Bên cạnh đó, vấn đề sử dụng mỹ phẩm không phù hợp, đặc biệt là mỹ phẩm chứa corticoid đã để lại nhiều ảnh hưởng như làm trầm trọng MTC, teo da, suy giảm collagen và gia tăng sự bội nhiễ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Cần Thơ, 2018
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: PGS.TS Nguyễn Văn Bá Người hướng dẫn phụ: PGS.TS Huỳnh Văn Bá
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến
sĩ cấp trường
Họp tại: Phòng Bảo Vệ Luận Án Tiến Sĩ, Lầu 2 – Nhà Điều Hành, Trường Đại Học Cần Thơ
Vào lúc 14 giờ 00 ngày 12 tháng 7 năm 2018
Phản biện 1: TS Mai Nguyệt Thu Hồng
Phản biện 2: PGS.TS Dương Xuân Chữ
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TRÊN TẠP CHÍ
1 Dương Thị Bích, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2014
Khảo sát tần suất xuất hiện của vi khuẩn Propionibacterium
acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
ở bệnh nhân trứng cá có bôi corticoid Tạp chí Y dược lâm sàng 108, 9 (5): 65-70
2 Dương Thị Bích, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2015
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế
Staphylococcus epidermidis ở bệnh nhân trứng cá có bôi
corticoid Y học Việt Nam, 427 (1): 41-45
3 Dương Thị Bí ch, Nguyễn Văn Bá, Huỳnh Văn Bá, 2016
Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh trứng cá của vi khuẩn lactic phân lập từ da Y học Việt Nam, 448 (1): 23-27
4 Nguyen Kim Đong, Duong Thi Bich, Nguyen Chi Toan,
2017 The Estimation method of S-acid lactic the
fermentation products Aloe vera gel by High-Performance
Liquid Chromatography Jounal of Natrura Science, 126 (1B/2017)
Trang 4Chương 1 GIỚI THIỆU
Tí nh cấp thiết của đề tài
Mụn trứng cá (MTC) là bệnh viêm nang lông tuyến
bã phổ biến ở da, đặc trưng bởi các vùng da tăng tiết bã nhờn như mặt, lưng và ngực Theo nhiều nghiên cứu thìnguyên nhân gây mụn liên quan đến bốn yếu tố chính gồm:
sự tăng sản xuất chất nhờn, sự tắc nghẽn lỗ chân lông, sự
phát triển quá mức của vi khuẩn Propionibacterium acnes (P acnes) và sự hiện diện các yếu tố viêm Bên cạnh đó,
vấn đề sử dụng mỹ phẩm không phù hợp, đặc biệt là mỹ phẩm chứa corticoid đã để lại nhiều ảnh hưởng như làm trầm trọng MTC, teo da, suy giảm collagen và gia tăng sự bội nhiễm của vi sinh vật Hiện nay, vấn đề điều trị MTC được áp dụng nhiều phương pháp như sử dụng kháng sinh, nội tiết và retinoid hay liệu pháp ánh sáng xanh Tuy nhiên, các biện pháp trên còn những hạn chế như gia tăng sự kháng thuốc ở vi sinh vật gây bội nhiễm MTC hoặc để lại nhiều tác dụng phụ cho người sử dụng Từ đó, yêu cầu về biện pháp mới có thể ức chế sự bùng phát của vi sinh vật gây bội nhiễm là rất cần thiết trong quản lý và điều trị MTC
Mục tiêu của đề tài
Tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic (LAB) có khả năng
ức chế vi sinh vật gây bội nhiễm phổ biến ở MTC có sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid, định hướng đưa ra phương pháp chăm sóc da MTC theo hướng cạnh tranh sinh học
Nội dung nghiên cứu
(1) Khảo sát tần suất xuất hiện của vi sinh vật bội
nhiễm phổ biến (P acnes, Staphyloccocus aureus (S.aureus), Staphyloccus epidermidis (S epidermidis),
Trang 5Demodex) trên da MTC có sử dụng sản phẩm bôi chứa
corticoid (gọi tắt là corticoid bôi); (2) Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến
ở MTC dùng sản phẩm bôi chứa corticoid và tuyển chọn
vi khuẩn chỉ thị (VKCT); (3) Phân lập và tuyển chọn những dòng LAB có khả năng ức chế VKCT; (4) Khảo sát một số hoạt tính sinh học có khả năng ứng dụng trong chăm sóc da của dòng LAB đã chọn; (5) Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm sóc da
Những đóng góp mới của đề tài
- Xác định nhóm vi khuẩn gây bội nhiễm phổ biến ở MTC sử dụng corticoid bôi và đánh giá thực trạng kháng thuốc kháng sinh
- Tìm được dòng LAB có khả năng ức chế nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến ở MTC dùng corticoid bôi, đồng thời có khả năng chăm sóc da bằng cách sản sinh hợp chất chống oxy hóa và giữ ẩm
- Bước đầu xây dựng được công thức lên men chế phẩm LAB chăm sóc da MTC từ gel Nha đam
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về mụn trứng cá
MTC là bệnh viêm da mãn tính, phổ biến ở lứa tuổi thanh thiếu niên với các biểu hiện lâm sàng: mụn đầu trắng, đầu đen, mụn mủ, nốt, nang (Bộ Y tế, 2015) Sinh bệnh học của MTC thường liên quan đến các yếu tố nội sinh, ngoại sinh nhưng rõ nhất là liên quan đến bốn yếu tố: Tăng sản xuất chất nhờn, tắc nghẽn lỗ chân lông, phát
triển quá mức của P acnes và phản ứng viêm (Tahir,
2010)
Trang 62.2 Vi sinh vật gây bội nhiễm MTC
Theo nhiều nghiên cứu về nhóm vi sinh vật gây bội
nhiễm ở MTC cho thấy, tỷ lệ P acnes ở MTC chiếm 32%,
S aureus là 45%, S epidermidis là 49% và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng Demodex đối với những trường hợp MTC lạm dụng corticoid bôi tăng lên 75,5% (Dolenc-Voljc et al.,
2005; Dhillon and Varshney, 2013)
Vi khuẩn P acnes là một trong những vi khuẩn
thuộc hệ vi sinh vật tự nhiên của da, chiếm khoảng 105
-106 tế bào/cm2 ở những vùng có nhiều bã nhờn như mặt, lưng, ngực và khoảng 102 tế bào/cm2 ở các vùng khác trên
cơ thể P acnes có khả năng sản xuất các enzym liên quan
đến sự phá hủy tế bào ký chủ như: hyaluronan, sialidase, neuraminidase, lipase và có khả năng thu hút đại thực bào
và tế bào đuôi gai kích thích mạnh mẽ phản ứng viêm (Bru¨ggemann, 2010)
Vi khuẩn S aureus là nhóm vi khuẩn da và niêm
mạc, phát triển nhiều ở tay, ngực, bụng và mũi Khoảng
10-35% người khỏe mạnh mang S aureus thường xuyên, 20-75% nhiễm không liên tục S aureus gây bệnh bằng
sản xuất enzym staphylokinase và protein A làm vô hiệu hóa vị trí hoạt động C3b, C1q của IgG và có khả năng bất
hoạt một số bổ thể và tránh sự truy bắt của bạch cầu S aureus gây bệnh với các biểu hiện lâm sàng dạng mụn mủ,
áp se, bong vảy da
S epidermidis là thành viên của hệ vi sinh vật da có
khả năng ức chế phản ứng viêm thông qua hoạt động của
acid lipoteichoic (LTA) Trên MTC, S epidermidis được
xem là nhân tố nhiễm trùng cơ hội, hiện diện với tỷ lệ từ
6,8-49% đứng sau P acnes là 52,7-91,6% (Dhillon and Varshney, 2013) Cơ chế gây bệnh của S epidermidis nhờ
khả năng tạo exopolysaccharid hình thành màng sinh học
ức chế sự tấn công của đại thực bào và các yếu tố chống
Trang 7nhiễm khuẩn của ký chủ, giảm tốc độ tăng trưởng và đột biến gen kháng lại thuốc kháng sinh, sản xuất chất ngoại bào acid poly-γ-glutamic, PNAG/PIA và PSMs bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi cơ chế miễn dịch bẩm sinh của ký chủ
Ký sinh trùng Demodex là một loại ve ký sinh có
kích thước nhỏ nhất trong nhóm động vật chân đốt, ký sinh chủ yếu ở nang lông ở các vị trí gần mũi, lông mày, đầu, mí mắt là những nơi tập trung nhiều tuyến nhờn và gây bệnh khi hiện diện với mật số cao Cơ chế gây bệnh
của Demodex là làm tổn thương nang lông, tắc nghẽn lỗ
chân lông gây viêm và tạo cơ hội cho yếu tố gây bệnh
khác xâm nhập như P acnes và S aureus (Tchernev, 2011) Một số biểu hiện lâm sàng do Demodex như khô
nang lông, ngứa, đỏ, da sần sùi, mụn mủ
2.3 Ảnh hưởng corticoid đối với MTC
Corticoid có tên đầy đủ corticosteroid là hợp chất có hoạt tính sinh học giống như hormon steroid tiết ra từ vỏ thượng thận có tác dụng chống viêm, chống dị ứng Tuy nhiên, việc lạm dụng corticoid đặc biệt là dạng bôi ngoài da cũng mang lại nhiều tác dụng phụ như: teo da, mỏng da, ửng đỏ hoặc rạn da, giãn mạch, suy yếu collagen, teo da, mất sắc tố, làm trầm trọng MTC, da dễ tổn thương và tạo
cơ hội cho nhiều vi sinh vật bội nhiễm như S aureus, P acnes và ký sinh trùng Demodex (Klein et al., 2001)
2.4 Sơ lược về vi khuẩn lactic và những ứng dụng trong chăm sóc da
Thuật ngữ vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria – LAB) dùng để chỉ nhóm vi khuẩn có khả năng lên men chất bột đường tạo thành acid lactic LAB có các đặc điểm chung như: Gram dương; không sinh bào tử; kỵ khí tùy tiện hay vi hiếu khí; tế bào có hình que hoặc cầu; âm tính với catalase, oxidase và gelatinase
LAB thường kết hợp với môi trường sống giàu chất dinh dưỡng, chẳng hạn như phát triển trên nhiều loại thực
Trang 8phẩm (sữa, thịt, rau), và một số là thành viên của hệ vi sinh vật trong miệng, ruột và âm đạo của động vật có vú Trong quá trình trao đổi chất, LAB có khả năng ức chế vi sinh vật khác bằng con đường cạnh tranh dinh dưỡng và sản sinh các sản phẩm như: acid lactic; acid acetic; peroxid hydrogen; carbon dioxid; bacteriocin; diacetyl; LAB được xem là vi khuẩn có lợi và đã được ứng dụng phổ biến trong các lĩnh vực như chăn nuôi, thủy sản, chế biến thực phẩm qua nhiều thời kỳ của lịch sử Thời gian gần đây, LAB được ứng dụng rộng rãi trong y học như: phòng chống tiêu chảy, cải thiện sự dung nạp lactose,
kích thích miễn dịch, phòng chống dị ứng, giảm tỷ lệ mắc ung thư ruột kết, cải thiện những bệnh có liên quan đến tim mạch,…
Ngoài các ứng dụng trên, LAB có thể ứng dụng để chăm sóc và bảo vệ da thông qua các đặc tính kích thích miễn dịch, ức chế vi khuẩn gây bội nhiễm trên da, giảm
hình thành melanin, chống lão hóa da, tăng tính đàn hồi và
giữ ẩm cho da (Chen et al., 2006; Tsai et al., 2013)
2.5 Sơ lược về Nha đam và những ứng dụng trong mỹ phẩm
Nha đam là cây lâu năm phát triển khắp các vùng
ôn đới và nhiệt đới Gel từ thịt lá Nha đam có chứa 99% là nước và các hợp chất hữu cơ khác gồm: phenolic như: emodin aloe, aloin, aloesin; các acid hữu cơ như: saponin
và terpenoid; các polysaccharid như: arabinan, acid glucuronic, galactan, và nhiều khoáng, acid amin, vitamin Với những thành phần này, gel Nha đam được dùng giữ ẩm, làm chậm quá trình lão hóa da, làm mát và kháng khuẩn, chống nấm nên có thể điều trị các bệnh nhiễm trùng da ở thể nhẹ như: mụn nhọt, u nang da lành
tính, giảm viêm (Nandal and Bhardway, 2012; Sanghi, 2015) Vì thế, Nha đam được ứng dụng phổ biến trong ngành công nghiệp mỹ phẩm
Trang 9Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Khảo sát tần suất xuất hiện của P acnes, S aureus, S epidermidis, Demodex trên da MTC có sử
dụng sản phẩm bôi chứa corticoid
Mục đích là xác định tác nhân bội nhiễm phổ biến ở MTC có sử dụng corticoid phục vụ nội dung nghiên cứu tiếp theo
Thời gian khảo sát từ tháng 3/2013 đến 10/2014 Thông qua phỏng vấn thu thập thông tin các bệnh nhân mụn trứng cá và lấy mẫu bệnh phẩm xét nghiệm vi sinh
vật (phân lập vi khuẩn và soi tươi Demodex)
Kiểm tra corticoid trong sản phẩm bôi da bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với chất chuẩn dexamethason acetat và phương pháp hóa học
3.2 Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của nhóm
vi khuẩn gây bội nhiễm phổ biến ở MTC dùng sản phẩm bôi chứa corticoid và tuyển chọn vi khuẩn làm chỉ thị
Thực hiện kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuếch tán trên đĩa thạch Kirby-Bauer với các loại kháng sinh gồm: trimethoprim/sulfamethoxazol, climdamycin, doxycyclin, erythromycin, oxacillin và tetracyclin và chọn đại diện các dòng vi khuẩn đại diện để làm VKCT
3.3 Phân lập và tuyển chọn những dòng LAB có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị
a) Phân lập LAB
Các mẫu nước vo gạo, nước bột, nước tàu hũ thu về
để lên men 1-2 ngày và mẫu vi sinh vật từ da, phân lập trên môi trường MRS bổ sung 1% CaCO3 Các dòng phân lập được kiểm tra hình thái và sinh hóa bằng các thử nghiệm nhuộm Gram, thử nghiệm catalase, oxydase, gelatinase chuẩn bị thí nghiệm sau
Trang 10b) Khảo sát khả năng ức chế VKCT
1) Phương pháp khuếch tán giếng thạch có cải tiến
Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar) có cải tiến là thay dịch ly tâm loại bỏ vi khuẩn bằng huyền phù vi khuẩn Khả năng ức chế VKCT được xác định bằng cách đo khoảng cách vùng vô khuẩn, không tính đường kính của giếng
2) Phương pháp chủng LAB đã chọn vào dịch nuôi
có VKCT
Chủng 1 mL dòng LAB với mật số 2-2,5x105CFU/mL vào 20 mL môi trường TSB bổ sung dịch trích tim có VKCT với mật số tế bào là 2-2,5x105 CFU/mL Kết quả xác định bằng đếm mật số vi khuẩn ở các thời điểm 2,
6, 12, 24, 30 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo công thức
Trong đó:
N = Số lượng vi khuẩn có trong 1 mL dịch nuôi
C = Tổng số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa
n i = Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ i
d i = Hệ số pha loãng thứ i
3.4 Khảo sát một số đặc tí nh sinh học ứng dụng trong chăm sóc da của dòng LAB đã chọn
a Kiểm tra khả năng sinh bacteriocin
Sử dụng phương pháp nhỏ giọt với VKCT: Bacillus coagulans JCM 2257T; Micrococcus leteus NBRC 12708;
S aureus ATCC 12600T; Pediococus pentosacus JCM
5885
Trang 11b Khảo sát khả năng sinh hoạt chất chống oxy hóa
Dịch nuôi LAB trong môi trường MRS 24 giờ ly tâm loại bỏ tế bào (DN-Lp), pha loãng các nồng độ 30%, 50%, 70% và 100% và thử hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) với DPPH (2,2–Diphenyl–1–picrylhydrazyl), vitamin C làm đối chứng Hỗn hợp sau phản ứng được đo độ hấp thu bằng máy quang phổ Genesys 10S UV- Vis ở bước sóng
517 nm HTCO (%) (trung bình của 3 lần đo) được tính theo công thức:
100 ) (
ODc
ODt ODc
HTCO
Trong đó:
ODc: Mật độ quang của DPPH và ethanol
ODt: Mật độ quang của DPPH và LAB
c Khảo sát khả năng giữ ẩm
Dịch nuôi LAB sau khi lọc loại tế bào được pha
loãng các nồng độ 10%, 50% và 100%, bổ sung 1 mL vào các týp nhựa 2 mL ủ ở nhiệt độ 50 oC, ẩm độ 60%, thời gian theo dõi là 96 giờ Mỗi nồng độ thử nghiệm lập lại 3 lần, đối chứng là glyceril 5%, 10% và nước là mẫu trắng Kết quả được tính theo công thức sau:
Trong đó:
Rr (%): % giữ ẩm
W0LAB: trọng lượng dịch LAB ở 0 giờ
WtLAB: trọng lượng dịch LAB ở 96 giờ
W0C: trọng lượng mẫu nước trước ở 0 giờ
WtC: trọng lượng mẫu nước ở 96 giờ
d Khảo sát khả năng sản sinh acid lactic
Dịch nuôi LAB trong môi trường MRS được ly tâm loại tế bào, đo lượng acid lactic sinh ra bằng sắc ký lỏng
Trang 12hiệu năng cao (HPLC) (trên máy US HPLC-1210 và cột RSpak SH-1011) ở nhiệt độ 75 oC, HClO4 3 mM làm pha động, tốc độ dòng chảy 0,6 mL/phút và thể tích mẫu tiêm vào là 2 mL Lượng acid lactic được xác định bằng bộ cảm ứng BF-5 biosensor (Japan)
e Khảo sát khả năng đề kháng với kháng sinh dùng trong điều trị mụn
Thực hiện kháng sinh đồ bằng kỹ thuật khuếch tán trên đĩa thạch Kirby-Bauer với các loại kháng sinh gồm: trimethoprim/sulfamethoxazol, erythromycin, tetracyclin, clindamycin, doxycyclin
3.5 Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm sóc da
3.5.1 Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi sinh khối LAB
Mục đích của thí nghiệm là tìm môi trường cải tiến giá thành rẻ để nuôi sinh khối LAB cung cấp cho thínghiệm lên men Nha đam làm chế phẩm, gồm các thínghiệm
a Khảo sát thời gian tăng trưởng: Vi khuẩn được
nuôi trong môi trường MRS lỏng, đếm mật số vi khuẩn sau 2, 6, 12, 24, 30 giờ
b Khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon:
LAB được cấy trên môi trường TSA có bổ sung 20% các loại đường: glucose, lactose, saccarose, tinh bột Quan sát
sự phát triển của vi khuẩn sau 24 giờ
c Khảo sát thành phần môi trường và điều kiện nuôi sinh khối
1) Khảo sát khả năng sử dụng đường
Thí nghiệm được thiết kế theo Bảng 3-1
Trang 13Bảng 3.1: Thành phần môi trường (MT) nuôi LAB
2) Khảo sát tỷ lệ các thành phần của môi trường
Thiết kế thí nghiệm theo Bảng 3.2
Bảng 3.2: Tỷ lệ thành phần môi trường nuôi LAB
Thành phần Mức 1 Mức 2 Mức 3 Biến
thiên
Nước tàu hũ (%) 100 100 100 0 Carbohydrat (%) 15 20 25 5
KH 2 PO 4 (%) 1,5 2 2,5 0,5 (NH 4 )SO 4 (%) 1,5 2 2,5 0,5
Thí nghiệm bố trí gồm 3 nhân tố, 3 mức độ và 2 lần lặp lại Chỉ tiêu khảo sát là sinh khối vi khuẩn sau 24 giờ
3) Thí nghiệm khảo sát điều kiện nuôi
Thiết kế thí nghiệm gồm 2 nhân tố: nhiệt độ và pH, khảo sát ở 3 mức độ với 3 lần lặp lại (Bảng 3.3) Chỉ tiêu khảo sát: sinh khối vi khuẩn sau 24 giờ
Bảng 3.3: Điều kiện nuôi LAB