Tuyển chọn, nghiên cứu các chủng vi khuẩn lactobacillus có khả năng sinh gamma aminobutyric acid (gaba) và một số đặc tính probiotic ứng dụng trong sản xuất các thực phẩm chức năng

Trong nghiên cứu ứng dụng probiotic, điều quan trọng là phải sử dụngcác chủng vi sinh vật an toàn và mang những đặc tính probiotic quan trọngvừa có tác dụng ức chế vi sinh vật có hại, vừ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Thị Anh Đào

TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG VI KHUẨN

LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS DƯƠNG VĂN HỢP

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa học thạc sĩ của mình, tôi vô cùng biết ơn các thầy

cô giáo trong Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật- Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu và tạo mọiđiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo

PGS.TS.Dương Văn Hợp, người đã tận tình hướng dẫn và đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoànthành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại Viện Vi sinh vật vàCông nghệ sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên,khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 27 thang 10 năm 2018

Nguyễn Thị Anh Đào

LƠI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, luân văn nay la kết qua nghiên cưu va lam viêc cuatôi, cac nội dung nghiên cứu kết qua trình bày trong luận văn la trung thưc, rõràng Nếu có bất kỳ vấn đề gì xảy ra, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, ngày 27 thang 10 năm 2018

Tac gia luân văn

Nguyễn Thị Anh Đào

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LÕÌI CAM ÐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN… 2

1.1 Probiotic ……… 2

1.1.1.Định nghĩa……… 2

1.1.2 Vai trò của probiotic 2

1.2 Vi khuẩn lactictrong sản xuất probiotic……… 7

1.2.1 Một số đối tượng vi sinh vật phổ biến trong sản xuất probiotic… 7

1.2.2.Vi khuẩn lactictrong sản xuất probiotic 8

1.3 Tổng quan về Gamma - Aminobutyric Acid……… 10

1.3.1 Giới thiệu……… 10

1.3.2 Hình dạng và cấu trúc của GABA……… 10

1.3.3 Thụ thể GABA……… 11

1.3.3.1.Thụ thể GABAA……… 12

1.3.3.2.Thụ thể GABAB……… 13

1.3.4 Quá trình tổng hợp GABA trong não………14

1.3.5 Cơ chế hoạt động của GABA………15

1.3.6 Chức năng của GABA……… 15

1.3.7 Các nguồn sinh tổng hợp GABA……… 17

1.3.8 Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn……….18

1.3.9 Tình hình nghiên cứu về GABA……… 19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 23

2.1 Nguyên liệu……… 23

2.2 Hóa chất và thiết bị……… 23

2.2.1 Hóa chất……… 23

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ………… ………23

2.3 Các loại môi trường nghiên cứu……… 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu……… 26

2.4.1 Phương pháp định tính GABA bằng sắc ký bản mỏng (TLC)……… 26

2.4.2 Phương pháp định lượng GABA……… 27

2.4.3.Phương pháp phân loại……… 29

2.4.3.1.Phân loại dựa trên phân tích trình tự rDNA……… 29

2.4.3.2 Phân loại bằng phương pháp quan sát hình thái……… 32

2.4.4 Xác định các đặc tính probiotics của các chủng vi khuẩn lựa chọn… 33 2.4.4.1 Phương pháp xác định khả năng chịu axit……… 33

2.4.4.2.Phương pháp xác định khả năng chịu muối mật……… 34

2.4.4.3 Phương pháp xác định khả năng sống trong môi trườngdịch dạ dày và dịch ruột giả lập……… 34

2.4.4.4 Phương pháp xác định khả năng bám dínhinvitro ………35

2.4.4.5 Phương pháp xác định khả năng kháng kháng sinh 36

2.4.4.6 Kiểm tra khả năng ức chế một số chủng vi sinh vật gây bệnh …… 36

2.4.4.7 Phương pháp xác định khả năng sinh axit lactic……… 37

2.4.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo GABAvà sinh khối cao của các chủng vi khuẩn lựa chọn……… 37

2.4.5.1 Lưa chon môi trương……… 38

2.4.5.2 Lưa chon nhiêt đô nuôi cấy thich hơp……… 38

2.4.5.3 Lưa chon pH môi trương nuôi cấy thich hơp……… 38

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 40

3.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA……… 40

3.2 Phân loại……… 42

3.2.1 Phân loại dựa trên phân tích trình tự rDNA 42

3.2.2 Hình thái của các chủng Lactobacillus nghiên cứu……… 43

3.2.2.1 Chủng VTCC-B-421……… 43

3.2.2.2 Chủng VTCC-B-426……… 44

3.2.2.3 Chủng VTCC-B-431……… 45

3.2.2.4 Chủng VTCC-B-1450……… 45

3.3 Xác định các đặc tính probiotics của các chủng vi khuẩn lactic……… 46

3.3.1 Kết quả xác định khả năng chịu axit……….47

3.3.2 Kết quả xác định khả năng chịu muối mật………48

3.3.3 Khả năng sống sót trong dịch dạ dày và dịch ruột giả lập………49

3.3.4 Khả năng bám dính trên màng nhầy ruộtinvitro 51

3.3.5 Kết quả xác định khả năng kháng kháng sinh……… 52

3.3.6 Kết quả kiểm tra khả năng ức chế một số chủng vi sinh vật gây bệnh 54 3.3.7 Khả năng sinh axit lactic của 4 chủng vi khuẩn……… 55

3.4 Kết quả nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo GABA và sinh khối cao của các chủng vi khuẩn lựa chọn……… 57

3.4.1.Kết quả lưa chon môi trương ……….57

3.4.2 Kết quả lưa chon nhiêt đô nuôi cấy thich hơp……… 60

3.4.3 Kết quả lưa chon pH nuôi cấy thich hơp……… 61

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………65

KẾT LUẬN………65

KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT……… 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 67Tài liệu tiếng Việt……… 67Tài liệu tiếng Anh……….……… 68PHỤ LỤC

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃCÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Vi sinh vật phổ biến trong sản xuất probiotic………… ……… 8Bảng 1.2: Vai trò và chức năng sinh lý của GABA ……… 16Bảng 2: Mật độ quang phổ (OD 570nm) ở các nồng độ GABA khác nhau 29Bảng 3.1.Kết quả sàng lọc khả năng sinh GABA của các chủng vi khuẩn

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Minh họa cơ chế tác động của probiotic……… 3

Hình 1.2: Hình ảnh bám dính của nấm men lên bề mặt của E.coli 6

Hình 1.3: Cấutrúcphântử GABA……… 11

Hình 1.4: Môhìnhcấutrúcthụthể GABAA……… 13

Hình 1.5:Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB ……… 13

Hình 1.6: Con đường tổng hợp GABA……… 14

Hình 3.1: Khả năng sinh GABA của các chủng vi khuẩn lactic………… 41

Hình 3.2: Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu với các loàicó mối quan hệ họ hàng gần……… 43

Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-421… 44

Hình 3.4: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủng VTCC-B-26… 44

Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-31… 45

Hình 3.6:Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-450….46 Hình 3.7: Khả năng chịu axit của 4 chủng vi khuẩn……… 48

Hình 3.8: Khả năng chịu muối mật của 4 chủng vi khuẩn……… 49

Hình 3.9: Khả năng chịu kháng sinh của chủng VTCC-B-421(A) và chủng VTCC-B-431(B)……… 53

Hình 3.10: Khả năng ức chế Bacillus cereus (A) và Salmonella enterica (B) của 4 chủng vi khuẩn……… 55

Hình 3.11: Con đường chuyển hóa glutamate thành ABA……… 64

LỜI MỞ ĐẦU

Vi khuẩn lactic được coi là an toàn, từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và bảo quản thực phẩm đặc biệt trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống như lên men sữa, thịt, rau quả Hiện nay, các hướng nghiên cứu về vi khuẩn lactic ứng dụng cho sản xuất các loại sản phẩm chức năng chứa các hợp chất có lợi cho sức khỏe đã và đang được quan tâm rộng rãi trên thế giới Đặc biệt một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng probiotic và sinh tổnghợp gamma-amino butyric acid được nhiều nhà khoa học quan tâm Gamma-amino butyric acid (GABA) là một acid amin có chức năng quan trọng trong

hệ thống thần kinh Do vậy các sản phẩm có chứa GABA có tác dụng bổ não và

bổ thần kinh, cải thiện giấc ngủ, điều chỉnh huyết áp, giảm mệt mỏi, tăng cường thể trạng.

Trong nghiên cứu ứng dụng probiotic, điều quan trọng là phải sử dụngcác chủng vi sinh vật an toàn và mang những đặc tính probiotic quan trọngvừa có tác dụng ức chế vi sinh vật có hại, vừa cung cấp các thành phầnvitamin, enzyme và các chất có hoạt tính sinh học quý cho vật chủ nhưbacteriocin, vitamin B12, gamma-aminobutyric acid, v.v

tài:

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

“Tuyển chọn, nghiên cứu các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh

Gamma-aminobutyric acid (GABA) và một số đặc tính probiotic ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm chức năng” với mục tiêu:

- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh tổng hợp

gamma-aminobutyric acid

- Nghiên cứu một số đặc tính probiotic quan trọng của các chủng lựa chọn

- Nghiên cứu khả năng sinh gamma-aminobutyric acid của các chủng lựa chọn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Probiotic

đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học:(i) theo Fuller 1989[21], probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức

ăn giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợicho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các visinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽđem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” [20]

Prebiotic và synbiotic: nhằm giúp tăng hiệu quả của probiotic với vậtchủ, probiotic thường được bổ sung cùng chất mang Prebiotic là các thànhphần hydratcacbon có tác dụng làm tăng sự phát triển của hệ vi sinh vậtđường ruột Thường là các loại olygosaccharides như: fructooligosaccharides(FOS), Xylooligosaccharide (XOS) và galactooligosaccharides (GOS).Synbiotic hoặc Co-Biotic là sự kết hợp chung của probiotic và prebiotic

1.1.2 Vai trò của probiotic

Việc duy trì ổn định hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò quan trọng trongbảo vệ sức khỏe, phòng ngừa bệnh tật Vai trò chính của probiotic là giúp cho

hệ vi sinh vật đường ruột khỏe mạnh, ngăn cản sự thâm nhập và phát triển visinh vật gây bệnh, tăng sức đề kháng tự nhiên với các bệnh truyền nhiễm củađường tiêu hóa Vai trò này được thể hiện ở một số các biểu hiện cụ thể sau:

➢ Tăng hiệu quả sử dụng đường lactose tránh bệnh tiêu chảy do dùng các sản

phẩm sữa:

Trong thành phần của sữa có đường lactose là một disaccharide Nhữngthiếu hụt về khả năng sinh enzyme β-galactosidse thường dẫn đến bệnh tiêuchảy Phần lớn các vi khuẩn probiotic đặc biệt là vi khuẩn lactic

(Lactobacillus, Streptococcus và Bifidobacterium) có khả năng sinh enzyme

β-galactosidse có khả năng thủy phân đường lactose thành đường đơn làgalactose và glucose Như vậy probiotic với các chủng vi khuẩn này khôngchỉ là pháp điều trị bệnh tiêu chảy do dùng sữa mà còn tăng hiệu quả hấp thuchất dinh dưỡng cho cơ thể con người và vật nuôi [40]

➢ Ức chế vi sinh vật gây bệnh cho vật chủ như E.coli Salmonella,

Staphylococcus…

Hình 1.1: Minh họa cơ chế tác động của probiotic

Một trong những vai trò có lợi hơn cả của probiotic là khả năng ức chếcác mầm bệnh do vi rút và vi sinh vật gây ra đối với cơ thể Probiotic có khảnăng ức chế các vi sinh vật gây bệnh theo một số cơ chế sau:

+ Cơ chế sinh ra các chất bacteriocin (bao gồm cả lantibiotic) như nisinenteriocin, subtilisin [8]

Bacteriocin lần đầu tiên được Gratia phát hiện (1925) cho đến nay cóhàng ngàn loại bacteriocins đã được nghiên cứu [12],[27] Bacteriocin đượcchia thành 4 nhóm :

- Nhóm 1: bao gồm các bacteriocin là các peptit kháng khuẩn như nisin,enterocin và các chất kháng khuẩn là peptid dạng vòng (lantibiotic) như:

s ub t i l i n , e pi d er m i n , g a l li d er m i n

- Nhóm 2: bao gồm các peptid bền nhiệt có trọng lượng phân tử <10 KD, cácpeptid này có vai trò ức chế các vi sinh vật khác thông qua hoạt tính hòa tanthành tế bào và được chia thành 4 nhóm a,b,c,d với các đại diện đặc trưng làPediocin-PA1, l a c to c o c c i n G , En t e r o c i n A S - 4 8 v à a u r e o c i n A 53

- Nhóm 3: là các bacteriocin có kích thước >10KD có khả năng làm tan thành

tế bào như l y s os t a phi n

- Nhóm 4: là các bacteriocin có thành phần phức tạp gồm protein và phiprotein như lipid và hydratcarbon, ví dụ như gl y c o c i n F

+ Probiotic có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh trong vật chủ thông quả

khả năng cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột của vật chủ Ví dụ vai trò của

L rhamnosus GG và Bifidobacterium animalis trong việc cạnh tranh vị trí

bám (receptor) đối với rotavirus giúp rút ngắn thời gian tiêu chảy cho ngườibệnh [41]

+ Probiotic có thể sinh ra các thành phần hữu cơ có tác dụng ức chế vi sinh

vật gây bệnh

Các vi khuẩn probiotic đặc biệt là vi khuẩn lactic sinh ra các thànhphần axít hữu cơ như acid lactic, acid acetic, ethanol có tác dụng ức chế sựphát triển của vi sinh vật gây bệnh [42].

+ Ngoài ra sự phát triển của vi khuẩn probiotic còn có khả năng ức chế vi sinhvật gây bệnh thông qua việc cạnh tranh nguồn thức ăn

➢ Kích thích và tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ.

Các nghiên cứu cho thấy: sự có mặt của vi khuẩn probiotic tạo thành môitrường có pH thấp với các thành phần bacteriocin, các peptid và sinh các loạiacid béo liên kết thành các mạch ngắn hay việc bám của vi khuẩn vào nhu môruột sẽ kích thích hệ thống miễn dịch tập nhiễm (innate immune response).Kết quả là kích thích sự hoạt động của đại thực bào tiết ra protein miễn dịchIgA, thông qua tế bào T để sinh ra các loại cytokine khác nhau như Interferon(IFN-γ), I), IL-10, IL-4 [42]

➢ Giảm pH của hệ tiêu hóa và tác dụng tích cực đến hệ vi sinh vật đường ruột

theo hướng có lợi cho vật chủ.

Trong hệ tiêu hóa của vật chủ có 1013-1014 tế bào vi sinh vật khác nhau.Chúng được chia thành 3 nhóm chủ yếu: nhóm có lợi cho vật chủ như

Lactobacilii, Bifidobacterium, một số nấm men và Bacillii Nhóm có hại cho

vật chủ: như Staphylococcus, Clostridium, E.coli và nhóm vừa có lợi vừa có hại như Enterococii Sự có mặt của vi khuẩn lactic làm giảm pH theo hướng

bất lợi cho nhóm vi sinh vật có hại do đó làm thay đổi cân bằng quần xã visinh vật đường ruột có lợi cho vật chủ [45]

➢ Giảm cholesterol trong máu và hạn chế các bệnh liên quan đến tim mạch.

Vi khuẩn probiotic được biết có vai trò sinh ra acid hữu cơ, làm giảm acidbéo, thành phần cholesterol trong máu và ức chế quá trình phát triển của các

khối u, ung thư [36].Các nghiên cứu chỉ ra rằng các vi khuẩn Lactobacilii và

Bifidobacterium không chỉ sinh ra các acid hữu cơ mà còn trực tiếp sử dụng

lipit và các thành phần cholesterol trong máu [52]

➢ Phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột sau khi sử dụng chất kháng sinh.

Sau khi sử dụng kháng sinh, thông thường cơ thể dễ bị tiêu chảy do các

chất độc sinh ra từ sự phát triển của Clostridium Việc xử lý với probiotic có chứa Lactobacilii và Sacchromycess cerevisiae có tác dụng giải độc tố ammonia và phenol cũng như ức chế sự phát triển của nhóm Clostridium [56].

➢ Bất hoạt hay ly giải độc tố vi sinh vật.

Một trong những hoạt tính quan trọng của probiotic là làm bất hoạt và

ly giải độc tố do vi sinh vật gây bệnh sinh ra Một số độc tố được hấp phụ bởi

vi khuẩn probiotic và một số được phân giải do cơ chế enzyme

Hình1.2 : Hình ảnh bám dính của nấm men lên bề mặt của E.coli Các nghiên cứu cho thấy là vai trò của nấm men Sacchromyces

boulardii không chỉ ức chế vi sinh vật với ethanol và hấp phụ vi sinh vật có

hại cũng như độc tố của chúng mà còn sinh ra protease có hoạt tính phân giảiđộc tố cao [60]

➢ Bổ sung các enzyme tiêu hóa và tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật chủ.

Các vi sinh vật đặc biệt là nhóm vi khuẩn có bào tử (Bacillii) không chỉ

đáp ứng được nhiều đặc tính quan trọng của probiotic mà còn là nguồnenzyme hỗ trợ tiêu hóa cho vật chủ như: protease, lipase, amylase,cellulose…

➢ Bổ sung thêm các thành phần vitamin nhóm B và acid folic cũng như các hoạt

chất khác như GABA… có lợi cho vật chủ [63].

➢ Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn:

Quá trình trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột cung cấp nguồn nănglượng quan trọng cho thành ruột, cung cấp đến 50% năng lượng hàng ngàycho tế bào biểu mô ruột kết (colonocytes), bằng cách lên men carbohydratethành acid hữu cơ, chủ yếu là butyrate, trong trường hợp trẻ em bú mẹ làlactate Những ích lợi rõ ràng đối với sức khỏe do probiotic mang lại là giảmcác triệu chứng về suy hấp thụ lactose, kích thích tiêu hóa, kìm hãm chất gâyung thư và giảm hàm lượng cholesterol trong máu [37]

Ngoài các tác dụng quan trọng trên, các nghiên cứu gần đây cho thấyprobiotic còn có tác dụng cải thiện tình trạng sức khỏe của người bệnh liênquan đến các bệnh thần kinh như: bệnh giảm trí nhớ (aizheimer) và bệnh tự

kỉ, trầm cảm

1.2 Vi khuẩn lactic trong sản xuất probiotic

1.2.1 Một số đối tượng vi sinh vật phổ biến trong sản xuất probiotic

Cho đến nay có 3 nhóm vi sinh vật được dùng phổ biến cho sản xuấtprobiotic là: (i) nhóm vi khuẩn lactic , (ii) nhóm vi sinh vật không thuộc nhóm

vi khuẩn lactic và (iii) nấm men như sau [63] :

Bảng 1.1: Vi sinh vật phổ biến trong sản xuất probiotic

*Dùng cho sản xuất thức ăn chăn nuôi.

1.2.2.Vi khuẩn lactic trong sản xuất probiotic

Đặc điểm chung

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, hình que hay hình cầu, khôngsinh bào tử, không di động, chịu được acid, chuyển hóa đường thành acidlactic Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrate và sinh ra acidlactic Acid lactic sinh ra có thể ở dạng D(-), L(+) hay DL Khác với một số vikhuẩn khác như vi khuẩn đường ruột cũng sinh ra acid lactic thì tất cả các vi

khuẩn lactic đều là vi khuẩn lên men bắt buộc không chứa các cytochrome vàenzyme catalase Chúng là các vi khuẩn kị khí không bắt buộc Khuẩn lạc của

vi khuẩn lactic thường tròn, nhỏ, bóng, có màu môi trường, màu trắng đục

hoặc vàng kem Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae Các chi chính bao gồm Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,

Streptococcus, Lactococcus Ngoài ra còn có các chi khác như Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Tetragenococcus, Atopobium… [65].

Đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic

Trong số các chủng vi sinh vật probiotic, các đối tượng thuộc

Lactobacillus chiếm một vị trí qua trọng, có thể nói hầu hết các sản phẩm

probiotic đều chứa đại diện của chi này Một trong những ưu thế của

Lactobacillus là phần lớn chúng được phân lập từ thực phẩm lên men như sữa

chua các loại, dưa, phomat, cá, thịt lên men Các đối tượng này được xem là

an toàn (GRAS) được sử dụng cho các sản phẩm lên men làm thực phẩm chức

năng cho con người Ngoài ra các chủng thuộc Lactobacillus còn thỏa mãn

khá đầy đủ các tiêu chuẩn khác của probiotic như có khả năng sống trong điềukiện khắc nghiệt: pH thấp (2-3), chịu nồng độ muối mật (0,1-0,3%) và cácenzym trong hệ tiêu hóa của vật chủ, sinh các bacteriocin kháng khuẩn (nhưacidophilin, plartacin, pediocin, enteriocin …), sinh các acid hữu cơ như acidlactic, acid acetic, propionic, ethanol làm thay đổi pH trong đường tiêu hóa

dẫn đến ức chế các vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, Clostridium, E.coli

(thích nghi pH trung tính) Mặt khác các chủng vi sinh vật này có khả năngphân giải đường lactose làm tăng hiệu quả hấp thu thức ăn của vật chủ

Lactobacillus là đại diện sinh trưởng hiếu khí tùy tiện (facultative), chúng có

khả năng bám dính tốt vào đường tiêu hóa và tồn tại, phát triển, phát huy khảnăng sinh acid hữu cơ, bacteriocin và kích thích miễn dịch tại các vị trí khác

nhau trong đường tiêu hóa với các điều kiện khác nhau về nồng độ oxy trong

hệ tiêu hóa

1.3 Tổng quan về Gamma - Aminobutyric acid

1.3.1 Giới thiệu

GABA là một acid amin khá phổ biến trong tự nhiên Nó có trong một

số loại thực phẩm như cà chua chín, thịt lợn nạc, gạo lức, gạo mầm, lúa mì vàngũ cốc nguyên hạt, lòng đỏ trứng gà, cá ngừ, cá hồi, mực,…Trong cơ thểngười và một số động vật có vú, GABA đã được chứng minh là một chất dẫntruyền thần kinh ức chế trong hệ thần kinh [19]

Năm 1883, GABA được tổng hợp lần đầu tiên, là sản phẩm chuyển hóathực vật và vi sinh vật Đến năm 1950, GABA được tìm thấy là một phần của

hệ thần kinh trung ương động vật có vú

1.3.2 Hình dạng và cấu trúc của GABA

Gama - aminobutyric acid, viết tắt là GABA, là một amino acid không thamgia cấu tạo nên protein

Tên IUPAC: acid 4-aminobutanoic

Công thức phân tử: C4H9NO2

Khối lượng phân tử: 103,12 g /mol

Điểm nóng chảy: 203,7 °C( 477 K, 399 ° F )

Gamma aminobutyric acid (GABA) là chất rắn, có khả năng hòa tantrong nước với độ tan khoảng 1300mg/ml

GABA có cấu trúc gồm 4C, bao gồm nhóm amino ( ) nhận proton

và nhóm acid cacboxylic (COOH) cho proton, và gốc R, chủ yếu được tìmthấy ở dạng lưỡng cực

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử GABA.

Trong trạng thái khí, GABA có dạng cuộn xoắn cao do lực tĩnh điệngiữa hai nhóm chức năng Trong trạng thái rắn, nó lại được tìm thấy ở dạngcấu trúc thẳng, cấu hình trans ở nhóm amino và cấu trúc cis ở cuối nhómcacboxyl, đây là do tương tác với các phân tử lân cận Ở trạng thái lỏng,GABA tồn tại ở cả dạng gấp khúc và thẳng Điều này giúp GABA có thể thựchiện nhiều chức năng sinh học quan trọng

Ở động vật có xương sống, GABA hoạt động ở các khớp thần kinh ứcchế trong não bằng cách gắn kết với các thụ thể xuyên màng trong màng tếbào của cả quá trình trước và sau synap Có ba loại receptor của GABA đượcbiết đến là là các ion receptor, và là metabotropicreceptor giúp đóng mở kênh ion trên màng tế bào,

liên kết với protein G để mở các kênh ion qua trung gian [64]

1.3.3.Thụ thể GABA

Thụ thể GABA là một nhóm thụ thể phản ứng với chất dẫn truyền thầnkinh γ), I-Aminobutyric acid (GABA) bao gồm: thụ thể GABAA là phần phức hệmang kênh ion và vị trí gắn kết với phối tử; thụ thể GABAB thuộc họ thụ thể

protein G có nhiệm vụ mở kênh ion thông qua truyền thông tin nội bào quaprotein G [64].

1.3.3.1.Thụ thể GABA A

Thụ thể GABAA thuộc về siêu họ thụ thể Cys-loop có liên quan đếntiến hóa và các kênh ion có cấu trúc gắn kết tương tự, bao gồm các thụ thểacetylcholin nicotinic, glyxin, và 5HT3 [14] GABAA là một phân tử lớn có 5tiểu đơn vị protein Tất cả các tiểu đơn vị này đều có đoạn cuối là N ở phầnbên ngoài tế bào, tiếp đến là 4 đoạn xuyên màng, ở đoạn xuyên màng 3 và 4

có một đoạn loop lớn, cuối cùng là đoạn cuối C ngắn Các tiểu đơn vị proteinnày tổ hợp bằng những con đường khác nhau và được sắp xếp tạo ra một lõicho phép kênh ion mang điện tích âm Cl- đi qua (Hình1.4) GABAA có vai trò

cơ bản trong điều khiển các biểu hiện lo âu và ảnh hưởng tới trí nhớ ở não.Các tế bào thần kinh sản xuất ra GABA được gọi là các thần kinh GABAergic

và hoạt động chính trong quá trình ức chế ở các động vật có xương sống tronggiai đoạn trưởng thành 17-20% neuron thần kinh là GABAergic và hầu hếtcác hoạt tính sinh lý của GABA được tạo thành thông qua thụ thể GABAA.Trong động vật có xương sống, GABA hoạt động ở các khe sinap trong nãobằng liên kết với thụ thể GABA xuyên màng tế bào thần kinh Quá trình liênkết này sẽ dẫn tới mở kênh ion để cho phép kênh ion mang điện tích âm Cl- đivào trong tế bào hoặc kênh ion mang điện tích dương ra ngoài tế bào Quátrình này sẽ tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn tới vị trí này thườngxuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh, khoảng -75mV trong tế bào thần kinh

Hình 1.4: Mô hình cấu trúc thụ thể GABAA [65]

1.3.3.2.Thụ thể GABA B

Thụ thể GABAB có hai tiểu đơn vị là GABAB1 và GABAB2 (Hình 1.5 ).GABAB1 có vai trò nhận dạng phối tử bên ngoài tế bào còn GABAB2 cónhiệm vụ ở trên màng tế bào và truyền tín hiệu Thụ thể GABAB được ứngdụng như là đích để tìm các loại thuốc trong điều trị dược học và liên quanđến vai trò truyền tín hiệu về khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển,tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm [29]

Hình 1.5: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB [66]

1.3.4 Quá trình tổng hợp GABA trong não

GABA được tổng hợp từ acid L-glutamic nhờ hoạt động của enzyme

glutamic acid decarboxylase (GAD) và pyridoxal phosphate (dạng hoạt độngcủa vitamin B6) thông qua một con đường trao đổi chất được gọi là GABAshunt

Hình 1.6: Con đường tổng hợp GABAGABA shunt là một nhánh tắt của chu trình Krebs Các GABA shunt làmột quá trình khép kín với hai mục đích sản xuất và bảo tồn nguồn cung cấpGABA Glucose là tiền chất chính để sản xuất GABA trong cơ thể, mặc dùpyruvate và các acid amin cũng hoạt động như là tiền chất Bước đầu tiêntrong GABA shunt là chuyển hóa amin của α-ketoglutarate (được hình thành

từ sự chuyển hóa glucose trong chu trình Krebs) nhờ GABA α-oxoglutaratetransaminase (GABA-T) thành acid L-glutamic Tiếp theo GAD xúc tácchuyển hóa acid L-glutamic thành GABA GABA được chuyển hóa bởiGABA-T để tạo thành semialdehyde succinic Để bảo tồn nguồn cung cấp sẵncủa GABA, quá trình chuyển hóa amin thường xảy ra khi hợp chất ban đầu α-ketoglutarate chấp nhận các nhóm amin tách ra từ GABA để hình thành lạiacid glutamic Vì vậy, một phân tử GABA được hình thành chỉ khi một phân

tử tiền thân được hình thành Succinic semialdehyde có thể bị oxy hóa bởi

Succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) thành succinic acid và sau

đó có thể tái nhập lại chu trình Krebs hoàn thành các vòng lặp [30]

1.3.5 Cơ chế hoạt động của GABA

Khi ức chế dẫn truyền thần kinh trong não, GABA tác động ảnh hưởngcủa nó bằng cách gắn vào hai thụ thể riêng biệt, GABAA và GABAB Các thụthể GABAA thuộc họ thụ thể ion dinh dưỡng có một phần vai trò trong việcsát nhập các protein Khi GABA gắn vào thụ thể GABAA trên màng tế bàothần kinh, nó sẽ kích hoạt mở kênh ion mang điện tích âm Cl- đưa đến sự cựcmàng gây ức chế thần kinh Các loại thuốc chống lo âu của họbenzodiazepine, gây hiệu ứng nhẹ nhàng bằng cách tăng ái lực giữa thụ thểGABAA và GABA Các thụ thể GABAB thuộc họ thụ thể chuyển hóa dinhdưỡng, có cấu trúc gần giống cấu trúc thụ thể chuyển hóa glutamate Thụ thểGABAB trú tại tiền synap và hậu synap dẫn tới mở kênh ion cho phép kênhion mang điện tích âm đi vào trong tế bào, kênh mang điện tích dương rangoài tế bào Quá trình này tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn tới vị trínày thường xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh [28]

1.3.6 Chức năng của GABA

GABA là một loại amino acid không thể thiếu đối với cơ thể để đảmbảo duy trì sự hoạt động bình thường của não bộ đặc biệt là các neuron thầnkinh Nó ngăn cản sự hoạt động thái quá của những neuron thần kinh nhấtđịnh tại hệ thống thần kinh trung ương và ức chế sự lan truyền của các tế bàodẫn truyền để tăng cường cảm giác thư thái trong hệ thần kinh Chất ức chếdẫn truyền này thường được biết đến như một liều thuốc an thần tự nhiên do

cơ thể tự sản sinh giúp thư giãn thần kinh và có giấc ngủ ngon Cùng vớiniacinamide va inositol, GABA ngăn căn cản các truyền dẫn căng thẳng vàbất an đến vùng thần kinh trung ương bằng việc chiếm giữ các vùng tiếp nhậntin của các tế bào này, khống chế các vùng tiếp nhận tin Vì thế, GABA giúp

cho cơ thể được cảm giác thư giãn, giúp ngủ ngon, giảm huyết áp và an thần[23].

Bảng 1.2: Vai trò và chức năng sinh lý của GABA

1.3.7 Các nguồn sinh tổng hợp GABA

GABA được phân bố rộng rãi trong tự nhiên GABA có nhiều nhấttrong não của các động vật có vú Các thụ thể GABA được tìm thấy trong cơthể con người, bao gồm cả não, hệ thống thần kinh trung ương, phổi, gan,đường tiêu hóa, tinh trùng, tinh hoàn, tuyến vú, và các tế bào khối u gan.Ngoài ra GABA còn tồn tại với một lượng thấp trong một số loại thực vật,ngũ cốc như mầm cám gạo, giá đỗ, đậu tương, cà chua, chuối, rau bina, lá chèxanh… GABA cũng được tìm thấy ở một số vi sinh vật như vi khuẩn lactic,nấm men, nấm mốc[32]

Sau khi phát hiện ra các chức năng quan trọng của GABA thì việcnghiên cứu ứng dụng sản xuất GABA rất được quan tâm Mặc dù GABAđược tìm thấy với hàm lượng lớn trong não động vật có vú, những nguồn này

không thể áp dụng được trong sản xuất Hàm lượng GABA sinh tổng hợpđược trong thực vật thì thấp Vì vậy nguồn sinh tổng hợp GABA từ vi sinh vật

chiếm nhiều ưu điểm hơn cả E.coli là vi sinh vật đầu tiên được ứng dụng

trong sản xuất GABA, nhưng có quá nhiều khó khăn và nguy hiểm tồn tại

trong quá trình lên men bởi E.coli Một số chất độc trong quá trình tổng hợp GABA bởi chủng E.coli là nguyên nhân gây một số bệnh ở người[18] Do

vậy, các nhà nghiên cứu đã nỗ lực tìm kiếm ra nguồn vi sinh vật khác có khảnăng sinh tổng hợp GABA an toàn hơn như các chủng vi khuẩn lactic Chúngđược nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng trong sản xuất GABA trong những

năm gần đây Trong đó Lactobacillus brevis, L paracasei, L plantarum,

Lactococcus lactis là những chủng vi khuẩn lactic được nghiên cứu và ứng

dụng để sản xuất thực phẩm giàu GABA và dược phẩm tổng hợp GABA

1.3.8 Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn

Vi khuẩn có thể được sử dụng để tổng hợp GABA bằng cách sử dụngGlutamic acid decarboxylase (GAD) chuyển hóa glutamate thành GABA Đặcđiểm sinh lý của GAD khác nhau phụ thuộc vào loài, do đó các loài khácnhau có khả năng sinh tổng hợp GABA khác nhau, và có loài có thể sinh tổnghợp GABA, có loài không Các nghiên cứu gần đây đã ứng dụng một số

chủng lactic như Lactobacillus và Lactococcus được phân lập từ nhiều loại

thực phẩm lên men, có khả năng sinh tổng hợp GABA, trong đó có kim chiHàn Quốc, paocai Trung Quốc, sữa tươi, rượu chưng cất và nước ép quả mâmxôi đen[32]

L delbrueckii subsp bulgaricus, L plantarum và L paracasei được

phân lập từ pho mát và từ cá lên men truyền thống Nhật Bản cũng có khảnăng sinh tổng hợp GABA [35] Quá trình làm giàu GABA cũng được tìmthấy trong một số thực phẩm như trà xanh ủ yếm khí, thóc ngâm nảy mầm,sữa, gạo, đồ uống lên men từ thực vật và cám gạo ở Thái Lan [24]

Các chủng phân lập từ kim chi được xác định là Lactococcus

lactis subsp lactis dựa trên trình tự 16S rDNA, chủng này sinh tổng hợp

GABA với nồng độ cao nhất được xác định là 3,68 g/l trong MRS lỏng[43]

Nồng độ GABA cao nhất trong pho mát Ý là 391 mg/kg, trong đó các

vi sinh vật sinh tổng hợp GABA chủ yếu là L paracasei ,

L plantarum, Lactobacillus sp và Enterococcus durans [57].

Trong shochu chưng cất, một loại đồ uống có cồn của Nhật Bản, hầuhết các acid glutamic tự do có nồng độ 10,50 mM được chuyển đổi thành

GABA có nồng độ 10,18 mM bởi L brevis IFO-12005 [66].

Nước hèm nho giải khát giàu GABA có tác dụng chống tăng huyết áp

và bảo vệ da được sản xuất bởi quá trình lên men sử dụng chủng

L plantarum DSM19463 [13].

Chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc

đã thu được nồng độ GABA trong dịch lên men tối ưu là 149,05 mM [40]

Đặc biệt chủng Lactobacillus sakei B2-16 được phân lập từ kim chi

Hàn Quốc lên men trên môi trường dịch cám gạo đã đạt hiệu suất lên menGABA là 660 mM [36]

Mặc dù nhiều chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ các nguồn thựcphẩm và xác định là sinh tổng hợp GABA, tuy nhiên nghiên cứu thêm về cácđặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn lactic là điều cần thiết vì nhiềuchủng sinh tổng hợp GABA có nhiều ứng dụng cho ngành công nghiệp thựcphẩm

1.3.9 Tình hình nghiên cứu về GABA

Trên thế giới

Tác giả Kastner và cộng sự (2013), ở Canada đã nghiên cứu khả năng

sản xuất GABA của các chủng Lactococcus được phân lập từ phô mai Các

tác giả đã cho thấy rằng trong tổng số 50 chủng vi sinh vật riêng biệt có tronghai mẫu phô mai, thì có 9 chủng vi sinh vật có thể sản xuất GABA, trong đóULAAC–A13 và ULAAC–A23 có khả năng sản xuất GABA lên đến 50mg/300 ml sữa lên men Nghiên cứu này cho thấy rằng chủng vi sinh vật sảnsinh GABA trong phô mai cứng và phô mai bán cứng với những điều kiệnphổ biến trong việc sản xuất GABA[31].

Nhóm tác giả Lim (2013) ở Hàn Quốc đã nghiên cứu quá trình sản xuấtGABA bằng glutamate decarboxylase cố định Các tác giả đã phát triển công

nghệ sản xuất GABA thông qua sự cố định của Escherichia coli–derived

glutamate decarboxylase (GAD) Dựa vào nghiên cứu hoạt động của enzym

cụ thể và đặc tính phản ứng, acid glutamic được ưu tiên chọn hơnmonosodium glutamate (MSG) để làm cơ chất chính cho GAD cố định [42]

Ở Việt Nam

-Tách chiết GABA từ đậu tương

Năm 2007, Viện Công nghệ Thực phẩm chủ trì dự án cấp nhà nước vềnghiên cứu tách chiết GABA từ đậu tương để sản xuất một số thực phẩm chứcnăng giàu GABA phòng chống bệnh ung thư Tuy nhiên, khả năng ứng dụngsản xuất ở mức quy mô công nghiệp vẫn chưa hiệu quả vì việc tách chiết chiếtGABA từ đậu tương là một công nghệ phức tạp, khó có thể đưa vào sản xuấtcông nghiệp vì hàm lượng GABA trong đậu tương không lớn Khối lượng sảnphẩm chính là GABA thu được rất nhỏ so với lượng đậu tương dùng làmnguyên liệu để sản xuất GABA, điều đó làm giá thành sản phẩm tăng lên rấtcao, khó được chấp nhận trên thị trường Trong khi đó, một số công ty dượccủa Trung Quốc đang bán sản phẩm có hàm lượng GABA cao với giá chỉkhoảng 400.000 đồng/kg

- Sản xuất thực phẩm chức năng từ lên men dịch cám gạo

Năm 2013, TS Trịnh Tất Cường và cộng sự thuộc Phòng thí nghiệmTrọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đạihọc Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài của bộ KH&CN “Nghiên cứu quitrình sản xuất acid gamma aminobutyric từ lên men dịch cám gạo bằng

Lactobacillus để ứng dụng làm thực phẩm chức năng” Đề tài hướng đến mục

tiêu: xây dựng quy trình sản xuất acid gamma aminobutyric từ lên men dịch

cám gạo bằng Lactobacillus (10lít/mẻ) [2].

Đề tài đã xây dựng được quy trình sản xuất GABA từ lên men dịch cám

gạo bằng Lactobacillus plantarum KLEPT Hàm lượng GABA thu được

tương đối cao, đạt tới 660 mM Quá trình thực hiện cho thấy, việc sản xuấtGABA tương đối đơn giản và có giá thành khá thấp

Đề tài của TS Trịnh Tất Cường đã áp dụng phương pháp lên men bằng

vi khuẩn lactic và đã thu được những thành công nhất định Tuy nhiên khi kếtthúc quá trình lên men, tác giả vẫn phải áp dụng công nghệ tách chiết, làmsạch để thu được chế phẩm giàu GABA sử dụng trong sản xuất thực phẩmchức năng Công nghệ tách chết và làm sạch cũng không đơn giản nên khó ápdụng để sản xuất công nghiệp mà chỉ dừng ở quy mô 10lít/mẻ

-Nghiên cứu vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA ứng dụng trong Bio-yogurt.

Năm 2013, Quách Thị Việt và cộng sự (Viện Công nghệ thực phẩm)

đã có nghiên cứu trên chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis NCTH24 có khả

năng sinh tổng hợp GABA ứng dụng trong Bio-yogurt Chủng vi khuẩn

Lactobacillus brevis NCTH24 được đánh giá là có khả năng chuyển hóa

glutamate thành GABA và có hoạt tính probiotic như: khả năng sống sóttrong dịch dạ dày và dịch ruột nhân tạo, có khả năng bám dính trên màng

nhầy ruột in vitro Sau 45 ngày bảo quản tại 4oC, sữa chua vẫn có độ sánhmịn, vị chua ngạt hài hòa và hương vị dễ chịu, mật độ chủng NCTH24 được

xác định ở mức 1,75 x 107CFU/g và vẫn duy trì khả năng sinh tổng hợpGABA[7].

Tuy nhiên các nghiên cứu trong nước hiện nay mới chỉ tập trung nghiêncứu về khả năng sinh GABA của vi khuẩn lactic mà chưa nghiên cứu sâu vềcác đặc tính probiotic của các chủng này Vì vậy trong nghiên cứu này chúngtôi tiến hành nghiên cứu để tìm ra các chủng vi khuẩn lactic vừa có khả năngsinh GABA cao vừa có các đặc tính probiotic tốt để có thể ứng dụng trong sảnxuất các thực phẩm chức năng

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

- Sử dụng 100 chủng vi khuẩn Lactobacillus được lưu giữ tại Bảo tàng giống

chuẩn Vi sinh vật (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học (IMBT),Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ)

- Cân điện tử AL – 300 (Osi, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng Hiclave HV – 85 (Hirayama, Nhật)

- Tủ sấy (Carbolite, Anh)

- Tủ cấy (Nuaire, Mỹ)

- Máy li tâm 5417R (Eppendorf, Đức)

- Kính hiển vi quang học Axio (Zeiss, Đức)

- Máy đo quang phổ (Beckman, Mỹ)

- Cùng các thiết bị liên quan khác

Dụng cụ : đĩa Petri, pipette các loại, ống eppendorf, đèn cồn, bình tam giác

(100ml, 250ml), ống nghiệm, ống đong định mức, que cấy…

2.3 Các loại môi trường nghiên cứu

- Môi trường MRS (g/l):

Gluco

201Pe

10Ca

5Mg

0,Mn

0,So

5K22

Tw

201Pe

10Ca

5M

g 0,2

n 0,So

5

M

o 50pH= 6,5

- Môi trường nutrient broth (g/l);

P

e 5Ca

3

pH

- Môi trường cà chua (g/l) [3]:

C

à 1Glu

2010

1

Glu

10C

a 10

- Môi trường 18 (Lactic acid Bacteria broth )(g/l):

T

ry 10Y

e 5

Glu

10

Sol

10g

10F

e

S

O

0,2g

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp định tính GABA bằng sắc ký bản mỏng TLC (Thin layer chrotomagraphy)[11]:

Nguyên tắc: Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh GABA trong môi

trường chứa sodium glutamate (MGS)

Phương pháp xác định GABA bằng sắc kí bản mỏng TLC (Thin Layer

Chromatography) theo phương pháp của T.Qiu năm 2010 [49].

- Chuẩn bị : Bản mỏng silicagel TLC (Merk), dung dịch GABA chuẩn 0.1M,buồng chạy sắc kí, tủ sấy.

- Pha dung môi chạy: Dung môi được pha với tỉ lệ n-butanol: acid axetic:H2O=5:3:2 Đổ dung môi vào buồng chạy (độ sâu tối thiểu là 0,5cm) Để ổnđịnh qua đêm

- Pha dung dịch hiển thị nihydrin: pha 2% nihydrin trong n-butanol bão hòa(n-butanol: H2O = 2:8)

- Chấm 5 dịch li tâm lactic lên bản TLC cách đáy tối thiểu 1cm, để khô Đốichứng là 5 dung dịch GABA chuẩn 0.1M

- Cho bản TLC vào buồng chạy, chạy trong khoảng 5-6h (dung môi cách đỉnh2cm) rồi nhấc ra khỏi buồng chạy, làm khô TLC ở nhiệt độ phòng

- Phun dung dịch hiển thị nihydrin, làm khô TLC ở nhiệt độ phòng

- Đặt TLC trong tủ sấy ở 110 khoảng 10 phút cho tới khi hiện màu

- Đặt TLC ở nhiệt độ phòng và quan sát mẫu

• Acid boric (Merk)

• Muối natri borat

• Acetone (Merck)

Ph a đ ệ m bo ra t

• Dung dịch A

Dung dịch acid boric 0,2M: cân 12,404g H3BO3 hòa tan và định mức đến1000ml

• Đun sôi hỗn hợp trong vòng 20 phút tại 85±5oC

• Làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút

• Để hỗn hợp có nhiệt độ bằng nhiệt độ phòng, bổ sung 2ml ethanol 50%

• Đo hỗn hợp OD 570 nm, dùng Blank là mẫu có nồng độ 0mg/ml

• Lặp lại thí nghiệm 2 lần để thu được gía trị OD1 và OD2

Từ bảng dưới đây, ta thu được phương trình tuyến tính là 0.0448 với R=0.9925 ( R là độ tin cậy), Y là nồng độ GABA (mg/ml), X làgiá trị OD 570 nm

Y=1.1817*X-Mẫu thí nghiệm: Chấm 500μl các mẫu thí nghiệm lên bản TLC và chạy trongdung môi như định tính Sau đó cạo lớp bột trên bản TLC cho vào các ống

định lượng chứa 500μl nước cất, ly tâm thu dịch trong và làm tương tự cácbước tiếp theo như mẫu đối chứng Từ đó, dựa vào phương trình tuyến tính tatính được lượng GABA có trong các mẫu thí nghiệm.

Bảng 2: Mật độ quang phổ (OD 570nm) ở các nồng độ GABA khác nhau

(

l

Bl0,

2.4.3 Phương pháp phân loại

2.4.3.1 Phân loại dựa trên phân tích trình tự rDNA

T

á c h D NA vi k h uẩ n