ỨNG DỤNG CỦA NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ VÀLAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG (FISH)TRONG Y HỌC

TS.BS Phan Thị Xinh Đại Học Y Dược TP HCMBộ Môn Huyết Học 19/03/2011 ỨNG DỤNG CỦA NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ VÀ LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG FISH TRONG Y HỌC... Nhiễm sắc thể đồ bình thường 2.. C

TS.BS Phan Thị Xinh Đại Học Y Dược TP HCM

Bộ Môn Huyết Học

19/03/2011

ỨNG DỤNG CỦA NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ VÀ LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG (FISH)

TRONG Y HỌC

Nội dung:

1 Nhiễm sắc thể đồ bình thường

2 Phương pháp nuôi cấy và nhuộm băng

3 Các dạng bất thường và danh pháp

4 Các rối loạn số lượng NST

5 Các rối loạn cấu trúc NST

DI TRUYỀN TẾ BÀO

1 Nhiễm sắc thể đồ bình thường

2 Phương pháp nuôi cấy và nhuộm band

3 Các dạng bất thường và danh pháp

4 Các rối loạn số lượng NST

5 Các rối loạn cấu trúc NST

Từ Sợi Đôi DNA Đến NST

NST 17, băng G, 400 băng

Đánh giá mức độ cuộn xoắn của sợi đôi DNA:

• 1:6 đối với nucleosomes,

• 1:36 đối với 30 nm của sợi chromatin

• Và > 1: 10,000 đối với NST ở kỳ giữa

Sự Phân Bào

Nguyên Phân

(Mitosis)

Từ kỳ sau đến trước khi

nhân đôi DNA trong gđ S

Lượng DNA Của NST

- Gđ M (mitosis): Thời kỳ phân chia

M (Mitosis): 1 hr Chu kỳ tế bào: Khoảng 24 giờ

Ngừng phân bào bằng colcemid

6-8 hrs

10-12 hrs 3-4 hrs

Phân tích nhiễm sắc thể

Nhiễm sắc thể nằm trên đĩa phân bào (metaphase plate)

p

Cấu Trúc Của Nhiễm Sắc Thể

Telomere: Có cấu trúc đặc biệt gồm DNA và protein,

là nắp tận của NST Có các chức năng sau:

- Duy trì cấu trúc nguyên vẹn của NST

- Đảm bảo việc sao mã DNA hoàn tất

- Giúp định vị NST

Centromere: - Vị trí gắn kết của 2 chromatid

-Có vai trò trong quá trình phân bào:

Ở người, centromere gồm hàng trăm Kb của DNA lặp lại, thành phần chính là α–satellite DNA, satellite DNA,

là chổ gắn của protein nhân CENP-B.

Phân Nhóm Nhiễm Sắc Thể Ở Người

Sơ Đồ Băng Của

Bộ Nhiễm Sắc Thể

Nhận diện dựa vào kiểu băng đặc hiệu

của từng NST

Độ phân giải băng khác nhau

của nhiễm sắc thể số 1:

400 –satellite DNA, 550 –satellite DNA, 850 băng

DI TRUYỀN TẾ BÀO

1 Nhiễm sắc thể đồ bình thường

2 Phương pháp nuôi cấy và nhuộm băng

3 Các dạng bất thường và danh pháp

4 Các rối loạn số lượng NST

5 Các rối loạn cấu trúc NST

Qui Trình Chuẩn Bị Nhiễm Sắc Thể

Hiện nay, khoảng 20 - 30 tế bào được phân tích để cho ra kết quả Trong trường hợp có bất thường NST chưa xác định được, chúng ta có thể phân tích thêm hoặc thực hiện các kỹ thuật

MM cells: 5-7 d

cell collection 0.075M KCl hypotonic

treatment 37℃, 20-30min

Carnoy fixation 3-4 times

cell suspension flaming method air-dry method

G-banding Q-banding (R, C, T, NOR)

analysing 20-30 metaphases

1.Băng G -xử lý bằng trypsin + nhuộm G iemsa

(băng đậm là băng G nhuộm vùng DNA giàu AT)

2 Băng Q -nhuộm bằng Q uinacrine,

DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) hoặc Hoechst 33258,

nhuộm vùng DNA giàu AT, giống băng G, KHV huỳnh quang

3 Băng R - R everse - ngược với band G (nhuộm vùng GC)

(biến tính trong dd muối nóng – Giemsa)

4 Băng T- -Giống băng R, nhưng nhuộm tập trung T elomere

5 Băng C -nhuộm C entromere (barium hydroxide-Giemsa)

Các Loại Băng

G-banding

16Q-banding

C-banding

DI TRUYỀN TẾ BÀO

1 Nhiễm sắc thể đồ bình thường

2 Phương pháp nuôi cấy và nhuộm band

3 Các dạng bất thường và danh pháp

4 Các rối loạn số lượng NST

5 Các rối loạn cấu trúc NST

near-triploidy(69 ± ) 58-80

69,XXX,+3,-5 ->no.3 = 4 no.5 = 2

t(9;22)(q34;q11) t(9;22)(9pter 9q34::22q11 22qter;

22pter 22q11:: 9q34 9qter)

t(9;22)(9pter 9q34::22q11 22qter; 22pter 22q11:: 9q34 9qter)

del(3)(p13) del(3)(p13 qter)

Danh Pháp Chi Tiết

Mô tả chi tiết NST

Nhánh dài (q) và nhánh ngắn (p)

nhiễm sắc thể số 1

der(8)

Mô Tả Một Số Bất Thường NST (International System for Human Cytogenetic Nomenclature: ISCN 1995 )

Mô Tả Một Số Bất Thường NST (International System for Human Cytogenetic Nomenclature: ISCN 1995 )

1 deletion: mất đoạn

3 balanced & unbalanced translocation:

chuyển vị NST cân bằng và không cân bằng

5 inversion: đảo đoạn

6 isochromosome: đồng NST

4 derivative chromosome

7 insersion: chèn đoạn

2 addition: thêm đoạn

8 Ring & maker chromosome

Deletion: mất đoạn

Mất đoạn ở phần nhánh NST

Mất đoạn ở trong NST

46,XX,del(5q )

Inversion: đảo đoạn

Inversion: đảo đoạn

Isochromosome: đồng NST

No.17

No.3 iso(17q)

iso(3p)

Cơ chế của đồng nhiễm sắc thể 17

 Khi đã xác định thì định danh bất thường

t(9;22)

DI TRUYỀN TẾ BÀO

1 Nhiễm sắc thể đồ bình thường

2 Phương pháp nuôi cấy và nhuộm băng

3 Các dạng bất thường và danh pháp

4 Các rối loạn số lượng NST

5 Các rối loạn cấu trúc NST

1 Hội chứng Down: trisomy 21

2 Hội chứng Edward: trisomy 18

3 Hội chứng Patau: trisomy 13

4 Hội chứng Klinefelter: 47,XXY

5 Hội chứng Turner: 45,X

6 Đa bội trong ung thư

Các rối loạn số lượng NST

Hội chứng Down: Trisomy 21

Hội chứng Edwards: trisomy 18

Hội chứng Patau: trisomy 13

Hội chứng Klinefelter: 47,XXY

Hội chứng Turner: 45,X

Bạch cầu cấp dòng lympho

DI TRUYỀN TẾ BÀO

1 Nhiễm sắc thể đồ bình thường

2 Phương pháp nuôi cấy và nhuộm băng

3 Các dạng bất thường và danh pháp

4 Các rối loạn số lượng NST

5 Các rối loạn cấu trúc NST

46,XY,t(8;21)(q22;q22)

46,XY,t(15;17)(q22;q12)

46,XY,t(16;16)(p13;q22)-AML-M4Eo

der(22)

Ph chromosome

ABL gene BCR gene

9q+

NST Ph

22q Ưu điểm:

 Phát hiện được nhiều dạng bất thường NST

trên một bệnh nhân

- Khuyết điểm:

 Đòi hỏi tế bào phân chia và phải thu được TB ở kỳ giữa.

 Nhận ra bất thường khi băng NST đó > 10 Mb

 Kết quả thường có trong vòng 2 tuần, sớm nhất là 3 ngày.

 Không phát hiện được bất thường NST nếu tái sắp xếp ẩn.

 Phân tích khoảng 20 - 30 tế bào.

 Không phát hiện được khuếch đại gen

Nhiễm Sắc Thể Đồ: Ưu và Khuyết Điểm

A Fluorescence in situ hybridization (FISH)

1 Metaphase FISH (Metaphase cell: tế bào phân chia)

Nguyên Tắc Của FISH

Những Probe Sử Dụng Cho FISH

BAC: Bacterial artificial chromosome

PAC: P1 artificial chromosome

Tế bào bình thường Tế bào bất thường

Nguyên tắc của interphase và metaphase FISH (1)

Metaphase FISH

Interphase FISH

No.8 α–satellite probe

No.7 α–satellite probe

Tế bào bình thường Tế bào bất thường

Nguyên tắc của interphase và metaphase FISH (2)

Probe A Probe B

Tổ hợp A/B

Metaphase FISH

Interphase FISH

der(1;7)

Spectrum Green Spectrum Orange

No.11 No.1

1.0 1.5 0.5

Màu xanh Màu vàng Màu đỏ

Khuếch đại Bình thường Mất đoạn

DNA chứng (người bình thường) DNA bệnh nhân

 Giúp cho chẩn đoán:

- Chẩn đoán trước sinh: Trisomy 13, 18, 21

- Chẩn đoán xác định bệnh: CML,

Prader-Willi syndrome (NST 15q patial deletion)

 Đánh giá tiên lượng: AML, ALL

 Đánh giá đáp ứng với điều trị, đặc biệt trong ung thư: NST Ph trong CML

Ứng Dụng Của FISH

HER-2: H uman E pidermal Growth Factor R eceptor type- 2

HER-2 Protein

HER-2 Genes

HER-2 Genes

FISH : DNA (khuếch đại)

Immunohistochemistry (IHC):

Protein

HER-2 orange signal : 2

CEP 17 green signals : 2

Ratio = 1.0

HER-2 orange signal : 10 CEP 17 green signals : 4 Ratio = 2.5

≥ 2.0 (positive)

HER2 signal X 20 nuclei CEP 17 signal X 20 nuclei

Ung thư phổi và ung thư đại trực tràng

(Goncalves A et al, BMC Cancer 2008, 8:169)

Khuếch đại gen EGFR

Ung thư tiền liệt tuyến

Bạch cầu cấp dòng tủy-M3

- Ưu điểm:

 Phát hiện được bất thường NST trên cả

TB không phân chia.

 Cho kết quả nhanh trong vòng 24 giờ.

 Mồi đặc hiệu nên phát hiện được tái sắp xếp ẩn.

 Phân tích nhiều TB: từ 200 đến 500 TB (độ nhạy để phát hiện clone bất thường là 1%).