Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero chuẩn quốc gia dùng trong kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế

ĐẶT VẤN ĐỀTrong lịch sử phát triển nghiên cứu y sinh học, việc ứng dụng sử dụng cácdòng tế bào có nguồn gốc từ động vật, thực vật rất phổ biến và là vật liệu không thểthiếu trong việc tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Văn Hùng

- TS Phạm Văn Hùng, người thầy có nhiều kinh nghiệm đã trực tiếp giúp đỡtôi từ lúc xây dựng đề cương cho đến khi hoàn thành luận văn.

- Các bạn đồng nghiệp tại Khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, Viện Kiểmđịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trongquá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

- Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, các bạn cùng lớp và cácđồng nghiệp trong các Khoa/ phòng của Viện đã động viên, khích lệ và giúp đỡ tôitrong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 11 năm 2018

Học viên

Nguyễn Mạnh Khải

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection Chủng chuẩn

CBER Center for Biologics Evaluation

Research

Trung tâm đánh giá các nghiêncứu sinh học

COA Certificate Of Analysis Chứng nhận chất lượng

DNA Acide Deoxyribonucleic Acide Deoxyribonucleic

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế Giới

MCQG National Reference Standard Mẫu chuẩn quốc gia

MCQT International Reference Standard Mẫu chuẩn quốc tế

MDBK Madin-Darby bovine kidney cell line Tế bào tiên phát thận bò

MRC-5 human diploid cell strain Tế bào lưỡng bội người

NIBSC National Institute for Biological

Standard and Control

Viện kiểm soát và thiết lập chấtchuẩn quốc tế

NRA National Regulatory Authority Cơ quan quản lý quốc gia vắc

xin

NICVB National Institute for Control of

Vaccine and Biological

Viện Kiểm định Quốc gia Vắcxin và Sinh phẩm Y tế

NCL National Laboratory Control Phòng kiểm định quốc gia

FDA Food and Drug Aministration Cơ quan quản lý thuốc và thực

phẩm Hoa KỳWCB Working Cell Bank Ngân hàng tế bào làm việc

JCM Japan Collection of Microorganisms Bộ sưu tập các chủng vi sinh vật

Nhật BảnSOP Standard Operating Procedure Qui trình thao tác chuẩn

GLP Good Laboratory Practice Thực hành phòng thí nghiệm tốtGMP Good Manufacturing Practice Thực hành sản xuất tốt

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuyếch đại chuỗi

TRS Technical Report Series Báo cáo kỹ thuật

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Tế bào động vật và cơ sở của việc nuôi cấy tế bào động vật 3

1.1.1 Các tế bào dịch huyền phù 3

1.1 Các tế bào d nh bám 3

1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 4

1 .1 Môi trường nuôi cấy 5

1.2.2 Kỹ thuật nuôi cây tế bào động vật 7

1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 10

1.3.1 Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật

10 1.3 Công nghệ nhân bản vô t nh động vật 11

1.3.3 Ứng dụng trong lĩnh vực y tế 13

1.4 Lịch sử ứng dụng nuôi cấy tế bào trong sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế, khái niệm ngân hàng tế bào 14

1.5 Dòng tế bào Vero 16

1.6 Hướng dẫn WHO thiết lập mẫu chuẩn quốc gia dùng cho kiểm định 18

1.7 Hướng dẫn của WHO thiết lập và đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào dùng cho sản xuất và kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm 19

1.7.1 Thử nghiệm nhận dạng 20

1.7.2 Thử nghiệm vô trùng 21

1.7.3 Kiểm tra độ sống 21

1.7.4 T nh đồng nhất giữa các ống tế bào

21 1.7.5 Thử nghiệm Mycoplasma 22

1.7.6 Thử nghiệm kiểm tra các tác nhân ngoại lai

22 1.7.7 Kiểm tra phát hiện vi khuẩn lao 23

1.7.8 Kiểm tra tính ổn định của ngân hàng tế bào MCB và WCB theo thời gian khi bảo quản ở điều kiện tối ưu -700C 23

.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.3 Vật liệu nghiên cứu 25

2.3.1 Mẫu chuẩn và mẫu thử 25

2.3.2 Các sinh phẩm, hóa chất: 25

2.3.3 Các thiết bị chính 26

2.3.4 Các dụng cụ và nguyên vật liệu khác

26 4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Thiết kế mô hình nghiên cứu 27

2.4.2 Kỹ thuật nghiên cứu 29

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Qui trình sản xuất ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và vero 76 NICVB-WCB01-18B chuẩn quốc gia 37

3.2 Quy trình chuẩn Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế” theo tiêu chuẩn WHO TRS No 978, phần 3, 2013 38

3.2 Kết quả kiểm tra chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-MCB01-18B 38

3.2.1 Kết quả kiểm tra nhận dạng tế bào vero 76 MCB01-18A và WCB01-18B 38 3.2.2 Kết quả kiểm tra vô trùng tế vero 76 MCB01-18A và WCB01-18B

39 3.2.3 Kết quả kiểm tra độ sống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB- WCB01-18B 40

3.2.4 Kết quả kiểm tra t nh đồng nhất các ống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B 42

3.2.5 Kết quả kiểm tra Mycoplasma tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B 44

3.2.6 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A

44

3.2.7 Kết quả kiểm tra vi khuẩn lao trong tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A

và

3.2.8 Kết quả kiểm tra tính ổn định ngân hàng tế bào vero 76

NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B khi bảo quản điều kiện -700C theo thời gian

46 CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 50

4.1 Tính cấp thiết của việc thiết lập và đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero đạt tiêu chuẩn WHO TRS No 978, 2013 50

4.2 Xây dựng qui trình chuẩn Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế” đạt tiêu chuẩn WHO 51

4.3 Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B 52

4.4 Tính ổn định của ngân hàng tế bào vero 76 MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B khi bảo quản theo thời gian tại nhiệt độ tối ưu -700C 53

KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

ảng 1.1 Thành phần môi trường Eagle 1959 7

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhận dạng tế bào vero 31

Bảng Điều kiện phản ứng chu kỳ nhiệt PCR nhận dạng tế bào vero 31

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR phát hiện Mycoplasma 34

Bảng .4 Điều kiện phản ứng chu kỳ nhiệt PCR phát hiện Mycoplasma 34

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra vô trùng 40

Bảng 3.2 kết quả kiểm tra độ sống tế bào vero 76 MCB01-18A và NICVB-MCB01-18B 41

Bảng 3.3 Kết quả t nh đồng nhất các ống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A 42

Bảng 3.4 Kết quả t nh đồng nhất các ống tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B 43

Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai của ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A 45

Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra phát hiện trực khuẩn lao trong tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B 46

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá t nh ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu theo thời gian 47

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá t nh ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu theo thời gian 48

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cây

4 Hình 1.2 Hình ảnh tế bào vero trong môi trường nuôi cấy MEM 10%FBS 17

Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu 29

Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và vero 76 NICVB-WCB01-18B chuẩn quốc gia 37

Hình 3.2 Tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B 38

Hình 3.3 Kết quả nhận dạng MCB01 và WCB01 39

Hình 3.4 Kết quả hình thái đặc trưng vero 76 trên môi trường nuôi cấy 41

Hình 3.5 Kết quả xác định Mycoplasma trong mẫu tế bào ngân hàng vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B 44

Hình 3.6 Kết quả tính ổn định độ sống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A 48

Hình 3.7 Kết quả tính ổn định độ sống tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong lịch sử phát triển nghiên cứu y sinh học, việc ứng dụng sử dụng cácdòng tế bào có nguồn gốc từ động vật, thực vật rất phổ biến và là vật liệu không thểthiếu trong việc triển khai nghiên cứu trong phòng thí nghiệm y sinh, đặc biệt làlĩnh vực sản xuất và kiểm định chất lượng thuốc, vắc xin, sinh phẩm y tế phục vụcông tác phòng và điều trị bệnh cho cộng đồng [11;12]

Việc ứng dụng rộng rãi phương pháp nuôi cấy tế bào động vật trong sản xuấtcũng như kiểm định các sản phẩm vắc xin và sinh phẩm y tế từ đầu thế kỷ XX, đặcbiệt trong 3 thập kỷ gần đây với việc phát triển và ứng dụng rộng rãi các thành tựukhoa học công nghệ tiên tiến như là các các kỹ thuật sinh học phân tử như DNA tái

tổ hợp, gene, protein kết hợp với sử dụng các dòng tế bào động vật nguyên pháthoặc thường trực vào việc nghiên cứu y sinh học để phát triển sản xuất ra nhiều loạisản phẩm sinh học công nghệ cao an toàn, hiệu lực và tiện sử dụng trong công tácphòng bệnh chủ động và điều trị bệnh có chất lượng, an toàn và hiệu quả cao [13].Mỗi loại tế bào thích hợp dùng để nuôi cấy một số loại vi rút khác nhau, nhưng cómột số loại tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy nhiều loại vi rút khác nhau như tế bàothận khỉ, tế bào chuột đất vàng, tế bào CHO, tế bào MRC-5, tế bào BHK, và tế bào

MD K… [21;22]

Trong số đó, dòng tế bào Vero được sử dụng rộng rãi trong sản xuất và kiểmđịnh vắc xin và sinh phẩm y tế, đặc biệt là các vắc xin vi rút sống giảm độc lựchoặc vi rút bất hoạt như: vắc xin sởi, vắc xin quai bị, vắc xin rubella, vắc xin Viêmnão nhật bản B, vắc xin dại, vắc xin rotavirus, vắc xin dengue (Tế bào Vero được

sử dụng để sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế và sử dụng trong công tác kiểm địnhchất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế tại các cơ quan kiểm định quốc gia và cácphòng kiểm định tại nhà máy) [10;18;19]

Mặt khác, để chủ động cho công tác kiểm định chất lượng sản phẩm, Tổchức Y tế Thế giới (WHO) đã có các tài liệu hướng dẫn kỹ thuật (TRS) cho các cơquan kiểm định quốc gia các nước hoặc khu vực thiết lập và đánh giá chất lượng và

sử dụng dòng tế bào Vero cho sản xuất và kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế

Đồng thời WHO khuyến cáo các cơ quan kiểm định quốc gia nên chủ động xâydựng ngân hàng tế bào riêng mình bao gồm: ngân hàng tế bào gốc giống (MasterCell Bank-MCB) và ngân hàng tế bào làm việc (Working Cell Bank-WC đạt tiêuchuẩn chất lượng theo hướng dẫn của WHO để chủ động trong công tác kiểm địnhchất lượng và quản lý hệ thống chất lượng của cơ quan quản lý vắc xin quốc gia(NRA) và cung cấp cho hệ thống phòng kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩmtrên phạm vi toàn quốc [40;41;42].

Việt Nam là một trong số 39 quốc gia có cơ quan quản lý quốc gia vắc xin(NRA) đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và nền công nghiệp sảnxuất vắc xin từ những năm 1970 Viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y

tế (NICVB) thực hiện hai trong sáu chức năng của cơ quan quản lý quốc gia vắcxin (NRA) là xuất xưởng lô và kiểm định chất lượng trong phòng thí nghiệm, giámsát chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế trên phạm vi toàn quốc, quản lý cung cấpmẫu chuẩn quốc gia (chủng chuẩn, độc tố chuẩn, kháng huyết thanh chuẩn, cácdòng tế bào chuẩn ) cho các phòng kiểm định của các nhà sản xuất vắc xin và sinhphẩm trên toàn quốc[4;5;6;35] Do vậy, việc nghiên cứu đề tài Đánh giá chấtlượng ngân hàng tế bào Vero chuẩn quốc gia dùng cho kiểm định chất lượng vắcxin và sinh phẩm y tế” là nhu cầu rất cấp thiết và phù hợp với yêu cầu thực tế nângcao năng lực của cơ quan NRA và kiểm định quốc gia trong công tác kiểm định vàgiám sát chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế trên phạm vi toàn quốc với các mụctiêu sau:

1 Nghiên cứu xây dựng qui trình chuẩn đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào Vero đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)

2 Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào Vero MCB và WCB

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tế bào động vật và cơ sở của việc nuôi cấy tế bào động vật

Tế bào động vật trong cơ thể trưởng thành hầu như t biểu hiện t nh toànnăng, có quá trình chết theo chu trình, rất nhạy cảm với môi trường, tốc độ sinh sảnchậm,… vì thế rất khó để nuôi cấy một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào của cơ thểtrưởng thành Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhaubởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô Mô động vật thường được phân chiatheo 4 nhóm: biêu mô (epithelium), mô liên kêt (connective tissue), mô cơ(muscle) và mô thần kinh (nerve) Biêu mô tạo thành lớp phủ và lớp lót trên các bềmặt tự do của cơ thể, cả bên trong và bên ngoài Ở mô liên kết, các tế bào thườngđược bao bọc trong thể gian bào rộng kéo dài , đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặcrắn Các tế bào mô cơ thường thon dài và được găn với nhau thành một phiênhoặc một bó bởi mô liên kêt Mô cơ chịu trách nhiệm cho hầu hêt chuyên động ởđộng vật bậc cao Các tế bào mô thần kinh gồm có thân tế bào chứa nhân và mộthoặc nhiều phần mở rộng dài và mảnh được gọi là sợi Các tế bào thần kinh được

k ch th ch dễ dàng và truyền xung động rât nhanh [3]

1.1.1 Các tế bào dịch huyền phù

Tế bào hồng cầu và bạch huyêt là các mô liên kêt không điên hình dạngthể lỏng Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyêt là các tế bào dịch huyềnphù (suspension cells), hoặc không d nh bám khi chúng sinh trưởng trong nuôi

cấy in vitro Các tế bào không d nh bám không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng.

Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết lymphocytes Hình 1a bắt nguồn từ môbạch huyết là các tế bào không d nh bám và có hình cầu đường k nh từ 1 - m.Chúng có thể được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng theo phương thức tương tự

vi khuẩn

1 ác tế nh á

Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào d nh bám, vì thế chúngcần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng Trong các ứng dụng, người ta sử dụng

rộng rãi các loại tế bào d nh bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi fibroblastHình 1b và

c Các tế bào d nh bám cần có một bề mặt ẩm để sinh trưởng như là thủy tinh hoặcplastic Đĩa petri hoặc các chai trục lăn là các loại được sử dụng rộng rãi nhất Cácchai được đặt nằm trên một trục lăn quay tròn chậm trong tủ ấm Chai có dung t ch 1lchứa khoảng 1 ml môi trường là th ch hợp cho các tế bào vừa sinh trưởng trênthành chai vừa tiếp xúc với môi trường và không kh Tuy nhiên, chai trục lăn chỉdùng cho quy mô phòng th nghiệm vì diện t ch bề mặt trên một đơn vị thể t ch củachai nuôi cấy khá nhỏ (500 cm2/l).

Hình 1.1: Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi

1.2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

Năm 19 7, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh mô

phôi ếch trong dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop Năm 19 3,

Carel đã hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh in vitro , dễtiệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào phát triển tốt Nhưng phải chờ đến những năm

196 , khi hoàn thiện được môi trường nuôi cấy nhân tạo thì kỹ thuật nuôi cấy tế bàođộng vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vào nhiều ngành công nghệsinh học [19].

1 Môi trường nuôi cấy

Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là môi trường nuôicấy phải đủ chất dinh dưỡng, nhân tố sinh trưởng, độ pH và nồng độ muối ổn định,đồng thời phải có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tế bào có thểsống và phát triển được Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật lớn hơn visinh vật do, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vô

cơ Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vào môi trường Môitrường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, cácvitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose Ngoài ra,môi trường cần được cung cấp từ -20% (theo thể t ch huyết tương của động vật có

vú Mặc dù huyết thanh có thành phần chưa được xác định đầy đủ, nhưng nhiềunghiên cứu đã cho thấy nó rất cần thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào trongnuôi cấy

1.2.1.1 Môi trường hóa chất

Huyết thanh dùng trong môi trường nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn lànguồn nhiễm bẩn virus và mycoplasma Do bản chất hóa học của huyết thanh chưađược xác định đầy đủ nên trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng xấu đến kếtquả nuôi cấy Sự hiện diện của nhiều protein khác nhau trong huyết thanh cũng cóthể làm phức tạp các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra Vì l do đó, nhiềunghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng công thức môi trường không có huyếtthanh Những công thức này chứa các hormone và các nhân tố sinh trưởng đượctinh sạch để thay thế cho huyết thanh

Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 195 đã thay thế hoàn toàncho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà, huyết tương,… Môi trường hóachất được điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế, thêm, bớt các chất cầnthiết, t bị lây nhiễm… Môi trường nuôi cấy có chứa đủ các chất dinh dưỡngCacbonhydrat, acid amin, vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tố sinhtrưởng Hiện nay, người ta dùng một số môi trường nuôi cấy như môi trườngEagle, môi trường Dulbecco,…

Môi trường nuôi cấy phải đẳng trương để duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu.Người ta thường dùng bicacbonat để tạo hệ đệm kết hợp với hệ làm giàu CO2 môitrường 5-10% CO2 95% không kh trong đó tế bào được nuôi Độ pH th ch hợp là7,4 Người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra độ pH của môi trường, nếu môitrường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển tốt, nếu chuyển sang vàng nhạt là môi trường bị nhiễm khuẩn.

1.2.1.2 Nhân tố sinh trưởng

Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không phát triển.Người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi cấy 1 -15%) vìtrong huyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng Nhưng dùng huyết thanh vừa đắttiền lại vừa dễ bị nhiễm khuẩn cho nên ngày nay người ta thường dùng các chất bổtrợ để thay thế cho huyết thanh như: insulin, transferin, ethanolamin,… hoặc sửdụng lớp tế bào nuôi

1.2.1.3 Các chất kháng sinh

Các chất kháng sinh như penecillin, streptomicin hoặc amphotericin thườngđược dùng để chống nhiễm khuẩn cho mẻ cấy Tuy nhiên, các chất kháng sinhthường độc vì vậy phải dùng với liều lượng th ch hợp và phải kết hợp với quy trìnhtiệt trùng chu đáo [11]

Bảng 1.1 h nh phần ôi trường Eagle ( 959)

1.2.2 K ỹ thuật nuôi cây tế bào động vật

Phương pháp ch nh trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sảnphẩm sinh - dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men Từlâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men Đầu tiên, sựlên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứngdụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các khángsinh… Kết quả dẫn đến sự phát triển nhanh chóng các phương pháp và các hệ thốnglên men khác nhau

Các nguyên l tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế bàođộng vật và thực vật Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khănhơn nhiều so với vi sinh vật, cái ch nh là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế

bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào.Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấmmen, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ Do

đó, các hệ thống khuấy và sục kh được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn Mặc dù

có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôicấy tế bào động vật t nhất cũng vài chục năm trước đây Các dòng tế bào khác nhaunhư HK- 1, LS, các tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theophương thức nuôi cấy chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine vàcác sản phẩm khác

Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằngcách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái ch o Việc cung cấp kh trực tiếp cóthể tạo ra bọt kh dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp kh bằng cách khuếch tánthông qua ống silicone Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây

ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nh Đối với nuôi cấy mật độ cao, cầncung cấp thêm oxygen Phương pháp dùng ống silicone để sục kh có nhiều ưu điểm

do không tạo ra bọt kh và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng

Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến th ch hợp có thể dùng đểnuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù Nếu muốnnuôi cấy một dòng tế bào d nh bám thì nên dùng một hệ thống chất mang như làmicrocarrier

Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy là vero, CHO4, NS 5, HK6, HEK- 937 và tế bào v ng mạc của người Người ta cũng có thể sử dụng tế bào tự do bạch cầu, limpho,… hoặc tế bào của mô để nuôi cấy Mô được phẩu thuật trong môi trường vô trùng, cắt thành mảnh nhỏ và được xử l bằng enzyme kết hợp với kỹ thuật nghiền mô để tách thành tế bào riêng biệt ở dạng huyền phù Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào tự do thường ở dạng huyền phù, còn tế bào mô thường bám vào đáy bình thành lớp Người ta sử dụng buồng đếm hoặc máy đếm tự động để t nh toán số lượng tế bào theo từng giai đoạn phát triển Người ta có thể thực hiện các mẻ cấy liên tục bằng cách tr ch một phần mẻ cấy trước để cấy chuyền vào môi trường mới, nếu là mẻ bám thì phải sử dụng enzyme

để tách riêng tế bào và phải làm rất nhanh trong vòng 15 phút vì enzyme có thể gâyhại cho tế bào [11].

1.2.2.1 Đời sống tế bào động vật trong nuôi cấy

Tế bào mô động vật, đặc biệt là động vật có vú có đặc điểm là khi nuôi cấy,

dù là cấy chuyền chỉ qua được 5 thế hệ, sau đó chúng thoái hóa và chết Số thế hệ

tế bào tùy thuộc vào độ biệt hóa của mô mà ta lấy tế bào Đối với tế bào gốc thì khảnăng sinh trưởng sẽ dài hơn so với tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinhtrưởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trưởng thành Tuy vậy, người ta đã tạo ra được cácdòng tế bào bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trưởng liên tục trong môi trườngcấy chuyền Đó ch nh là các tế bào ung thư của cơ thể hoặc là dạng tế bào được làmchuyển dạng ung thư hóa” với những biến đổi di truyền Sự chuyển dạng thườngđược thực hiện nhờ tác nhân gây đột biến, nhờ virut, nhờ gen ung thư,… Ngày nay,người ta đã nuôi cấy và cất giữ nhiều dòng tế bào bất tử” nhân tạo như các dòng tếbào chuột, chuột Hamster TQ, khỉ,… hoặc lấy từ cơ thể từ các mô ung thư tế bàoHela tế bào ung thư cổ tử cung hay tế bào Namalwa tế bào ung thư limphoma củamột phụ nữ có tên là Namalwa

1.2.2.2 Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy

Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 3 pha:

- Pha chậm Lag phase là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấycho đến khi tế bào bắt đầu phát triển Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vàotrạng thái biệt hóa của mô được tr ch tế bào

- Pha tiến triển exponential phase là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăngnhanh số lượng tế bào trong khoảng thời gian từ 15 – 5 giờ với số lượng tế bào đạt1-2 x 106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ

- Pha dừng Stationary phase là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số lượng tếbào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dưỡng ngh o dần và bắt đầu t ch lũycác sản phẩm trao đổi chất độc hại ắt đầu xuất hiện tự hoại tế bào thể hiện ở chổnhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối có thể quan sát đượcdưới k nh hiển vi Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng cần thực hiện các mẻ cấychuyền với môi trường mới

1.2.2.3 Các phương thức nuôi cấy

Phương thức nuôi cấy đơn giản nhất là nuôi cấy theo mẻ batch culture ,trong đó tế bào được nuôi vài ngày cho tới khi sinh trưởng dừng lại Đây là hệthống nuôi cấy k n vì không cho thêm gì vào và cũng không lấy từ môi trường ramột chất gì Điều kiện chuẩn: mật độ tế bào trong môi trường là 1 5/cm3 và nuôitrong 3 ngày cho tới khi mật độ tế bào đạt 1 6/cm3 Trong khi nuôi cấy phải khuấylắc để huyền phù tế bào và chất dinh dưỡng phân bố đều trong môi trường Tuynhiên, môi trường sẽ ngh o dần chất dinh dưỡng và t ch lũy nhiều chất độc sảnphẩm chuyển hóa của tế bào do đó tế bào sẽ đi vào thoái hóa Người ta có thể kéodài thời gian nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trườngnuôi cấy theo thời gian để tế bào tiếp tục tăng sinh, nhưng đến một thời gian nhấtđịnh, sinh trưởng sẽ dừng lại vì môi trường đã t ch lũy quá nhiều chất độc nhưamoniac hay lactat,…

Để giải quyết vấn đề trên người ta tiến hành phương thức nuôi cấy liên tụccontinuous culture , trong đó môi trường luôn được đổi mới và các chất độc luônđược loại bỏ tương tự như trong cơ thể Có hai cách nuôi cấy liên tục: Cách thứ nhất

là dùng hệ thống tiếp liệu chất dinh dưỡng nhưng vẫn duy trì tế bào trong mẻ cấycho đến khi số lượng tế bào đạt 1 7/cm3 Cách thứ hai là đồng thời có thêm hệ thốngrút bớt môi trường cùng với tế bào ra khỏi mẻ cấy, như vậy hệ số tăng trưởng tếbào sẽ tỷ lệ với hệ số đổi mới dòng chảy vào và ra Một hệ cân bằng như vậy đượcgọi là hệ ổn hóa (chemostat), một dạng nồi lên men để nuôi cấy liên tục [11];[19]

1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

1.3 Nuôi cấy v tạ tế lai s a động vật

Trong các nghiên cứu in vivo, sự tạo thành tế bào lai soma là vô cùng hiếm.Tuy nhiên in vitro người ta có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, của các

mô khác nhau trong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng một loài,thậm ch người ta có thể nuôi cấy các tế bào giữa các loài khác xa nhau để tạo nên

tế bào lai soma hybridoma Năm 196 , lần đầu tiên, các tác giả arski, Sorieul,Cornefert thông báo là đã tạo được tế bào lai soma in vitro khi nuôi cấy trộn lẫn các

tế bào sarcoma của chuột thuộc hai dòng khác nhau Các dòng tế bào nuôi cấy khác

biệt nhau ở nhiều đặc điểm: Khả năng tạo thành u khi tiêm chúng vào chuột mang

t nh tương hợp mô và số lượng, hình thái nhiễm sắc thể của chúng cũng khác nhau Khi tế bào lai được hình thành từ các tế bào cùng một khởi nguồn, thì tế bào lai được gọi là tế bào đồng nhân Homocaryon – lai giả , còn khi các tế bào lai được nuôi cấy thuộc các cơ thể khác nhau về bậc phân loại khác nhau ta thu được tế bào lai dị nhân Heterocaryon – lai thật Như vậy, theo nghĩa đúng đắn thì heterocaryonmới thực sự là tế bào lai hybridoma Khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào thuộc hai loài khác nhau người ta vẫn có thể thu được tế bào lai một cách ngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần số rất thấp Vì vậy, để thu được tế bào lai dễ dàng với tần số cao hơn người ta thường phải sử dụng các nhân tố k ch th ch, thông thường người ta dùng hóa chất hoặc virut làm nhân tố k ch th ch Một số virut được sử dụng làm nhân tố

k ch th ch đã trở nên phổ biến là các virut chứa ADN nhóm virut Herpes, virut đậu mùa,… , các virut chứa ARN virut lợn, virut Niucatson, virut Sendai,… hoặc các virut gây ung thư virut Sarcoma Rous ,…

1.3 ông nghệ nhân ản vô t nh động vật

Nhân bản vô t nh là thuật ngữ được dùng để chỉ quá trình hình thành cơ thể

đa bào không bằng con đường sinh sản hữu t nh tự nhiên mà thông qua sự phát triểncủa tế bào soma bằng cách phân bào nguyên nhiễm và biệt hóa tế bào thành cơ thểtrong điều kiện nuôi cấy in vitro Đối với đa số động vật sinh sản hữu t nh thì kỹthuạt nhân bản có nhiều thủ thuật đặc biệt

1.3.2.1 Kỹ thuật chuyển nhân

Trong nhân của tế bào soma có chứa n NST, chứa hệ gen quy định nên tất

cả các t nh trạng của cơ thể giống như bộ NST của hợp tử Qua quá trình phát triển,

từ hợp tử sẽ phân bào và biệt hóa để cho ra các tế bào và mô khác nhau Quá trìnhbiệt hóa là thể hiện sự hoạt động biệt hóa trong hệ gen theo thời gian và không giancủa phôi đang phát triển dưới sự kiểm soát của các yếu tố nội bào và ngoại bào.Nhân còn t biệt hóa thì càng có nhiều tiềm năng biệt hóa, vì vậy sử dụng tế bào gốc

để nhân bản vô t nh là dễ thực hiện hơn so với tế bào đã biệt hóa ình thườngngười ta tách nhân từ tế bào cho tế bào soma và đem cấy chuyển vào tế bào trứngchưa thụ tinh đã bị lấy hoặc hủy nhân để tạo nên một tế bào n giống như hợp tử

chứa nhân của tế bào soma và tế bào chất của tế bào trứng Vì nhân n của tế bàocho đã biệt hóa đến một mức độ nhất định nào đó do tế bào chất của nó quy địnhphù hợp với thời gian và không gian phát triển của phôi Khi nhân này được cấychuyển vào tế bào chất của trứng là môi trường giống với hợp tử thì nhân sẽ tái biệthóa trở lại trạng thái như nhân của hợp tử và hệ gen của nó sẽ hoạt hóa theo đúngchương trình phát triển do các nhân tố của trứng điều khiển.

Những thành công của nhân bản vô t nh bằng cấy nhân được thực hiện ở ếch,bằng cách sử dụng nhân của các tế bào soma lấy ở giai đoạn phôi Năm 195 , lầnđầu tiên, hai nhà khoa học tai Philadelphia là R riggs và T King đã nhân bản vô

t nh con nòng nọc bằng kỹ thuạt chuyển cấy nhân từ tế bào phôi nang ếch Từ nhữngnăm

196 , J Gordon đã nhân bản vô t nh thành công con ếch trưởng thành từ nhân tế bàoruột nòng nọc và về sau là từ nhân của tế bào ruột ếch Đến nay đã thành công trongviệc nhân bản vô t nh nhiều động vật như cá và cả động vật có vú [11]

1.3.2.2 Nhân bản vô tính động vật có vú

Đối với động vật có vú là động vật thụ tinh trong và phôi phát triển trong dạcon của m dưới sự nuôi dưỡng qua nhau thai Vì vậy, kỹ thuật nhân bản vô t nhkhó khăn và phức tạp hơn các loài động vật khác rất nhiều Từ những năm 1960-

198 , các nhà khoa học đã thành công trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo nên phôi người và cấy chuyển phôi vào dạ con người m và sinh ra em bé được gọi là em bé sinh ra từ ống nghiệm Em bé đầu tiên là rown, 1978, tại Anh [11] Kết hợp kỹ thuật chuyển nhân với kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm từ 1983, người ta đã nhân bản thành công đối với chuột từ nhân lấy ở giai đoạn phôi nang, và

từ 1984 – 1986 đã thực hiện thành công ở bò, cừu,… từ nhân lấy ở giai đoạn phôi Trước năm 199 , các nhà khoa học cho rằng, đối với động vật có vú chỉ có thể nhân bản vô t nh thành công với nhân lấy từ giai đoạn phôi, còn đối với nhân của tế bào soma trưởng thành thì không thể thực hiện được vì t nh biệt hóa của chúng là không thể đảo ngược Tuy nhiên, sự kiện tháng 1997, khi báo ch công bố con cừu Dolly

ra đời ngày 5 tháng 7 năm 1996 bằng kỹ thuật nhân bản vô t nh với nhân lấy từ tế

bào tuyến vú của cừu m trưởng thành 6 năm tuổi do I Wilmut, Campbel và cộng

sự ở Viện Roselin Scottland thực hiện Tế bào được thu nhận từ sinh thiết tuyến

vú của một cừu cái giống Finn Dorset ở giai đoạn 3 tháng cuối của thai kỳ, lúc tếbào đang tăng sinh và biệt hóa Các tế bào này được nuôi cấy, sau đó được đưa vàomôi trường rất ngh o huyết thanh nhằm làm ngừng hoàn toàn chu kỳ tế bào Đồngthời, một trứng của cừu cái giống Scottish lackface Đầu đen có chu kỳ tế bàongừng ở kỳ giữa giảm phân II, bị hút bỏ bộ nhiễm sắc thể đơn bội cùng với thể cực

và một t tế bào chất, phần còn lại của trứng được chuyển vào môi trường nuôi cấy

ở 370C, hoạt hóa bằng một xung điện rồi cho kết hợp với tế bào tuyến vú của FinnDorset bằng một loạt xung điện khác Kết quả tạo thành một phôi Phôi này đượcđưa vào nuôi cấy tự nhiên trong ống dẫn trứng đã thắt của một cừu cái khác Khiphôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu hay phôi nang, chúng được cấy vào tử cungcủa cừu cái mang, từ phôi này phát triển thành cừu Dolly Điều đáng chú là trong

số 77 phôi được tạo ra ban đầu, đến giai đoạn phôi nang chỉ còn 9 và chỉ có 1trong số đó phát triển được thành cừu con Cừu Dolly đã sống được 6 năm tuổinhưng những phân t ch trên tế bào chứng minh rằng nó đã 1 năm tuổi [13]; [11]

1.3 3 Ứng ụng tr ng lĩnh vực y tế

1.3.3.1 Cấy ghép mô, cơ quan

Với công nghệ nuôi cấy tế bào, người ta đã nuôi cấy thành công gần như tất

cả mọi bộ phận trên cơ thể con người như mũi, tai, xương, gân, thậm ch cả tim,phổi, não trong phòng th nghiệm theo đơn đặt hàng từ các bệnh viện Giống nhưviệc sản xuất các phụ tùng thay thế của xe hơi hay máy vi t nh, giới khoa học gọiđây là "thuật giả kim phân tử của thế kỷ 1"

1.3.3.2 Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất:

Một hóa chất trị bệnh, trước khi được phép lưu hành, phải trải qua nhiềuthử nghiệm, trong đó có giai đoạn thử nghiệm trên động vật như chuột, thỏ,khỉ,… Các thử nghiệm này đã gặp phải sử phản đối kịch liệt của các phong tràobảo vệ động vật hoang dã, đồng thời những thử nghiệm này nhiều khi không thể

mở rộng trên người, th nghiệm lâu dài và tốn kém,… Vì vậy, người ta nghĩ rahướng sử dụng tế bào nuôi cấy làm mô hình thử nghiệm, khi có thể nuôi cấy bất

kỳ loại tế bào nào

1.3.3 3 Nuôi cấy tế tr ng độc chất học

Người ta có thể chủ động tạo ra các hư hại đặc trưng trên tế bào bằng cácchất độc, từ đó phát hiện ra các bào quan bị ảnh hưởng và xác định các cơ chế sinhhóa và phân tử của quá trình chuyển hóa chất độc

1.3.3.4 Nuôi cấy tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học

Tế bào động vật nuôi cấy cũng đã được ứng dụng trong việc sản xuất các chếphẩm sinh học Các vaccine virus sản xuất từ tế bào động vật nuôi cấy đã có nhữngđóng góp cho lĩnh vực y tế cộng đồng trên thế giới mà điển hình nhất là hiệu quảngừa bệnh đậu mùa và chứng bại liệt ở trẻ em, trong ngành thú y là vaccine ngừabệnh lở mồm long móng ở gia súc Để sản xuất vaccine, người ta cho nhiễm vànhân virus trong tế bào nuôi cấy để đạt đến mật độ tối đa Sau đó, virus được ly

tr ch và xử l bằng các tác nhân gây bất hoạt trước khi sử dụng làm vaccine [13]

1.4 Lịch sử ứng dụng nuôi cấy tế bào trong sản xuất vắc xin và sinh phẩm y

tế, khái niệm ngân hàng tế bào.

Có thể nói tế bào là đơn vị tổ chức cơ sở của vật chất sự sống về hình thái,sinh lý, sinh hóa và di truyền ổn định qua các thế hệ Nuôi cấy tế bào được sử dụngngay từ năm đầu thế kỷ 20 khi kỹ thuật nuôi cấy được nghiên cứu phát triển vàquan sát trên kính hiển vi

Năm 19 7, Ross Harrison đã lần đầu tiên nuôi cấy thành công tế bào thầnkinh ếch và mô tả quan sát trên kính hiển vi Kể từ đó, kỹ thuật nuôi cấy tế bàongày càng hoàn thiện, góp phần phát triển những ứng dụng của tế bào trong khoahọc, đặc biệt là sản xuất vắc xin và các chế phẩm sinh học Tế bào dùng để sản xuấtvắc xin và các chế phẩm sinh học được gọi là tế bào nền cell substrate Chúngđược đánh giá nghiêm ngặt cả về nguồn gốc và những yếu tố liên quan đến sự pháttriển của tế bào, vì nó có thể ảnh hưởng đến đặc tính và sự an toàn của sản phẩmcuối cùng Do đó, cần phải hiểu biết đầy đủ về đặc tính của các tế bào nguyên liệunhằm mục đ ch xác định các nguy cơ và xây dựng một hệ thống quản lý chất lượngngăn ngừa các nguy cơ đó [13]; [24]; [29]

Năm 1954, Enders và đồng tác giả đoạt giải Nobel về lĩnh vực y sinh học

khi phát hiện ra khả năng nuôi cấy vi rút bại liệt (poliomyelitis viruses) trên một số

mô tế bào khác nhau.

Năm 1954, WHO đã có những khuyến cáo đầu tiên cho tế bào dùng trongsản xuất vắc xin bại liệt bất hoạt từ tế bào thận khỉ tiên phát Những khuyến cáo đóđược xem xét và ban hành lại năm 1966 Sau đó, các tế bào tiên phát khác được sửdụng cho sản xuất các vắc xin vi rút.

Năm 196 , vắc xin Rubella được sản xuất khi nuôi cấy trên tế bào lưỡng bộingười Sau đó các tế bào lưỡng bội người được phát triển hướng tới thay thế các tếbào thận khỉ tiên phát để sản xuất vắc xin bại liệt, cũng như các vắc xin khác Docác tế bào này có đặc tính: Có thể bảo quản tế bào ở mức độ nhân đôi thấp; có thểthiết lập và mô tả đặc tính các ống tế bào được cất giữ mà sau này có thể mở rộng

để cung cấp nguồn tế bào tiêu chuẩn cho nhiều thập kỷ; đánh giá chất lượng các tếbào trước khi sử dụng trong sản xuất vắc xin; chứng minh được các tế bào không bịnhiễm các tác nhân ngoại lai và chúng không có khả năng tạo khối u khi tiêm vàođộng vật giảm miễn dịch Mặt khác, các tổ chức nhân đạo quốc tế và WHO cũngkhuyến cáo việc hạn chế sử dụng động vật cho việc nghiên cứu và sản xuất nếu cóthể có các phương pháp thay thế bằng nuôi cấy trên tế bào Do vậy, nhu cầu thực tế

về bảo quản, sử dụng và quản lý chất lượng tế bào Khái niệm về hệ thống ngânhàng giống gốc (MCB), ngân hàng làm việc (WCB) và sự mô tả đặc tính của các tếbào dùng làm nguyên liệu sản xuất cũng ra đời để đáp ứng [4]; [15]; [45]

Ngân hàng tế bào (Cell Bank): Là một tập hợp các ống thích hợp có chứathành phần đồng nhất và được cất giữ ở điều kiện tiêu chuẩn Mỗi ống là đại diệncho một phần chia đều của mỗi phần hộn đơn tế bào

Theo khuyến cáo của WHO, ngân hàng tế bào là nơi cất giữ tế bào được bảoquản trong các ống chuyên biệt Những tế bào này được chuẩn bị từ chỉ một mẻđồng nhất dưới điều kiện xác định và đã được kiểm tra các đặc tính

Ngân hàng tế bào giống gốc (Master Cell bank - MCB): Là một lượng tế bào

có đặc tính tốt, có nguồn gốc động vật hoặc nguồn gốc khác, được lấy từ tế bàogiống gốc ở mức độ nhân đôi hoặc số lần cấy chuyển xác định, được chia vào nhiềuống giống nhau, được giữ đông băng dưới điều kiện xác định, trong Nitơ ở trạngthái lỏng hoặc khí Ngân hàng tế bào giống gốc được chuẩn bị từ một hỗn dịch tếbào đồng nhất

Ngân hàng tế bào làm việc (Working Cell bank - WCB): Một lượng tế bào

có đặc tính tốt, có nguồn gốc động vật hoặc nguồn gốc khác, được lấy từ ngân hàng

tế bào giống gốc ở mức độ nhân đôi hoặc số lần cấy chuyển xác định, được chiavào nhiều ống giống nhau, được giữ đông băng dưới điều kiện xác định, trong khíhoặc Nitơ lỏng Ngân hàng tế bào làm việc được chuẩn bị từ một hỗn dịch tế bàođồng nhất Mỗi lần có thể sử dụng một hoặc nhiều ống

Thập niên 1970-1980: Tế bào ung thư người (Namalwa) được sử dụng làm

nguyên liệu để sản xuất IFN-α và các dòng tế bào thường trực có nguồn gốc độngvật được sử dụng để sản xuất các protein và kháng thể đơn dòng Chúng có khảnăng sinh trưởng tốt hơn và cho sản lượng lớn hơn so với các dòng tế bào lưỡngbội người và tế bào tiên phát [15;45]

Những năm , một số dòng tế bào thường trực được nghiên cứu để sản

xuất các loại vắc xin mới: HeLa cho vắc xin HIV, PER C6, 293ORF6 sử dụng chonghiên cứu và sản xuất vắc xin HIV, MDCK, tế bào Vero sử dụng sản xuất và kiểmđịnh nhiều loại vắc xin như; viêm não nhật bản B, vắc xin rota vi rút, vắc xin dại Gần đây hơn, các dòng tế bào từ côn trùng và tế bào gốc cũng được đề xuất để sảnxuất các chế phẩm sinh học và các tế bào này đưa ra các thách thức mới để đánhgiá và mô tả chúng

1.5 Dòng tế bào Vero

Tế bào vero có nguồn gốc từ thận của một con khỉ xanh Châu Phi

(Cercopithecus trưởng thành vào 27/03/1962 bởi Y Yasumura và Y Kawakita

tại đại học Chiba- Nhật Bản và được công bố trên tạp chí Nippon Rinsho1:1 9 năm 1963 Sau đó, dòng tế bào này được cấy chuyền tại phòng thí nghiệm vi rút học nhiệt đới, NIAID, NIH bởi tiến sỹ Simizu vào tháng 6 năm

1964 và hoàn thiện hồ sơ chất lượng và quy trình nuôi cấy có huyết thanh bàothai bê Tế bào Vero nhạy cảm và phù hợp cho việc gây nhiễm với các loại virút; SV-40, SV-5, sởi, rubella, bại liệt, arboviruses, reoviruses, simianadenoviruses, cúm, parainflenza, đậu mùa…[26]; [45]

Tế bào Vero được phát triển và công bố bởi cơ quan quản lý thuốc và thựcphẩm (FDA) Mỹ là dòng tế bào ATCC ở đời thứ 113 và được sử dụng cấy chuyển

đến đời ATCC 1 1 để sử dụng thiết lập thiết lập ngân hàng tế bào Vì vậy, hầu hếtcác nhà sản xuất vắc xin đều sử dụng tế bào đời cấy chuyền từ 130-14 để pháttriển thiết lập MCB và WCB nuôi cấy sản xuất và kiểm định vắc xin Hiện naydòng tế bào Vero được sử dụng phổ biến nhất để nuôi cấy sử dụng trong sản xuất

và kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm trên thế giới được WHO khuyến cáo

là dòng tế bào (Vero 76, ATCC- CRL-1587 như hình 1.2) [38]; [42; [44]

Hình 1.2 Hình ảnh tế bào vero trong ôi trường nuôi cấy MEM 10%FBS

Lý do tế bào vero được sử dụng nhiều và thay cho tế bào thận khỉ tiên phát

là do nó có thể xây dựng ngân hàng tế bào và có t nh đặc hiệu tốt, cấu trúc nhân vàhình dạng ổn định, không biến động khi đánh giá từng loạt và khả năng thấp bịnhiễm các yếu tố ngoại lai trong quá trình nuôi cấy sơ cấp Ngoài ra, việc sử dụngcác tế bào tiên phát từ động vật còn vướng vào các vấn đề về đạo đức và kinh tếtrong nghiên cứu và phải trải qua nhiều qui định của quốc tế phức tạp hơn Mặtkhác, tế bào vero cũng được sử dụng để thay thế cho tế bào lưỡng bội trong nghiêncứu và sản xuất các sản phẩm y sinh học vì nó khả năng sinh trưởng tốt hơn, chosản lượng vi rút nhiều hơn Đây ch nh là yếu tố quan trọng cho việc ứng dụng sửdụng tế bào vero để sử dụng nghiên cứu phát triển sản xuất vắc xin (giảm thiểu sựlây nhiễm mảng tế bào), sản lượng vắc xin nhiều hơn, tạo lợi ích kinh tế khi sảnxuất vắc xin, đó cũng ch nh là l do ch nh mà hầu hết các nhà sản xuất đề xuất với

cơ quan đánh giá và nghiên cứu sinh học mỹ C ER để sử dụng Vero trong sảnxuất vắc xin [31;33;34].

Năm 14, các nhà khoa học Nhật Bản đã giải mã toàn bộ bộ gen của tế bàovero cho thấy nhiễm sắc thể số 12 của tế bào vero bị mất một đoạn gene khoảng9Mb, chứa gen mã hóa tổng hợp interferon Do đó, trong quá trình nuôi cấy và sinhsản nó không tạo interferon alpha hoặc beta khi gây nhiễm vi rút phù hợp cho việcnhiên cứu và sản xuất thuốc, vắc xin và sinh phẩm y tế

1.6 Hướng dẫn WHO thiết lập mẫu chuẩn quốc gia dùng cho kiểm định

MCQG được thiết lập theo hướng dẫn của WHO (WHO TRS 932 phần 3),

do cơ quan KĐQG làm đầu mối nghiên cứu phối hợp với các nhà sản xuất trongnước sản xuất, đánh giá chất lượng so sánh song song với MCQT với các tiêu chíchất lượng như sau:

- Phương pháp điều chế: Điều thiết yếu đầu tiên là t nh đồng nhất và thànhphần của mẫu chuẩn phải giống với mẫu thử nghiệm Khi dùng chất bảo quản nênchọn loại không làm ảnh hưởng đến chế phẩm khi đông khô chất bảo quản thườngdùng là thimerosal) Những chất thêm vào hay chất pha loãng chế phẩm đều chọnchất không gây giảm hoặc ảnh hưởng đến hoạt tính

- Đóng ống: mẫu chuẩn có thể được đóng vào ống hay lọ thủy tinh trung tínhsẫm màu và dập nút cao su Trong quá trình đóng ống phải chú ý đến t nh đồng nhấtgiữa các ống nên đóng ống từ một lô bán thành phẩm và trong điều kiện thực hiệnnhư nhau Nhiệt độ và tốc độ khuấy trong quá trình đóng ống phải ổn định Cần chú

ý các yêu cầu về tính chất của lọ hay ống thủy tinh như độ trung t nh, độ dày, màusắc, số lượng sản phẩm có trong ống phải phù hợp cho việc sử dụng

- Các tiêu chuẩn về chất lượng:

 Hàm lượng đóng ống trong mỗi đơn vị đóng ống mẫu chuẩn: Ít nhất đủ cho một lần kiểm định công hiệu

 Số lượng phải đủ dùng ít nhất từ 5-1 năm cho cả KĐQG và labo kiểmđịnh tại nhà sản xuất

 Hạn dùng của mẫu chuẩn tối thiểu trên 10- năm

 Đạt các tiêu chuẩn xuất xưởng như thông thường theo qui định

Yêu cầu trước hết đối với mẫu chuẩn là phải đảm bảo chất lượng đối với mộtsản phẩm xuất xưởng bao gồm: Tính vô khuẩn, tính an toàn, hiệu quả, tính chất hóa

l … Đây là điều cơ bản bắt buộc đối với bất kỳ một mẫu chuẩn nào trước khi sửdụng Trong đó t nh vô khuẩn là một trong những điều kiện hết sức quan trọng chotính ổn định lâu dài của sản phẩm Tính an toàn có nghĩa là vắc xin đó không gâyđộc cho động vật thử nghiệm Tính chất hóa lý là yếu tố quan trọng của vắc xinđảm bảo bản chất kháng nguyên của vắc xin không bị thay đổi Công hiệu là yếu tố

k ch th ch cơ thể sinh miễn dịch chủ động sau khi sử dụng vắc xin Đây là yếu tốquan trọng nhất, quyết định chất lượng của vắc xin [2;15;28;40]

 Đạt yêu cầu t nh đồng nhất giữa các ống

Thử nghiệm t nh đồng nhất là yêu cầu cần thiết đầu tiên sau khi đóng ốnggiữa các lọ vắc xin là tương đương nhau và dao động trong giới hạn cho phép nhấtđịnh Sự đồng nhất này sẽ là yếu tố quan trọng đảm bảo cho sự ổn định trong cácthử nghiệm về hiệu lực của mẫu chuẩn

 Đạt yêu cầu về tính ổn định chất lượng theo thời gian

Một trong những yêu cầu quan trọng là tính ổn định về hiệu quả hay hiệu lực.Việc nghiên cứu tính ổn định của mẫu chuẩn có thể xác định được mẫu chuẩn cóhiệu quả ổn định qua thời gian bảo quản Qua đó ta có thể ước t nh được thời gian

sử dụng, lưu trữ và phân phối tới các phòng thí nghiệm hợp lý góp phần chủ độngtrong công tác kiểm định vắc xin

1.7 Hướng dẫn của WHO thiết lập và đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào dùng cho sản xuất và kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm

WHO khuyến cáo các quốc gia có nền sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tếchủ động thiết lập ngân hàng tế bào MC và WC để chủ động trong công tác

nghiên cứu, phát triển sản xuất và kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tếđạt tiêu chuẩn theo khuyến cáo của WHO TRS No.978 phần 3, 2013 và WHO TRS

No 923, phần 3, 2006 và các tiêu chuẩn tương đương như FDA, dược điển ChâuÂu theo các điều kiện sau:

* Cơ quan kiểm định quốc gia (NRA) phải có trách nhiệm nghiên cứu, thiếtlập ngân hàng tế bào chuẩn (MCB và WCB) Bảo quản hồ sơ chất lượng, giám sátchất lượng và tính ổn định của tế bào, phân phối tế bào cho các cơ sở sản xuất vàkiểm định trong cả nước

* Cơ sở hạ tầng: Cơ sở hạ tầng, trang thiết bị và vật liệu, hóa chất môi trườngdùng cho việc nuôi cấy, bảo quản và đánh giá chất lượng tế bào đạt yêu cầu về chấtlượng và an toàn sinh học, các kỹ thuật đánh giá chất lượng tế bào phải được thẩmđịnh, các qui trình (SOPs) thực hiện kỹ thuật phải tuân thủ qui định của GMP vàGLP và được cơ quan NRA công nhận [8;9;42]

* Nguồn gốc tế bào gốc giống dùng cho thiết lập ngân hàng tế bào: Các tếbào gốc giống phải có hồ sơ chất lượng nguồn gốc từ ATCC của Anh (NIBSC)hoặc JCM của Nhật Bản và có giấy chứng nhận chất lượng (COA) rõ ràng, có hồ

sơ nhà cung cấp ống gốc giống sử dụng để thiết lập ngân hàng tế bào

* Qui trình thiết lập ngân hàng: Qui trình thiết lập cụ thể từng bước đối vớiMCB và WCB số lượng phải đủ lớn để sử dụng cho việc đánh giá chất lượng, tính

ổn định các ống tế bào, t nh đồng nhất WHO qui định tối thiểu MCB ít nhất 200ống và WCB ít nhất 350 ống tế bào)

* Kiểm định chất lượng tế bào

Qui trình kiểm tra chất lượng ngân hàng tế bào (MCB và WCB dùng cho sảnxuất và kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế như sau:

1.7.1 Thử nghiệm nhận dạng

Phương pháp: Kiểm tra nhận dạng đặc hiệu tế bào vero bằng phương phápxác định trực tiếp PCR với mồi đặc hiệu trên trình tự DNA người cho tế bào vero.Thử nghiệm có giá trị: Mẫu dương t nh phải xuất hiện, mẫu âm tính khôngxuất hiện băng tương ứng với k ch thước của mồi bp và băng marker DNA phải

r nét khi điện di trên thạch agarose 3%

Tiêu chuẩn: Kết quả PCR tương đương với mẫu chuẩn dương khi điện ditrên thạch agarose 3%, kết quả giải trình tự DNA tương đồng với kết quả so sánhtrên ngân hàng gene đối với tế bào vero 76 ATCC-CRL1587 [48].

Tiêu chuẩn: Lượng tế bào sống ≥90% so với khi cất giữ (nồng độ 2x106tb/ml/ống)

1.7.4 nh đồng nhất giữa các ống tế bào

Đảm bảo độ tin cậy và ổn định trong quy trình sản xuất vắc xin và sản xuất

WC sau này, thì t nh đồng nhất giữa các ống tế bào của MCB, WCB rất quantrọng vì nếu không các WCB sản xuất từ MC cũng như các loạt sản xuất vắcxintrên tế bào sẽ không ổn định

T nh đồng nhất giữa các ống tế bào được thể hiện trên kết quả kiểm tra độsống và đặc tính phát triển hình thái, độ sống, thời gian nhân đôi tế bào) với sốlượng ống tế bào lấy ngẫu nhiên trong giai đoạn đầu-giữa-cuối trong quá trìnhchia tuýp khi cất và sau khi cất đông tế bào trong nitơ lỏng)

Phương pháp: Kiểm tra độ sống ít nhất 6 ống tế bào ngẫu nhiên và so sánh

độ đồng đều về độ sống giữa các ống tế bào, đặc tính phát triển và tính chất nuôicấy các ống tế bào tại mỗi thời điểm đầu-giữa-cuối qui trình phân ống tế bào

Tiêu chuẩn: Số lượng tế bào sống giữa các ống tế bào đạt ≥ 9 % nồng độ 2x106tb/ống/ml nằm trong khoảng ±2SD, và đặc tính phát triển và tính chất nuôi cấy làđặc trưng tế bào vero

r nét khi điện di trên thạch agarose 3%.

Tiêu chuẩn: Thử nghiệm đạt yêu cầu khi không phát hiện mycoplasma trongmẫu

1.7.6 Thử nghiệm kiểm tra các tác nhân ngoại lai

1.7.6.1 Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột nhắt trưởng thành:

Mục đ ch: Phát hiện các vi rút gây độc ngoại lai nhiễm vào tế bào như vi rútviêm màng não mủ, coxsackieviruses, flaviviruses, và vi rút Dại

Phương pháp: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên động vật thí nghiệm với tỷ lệ tếbào 1x107 tế bào/ ml/10ml trên số lượng chuột 10 con trọng lượng 15-20gram/chuột

Liều tiêm Đường tiêm/số lượng chuột: 0,5ml/ổ bụng/10 con và 10 con/nhómchứng sau đó theo dõi 3 tuần (21 ngày)

Tiêu chuẩn: ≥ 8 % chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bện lý

1.7.6.2 Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột lang:

Mục đích: Phát hiện các vi rút ngoại lai và vi khuẩn lao

Phương pháp: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên động vật thí nghiệm với tỷ lệ tếbào 1 x 107 tế bào/ml/40ml với số lượng chuột 5 con với trọng lượng 350-450gram/chuột sau đó theo d i 4 ngày

Liều tiêm Đường tiêm/số lượng chuột: 5 ml/ổ bụng/con

Tiêu chuẩn: ≥ 8 % chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý

1.7.6.3 Kiểm tra các tác nhân ngoại lai trên trứng gà có phôi:

Mục đ ch: Phát hiện các tác nhân gây nhiễm tế bào trong quá trình nuôi cấy

và gặt là các loại vi rút cúm, sởi, quai bị…

Phương pháp: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên trứng gà có phôi với tỉ lệ tế bào

1 x 107 tế bào/ml/10ml với số lượng trứng gà có phôi là 10 quả 10-11 ngày tuổi

Liều tiêm: 0,5 ml/quả.

Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy: Điều kiện 36±1oC/72h

Tiêu chuẩn đánh giá: ≥ 8 % phôi gà sống sau 72h theo dõi và dịch niệu không

có vi rút ngưng kết hồng cầu gà

1.7.7 Kiểm tra phát hiện vi khuẩn lao

Phương pháp: Nuôi cấy 1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trên môi trườngLowenstein Jenssen ở điều kiện 36±1oC trong thời gian 28 ngày Nhuộm Zielh-Neelsen và quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu để phát hiện sự có mặt trựckhuẩn Lao

Tiêu chuẩn: Không phát hiện vi khuẩn lao trong mẫu thử

1.7.8 Kiểm tra tính ổn định của ngân hàng tế bào MCB và WCB theo thời gian khi bảo quản ở điều kiện tối ưu -70 0 C

Phương pháp: Kiểm tra độ sống ngân hàng tế bào MCB và WCB khi bảoquản ở nhiệt độ tối ưu -700C theo thời gian sau sản xuất 3 tháng; 6 tháng; 12 tháng.Tại mỗi thời điểm thử nghiệm được lặp lại 6 lần có so sánh kết quả với mẫu chuẩnquốc tế [9;10;14;16]

Tiêu chuẩn: Tại mỗi thời điểm số lượng tế bào sống trên mỗi ống tế bào ≥90% so với lúc sản xuất (2x106 tb/ống/1ml)

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Đối tượng

Ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B do ViệnKiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế sản xuất tháng 10/2017 với sốlượng NICVB-MCB01-18A: 280 ống và NICVB-WCB01-18B: 1600 ống đưa vàonghiên cứu đánh giá chất lượng theo các tiêu chuẩn của WHO TRS 978, phần 3

 Địa điểm

Đề tài được thực hiện tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y

tế và Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện 10/2017-12/2018

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đề ra, các nội dung nghiên cứu chínhbao gồm:

- Xây dựng quy trình chuẩn Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bàovero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế’’ đạt tiêu chuẩn theo quy địnhcủa WHO TRS No.978 phần 3

- Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A vàNICVB-WCB01-18B với các thử nghiệm sau:

+ Nhận dạng đặc hiệu tế bào vero (MCB và WCB)

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Mẫu chuẩn và mẫu thử

- Ngân hàng tế bào vero 76 chuẩn gốc giống NICVB-MCB01-18A: 30 ống (2x106tb/ống/ml)

- Ngân hàng tế bào vero 76 chuẩn làm việc NICVB-WCB01-18B: 100 ống (2x106tb/ống/ml)

- Tế bào Vero chuẩn quốc tế ATCC 76 (ATCC CRL-1587): 5 ống

- Trình tự Nucleotide tế bào vero chuẩn quốc tế NIBSC ATCC CRL-1587 trên ngân hàng Genbank (NCBI) mã số: L13119

- Tế bào MDBK ATCC CCL-10 chủng làm việc: 5 ống (2x106 tb/ống/ml)

- DNA của chủng Mycoplasma pneumoniae ATCC 29342: 01 ống (100ng/ml)

2.3.2 Các sinh phẩm, hóa chất:

- Truseq Strand mRNA LT set A hoặc B (RS-122-2101 hoặc RS-122-2102)

- EpiScreipt Reverse Transcriptase (ERT12910K)

- RNA clean & Concentrator-5 (R1015)

- Miseq Reagent Kit (MS-102-2002)

- Library Quantification Kit – Illumina (KK4824)

- Các viên bi từ tính (Ampure Bead)

- Kit real-time RT-PCR Invitrogen

- Kit tách chiết DNA và ARN Qiagen, Đức)

- Bộ sinh phẩm PCR Qiagen, Đức)

- Dung dịch AMPure XP bead ở 2-80C

- Hóa chất điện di DNA

- Bộ thuốc nhuộm Zeihl Neelsen (Nam Khoa)

- Tế bào Vero (ATCC, CRL-1587)

- Môi trường MEM 2%FBS

- Neutral Red (mp- bio, 1023438)

- Dung dịch phủ thạch MEM 2X

- Agarose ME (Nisui-Nhật bản)

- Eagle MEM (Wako –Nhật bản)

2.3.3 Các thiết bị chính

- Máy PCR (Applied Biosystem, Mỹ mã PC 04 VR)

- Máy PCR real-time 7500 FAST (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy đo nồng độ DNA (Nanodrop- Thermo, Mỹ)

- Máy giải trình tự gen thế hệ mới (Illumina platform, Mỹ)

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12-Sacase Biotechnology

- Giá từ (Thermo, Mỹ)

- Pipetman đơn các loại 50 µl, 100-200µl, 1000 µl, 5000 µl (Gilson): mãGG29329, EJ87599, EG53274, 467106

- Máy lắc JK Mã : VT 03 VR/ Thermo VT 04 VR

- Pipet aid Model 4-000-220, USA

- ơm chân không Gallekamp mã VP 1 VR

- Bể ổn nhiệt (Shel - Lab) mã WB 03 VR

- Máy đo pH Themor) mã pH-14 VR

- Tủ cấy vô trùng (Nuaire) mã LH 06 VR

- Cân phân t ch độ nhạy 1g Sartorius, Đức)

- Kính hiển vi quang học (Olympus SZ61, Nhật Bản)

- Bộ lọc 1lít có đường kính màng lọc , μm

- Tủ ấm CO2 Astec SCA-165DS

- Tủ lạnh SANYO 2-80C

2.3.4 Các dụng cụ và nguyên vật liệu khác

- Phiến nhựa 96 giếng (Nunc)

- Phiến nhựa 6 giếng (Nunc)

- Phiến pha loãng (Nunc)