu vùng lặp lại Giá trị của SSR là do nó sinh ra đahình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp genome và có bản chấtđồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR Cho đến nay kỹ thuật này đangđược ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật;thực vật [30]

Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện SSR

là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao Đây là chỉ thịphân tử giúp tránh được các nhầm lẫn trong phân tích genome và là mộtloại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền vàphân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài.Nhược điểm của chỉ thị SSR là quá trình thiết kế mồi tốn kém và hầunhưmỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tổng số 60 mẫu lá sâm ngọc linh thu ngẫu nhiên từ 25 cây sâm tại vườnsâm Tăc-ngo, xã Trà Linh, tỉnh Quảng Nam và 35 mẫu sâm thu tại Măng ri,Kon Tum (Hình 2.1) Các mẫu thu được được giữ trong phòng bì giấy vàbảo quản trong silicagel cho đến khi sử dụng

Hình 2.1 Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Ditruyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoahọc và Công nghệ Việt Nam từ tháng 12/2016 - 07/2018

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Các mẫu lá sâm ngọc linh được thu tại Quảng Nam và Kon Tum đượcbảo quản trong silicagen cho đến khi thực hiện các nghiên cứu phân tử.Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle(1987) [32], có cải tiến thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và ditruyền bảo tồn gồm các bước sau:

Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá thu được Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng

cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn, cho vào ống eppendorf 2ml

0,5 %) vào ống eppendorf chứa mẫu, vortex tạo thành dịch đồng nhất

Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi (lặp lại bước này 2 lần)

Bước 3: Bổ sung 800l đệm tách chiết (NaCl 1,5M, Tris-HCl 100mM, EDTA

20mM, CTAB 4 %) wotex tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ 1 giờ 30 phút ở

650C thỉnh thoảng trộn đều Lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Bước 4: Bổ sung 800l chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều tạo

thành dịch đồng nhất Ly tâm 12000v/p trong 10 phút ở 40C, hút dịch nổisang ống eppendorf 1,5ml mới (lặp lại bước này 2 lần)

tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa

Bước 7: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng Hoà tan DNA trong 50-100 l

TE Bước 8: Bổ sung 3l RNase (10mg/ml), ủ ở 370C trong 1 giờ

trong 30 phút Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi, thu tủa

Bước 11: Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng Hoà tan DNA trong 50-100 l

TE DNA tổng số được kiểm tra độ sạch và hàm lượng DNA bằng điện ditrên gel agarose 1% Sau đó pha loãng về nồng độ 10ng/l để bảo quản vàthực hiện PCR

2.3.2 Lựa chọn mồi SSR

Nhóm nghiên cứu của GS Kim Joonki tại trường đại học Kongju, Hàn Quốc đã phát hiện được 642 vùng lặp microsatellite trên toàn bộ vùng

gen loài Nhân sâm hàn quốc (Panax ginseng), đã chọn được 251 vùng khác

nhau và đã thiết kế được 90 cặp mồi SSR để nhân những vùng microsatellitenày Kết quả nghiên cứu đã chọn ra 11 cặp mồi SSR cho kết quả đa hình

[42] (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích

2.3.3 Phân tích số liệu SSR

Dẫn liệu di truyền được ghi nhận trên cơ sở sự có mặt hoặc vắng mặtcủa các đỉnh (peak) DNA thu được hoặc băng vạch DNA trên bản điện di.Các thông số xác định đa dạng di truyền trong quần thể bao gồm tần sốallen cho một lô cút (A), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), hệ số gen dịhợp tử mong đợi (He) và hệ số giao giao phấn cận noãn (Fis) được tínhtoán bằng phần mềm GenAlex Đặc điểm di truyền quần thể được phân tíchdựa trên các số liệu thu được

Các chỉ số thống kê F của Wright (1969) được dùng để đánh giá sựphân bố allen trong và giữa các quần thể, trong đó Fis là hệ số dư thừa genđồng hợp tử trong quần thể, Fit là hệ số sai khác trong quần thể và Fst là hệ

Dst = Ht – Hs và Gst = Dst/Ht [41]

Sự sai khác di truyền giữa các quần thể được đánh giá theo tần số alen sửdụng chỉ số khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền của Nei’s(1972)

Xác định cấu trúc di truyền ở cả hai mức độ quần thể và loài của haiquần thể sâm ngọc linh thu tại hai điểm Quảng Nam và Kon Tum trên cơ sởphân tích bốn lô cút gen bằng chỉ thị SSR Các thông số đa dạng di truyền sẽđược xác định bằng phần mềm GenAlex và FSTAT bao gồm số alen chomỗi lô cút, tỉ lệ phần trăm lô cút đa hình, tần số gen dị hợp tử quan sát và lýthuyết dưới điều kiện cân bằng Hardy-Weinberg Kiểm định giả thiết 2được sử

dụng để đánh giá sự sai khác giữa tần số gen dị hợp tử quan sát và lýthuyết

Các chỉ số thống kê F của Wright (1969) cũng được sử dụng để đánh giá sựphân bố alen trong và giữa các quần thể Mức độ đa dạng di truyền trong vàgiữa các quần thể sử dụng các tham số thống kê của Nei (1987) để phân tíchđối với mỗi lô cút đa hình Nghiên cứu mối quan hệ sinh sản giữa các cáthể trong quần thể và giữa các quần thể của loài trên cơ sở xác định hệ sốthụ phấn cận noãn Chỉ số thụ phấn chéo trong mỗi quần thể cũng đượcxác định Nghiên cứu không gian phân bố di truyền trong quần thể liên quanđến khoảng cách di truyền, hệ số di truyền tương đồng và mức độ trao đổi

di truyền giữa các quần thể Điện di phân tách trên máy điện di mao quảnABI Prizm 3100 Các phân đoạn SSR sau đó được phân tích bằng phầnmềm Genscan v 3.7 Tất cả các thông số trên được tính toán và phân tíchbằng phần mềm GenAlex và FSTAT Phân tích mức độ tiến hoá và mốiquan hệ