Nghiên cứu một số chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học kháng vi khuẩn khử sulfate nhằm ứng dụng chống ăn mòn và nâng cao chất lượng dầu

NGUYỄN THANH BÌNH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SINH HỌC KHÁNG VI KHUẨN KHỬ SULFATE NHẮM ỨNG DỤNG CHỐNG ĂN MÕN VÀ NÂNG CAO CHẤT LƢỢN

NGUYỄN THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SINH HỌC KHÁNG VI KHUẨN KHỬ SULFATE NHẮM ỨNG DỤNG CHỐNG ĂN MÕN VÀ NÂNG CAO CHẤT LƢỢNG DẦU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SINH HỌC KHÁNG VI KHUẨN KHỬ SULFATE NHẮM ỨNG DỤNG CHỐNG ĂN MÕN VÀ NÂNG CAO CHẤT LƢỢNG DẦU

Chuyên ngành: Động vật học (Vi sinh vật học)

Mã số: 8 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Kiều Thị Quỳnh Hoa

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu sử dụng trong luận văn này là trung thực vàchưa được nhóm nghiên cứu nào khác công bố dưới bất kỳ hình thức nào.Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánhgiá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tàiliệu tham khảo

Tác giả

Nguyễn Thanh Bình

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô Khoa đào tạo sau đại học, ViệnSinh thái và Tài nguyên sinh vật Đặc biệt là các thầy cô chuyên ngành Vi sinhvật học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Vi sinh vậtdầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi hoànthành luận văn tốt nghiệp đúng thời hạn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những ngườithân luôn bên cạnh động viên và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành tốt luậnvăn

Hà Nội, ngày …tháng… năm 2018

Nguyễn Thanh Bình

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG .

vi DANH MỤC HÌNH

vii PHẦN 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Vai trò của ngành công nghiệp dầu khí 4

1.2 Vi khuẩn khử sulfate (KSF) 5

1.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn khử sulfate đến quá trình ăn mòn thiết bị bằng kim loại và chất lượng dầu trong công nghiệp dầu khí

6 1.4 Các phương pháp hạn chế vi khuẩn khử sulfate thường dùng trong công nghiệp dầu khí 8

1.5 Chất hoạt động bề mặt sinh học 10

1.5.1 Khái niệm chất hoạt động bề mặt sinh học 10

1.5.2 Phân loại chất hoạt động bề mặt sinh học 10

1.5.3 Tính chất của chất hoạt động bề mặt sinh học 12

1.5.4 Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học 14 1.5.5 Ứng dụng của chất hoạt động bề mặt sinh học 15

1.6 Khả năng kháng vi khuẩn gây hại của chất hoạt động bề mặt sinh học tạo ra từ vi sinh vật 15

1.7 Tình hình nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn khử sulfate bằng chất hoạt động bề mặt sinh học tạo ra từ vi sinh vật 16

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19 2.1 Vật liệu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi sinh vật nghiên cứu 20

2.2.2 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH bằng chỉ số nhũ hóa

E2421

2.2.3 Sàng lọc tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp CHĐBMSH có

2.2.4 Xác định đặc điểm sinh hóa của chủng nghiên cứu bằng kít chuẩn sinhhóa API 222.2.5 Phân loại chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phân tích trình tự gen16S rRNA 222.2.6 Nuôi cấy và làm giàu vi khuẩn KSF 232.2.7 Xác định hàm lượng sulfide 232.2.8 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợpCHĐBMSH của chủng vi khuẩn lựa chọn 242.2.9 Nghiên cứu động thái sinh trưởng và sự sinh tổng hợp CHĐBMSH từchủng lựa chọn 242.2.10 Lên men, tách chiết CHĐBMSH 252.2.11 Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tạo ra từchủng vi khuẩn lựa chọn 25

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bềmặt sinh học cao 273.2 Sàng lọc tuyển chọn chủng vi sinh vật tổng hợp CHĐBMSH ức chế vikhuẩn khử sulfate 283.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và đặc điểm sinh hóa củachủng vi khuẩn 310-RP3-1 293.4 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chất hoạtđộng bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn lựa chọn 323.5 Động thái sinh trưởng và hiệu quả sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặtsinh học của chủng vi khuẩn lựa chọn 41

3.6 Khả năng ức chế vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tạo ra từ chủng vi khuẩnlựa chọn 42

KẾT LUẬN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại CHĐBMSH theo nguồn gốc VSV [36] 11Bảng 3.1 Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của các chủng vi khuẩn và 27Bảng 3.2 Khả năng ức chế vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tổng hợp bởi 10chủng VSV nghiên cứu 29Bảng 3.3 Kết quả các phản ứng sinh hoá của kit chuẩn API 50 CHB của chủng310-RP3-1 31Bảng 3.4 Động thái sinh trưởng và hiệu quả sinh tổng hợp CHĐBMSH củachủng 310-RP3-1 41Bảng 3.5 Ảnh hưởng của CHĐBMSH nghiên cứu lên sinh trưởng và phát triển

của chủng vi khuẩn KSF D vulgaris DSM644 theo thời gian 43

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của CHĐBMSH nghiên cứu lên sinh trưởng và phát triển

của chủng vi khuẩn KSF Desulfovibrio sp RP3-303 theo thời gian 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh mô phỏng quá trình ăn mòn kim loại của vi khuẩn KSF 7Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng 310-RP3-1 30Hình 3.2.Chủng 310-RP3-1 sau khi sốc nhiệt (80oC, 15 phút) 30Hình 3.3 Hình thái tế bào của chủng 310-RP3-1 dưới kính hiển vi điện tửquét 30Hình 3.4 Vị trí phân loại của chủng vi khuẩn 310-RP3-1 32

Hình 3.5 Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-1

trên các nguồn carbon khác nhau 33

Hình 3.6 CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-1 với nguồn carbon 33 Hình 3.7 Khả năng sinh tổng hợp của chủng B subtilis 310-RP3-1 với các nồng

độ glucose khác nhau 34

Hình 3.8 CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-1 với các nồng độ glucose

khác nhau 34

Hình 3.9 Khả sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-1 với

các nguồn nitơ khác nhau 35

Hình 3.10 CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-1 với các nguồn nitơ

khác nhau 35

Hình 3.11 Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B subtilis

310-RP3-1 với các nồng độ NaNO3 khác nhau 37

Hình 3.12 CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-1 với các nồng độ

NaNO3 khác nhau 37

Hình 3.13 Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B subtilis

310-RP3-1 với các giá trị pH khác nhau 38

Hình 3.14 CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-1 với các giá trị pH 38 Hình 3.15 Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-

1 với các nhiệt độ khác nhau 40

Hình 3.16 CHĐBMSH của chủng B subtilis 310-RP3-1 với các nhiệt độ 40

Hình 3.17 Động thái sinh trưởng và hiệu quả sinh tổng hợp CHĐBMSH củachủng 310-RP3-1 theo thời gian 41

Hình 3.18 Ảnh hưởng của CHĐBMSH nghiên cứu lên sinh trưởng và phát triển

của chủng vi khuẩn KSF D vulgaris DSM644 theo thời gian 43

Hình 3.19 Ảnh hưởng của CHĐBMSH nghiên cứu lên sinh trưởng và phát triển

của chủng vi khuẩn KSF Desulfovibrio sp RP3-303 theo thời gian 44

MỞ ĐẦU

Dầu khí là ngành công nghiệp mũi nhọn, mang lại nguồn lợi to lớn chonền kinh tế của nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam Tuy nhiên, trênthực tế, sản lượng dầu thu được từ khai thác sơ cấp (tự phun bằng chính nănglượng tự nhiên của vỉa) chỉ chiếm phần rất nhỏ tổng lượng dầu khai thác.Nguyên nhân là do độ nhớt, sức căng bề mặt làm cho tính thấm và linh độngcủa dầu mỏ thấp, dẫn đến sản lượng dầu khai thác chưa cao Do đó, việc khaithác dầu thứ cấp (bơm ép nước biển hay nén khí vào giếng khoan để duy trì ápsuất vỉa) nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi dầu đang được ứng dụng rộng rãi

Các nghiên cứu trước đây cho thấy, vi khuẩn khử sulfate (KSF) là mộttrong những nhóm vi khuẩn xuất hiện phổ biển trong nước biển Khi nước biểnđược sử dụng để bơm ép vào lòng vỉa, các vi sinh vật (VSV) gặp điều kiệnthuận lợi sẽ phát triển tạo thành các màng biofilm gây bít nhét vỉa, làm giảmkhả năng tiếp nhận nước bơm ép Vi khuẩn KSF sinh ra khí H2S không chỉ làtác nhân gây ăn mòn, phá hỏng hệ thống đường ống, làm tắc các thiết bị khoan

và bơm ép nước mà còn làm thối dầu, gây khó khăn cho việc tách nước từ dầu

và làm giảm chất lượng dầu dẫn đến cản trở việc thu hồi dầu Hơn nữa, khí H2Scòn gây độc hại trực tiếp tới con người và sinh vật sống

Do đó, bên cạnh việc tìm kiếm các giải pháp để nâng cao hiệu suất khaithác dầu, các công ty dầu khí trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang tăngcường các biện pháp diệt vi khuẩn KSF, nhóm vi khuẩn gây tác hại nghiêmtrọng đến quá trình khai thác, vận chuyển cũng như lưu trữ dầu làm giảm chấtlượng và giá trị thương mại của dầu

Hàng năm, nhu cầu sử dụng chất diệt khuẩn trong ngành khai thác dầukhí là rất lớn Đối với các đơn vị khai thác trong nước, chỉ tính riêng tại Liêndoanh dầu khí Việt-Nga (Vietsovpetro) mỗi năm sử dụng hàng trăm tấn chấtdiệt khuẩn cho nước bơm ép Các chất diệt khuẩn được sử dụng để ức chế vi

khuẩn nói chung và vi khuẩn KSF nói riêng thường được tổng hợp từ các hợpchất hóa học như chloride, glutaraldehyde, isothiazolones, formaldehyde và cácmuối amoni bậc bốn Các hợp chất này rất độc hại đối với con người và hệ sinhthái, gây ức chế sự sinh trưởng và trao đổi chất của sinh vật sống Vì vậy, việctìm kiếm các “chất diệt khuẩn xanh” (green biocides) có nguồn gốc từ VSVhiệu quả và thân thiện với môi trường đang thu hút được sự quan tâm nghiêncứu của các nhà khoa học trên thế giới.

Trong công nghiệp dầu khí, người ta thường sử dụng các chất hoạt động

bề mặt sinh học (CHĐBMSH) từ VSV có khả năng phân hủy dầu để nâng caohiệu suất thu hồi dầu tam cấp thay cho các chất hoạt động bề mặt hóa học đắttiền, độc hại với môi trường sống và con người Một ứng dụng tiềm năng nữacủa CHĐBMSH sinh tổng hợp từ VSV phải kể đến là khả năng kháng khuẩn.Trên thế giới, đã có các công trình công bố về khả năng kháng khuẩn của

CHĐBMSH sinh tổng hợp từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, B licheniformis,…), nấm men (Candida albicans, C bombicola,…), hay xạ khuẩn (Streptomyces

lunalinharesii…) Các CHĐBMSH này đã được ứng dụng trong y dược và công

nghiệp thực phẩm, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, đồng thời ức chế

ngăn chặn sự kết dính và tạo màng sinh học của các nhóm vi khuẩn gây hại (E.

coli, Staphylococcus aureus…).

Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn đề cập ở trên, đề tài luận văn

“Nghiên cứu một số chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động

bề mặt sinh học kháng vi khuẩn khử sulfate nhằm ứng dụng chống ăn mòn

và nâng cao chất lượng dầu” mở ra hướng nghiên cứu trong việc tạo

CHĐBMSH kháng vi khuẩn KSF nhằm ứng dụng chống ăn mòn và nâng caochất lượng dầu Kết quả thu được từ đề tài luận văn có ý nghĩa khoa học và thựctiễn nhằm ứng dụng trong công nghiệp dầu khí

 Mục tiêu nghiên cứu

Lựa chọn chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặtsinh học kháng vi khuẩn khử sulfate nhằm ứng dụng chống ăn mòn và nâng caochất lượng dầu

 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Sàng lọc tuyển chọn một số chủng VSV tạo CHĐBMSH

kháng vi khuẩn KSF

Nội dung 2: Phân loại chủng VSV lựa chọn

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng tạo

CHĐBMSH kháng vi khuẩn KSF của chủng lựa chọn

Nội dung 4: Lên men và thu nhận CHĐBMSH kháng vi khuẩn KSF Nội dung 5: Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn KSF của CHĐBMSH

kháng vi khuẩn KSF lựa chọn

PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 Vai trò của ngành công nghiệp dầu khí

Dầu khí đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, cũng như đốivới từng quốc gia Ngành dầu khí luôn là ngành mũi nhọn của các quốc gia xuấtkhẩu dầu mỏ, cung cấp nguồn nguyên liệu quan trọng cho xã hội hiện đại, đặcbiệt là để sản xuất điện và nhiên liệu cho các phương tiện giao thông vận tải.Ngành dầu khí còn cung cấp đầu vào cho các ngành công nghiệp khác như: côngnghiệp hóa chất, phân bón và nhiều ngành khác - trở thành ngành năng lượngquan trọng, cần thiết đối với đời sống xã hội Ngành dầu khí mang lại lợi nhuậnlớn cho các quốc gia sản xuất, chế biến và xuất khẩu dầu khí Trong quá trìnhcông nghiệp hóa và hiện đại hóa, ngành dầu khí đóng vai trò quan trọng và đemlại ý nghĩa to lớn cho nền kinh tế nước ta

Ngành công nghiệp dầu khí Việt Nam (PVN) luôn duy trì vai trò là đầutàu kinh tế của đất nước, trong khi khối doanh nghiệp Nhà nước đóng gópkhoảng 42% GDP của cả nước, riêng PVN đã chiếm khoảng 20 - 26% GDP,mức cao nhất so với cả nước trong giai đoạn 2008 – 2015 Vài năm trở lại đây,

dù đang phải đối diện với nhiều khó khăn, đặc biệt trong bối cảnh giá dầuxuống thấp, kinh tế thế giới có nhiều biến động, PVN vẫn đóng góp trên 10%ngân sách

Sự phát triển của ngành dầu khí còn góp phần bảo đảm môi trường tăngtrưởng và giải quyết việc làm, an sinh xã hội Đặc biệt sự phát triển khai thácdầu khí trên biển, đã góp phần quan trọng khẳng định chủ quyền lãnh hải ViệtNam Các nguồn lực đem lại từ phát triển ngành dầu khí giúp cân đối vĩ mô,thúc đẩy tăng trưởng chung của cả nền kinh tế Tuy nhiên, sau nhiều năm đưavào khai thác và sử dụng, hệ thống trang thiết bị phục vụ ngành dầu khí đã vàđang xuống cấp nghiêm trọng PVN đã phải tiêu tốn không ít tiền bạc cho việcsửa chữa, thay mới Không những thế ngành công nghiệp dầu khí trên thế giới

nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang phải đối mặt với việc chua hóa dầu,đặc biệt là tình trạng ăn mòn các hệ thống máy móc thiết bị bằng kim loại sửdụng trong khai thác, vận chuyển và dự trữ dầu mỏ Nguyên nhân chủ yếu gây

ra ăn mòn và chua hóa dầu hiện nay được cho là do vi khuẩn khử sulfate, nhóm

vi khuẩn phổ biến trong nước biển nơi có hàm lượng SO42- cao

1.2 Vi khuẩn khử sulfate (KSF)

Vi khuẩn KSF là nhóm vi khuẩn kị khí bao gồm vi khuẩn thật (Bacteria)

và vi khuẩn cổ (Archaea) Nhóm vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong tự nhiên,chủ yếu ở các vùng trầm tích, bùn lắng ở đáy sông, hồ, ao tù, trong đất, trongcác vùng có nhiệt độ cao như suối nước nóng và đặc biệt có rất nhiều trong các

mỏ dầu Thỉnh thoảng cũng phát hiện thấy chúng trong các lắng cặn thủy vựchiếu khí do chúng có khả năng hình thành những ổ nhỏ kị khí và phát triển khátốt trong điều kiện đó Ngoài ra, người ta còn tìm thấy chúng trong các mạchnước ngầm dưới đất, trong các vỉa than ngậm nước, thậm chí trong đường tiêuhóa của bò, cừu, sâu bọ… [45]

Vi khuẩn KSF đầu tiên được Beijerinck phân lập vào năm 1895 từ các

ống nước dẫn nước có tên là Spirillum Desulfurcccicans [53] Vi khuẩn này

hình xoắn, di động, có khả năng sử dụng nguồn sulfate (SO42-) và các chất kháclàm chất nhận điện tử Năm 1926, các nhà khoa học Nga và Mỹ đồng thời pháthiện ra vi khuẩn KSF trong các giếng khoan dầu khí [3] Vi khuẩn KSF có khảnăng tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau như trên cạn, dưới nước, trongđiều kiện vi hiếu khí, chúng sẵn sàng trở thành dạng hoạt động bất cứ lúc nàokhi môi trường xung quanh ở dạng kị khí [45]

* Đặc điểm phân loại của vi khuẩn KSF

Vi khuẩn KSF đại diện cho nhóm vi khuẩn kị khí, có khả năng khửsulfate thành sulfide Theo khóa phân loại đầu tiên của Postgate năm 1984, vi

khuẩn KSF được chia thành hai chi: chi không tạo bào tử là Desulfovibrio và chi có khả năng tạo bào tử là Desulfotomaculum Theo khóa phân loại mới của

Bergey năm 1984, Desulfovibrio được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram âm còn

Desulfotomaculum được xếp vào nhóm vi khuẩn Gram dương [39].

Vi khuẩn KSF có kích thước tế bào tương đối nhỏ, dao động trongkhoảng: 0,3 – 1,5µm × 0,8 – 10µm Hình dạng bên ngoài của chúng rất đa dạng:

hình cầu như Desulfococus nultivorans, hình que như Desulfomicrobium

baculatum, hình sợi như Desulfonema magnum, hình hạt đậu như Desulfovibrio saprovorans… Tuy nhiên, hình dạng của tế bào cũng thay đồi thùy thuộc vào

điều kiện nhiệt độ Mặt khác, hình dạng tế bào cũng thay đổi trong một số điềukiện nuôi cấy đặc biệt như: nuôi cấy trong thời gian dài, trong môi trường cóchất diệt khuẩn… [39]

Theo phương pháp phân loại truyền thống, vi khuẩn KSF được phân loạidựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa như:

- Theo hình dạng tế bào, khả năng di động, hàm lượng guanine vàcystosine (%GC) trong ADN

- Dựa vào loại enzyme khử sulfate thành sulfide

- Dựa vào protein chuyển điện tử

- Dựa vào quá trình trao đổi chất chia thành 2 nhóm chính: nhóm oxy hóakhông hoàn toàn các hợp chất hữu cơ đến acetate Thuộc nhóm này chủ yếu là

các loài thuộc chi Desulfovibrio spp; nhóm oxy hóa hoàn toàn các hợp chất hữu

cơ (bao gồm cả acetate) thành CO2 Trong nhóm này có sự đa dạng các loài vi

khuẩn KSF khác nhau như Desulfobacter spp., Desulfobacterium spp.,

Desulfosarcina spp… [31].

Ngày nay, bằng phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA, vi khuẩnKSF được chia thành 7 nhánh tiến hóa, trong đó có 5 nhánh thuộc vi khuẩn thậtvà

2 nhánh thuộc vi khuẩn cổ bao gồm 29 chi với hơn 100 loài đã được xácđịnh

1.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn khử sulfate đến quá trình ăn mòn thiết bị bằng kim loại và chất lượng dầu trong công nghiệp dầu khí

Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng đến sản phẩm tạo thành củangành công nghiệp dầu khí là sự có mặt của các VSV không mong muốn trong

đường ống thu gom dầu, đặc biệt là các VSV tạo màng sinh học, trong đó cónhóm vi khuẩn KSF Các VSV này gây ra rất nhiều vấn đề nghiêm trọng nhưlàm tắc nghẽn đường ống dẫn dầu, gây ăn mòn sinh học dẫn đến thủng đườngống dẫn dầu và ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm trong quá trìnhkhai thác dầu [40], [51].

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nguyên nhân chủ yếu gây ăn mòn đườngống dẫn dầu, các bể chứa và các thiết bị kim loại liên quan đến khai thác vàlọc hóa dầu trong ngành công nghiệp dầu khí là do nhóm vi khuẩn KSF [11],[21], [52]

Trong quá trình khai thác dầu khí ngoài khơi, một lượng nước biển đãđược loại bỏ oxy thường được bơm vào các giếng dầu nhằm duy trì áp suấttrong giếng và tăng cường khai thác dầu thứ cấp Vì thế, các vi khuẩn bản địaxung quanh khu vực có dầu cũng được theo vào trong giếng khoan Các điềukiện kỵ khí kết hợp với hàm lượng sulfate cao trong nước biển đã thúc đẩy sựsinh trưởng mạnh mẽ của vi khuẩn KSF trong các giếng khoan cũng như hệthống khai thác, tồn chứa và vận chuyển dầu Vi khuẩn KSF khử sulfate thànhsulfide, sau đó kích thích hoạt động của gốc sulfide và làm tăng cường quá trình

ăn mòn đường ống [13], [19] Khả năng ăn mòn đường ống và bể chứa dầubằng kim loại được mô phỏng trên Hình 1.1

Hình 1.1 Hình ảnh mô phỏng quá trình ăn mòn kim loại của vi khuẩn KSF

Vi khuẩn KSF sinh ra khí H2S không chỉ là tác nhân gây ăn mòn, pháhỏng hệ thống đường ống, làm tắc các thiết bị khoan và bơm ép nước mà cònlàm chua hóa dầu mỏ, làm giảm chất lượng dầu dẫn đến ảnh hưởng đến giáthành sản phẩm dầu tạo thành Không những thế, lượng H2S do vi khuẩn KSFtạo ra còn có tác hại không nhỏ đến quá trình sinh hoạt của con người thậm chídẫn đến tử vong khi hít phải lượng H2S lớn.

Như vậy, việc hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn KSFtrong các thiết bị liên quan đến khai thác và lọc hóa dầu ở các công trình biển làthực sự rất cần thiết hiện đã và đang được các nhà khoa học và các công ty dầukhí trên thế giới quan tâm nghiên cứu

1.4 Các phương pháp hạn chế vi khuẩn khử sulfate thường dùng trong công nghiệp dầu khí

Hiện nay, nhằm giảm thiểu và hạn chế số lượng vi khuẩn KSF người tathường sử dụng các chất diệt khuẩn hóa học để diệt nhóm vi khuẩn này Cácchất diệt khuẩn công nghiệp được sử dụng để ức chế vi khuẩn KSF thườngđược tổng hợp từ các hợp chất hóa học như chloride, glutaraldehyde,isothiazolones, formaldehyde và các muối amoni bậc bốn…

- Formaldehyde: Formaldehyde được sử dụng như một chất diệt khuẩn

được công bố sớm nhất bởi Loew và Fisher năm 1886 Formaldehyde có thểgiết chết phần lớn các loại vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn KSF bằng cách tấncông màng tế bào, phản ứng với protein và lipopolysacchrides tạo thành cácchất độc hại đối với tế bào chất của vi khuẩn Ngoài ra, formaldehyde còn cókhả năng làm giảm độc tính của các protein bằng cách phản ứng với các nhómamin và sulfhydryls (nhóm chức của axit amin cystein) [44]

- Isothiazolone: Isothiazolone là một hợp chất dị vòng, các dẫn xuất của nó

như benzisothiazolone (BIT), N-methylisothiazolone (MIT) và methylisothiazolone (CMIT) được sử dụng rộng rãi để làm chất diệt khuẩn côngnghiệp Cơ chế diệt khuẩn của isothiazolone khá phức tạp, bao gồm 2 bước

5–chloro-chính: ức chế quá trình trao đổi chất và khả năng sinh trưởng của vi khuẩn bằngcách ức chế hoạt động của enzyme dehydrogenases và gây tổn thương khôngthể phục hồi dẫn tới phá hủy tế bào vi khuẩn [49], [54].

- Glutaraldehyde: Glutaraldehyde (C5H8O2) là một hợp chất di-dehyde 5carbon bão hòa thường được sử dụng như chất cố định bộ phận trong phân tích

tế bào dưới kính hiển vi điện tử Dung dịch glutaraldehyde có nồng độ từ 0.1 –1% được sử dụng làm chất diệt khuẩn Glutaraldehyde có khả năng diệt khuẩn

do nhóm carbonyl (C=O) tương tác với axit nucleic và protein của tế bào, qua

đó cho phép tạo liên kết chéo với nhóm amin trên bề mặt tế bào và màng tế bàocủa vi khuẩn từ đó làm bất hoạt vi khuẩn

Tuy được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dầu khí nhưng các hợp chấtnày rất độc hại đối với con người và hệ sinh thái, gây ức chế sự sinh trưởng vàtrao đổi chất của sinh vật sống

Có nhiều báo cáo về mức độ độc hại của formaldehyde đối với conngười, động vật và môi trường Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ phân loạinhư là chất có khả năng gây ung thư ở người và được Cơ quan nghiên cứu ungthư quốc tế (IARC) coi là chất gây ung thư đã biết ở người Trong cơ thể,formaldehyde có thể làm cho các protein liên kết không đảo ngược được vớiDNA Các động vật trong phòng thí nghiệm bị phơi nhiễm một lượng lớnformaldehyde theo đường hô hấp trong thời gian sống của chúng có nhiều dấuhiệu của ung thư mũi và cổ họng hơn so với các động vật đối chứng.Isothiazolone được biết là chất có độc tính thủy sinh cao và một số dẫn xuất cóthể gây ra quá mẫn cảm khi tiếp xúc trực tiếp hoặc qua không khí.Glutaraldehyde là một chất khử trùng mạnh, độc và gây kích ứng mạnh [37]

Mặc dù chất diệt khuẩn hóa học kể trên có hiệu quả hạn chế số lượng vikhuẩn KSF tại các công trình dầu khí trên biển và làm giảm thiểu đáng kể việclàm thối dầu của nhóm vi khuẩn này nhưng chúng lại ảnh hưởng tiêu cực đếnsức khỏe con người và hệ sinh thái biển Chính vì vậy, việc tìm kiếm các chất

diệt khuẩn an toàn, hiệu quả, có nguồn gốc từ các VSV có ích để thay thế cácchất diệt khuẩn hóa học độc hại hiện đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứucủa các nhà khoa học trên thế giới.

Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, CHĐBMSH được tổng hợp từVSV có vai trò đáng kể trong việc nâng cao hiệu suất thu hồi dầu tam cấp thaycho các chất hoạt động bề mặt hóa học đắt tiền, độc hại với môi trường sống vàcon người Khả năng ức chế vi khuẩn, nấm men và nấm mốc của CHĐBMSHtổng hợp từ VSV cũng đã được các nhà khoa học trên thế giới công bố [16],[17], [18] Như vậy, trong tương lai, có thể sử dụng CHĐBMSH sinh tổnghợp từ VSV để diệt vi khuẩn KSF nhằm giảm thiểu tác hại của nhóm vi khuẩnnày Đây là một hướng nghiên cứu mới hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích chongành dầu khí của nước ta nói riêng cũng như các nước khai thác và xuất khẩudầu khí trên thế giới nói chung

1.5 Chất hoạt động bề mặt sinh học

1.5.1 Khái niệm chất hoạt động bề mặt sinh học

Chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) là những hợp chất lưỡngcực có hoạt tính bề mặt do VSV tạo ra Chúng có cấu tạo gồm hai phần: phần

ưa nước (hydrophilic) và kỵ nước (hydrophobic) Phần kỵ nước là các axit béochuỗi dài hoặc dẫn xuất của axít béo; phần ưa nước có thể là mono-, oligo-,hoặc polysaccharide, peptide, protein…

CHĐBMSH thu được nhờ lên men VSV Cũng giống như chất hoạt động

bề mặt được tổng hợp hóa học, CHĐBMSH đặc trưng bởi: sự đa dạng về cấutrúc hóa học, có hoạt tính bề mặt có khả năng tạo nhũ, tạo bọt, khả năng chịunhiệt, pH và chịu lực ion, khả năng phân hủy sinh học và tính độc thấp Hiệnnay, CHĐBMSH được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp [9],[55]

1.5.2 Phân loại chất hoạt động bề mặt sinh học

CHĐBMSH là những hợp chất rất đa dạng về cấu trúc hóa học và hoạttính bề mặt Rosenberg và Ron (1999) đã chia CHĐBMSH thành hai nhóm: các

CHĐBMSH có khối lượng phân tử thấp và các CHĐBMSH có khối lượng phân

tử cao CHĐBMSH có khối lượng phân tử thấp bao gồm các glycolipid,lipopeptid và lipoprotein Các CHĐBMSH khối lượng phân tử cao như các chấtnhũ hóa thực phẩm, biodispersan [43]

Ngoài cách phân loại nói trên, CHĐBMSH còn được phân loại dựa vàonguồn gốc VSV CHĐBMSH tạo ra từ VSV được chia thành các nhóm nhỏ nhưBảng 1.1 [36]

Bảng 1.1 Phân loại CHĐBMSH theo nguồn gốc VSV [36]

1.5.3 Tính chất của chất hoạt động bề mặt sinh học

Mỗi loại VSV khác nhau có khả năng tạo ra các CHĐBMSH có bản chấthóa học khác nhau Do đó, CHĐBMSH có nhiều tính chất khác nhau như hoạttính bề mặt, khả năng chịu nhiệt, pH, phân hủy sinh học, không độc hại…

*Hoạt tính bề mặt.

Nghiên cứu của Cooper and Paddoc (1984) đã cho thấy sophorolipid tạo

ra bởi chủng nấm men Torulopsis bombicola có khả năng giảm sức căng bề mặt

của n-hexadecane từ 40 mN/m xuống 5 mN/m [12] Theo Luna và cộng sự

(2013), CHĐBMSH được tạo ra bởi chủng nấm men Candida sphaerica UCP

0995 có khả năng giảm sức căng bề mặt của nước từ 72 xuống 25 mN/m [30]

*Khả năng chịu nhiệt, pH và chịu lực ion

Nhiều CHĐBMSH không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường nhưnhiệt độ, pH Chúng có thể phát triển ở môi trường có điều kiện khắc nghiệt

Theo Jenaman và cộng sự (1983) thì chủng Bacillus licheniformis JF-2 trong

giếng khoan dầu ở Cater, Oklahoma, có khả năng phát triển ở môi trường kị khí

có nồng độ NaCl lên tới 10% Chủng này không bị tác động bởi nhiệt độ trên

50oC và sống được trong môi trường pH dao động từ 4,6 - 9,9 [26] Một

lipopeptide từ Bacillus subtilis LB5a vẫn giữ được ổn định sau khi khử trùng

(121oC/20 phút) và sau 6 tháng bảo quản ở -18oC, hoạt tính bề mặt không thayđổi khi pH thay đổi từ 5 – 11 và chịu được nồng độ NaCl lên tới 20% [33]

*Khả năng bị phân hủy sinh học và tính độc thấp

Không giống các chất hoạt động bề mặt hóa học, CHĐBMSH dễ dàng bịphân hủy trong môi trường Do đó, chúng đặc biệt thích hợp với các ứng dụngliên quan đến môi trường như phục hồi sinh học và xử lý ô nhiễm môi trường.Ngoài ra, chúng đã được minh chứng là hầu như không độc Vì vậy,CHĐBMSH được nhiều công ty trên thế giới nghiên cứu, ứng dụng khôngnhững trong lĩnh vực xử lý ô nhiễm môi trường mà còn được ứng dụng trongcác ngành công nghiệp đòi hỏi sản phẩm có độ an toàn cao như thực phẩm, mỹ

phẩm và dược phẩm [26] CHĐBMSH do Pseudomonas aeruginosa được so

sánh với chất hoạt động bề mặt hóa học Marlon A – 350 về phương diện gâyđộc và gây đột biến Các phân tích đều cho thấy Marlon A – 350 có khả năng

gây độc và gây đột biến, còn CHĐBMSH do Pseudomonas aeruginosa được

đánh giá là tác nhân không gây độc, không gây đột biến [15]

*Đa dạng về cấu trúc hóa học

CHĐBMSH là nhóm đa cấu trúc, mỗi loài VSV khác nhau có thể tạo racác loại CHĐBMSH khác nhau có bản chất và trọng lượng phân tử khác nhau

Do đó CHĐBMSH rất đa dạng về mặt cấu trúc Với sự đa dạng này mà chúng

có những đặc tính như tạo bọt, giữ ẩm, hòa tan, khả năng hoạt động bề mặt vàkhả năng nhũ hóa… nên CHĐBMSH được sử dụng rộng rãi trong các ngànhcông nghiệp [36]

1.5.4 Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học

Từ những năm 1950 đến nay, nhiều nhà khoa học đã không ngừng tìmkiếm và phát hiện ra những loài VSV có khả năng tạo CHĐBMSH

Lần đầu tiên Bayer và Gutnik (1950) đã phát hiện vi khuẩn Acinetotacter

calcoacetius RAG – 1 có khả năng tạo CHĐBMSH Sau đó La Rivie (1955)

phát hiện ra khả năng ứng dụng các chất này trong khai thác dầu khí Một sốnhóm nghiên cứu trên thế giới như Khopade và cs (2012); Chakraborty và cs

(2011); Liu và cs (2010) đã phát hiện các chủng Bacillus velezensis H3,

Saccharopolyspora sp A9 và Streptomyces sp có khả năng tạo CHĐBMSH cao

[10], [27], [29]

Ndlovu và cộng sự (2017) phát hiện ra hai chủng vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens ST34 và Pseudomonas aeruginosa ST5 phân lập từ

một nhà máy xử lý nước thải có khả năng tạo CHĐBMSH có khả năng khángkhuẩn [38]

Kiều Thị Quỳnh Hoa và cộng sự (2016 - 2018) đã phân lập và tìm kiếm

được nhiều chủng vi khuẩn và nấm men thuộc các chi Candida; Pseudomonas

và Bacillus có khả năng tạo CHĐBMSH với hiệu suất cao trên nguồn carbon

duy nhất là dầu thô và dầu DO Các chủng này được xem là có tiềm năng caotrong việc ứng dụng để nâng cao hiệu suất khai thác dầu và xử lý môi trườngcát, trầm tích hay nước biển ô nhiễm dầu [1], [2]

Các loài VSV khác nhau có thể tạo ra các loại CHĐBMSH có bản chấthóa học và trọng lượng phân tử khác nhau Các nhà khoa học đã tách chiết và

mô tả được bản chất hóa học của các CHĐBMSH do một số chủng vi khuẩn tạo

ra Mulligan và cộng sự (2005) đã tổng kết được một số VSV có khả năng sinhtổng hợp CHĐBMSH và bản chất hóa học của từng chất do các chủng tương

ứng tạo ra: Bacillus subtilis tạo CHĐBMSH có bản chất hóa học là sufactin,

Acinetobacter sp tạo CHĐBMSH có bản chất là Phospholipid, Candida tropicalis tạo CHĐMBMSH có bản chất là mannan (Bảng 1.1.)…[36]

Hiện nay, CHĐBMSH tổng hợp từ vi khuẩn và nấm men là đối tượngđược quan tâm nhiều nhất trong các VSV tạo CHĐBMSH vì dễ nuôi cấy, chu

kỳ sinh trưởng ngắn, tạo ra lượng sinh khối lớn… Những nghiên cứu đã công

bố cho thấy tiềm năng tạo CHĐBMSH của vi khuẩn và nấm men là rất lớn

1.5.5 Ứng dụng của chất hoạt động bề mặt sinh học

CHĐBMSH được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

- Công nghiệp dệt nhuộm: là chất làm mềm cho vải sợi, chất trợ nhuộm.

- Y dược: kháng khuẩn, kháng nấm, đồng thời ức chế ngăn chặn sự kết dính và tạo màng sinh học của các nhóm vi khuẩn gây hại (Escherichia coli,

Staphylococcus aureus…).

- Công nhiệp thực phẩm: chất nhũ hoá cho bánh kẹo, bơ sữa và đồ hộp.

- Công nghiệp mỹ phẩm, : chất tẩy rửa, Cetyl stesulfat, sunfosucinat Na,

chất tạo bọt trong phối chế dầu gội, sữa tắm…

- Ngành in: chất trợ ngấm và phân tán mực in…

- Xây dựng nhũ hoá nhựa đường: làm tăng cường độ đông rắn của bê tông.

- Công nghiệp khoáng sản: làm chất tuyển nổi, chất nhũ hoá, chất tạo bọt

làm giàu khoáng

- Nông nghiệp: Chất dễ gia công thuốc bảo vệ thực vật.

- Dầu khí: làm chất nhũ hoá, tăng cường khai thác dầu.

- Xử lý ô nhiễm môi trường: xử lý ô nhiễm dầu, ô nhiễm kim loại nặng.

1.6 Khả năng kháng vi khuẩn gây hại của chất hoạt động bề mặt sinh học tạo ra từ vi sinh vật

Từ lâu các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu khả năng kháng các vikhuẩn gây hại của CHĐBMSH tạo ra từ VSV Các công trình nghiên cứu chothấy các thành tựu to lớn mà CHĐBMSH mang lại

Theo Fernandes và cộng sự (2007) CHĐBMSH tạo ra từ Bacillus subtilis

R14 có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn gây bệnh đặc biệt là

Enterococcus faecalis Đường kính vòng kháng khuẩn do CHĐBMSH tạo ra

đối với Enterococcus faecalis trung bình là 14,6 mm Đối với Escherichia coli đường kính trung bình là 13,8 mm và đối với Pseudomonas aeruginosa đường

kính dao động từ 9,8 – 12,1 mm [18]

Falagas và Makris (2009) đã đề xuất việc áp dụng CHĐBMSH tạo ra từ

probiotic LAB cho các thiết bị chăm sóc bệnh nhân trong các bệnh viện để

chống lại sự xâm chiếm của các VSV gây nhiễm trùng ở bệnh viện [17]

CHĐBMSH có nguồn gốc từ S thermophiles A được tìm thấy là chất chống kết

dính hiệu quả trên cao su và chống lại sự xâm chiếm của các VSV khác nhau

[41] CHĐBMSH có nguồn gốc từ L paracasei subsp paracasei A20 được ứng

dụng như là một phân tử chống độc mạnh để loại bỏ nấm và vi khuẩn gây bệnh

trên bề mặt polystyrene [22] CHĐBMSH được sản xuất bởi chủng E faecium

MRTL 9 làm giảm gần như hoàn toàn số lượng vi khuẩn trên ống silicone.CHĐBMSH cho thấy các đặc tính chống dính chống lại các chất tạo màng sinhhọc thông thường trên ống silicone của các thiết bị y tế và phẫu thuật cấy ghép

Số lượng vi khuẩn trên ống silicone giảm 95% khi bổ sung hàm lượngCHĐBMSH vào môi trường nuôi cấy là 25 mg ml-1 [47]

Ghribi Dhouha và cộng sự (2012) chỉ ra rằng CHĐBMSH tạo ra từ

Bacillus subtilis SPB1 có khả năng kháng một số vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Staphylococcus xylosus, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumonia

[16]

CHĐBMSH sản xuất từ hai chủng vi khuẩn Bacillus amyloli quefaciens ST34 và Pseudomonas aeruginosa ST5 phân lập từ nhà máy xử lý nước thải thể

hiện tính kháng khuẩn rõ rệt với một loạt các VSV gây bệnh bao gồm chủng

Staphylococus aureus, Escherichia coli và Candida albicans [38].

1.7 Tình hình nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn khử sulfate bằng chất hoạt động bề mặt sinh học tạo ra từ vi sinh vật

Bên cạnh những báo cáo về vai trò của CHĐBMSH tạo ra từ VSV vớinhóm vi khuẩn gây bệnh, gần đây, nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn KSFcủa CHĐBMSH nhằm ứng dụng trong ngành công nghiệp dầu khí cũng được

một số nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu bởi những đặc tính ưuviệt như không độc hại, có khả năng phân hủy sinh học, có khả năng chịu nhiệt,chịu áp, phổ pH rộng… [28].

Ngoài khả năng phân hủy dầu ứng dụng nâng cao hiệu suất khai thác và

xử lý môi trường nhiễm dầu, CHĐBMSH sinh tổng hợp từ VSV còn được biếtđến bởi khả năng tạo chất kháng VSV, như bacteriocin, enzyme ngoại bào,ezyme phân hủy ARN, enzyme phân hủy thành tế bào, peptide và chất khángsinh lipopeptide [8], [35], [36], [42] Trong đó, một số chất chỉ kháng cùng loàihay những loài gần gũi [35], còn một số chất khác lại có thể kháng khuẩn ở phổrộng Do đó CHĐBMSH được xem như tiềm năng thay thế chất diệt vi khuẩnKSF hóa học trong ngành công nghiệp dầu khí

Jayaraman và cộng sự (1999) nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn KSF

của chủng Bacillus sp Nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng chủng này có khả năng

ức chế vi khuẩn KSF Desulfovibrio vulgaris và D gigas [25].

Nghiên cứu của Gana và cộng sự (2011) về khả năng kháng vi khuẩn

KSF của CHĐBMSH tạo ra từ chủng vi khuẩn Bacillus sp B21 phân lập từ mỏ

dầu ở Algeria cho thấy CHĐBMSH tạo ra từ chủng này có khả năng ức chế vikhuẩn KSF tốt hơn so với với tetrakis hydroxymethyl phosphonium sulfate(THPS), một chất diệt khuẩn hóa học hay dùng trong ngành công nghiệp dầukhí Hàm lượng H2S tạo ra trong trường hợp ức chế vi khuẩn KSF bằng

CHĐBMSH do Bacillus sp B21 cũng giảm hơn so với ức chế bằng chất diệt

khuẩn hóa học THPS [20]

Theo Korenblum và cộng sự (2012) CHĐBMSH tổng hợp từ chủng

Bacillus sp.H2O – 1 có khả năng ức chế và diệt vi khuẩn KSF Desulfovibrio

alaskensis NCIMB 13491 với nồng độ là 5 μg/ml [28].

Theo Sheshtawy và cộng sự (2015) đã nghiên cứu tạo CHĐBMSH tổng

hợp từ chủng Bacillus licheniformis phân lập tại giếng khoan dầu khí có khả

năng ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng của vi khuẩn KSF ở nồng độ 1% (w/v)CHĐBMSH thô sau 3 giờ tiếp xúc [23].

Như vậy những nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy khả năng kháng vikhuẩn KSF của CHĐBMSH sinh tổng hợp từ VSV Tuy nhiên, các công bố vềkhả năng kháng vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tạo ra từ VSV còn hạn chế ởtrên thế giới và hiện chưa có công bố nào ở Việt Nam Do đó, nghiên cứu vềkhả năng kháng vi khuẩn KSF của CHĐBMSH của đề tài luận văn là có ý nghĩa

về mặt khoa học và thực tiễn

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

* Mẫu bùn và nước:

Mẫu bùn và nước thu được tại Huế, Thanh Hóa, Hưng Yên, Vũng Tàubằng dụng cụ chuyên dụng, bảo quản lạnh 4oC trong bình Duran tới khi phântích Các mẫu được phân tích vi sinh trong vòng 24 giờ

* Vi sinh vật sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH)

Các chủng VSV (vi khuẩn và nấm men) có khả năng sinh tổng hợpCHĐBMSH được phân lập từ các mẫu bùn và nước thu được tại Huế, ThanhHóa, Hưng Yên, Vũng Tàu

* Vi khuẩn khử sulfate (KSF)

Hai chủng vi khuẩn KSF được sử dụng làm chủng chỉ thị trong nghiên

cứu này gồm: 01 chủng chuẩn (Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) mua tạiDSMZ (Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH), Đức và 01 đơn

chủng (Desulfovibrio sp RP3-303) phân lập được từ giếng khai thác dầu số 303,

giàn RP3, mỏ Rồng Hai chủng vi khuẩn KSF này được nuôi cấy trên môitrường kỵ khí đặc hiệu số 63 của DSMZ (Medium 63)

*Môi trường nuôi cấy

Môi trường hiếu khí (HKTS) (g/l): NH4NO3 2; KH2PO4 1; NaCl 5 20; KCl 0,25; MgCl2 1,2; Glucose 1; Pepton 5; Cao men 0,2; Cao thịt 3; Agar20; pH 7

-Môi trường Hansel (g/l): Glucose 30; KH2PO4 3; NaCl 5 – 20; MgSO42; Peptone 10; Cao men 1; Agar 20; Chất thêm: chloramphenicol 0,0625;cyclohexymicle 0,0625; pH 6

Môi trường khoáng (g/l): KNO3 3; Na2HPO4 0,7; KH2PO4 0,3; MgSO40,4; NaCl 5 - 20; Glucose 2% (w/v); pH 6,9 – 7,2; Vi lượng: FeSO4 0,116;

H3BO3 0,232; CoCl2 0,41; ZnSO4 0,174; CuSO4 0,008; MnSO4 0,008;(NH4)6Mo7O24 0,022

Môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn KSF (DSMZ_Medium 63) (g/l)

K2HPO4 0,5; NH4Cl 1; Na2SO4 1; CaCl2 x 2H2O 0,1; MgSO4 x 7H2O 2; lactate 2; Yeast extract 1; FeSO4 x 7H2O 0,5; Na-thioglycolate 0,1; pH 7

Na-DL-Các hóa chất phân tích sử dụng trong luận văn chủ yếu là của Merck(Đức) hay Sigma (Mỹ)

*Máy móc và thiết bị

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật dầu mỏ và Phòng thínghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu.

2.2.1 Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi sinh vật nghiên cứu

*Hình thái khuẩn lạc của chủng vi sinh vật lựa chọn trên môi trường thạch

Hình thái, màu sắc, đặc điểm và kích thước khuẩn lạc của các chủng VSVtrên môi trường thạch chọn lọc được tiến hành quan sát sau 24 - 72 giờ nuôi cấy

ở 28 - 30oC Môi trường HKTS được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn và môitrường Hansen được sử dụng để nuôi cấy nấm men

*Quan sát hình thái tế bào của chủng vi sinh vật lựa chọn dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Hòa sinh khối chủng VSV lựa chọn vào 1ml dung dịch đệm phosphat(PBS) Ly tâm 4000 v/ph trong 5 phút để thu sinh khối Bổ sung 0,5 ml dungdịch glutaraldehyde 2,5% để cố định mẫu Trộn đều dung dịch đã cố định và trảiđều các lớp mỏng trên lamen có bổ sung polylizin 1% Tiếp tục sử dụng dungdịch OsO4 1% để cố định lại mẫu Rửa lại mẫu sau khi cố định bằng dung dịchcồn với nồng độ khác nhau 50%, 70%, 80%, 90% và 100%, Mẫu được xử lý vàchụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM-Scanning Electron Microscope) (S-

4800, Nhật Bản với hiệu điện thế là 10 kv) tại phòng kính hiển vi điện tử, Viện

Vệ sinh dịch tễ Trung ương

*Xác định sự hình thành bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt

Sau 72 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa HKTS, sinh khối chủng vikhuẩn nghiên cứu được hòa tan trong ống nghiệm chứa muối sinh lý 0,85%

Chủng đối chứng dương và đối chứng âm lần lượt là Bacillus sp và Escherichia

coli Chủng nghiên cứu và các chủng đối chứng được tiến hành sốc nhiệt ở 80oCtrong 15 phút để xác định khả năng hình thành bào tử Sau đó gạt dịch nuôi cấytrên môi trường hiếu khí, ủ ở 30oC trong 24 đến 48 giờ để kiểm tra sự sống sótcủa chủng vi khuẩn nghiên cứu và các chủng đối chứng sau khi đã sốc nhiệt.Nếu sau khi sốc nhiệt chủng vi khuẩn nào phát triển trở lại chứng tỏ chủng vikhuẩn đó có khả năng hình thành bào tử

2.2.2 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH bằng chỉ số nhũ hóa E 24

Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của các chủng nghiên cứu đượcđánh giá dựa trên chỉ số nhũ hóa E24 Chỉ số nhũ hoá (E24) đặc trưng cho khảnăng nhũ hoá của CHĐBMSH do VSV tạo ra với dung môi (xylene và n-hexan)sau 24 giờ [12]

Cách tiến hành: Hút 1 ml dịch nuôi cấy của chủng nghiên cứu vào 1 mldung môi (xylen hoặc n-hexan), vortex đều (2000 vòng/2 phút), ủ ở 4oC trong

24 giờ và đo chỉ số nhũ hóa E24

Chỉ số nhũ hoá (E24) được tính theo công thức:

C hiều ca o cột nhũ hóa

KSF (Desulfovibrio vulgaris DSM 644 và Desulfovibrio sp RP3-303) Khả năng

ức chế vi khuẩn KSF của các CHĐBMSH từ các chủng VSV lựa chọn đượcđánh giá dựa trên sự sinh trưởng của vi khuẩn KSF thông qua kết tủa FeS (màuđen) sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung CHĐBMSH nghiên cứuvới hàm lượng 0,1 và 0,5% (w/v) CHĐBMSH thu được được bổ sung sau khilọc qua màng lọc vô trùng 0,45 µm Vi khuẩn KSF ở cuối pha log được bổ sungvới hàm lượng ban đầu là 105 CFU/ml

2.2.4 Xác định đặc điểm sinh hóa của chủng nghiên cứu bằng kít chuẩn

sinh hóa API

Đặc điểm sinh hóa chủng VSV nghiên cứu được xác định bằng kít chuẩnAPI 50 CHB (Biomerieux – Pháp) Các thao tác được thực hiện theo hướng dẫn

sử dụng của nhà sản xuất (h t t p s :/ / ap i w e b b i o m e r i e ux c o m ) Kết quả được tratrên phần mềm API LAP Plus hoặc đối chiếu (profile index) để xác định tên chi/loài

2.2.5 Phân loại chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phân tích trình tự gen