Tài liệu ôn thi viên chức sự nghiệp khoa học và công nghệ tỉnh Bắc Kạn năm 2019

Rửa lại bằng xà phòng và nước nhiều lần cho tới pH trung tính - Các dụng cụ đã sử dụng có chứa các vi sinh vật gây bệnh, plasmid mang DNA tái tổ hợp,...trước khi rửa nhất thiết phải được

Phần I

LÝ THUYẾT NỘI QUY, AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM

I NỘI QUY AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM

1 Chỉ được phép làm việc trong phòng thí nghiệm khi:

- Được sự cho phép của người phụ trách phòng thí nghiệm

- Sau khi được huấn luyện các quy tắc an toàn phòng thí nghiệm

2 Quy định chung

- Không đưa trẻ em, bạn bè, vào phòng thí nghiệm

- Trong phòng thí nghiệm phải giữ thái độ nghiêm túc, không được cười đùa, nghịch ngợm tránh gây những điều đáng tiếc cho người khác

- Quan sát, tìm hiểu thật kỹ các sắp xếp, bố trí trong phòng thí nghiệm:

+ Hóa chất, thiết bị,

+ Hệ thống điện, nước, gas + Các thiết bị an toàn: vòi nước sạch, hệ thống chữa cháy, hộp báo động,

+ Các số điện thoại cần thiết: Người phụ trách, Y tế, Cứu hỏa,

- Không tự ý thay đổi các bố trí trong phòng thí nghiệm

- Chỉ được phép vận hành máy móc sau khi được hướng dẫn và thực hành

- Không ra vào tự do trong phòng thí nghiệm

- Không mang đồ ăn, uống vào phòng thí nghiệm, không bảo quản thức ăn

và đồ uống trong tủ lạnh đựng mẫu, hóa chất

- Không hút thuốc lá trong phòng thí nghiệm

- Mặc trang phục gọn gàng, phù hợp Không được mặc quần áo quá dài hoặc quá ngắn, tóc dài phải được buộc gọn không đi dép xỏ ngón hoặc dép quá cao gót dễ trượt ngã

- Không được đi chân trần trong phòng thí nghiệm do có thể có các mảnh thủy tinh vỡ, hóa chất,

- Trong phòng thí nghiệm nhất thiết phải mặc áo blouse Khi làm thí nghiệm phải đeo khẩu trang và găng tay

- Khi tiếp xúc với các tác nhân độc (hóa chất độc, sinh vật gây bệnh, các thiết bị phóng xạ, ) phải mặc trang phục bảo hộ (quần áo bảo hộ, kính, khẩu trang, găng tay, mặt mạ phòng độc, mũ ) và tuân thủ nghiêm ngặt các quy định riêng đối với các tác nhân độc

- Không nếm thử bất cứ một chất gì trong phòng thí nghiệm Lưu ý không

để miệng chạm vào bất cứ một vật gì trong phòng thí nghiệm

- Không được nhìn trực tiếp, thẳng góc vào ống nghiệm Phải quan sát từ phía cạnh

- Không đưa mũi ngửi trực tiếp bất kỳ một chất gì trong ống nghiệm hoặc trong bình, lọ

- Nghiêm cấm sử dụng pipet bằng miệng Khi hút nhiều hóa chất cùng một lúc phải hút bằng các pipet khác nhau hoặc phải thay đầu tip nếu là pipetman

- Khi làm việc với các dung môi có mùi hoặc dễ bay hơi (phenol, chloroform, õ- Mecaptoethanol, acetic acid, ) phải làm trong tủ hood

- Các hóa chất pha phải được gắn nhãn cẩn thận (tên hóa chất, công thức hóa học, nồng độ, ngày pha, tên người, )

- Trước khi sử dụng hóa chất phải đọc kỹ nhãn mác trên vỏ chai/lọ hóa chất, tránh nhầm lẫn các chất có tên gọi, công thức hóa học giống nhau

- Trên bàn thí nghiệm chỉ được để các hóa chất đang dùng lúc đó

- Lập kế hoạch cụ thể cho công việc (kiểm tra lại dụng cụ, hóa chất, thiết

bị, nhân lực, ) Nếu sử dụng các thiết bị chiếm nhiều thời gian thì phải bàn bạc, sắp xếp với các đồng nghiệp khác

- Phải báo cáo ngay cho người phụ trách phòng thí nghiệm khi xảy ra các

sự cố dù là nhỏ nhất

- Khi cân không được để hoá chất trực tiếp lên mặt cân, phải có đĩa cân hoặc giấy cân

- Không để dây các dung môi, hóa chất lên các thiết bị đo đạc, phân tích

- Khi sử dụng các thiết bị phân tích được điều khiển qua máy tính, nếu có

sự cố về phần mềm, giữ nguyên hiện trạng và báo ngay cho người phụ trách phòng thí nghiệm

- Khi chuẩn bị các dung dịch hóa chất phải tuân thủ các quy trình pha (không được đổ nước vào dung dịch axit đậm đặc mà phải cho từ từ axit vào nước,…)

- Các chất thải trong phòng thí nghiệm phải được phân loại Những chất thải thông thường cho vào túi, buộc chặt trước khi đưa ra ngoài Đối với những chất thải là các hoá chất phải để riêng vào các bình chứa được đánh dấu theo tính chất đặc hiệu hay chủng loại (chất dễ cháy, chất độc bảng A, chất oxy hóa, axit, kiềm, phenol,…) Tuyệt đối không thải chúng trực tiếp qua bồn nước

- Đối với các plasmid mang DNA tái tổ hợp, vi sinh gây bệnh, mẫu vật, phải xử lý (hấp vô trùng) trước khi thải ra môi trường

- Khi bị bỏng ở da phải nhúng ngay chỗ bị thương vào nước mát bằng vòi nước sạch, báo cho người phụ trách, gọi sơ cứu từ y tế cơ quan

- Nếu bị hóa chất dây vào mắt phải xả liên tục dưới vòi nước sạch, báo cho người phụ trách và gọi sơ cứu từ y tế cơ quan

- Trả lại phòng thí nghiệm những vật liệu và dụng cụ đúng vị trí sau khi dùng

- Sau khi hoàn tất công việc, rửa/lau sạch, làm khô tất cả cá dụng cụ, thiết

bị, bàn thí nghiệm, khu vực làm việc của mình Ghi nhật ký về tình trạng sử dụng các trang thiết bị

II HOÁ CHẤT VÀ CÁCH BẢO QUẢN

1 Hoá chất:

Hoá chất có thể ở trạng thái rắn, lỏng, khí được đóng gói trong các chai,

lọ thuỷ tinh, nhựa, Trên nhãn có các thông tin:

- Điều kiện bảo quản

- Các ký hiệu an toàn phòng thí nghiệm và các ký hiệu cấm

2 Cách sử dụng và bảo quản hoá chất

- Chai lọ hoá chất phải có nắp

- Trước khi lấy hoá chất phải lau sạch nắp và cổ lọ

- Không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hoá chất

- Không dùng hoá chất đã rơi vãi

- Trên bàn thí nghiệm chỉ để hoá chất đang dùng lúc đó

- Các hoá chất dễ bốc hơi, có mùi phải được lấy trong tủ hood

- Khi làm việc với axit, kiềm và các chất độc phait tuân thủ đúng quy định

- Không được ngửi hay nếm hoá chất

- Các hoá chất dễ cháy, nổ không được để gần lửa

III AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM

1 Phương pháp rửa dụng cụ

Các dụng cụ thí nghiệm bao gồm các ống nghiệm, chai lọ, đĩa pettri, bình tam giác, hộp, thủy tinh; đầu côn, eppendoff, hộp đựng đầu côn, bằng nhựa; cối chày sứ, Mỗi loại dụng cụ phụ thuộc vào các mục đích nghiên cứu khác

1.1 Yêu cầu:

Các dụng cụ trên cần phải sạch sẽ về mặt hóa học (không dính các chất hữu cơ, vô cơ) và sạch về mặt sinh học (không chứa nấm, vi khuẩn, các bào tử, )

1.2 Xử lý dụng cụ trước khi rửa:

- Dụng cụ thuỷ tinh mới mua, chưa sử dụng, cần ngâm nước lã hoặc H2SO4 loãng trong vòng 24h Rửa lại bằng xà phòng và nước nhiều lần cho tới

pH trung tính

- Các dụng cụ đã sử dụng có chứa các vi sinh vật gây bệnh, plasmid mang DNA tái tổ hợp, trước khi rửa nhất thiết phải được khử trùng bằng hơi nước áp lực cao để giết chết các tế bào, để đảm bảo an toàn cho người rửa, không reo rắc mầm bệnh vào môi trường

- Các dụng cụ đã sử dụng có chứa các hoá chất có độc dễ bay hơi (phenol, chloroform, acetic acid, õ-Mecaptoethanol, TEMED, ) trước khi rửa phải mở nắp các dụng cụ để trong tủ hood ít nhất 3 ngày cho bay hơi hết

- Các dụng cụ đã sử dụng chứa mẫu vật và các hoá chất thông thường xếp vào nồi hoặc chậu nhôm chuyên dụng, đổ nước và xà phòng, dìm các dụng cụ ngập kín nước, đun sôi 15-30 phút Gom các cặn bẩn vào túi nilon, buộc kín, cho vào thùng rác

- Các dụng cụ bẩn nhất thiết phải ngâm chìm trong nước lã nếu chưa thể rửa ngay để tránh hiện tượng đóng cặn và ăn mòn

1.3 Dung dịch dùng để rửa

- Nước rửa chai lọ (có chứa SDS)

- Dung dịch 5N NaOH

- Nước rửa crom: 5% K2Cr207 trong 100ml H2SO4 đặc

Cách pha: Lượng K2Cr207 cần đủ pha nghiền nhỏ bằng cối chày sứ sau đó chuyển sang cốc chịu nhiệt (nếu pha 200ml thì cần cốc chịu nhiệt 1000ml), đổ H2SO4 từ từ đặc vào và khuấy liên tục bằng đũa thuỷ tinh, đổ rất cẩn thận 5-10

ml nước cất vào để tăng nhiệt độ dung dịch lên cho dể tan Sau 20 phút thì để cho dung dịch tự ổn định Khi dung dịch nguội thì cho vào chai giữ cẩn thận

Chú ý: Pha trong tủ hood hoặc ngoài ban công

bằng nước lã 10 lần, tráng bằng nước cất Đun trong nước cất ít nhất hai lần, mỗi lần 15 phút Sấy khô khoảng 30 phút ở 800

C

Dụng cụ này có thể rửa bằng máy siêu âm trong dung dịch kiềm

Rửa các dụng cụ bằng nhựa thông thường: Xả bằng nước lã, dùng khăn mềm thấm xà phòng rửa sạch dụng cụ, xả kỹ bằng nước lã, tráng lại bằng nước cất, dụng cụ phải được úp ngược trong rổ sạch cho ráo nước và không bị bám cặn bẩn, không bị bụi rơi vào

2.2 Rửa dụng cụ thuỷ tinh

Chai lọ thuỷ tinh dùng trong nuôi cấy vi sinh, thực vật, gieo hạt, : Dụng

cụ thuỷ tinh sau khi dùng xong rưả sạch bằng nước lã, dùng miếng nhám thấm cồn lau sạch các kỹ hiệu ghi trên dụng cụ, chọn chổi rửa thích hợp với các loại ống hoặc bình, rửa bằng nước rửa chai lọ, dùng khăn mềm rửa sạch phía ngoài,

xả sạch nhiều lần phía trong và phía ngoài (*) Tráng lại bằng nước cất, dựng ngược ống va bình vào rổ có lót giấy sạch để thấm nước, làm khô ở nhiệt độ phòng hoặc ở 1200

C

- Các dụng cụ thuỷ tinh để phục vụ các thí nghiệm sinh hoá: Nhất thiết phải dùng dung dịch crom Dụng cụ sau khi rửa đến bước (*) thì tráng bằng dung dịch crom, sau 30 phút đến 1giờ mới rửa lại sạch bằng nước lã nhiều lần, tráng nước cất và làm khô

- Pipet dùng hút dịch có chứa các vi sinh vật: Sau khi sử dụng cần ngâm ngay vào ống nước sát trùng Khều bỏ nút bông, ngâm tiếp vào ống nước xà phòng một ngày Chuyển sang bình rửa pipet tự động qua đêm, tráng nước cất, hong khô Nếu rửa trực tiếp dưới vòi, cần điều chỉnh sao cho dòng nước chảy qua bên trong pipet Rửa sạch xà phòng, tráng lại bằng nước cất

- Pipet dùng cho các phản ứng hoá học: Không cần ngâm nước sát trùng Đặt pipet dưới vòi nước chảy, xả bớt hoá chất bám dính bên trong Ngâm vào ống nước xà phòng một ngày, rửa sạch, tráng nước cất Hong khô ở nhiệt độ phòng, không được sấy ở nhiệt độ cao dẫn đến làm cho thuỷ tinh giãn nở dẫn đến sai lệch thể tích

Kính sử dụng chạy điện di: Sau khi dùng xong phải ngâm vào dung dịch tảy rửa hoặc sát trùng, rửa bằng nước rửa chén, dùng khăn mềm tránh xước kính, xả sạch, tráng nước cất Sau 5 thí nghiệm phải rửa bằng nước crom một lần

3 Phương pháp khử trùng:

3.1 Mục đích của khử trùng:

Nhằm loại bỏ tất cả các yếu tố sinh học như vi sinh vật, enzyme

3.2 Các phương pháp khử trùng:

của hơi nước (thông thường 1.06 atm (tương đương với 1210C) trong thời gian

- Khử trùng bằng các hoá chất:

+ Dung dịch chloramine 5%: Là dung dịch khử trùng rất tốt, thường dùng để lau chùi, tảy uế các khu vực nhiễm trùng, ngâm các dụng cụ bẩn sau khi thao tác

+ Cồn 70%: Có tác dụng tiệt trùng một số đối tượng vi sinh vật, dùng

để lau bàn, tủ cấy trước và sau khi làm việc, khử trùng tay trước và sau khi làm việc

+ Các dung dịch tảy rửa: Xà phòng, sữa tắm, dầu gội, cũng có tác dụng tiệt trùng và loại bỏ vi trùng rất tốt Khi làm việc với các tác nhân độc cần phải loại bỏ các tư trang như áo choàng, mũ giày, khẩu trang, găng tay, và được tắm gội trước khi ra khỏi khu vực làm việc

3.2.1 Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh:

Khử trùng trong lò sấy khô nhiệt độ cao:

- Các dụng cụ trước khi khử trùng phải được rửa kỹ càng, làm khô và gói giấy để đảm bảo tính vô trùng sau khi sấy

+ Pipét: Mỗi một pipét được gói trong một dải giấy dài có chiều rộng 4-5cm Đầu hút của pipet được nút bằng bông Gói từ phía đầu nhỏ giọt, cuộn giấy đând dần vào theo kiểu xoắn trôn ốc chô đến khi hết ở phía đầu có nút bông Phải cuộn giấy cho sát khít vào pipét Sau khi cuộn giấy, để giữ cho khỏi bẩn và bị rách ta buộc các pipét thành từng bó hoặc cho vào ống đựng pipét làm bằng kim loại hay bìa cứng

+ Đĩa petri được xếp theo bộ và gói thành từng chồng khoảng 2-4 bộ hoặc xếp vào các ống trụ làm bằng thép không rỉ hoặc nhô

+ Các chai lọ, ống nghiệm, bình tam giác, ống burri,…đều phải được đậy nắp hoặc nút bằng nút bông, bịt bằng giấy bạc trước khi khử trùng

- Các bước khử trùng:

+ Các dụng cụ đã chuẩn bị tốt được xếp vào tủ sấy Không nên xếp quá khít nhau để không khí có thể lưu thông được và làm nóng đều các vật cần khử trùng

+ Đóng cửa tủ sấy thật kín sau đó đóng các lỗ thông khí

+ Bật công tắc điện

+ Khi nhiệt độ 160-1800C thì bắt đầu tính thời gian và duy trì nhiệt độ này trong khoảng 1giờ 30phút

+ Nếu tủ sấy không có thiết bị điều nhiệt thì phải theo dõi trong suốt thời gian này vì nếu nhiệt độ tụt xuống thì không đủ khử trùng, nếu vượt quá thì

sẽ làm cháy bông, giấy và nếu vượt qúa mức cho phép có thể làm vỡ nhiệt kế thủy ngân của tủ sấy

+ Khử trùng xong tắt công tắc điện và đợi cho nhiệt độ hạ xuống dưới

800C mới được mở cả tủ ra, nếu không sự thay đổi nhiệt độ quá đột ngột có thể làm nứt vỡ dụng cụ và làm ảnh hưởng đến tính vô trùng của dụng cụ

+ Các dụng cụ khử trung xong được cất giữ ở chỗ kín, sạch, khô ráo Không được bóc bỏ giấy

- Khử trùng bằng hơi nước áp lực cao: Các dụng cụ chịu nhiệt ngoài khử trùng bằng lò sấy khô cũng có thể khử trùng bằng nồi hơi áp lực cao

3.2.2 Khử trùng môi trường dinh dưỡng và hóa chất

Pha chế môi trường

- Đọc kỹ công thức môi trường, chuẩn bị hoá chất và các dụng cụ liên quan

- Tuân thủ công thức pha môi trường, lần lượt cân, đong các thành phần Đánh dấu vào công thức thành phần đã được cân hoặc đong

- Nếu môi trường phải đun nấu, ngoài thể tích nước theo công thức, nên

bổ sung một lượng nước nhỏ bù lại thể tích nước bị bay hơi (khoản 15-20ml/lit môi trường)

- Mỗi hoá chất được xúc bằng một thìa riêng khi cân Cho chất được cân lên đĩa (có giấy cân) một cách từ từ tới khi vữa đủ Nắm vững cách sử dụng từng loại cân

- Với các thành phần có hàm lượng nhỏ nên pha dung dịch gốc (stock solution), tính toán hàm lượng cần lấy bổ sung vào môi trường

Đun môi trường

- Nếu các thành phần dễ hoà tan trong nước thì không cần đun, khuấy bằng máy khuấy từ để các chất được hoà tan Với môi trường thạch thì đun bằng

lò vi sóng Nếu không có lò vi sóng thì đun bằng bếp, vừa đun vừa khuấy bằng đũa thuỷ tinh đến khi môi trường sôi, thạch tan hết là được

- Nếu pH sai khác quá lớn thì phải kiểm tra lại hoá chất (chủng loại, thời hạn sử dụng, ) và quá trình pha chế Cần thiết phải pha lại môi trường

- Nếu sai khác giá trị pH không quá lớn, có thể điều chỉnh bằng dung dịch kiềm hoặc axit loãng, việc điều chỉnh pH cần tiến hành thận trọng để sau khi chỉnh thể tích của môi trường không bị thay đổi ngoài phạm vi cho phép

- Giá trị pH quá thấp hoặc quá cao sẽ làm ảnh hưởng đến tính chất của môi trường, khi pha chế các môi trường có pH axit hoặc kiềm cần đọc kỹ chỉ dẫn, có thể khử trùng riêng các thành phần và chộn lại với nhau sau khi khử trùng hoặc khử trùng các thành phần ở pH trung tính sau đó dùng dung dịch kiềm hoặc axit để chỉnh pH (nhưng phải trong điều kiện vô trùng)

- Sau khi khử trùng pH của môi trường có thể thay đổi lại nên cần phải kiểm tra lại

Khử trùng

- Môi trường dinh dưỡng và hóa chất có các trạng thái vật lý và tính bền với nhiệt khác nhau nên được khử trùng bằng các phương pháp khác nhau

Khử trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực

- Nguyên tắc: Làm gia nhiệt môi trường, hoá chất và các dụng cụ nhờ hơi nước bão hoà dưới một áp suất lớn hơn áp suất khí quyển Khi áp suất tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo

- Tác dụng phối hợp giữa nhiệt độ cao và áp suất đảm bảo cho việc khử trùng được thực hiện tốt Khi hấp áp lực sẽ tiêu diệt các tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật Đồng thời có thể phân huỷ tốt các enzyme

- Các môi trường sẽ khử trùng trong nồi hấp áp lực được rót đến mức không quá nửa chiều cao của dụng cụ đựng chúng Các dụng cụ chứa môi trường không được vặn nắp quá chặt mà phải nới lỏng hoặc nút bằng nút bông Nút bông phải được làm cẩn thận, không quá lỏng và cũng không quá chặt, phải đảm bảo không cho vi sinh vật trong không khí nhiễm vào đồng thời cũng phải đảm bảo sự cung cấp không khí vào môi trường nuôi cấy Hơi nước khi khử trùng nhất thiết phải được đi qua nút vào bên trong dụng cụ để việc khử trùng đạt yêu cầu

- Hiện nay có rất nhiều loại nồi khử trùng, thông dụng nhất là những nồi điện có chế độ tính giờ tự ngắt điện

- Cách vận hành: Xem “Quy trình nồi hấp vô trùng” theo hãng cung cấp

- Khi hết thời gian khử trùng phải đợi cho áp suất trong nồi cân bằng với

áp suất khí quyển (nhiệt độ dưới 1000C) mới được mở nắp Nếu không, áp suất

hạ đột ngột sẽ dễ dẫn đến tai nạn, môi trường trong dụng cụ sôi lên làm trào ra ngoài làm mất tác dụng vô trùng Khi mở nắp tránh để mặt thẳng diện với nồi tránh bị bỏng bởi hơi nước, khi lấy các dụng cụ ra phải đi găng tay

- Sau khi khử trùng các dụng cụ, hoá chất, môi trường được bảo quản ở những nơi quy định

cụ lọc khuẩn đã khử trùng chỉ dùng một lần

IV AN TOÀN SINH HỌC

1 Khái niệm an toàn sinh học

Các phòng thí nghiệm sinh học, đặc biệt là phòng thí nghiệm vi sinh vật là môi trường làm việc đặc biệt, môi trường mở, môi trường thực hành các tác nhân sinh học như vi khuẩn, nấm mốc, virus và nhiều tác nhân khác gây bệnh cho người và động vật Do vậy, phòng thí nghiệm sinh học luôn tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm bệnh cho người làm việc trong phòng thí nghiệm và cộng đồng dân cư xung quanh Theo các công bố, trong những năm trước đây có nhiều trường hợp gây dịch bệnh thương hàn, bệnh tả, bệnh lở mồm long móng và bệnh uốn ván có nguyên nhân từ phòng thí nghiệm vi sinh vật và y sinh Theo thống kê, có tới khoảng 72% bệnh nhiễm trùng do lây nhiễm từ các phòng thí nghiệm, trong khi

đó các bệnh nhiễm trùng tự nhiên chỉ chiếm khoảng 16% tất cả các bệnh truyền nhiễm Các trường hợp mắc bệnh trong phòng thí nghiệm vi sinh vật và y sinh học phần lớn liên quan đến việc thao tác trong các phòng thí nghiệm không đúng cách như sử dụng miệng để hút pippette và sử dụng kim tiêm không đúng cách Theo Pike (1979), sự hiểu biết về nguyên nhân gây bệnh, kỹ thuật thực hành phòng thí nghiệm tốt và trang thiết bị đầy đủ, phù hợp có thể ngăn cản được hầu hết bệnh nhiễm trùng trong phòng thí nghiệm

Do đó, ở Mỹ người ta bắt đầu xây dựng các quy định, tiêu chuẩn hóa công tác phòng thí nghiệm y sinh học, các bản hướng dẫn chi tiết kỹ thuật, thiết bị và thực hành phòng thí nghiệm, công bố các tác nhân gây bệnh bản địa và ngoại lai

để khắc phục tình trạng trên Sổ tay “Phân loại các tác nhân dựa vào mối nguy hại” được xem như tài liệu tham khảo chung cho các hoạt động của phòng thí nghiệm có sử dụng các tác nhân sinh học gây bệnh tại Mỹ

Công nghệ sinh học hiện đại có nhiều tiềm năng phát triển cuộc sống con người, đáp ứng được nhu cầu thiết yếu về thực phẩm, nông nghiệp và sức khỏe con người Để tăng cường tính an toàn của công nghệ sinh học, giảm tối thiểu mối đe dọa tiềm tàng tới đa dạng sinh học và các nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe, an toàn sinh học là một trong những vấn đề được đề cập trong Công ước

cực có thể có trong các sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại Nghị định thư Cartagena về an toàn sinh học đề cập đến các biện pháp mà các bên tham gia cần thực hiện ở cấp quốc gia, nhằm xây dựng khung pháp lý có tính quốc tế để giải quyết vấn đề an toàn sinh học Mục tiêu của nghị định thư Cartagena là góp phần đảm bảo an toàn trong lĩnh vực chuyển giao, xử lý và sử dụng các sinh vật biến đổi gene có thể có tác động bất lợi đến việc bảo tồn và sử dụng bền vững đa dạng sinh học Nghị định thư chú trọng đặc biệt sự vận chuyển xuyên biên giới các sản phẩm biến đổi gen, và quan tâm đến sự ảnh hưởng của các yếu tố rủi ro đối với sức khỏe con người

Nhận thức an toàn sinh học là vấn đề có tính quốc tế quan trọng Từ năm

1983, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xuất bản lần đầu cuốn “Sổ tay an toàn sinh học phòng thí nghiệm” Sổ tay an toàn sinh học phòng thí nghiệm động viên các nước chấp nhận và thực thi các nguyên lý cơ bản trong an toàn sinh học

và đưa ra các quy định thực hành ở cấp quốc gia cho các thao tác vi sinh vật gây bệnh ở phòng thí nghiệm trong lãnh thổ của nước mình WHO là cơ quan kiểm soát quốc tế về an toàn sinh học Cuốn “Sổ tay an toàn sinh học phòng thí nghiệm” được tái bản lần thứ 3 (2004), nhấn mạnh trách nhiệm của các cá nhân

và bổ sung các quy định về đánh giá rủi ro, sử dụng an toàn kỹ thuật DNA tái tổ hợp và vận chuyển các vật liệu lây nhiễm bệnh

An toàn sinh học là việc áp dụng hiểu biết, kỹ thuật và phương tiện để ngăn chặn lây nhiễm cho môi trường, phòng thí nghiệm và con người trước những tác nhân có nguy cơ gây nhiễm (độc hại sinh học) Đưa ra các chính sách, điều kiện ngăn chặn để có thể thao tác trên các tác nhân gây nhiễm một cách an toàn Mục tiêu chính sách này hạn chế các độc hại sinh học, làm giảm nguy cơ lây nhiễm cho người tiếp xúc trực tiếp cũng như gián tiếp và môi trường trước các tác nhân có nguy cơ gây nhiễm

Trong lĩnh vực an toàn sinh học sinh vật biến đổi gen, theo Nghị định 69/2010/NĐ-CP của Chính phủ nước CHXHCN Việt Nam về An toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen, thuật ngữ An toàn sinh học được hiểu là các biện pháp quản lý để đảm bảo an toàn đối với môi trường, đa dạng sinh học, sức khỏe con người và vật nuôi

Như vậy, có thể hiểu an toàn sinh học (biosafety) là khái niệm chỉ sự bảo

vệ tính toàn vẹn sinh học Đối tượng của các chiến lược an toàn sinh học bao gồm biện pháp bảo vệ môi trường sinh thái và sức khoẻ con người

2 Phân loại các nhóm nguy cơ

Sự phát triển vượt bậc của ngành công nghệ sinh học đòi hỏi yêu cầu về các biện pháp quản lý an toàn sinh học cũng ngày càng khắt khe hơn Việc phân loại các nhóm rủi ro và cấp độ an toàn sinh học là nguyên tắc quan trọng, bảo đảm thực hiện an toàn sinh học có hiệu quả Tùy thuộc vào mỗi quốc gia, tổ chức và cá nhân, người ta đưa ra các phương pháp phân loại nhóm rủi ro và tiêu chuẩn cấp độ an toàn sinh học khác nhau

Vấn đề cốt lõi của thực hành an toàn sinh học là việc đánh giá rủi ro tác nhân sinh học Theo WHO năm 2004, các nguy hại của vi sinh vật lây nhiễm được phân loại theo 4 nhóm nguy cơ dựa vào tính chất gây bệnh của vi sinh vật

và khả năng điều trị

- Nhóm rủi ro loại 1 (Risk Group 1 - RG1) (không có hoặc có nguy cơ

thấp đối với cá nhân và cộng đồng): các vi sinh vật thuộc nhóm này thường không có khả năng gây bệnh cho người và động vật Một số vi sinh vật sau đây

được xếp vào nhóm này: Bacillus subtilis, B thuringiensis, E coli K12,

Lactobacillus acidophilus, Micrococcus leuteus, Aspergillus niger, động vật

nguyên sinh, sán lá gan, sán dây, giun tròn…

- Nhóm rủi ro loại 2 (Risk Group 2 - RG2) (có nguy cơ tương đối đối với

cá nhân và có nguy cơ thấp đối với cộng đồng): các tác nhân có thể gây bệnh cho người hoặc động vật, nhưng thường không phải là mối nguy hiểm cho nhân viên phòng thí nghiệm, cộng đồng, vật nuôi hay môi trường Phơi nhiễm phòng thí nghiệm có thể gây ra nhiễm trùng nghiêm trọng nhưng có biện pháp phòng ngừa, điều trị hữu hiệu và nguy cơ lan truyền trong cộng đồng thấp Ví dụ:

Human adenovirus A, B, C, D, E, F, G; Tacribe virus, Human coronavirus

229E, Human coronavirus NL63, Hepatilis B virus, Hepatilis C virus, Hepatilis

E virus, Human Herpes virus (HHV-5), Epstein – Barr virus (EBV), Chlamydia

hydrophilia, Bacillus cereus, Clostridium ssp., Enterococcus faecalis, E coli

(trừ chủng K12, O157:H7, O103), Klebsiella pneumoniae, Salmonella

choleraesuis, S enteritisis, Aspergillus fumigatus, Cadida albicans…

- Nhóm rủi ro loại 3 (Risk Group 3 - RG3) (có nguy cơ cao đối với cá

nhân và nguy cơ thấp đối với cộng đồng): Các tác nhân thường gây bệnh nghiêm trọng cho người hoặc động vật nhưng không lan truyền từ người sang người Có

các biện pháp phòng ngừa và điều trị hữu hiệu Ví dụ: Hantaan virus,

coronavirus SARS (Severe acute respiraory syndrome coronavirus), West Nile

virus, Yellow ferver virus chủng hoang dại, Virus cúm A H5, Virus cúm A H7,

Coxiella burnetii, Bacillus anthracis, Brucella spp., Burkholderia pseudomallei,

E coli O157:H7, E coli O103, Mycobacterium tuberculosis (vi khuẩn lao

người), Salmonella enterica, Salmonella serovar typhi, Blastomyces

dermatitidis…

- Nhóm rủi ro loại 4 (Risk Group 4 - RG4) (nguy cơ cao đối với cá nhân

và cộng đồng): Tác nhân thường gây bệnh nghiêm trọng cho người hoặc động vật và có thể lan truyền trực tiếp hoặc gián tiếp nhanh chóng từ người sang người Chưa có các biện pháp phòng ngừa và điều trị hữu hiệu Ví dụ: Guanarito virus, Junin virus, Lassa virus, Machupo virus, Sabia virus, Crimean – Congo herorhagic fever virus, Lake Victoria Marburg virus, Variola virus, Ebola virus…

Từ việc phân loại các nhóm rủi ro, người ta đã xây dựng các tiêu chuẩn cụ

dựng các phòng thí nghiệm an toàn sinh học ở các cấp độ nào cần dựa trên tính đặc trưng của phòng thí nghiệm, điều kiện của quốc gia đó nhưng phải tuân thủ các nguyên tắc quốc tế để đảm bảo an toàn cho mọi hoạt động của phòng thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng vào thực tế sản xuất

3 Phòng thí nghiệm an toàn sinh học

Trọng tâm của các biện pháp an toàn sinh học là phòng ngừa, ngăn chặn

sự lan truyền của các tác nhân sinh học gây nguy hại cho người làm việc, cho cộng đồng và môi trường Để thực thi tốt các biện pháp an toàn sinh học, cần xây dựng phòng thí nghiệm phù hợp với các cấp độ an toàn sinh học

Phòng thí nghiệm an toàn sinh học được hiểu gồm các phòng thí nghiệm nghiên cứu của các trường đại học, các viện nghiên cứu liên quan đến các tác nhân sinh học nguy hại, các cơ sở nghiên cứu và triển khai công nghệ, các cơ sở sản xuất và các phòng khám bệnh, chẩn đoán bệnh thuộc các cơ sở y tế, bệnh viện…

Căn cứ vào kết quả đánh giá an toàn sinh học có thể phân chia tác nhân sinh học thuộc một nhóm rủi ro nhất định, từ đó thiết kế phòng thí nghiệm và trang thiết bị an toàn tương ứng với cấp độ an toàn của nhóm rủi ro đó Ví dụ, một tác nhân sinh học được xếp vào nhóm rủi ro 2, đòi hỏi thiết kế phòng thí nghiệm cũng như các thiết bị an toàn và quy trình thực hành phải tuân theo quy định an toàn sinh học cấp độ 2 Do đó, sắp xếp mức độ an toàn sinh học được quyết định bởi các nhà chuyên môn, dựa trên việc đánh giá rủi ro các tác nhân sinh học chính xác

Tùy theo mục đích nghiên cứu và cấp độ an toàn sinh học mà tổ chức xây dựng các phòng thí nghiệm an toàn sinh học ở các cấp độ khác nhau Phòng thí nghiệm cơ sở là các phòng thí nghiệm có mức an toàn sinh học cấp độ 1 và cấp

độ 2; phòng thí nghiệm ở mức độ kiểm soát là phòng thí nghiệm có mức an toàn sinh học cấp độ 3 và phòng thí nghiệm có mức độ kiểm soát tốt đa là an toàn sinh học cấp độ 4 Những hướng dẫn cho những phòng thí nghiệm cơ bản – An toàn sinh học cấp độ 1 và 2 cần rất chi tiết và toàn diện, vì chúng là cơ sở cho phòng thí nghiệm của tất cả các cấp độ an toàn sinh học

3.1 Phòng thí nghiệm An toàn sinh học mức I (Biosafety level I – BLI):

Phòng an toàn sinh học mức I được áp dụng khi thao tác với các tác nhân thuộc nhóm nguy cơ rủi ro loại 1 Các điều kiện của phòng thí nghiệm an toàn sinh học mức I phải đảm bảo như sau:

Điều kiện về cơ sở vật chất:

- Có diện tích tối thiểu là 12m2 (không bao gồm diện tích để thực hiện các công việc hành chính liên quan đến thí nghiệm);

- Có cửa ra vào, cửa sổ chắc chắn và có khóa, tường, bàn thí nghiệm phải bằng phẳng, không thấm nước, chịu được nhiệt và các loại hóa chất ăn mòn;

- Có bồn nước rửa tay, vòi rửa mắt khẩn cấp, hộp sơ cứu;

- Có điện và nước sạch; đường ống cấp nước trực tiếp cho phòng thí nghiệm phải có van chống chảy ngược để bảo vệ hệ thống nước công cộng;

- Có các thiết bị phòng, chống cháy nổ

Điều kiện về trang thiết bị:

- Các thiết bị thí nghiệm phù hợp với kỹ thuật và loại vi sinh vật được thí nghiệm;

- Có các dụng cụ chứa chất thải đáp ứng tiêu chuẩn qui định đối với từng loại chất thải;

- Có thiết bị để khử trùng dụng cụ, mẫu phân tích và bệnh phẩm;

- Các trang thiết bị bảo hộ cá nhân phù hợp với các kỹ thuật thí nghiệm thực hiện trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp I

Điều kiện về nhân sự: Người phụ trách và nhân viên của phòng thí nghiệm phải có văn bằng, chứng chỉ đào tạo phù hợp và có giấy xác nhận đã qua tập huấn về an toàn sinh học từ cấp I trở lên do cơ quan có thẩm quyền trong nước hoặc nước ngoài cấp

3.2 Phòng thí nghiệm An toàn sinh học mức II (Biosafety level II – BLII):

Phòng an toàn sinh học mức II được áp dụng cho các thao tác với các tác nhân thuộc nhóm nguy cơ rủi ro loại 2 Ngoài các điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị như phòng thí nghiệm an toàn sinh học mức I, Phòng thí nghiệm an toàn sinh học mức II còn phải đáp ứng các điều kiện sau:

Điều kiện về cơ sở vật chất:

- Có diện tích tối thiểu là 20m2 (Không bao gồm diện tích để thực hiện các công việc hành chính liên quan đến thí nghiệm);

- Có hệ thống xử lý nước thải đạt quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về môi trường trước khi thải vào nơi chứa nước thải chung;

- Phải riêng biệt với các phòng thí nghiệm khác của cơ sở thí nghiệm;

- Có biển báo nguy hiểm sinh học theo quy định

Điều kiện về trang thiết bị:

- Có tủ an toàn sinh học cấp II và nồi hấp ướt tiệt trùng;

- Các trang thiết bị bảo hộ cá nhân phù hợp với loại kỹ thuật thí nghiệm thực hiện trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp II

Điều kiện về nhân sự: Người phụ trách và nhân viên của phòng thí nghiệm phải có văn bằng, chứng chỉ đào tạo phù hợp và có giấy xác nhận đã qua tập huấn về an toàn sinh học từ cấp II trở lên do cơ quan có thẩm quyền trong nước hoặc nước ngoài cấp

Hình 1 Phòng an toàn sinh học mức I (A) và Phòng an toàn sinh học mức II

(B) điển hình 3.3 Phòng an toàn sinh học mức III (Biosafety level III – BLIII)

Phòng an toàn sinh học mức III được áp dụng cho các thao tác với các tác

nhân thuộc nhóm nguy cơ rủi ro 3 Ngoài các điều kiện về cơ sở vật chất, trang

thiết bị như phòng thí nghiệm an toàn sinh học mức II, các điều kiện của phòng

thí nghiệm an toàn sinh học mức III phải đảm bảo như sau;

Điều kiện về cơ sở vật chất:

- Có hai phòng là phòng thực hiện thí nghiệm và phòng đệm trước khi vào

phòng thực hiện thí nghiệm Trong đó phòng thực hiện thí nghiệm phải có diện

tích tối thiểu là 20m2;

- Phải có hệ thống xử lý chất thải lỏng bằng hóa chất đạt quy chuẩn kỹ

thuật quốc gia về môi trường trước khi xả thải vào hệ thống thoát nước thải

chung;

- Phải tách biệt với các phòng thí nghiệm khác của cơ sở thí nghiệm, nếu

trong cùng một toà nhà thì phải được bố trí tại cuối hành lang nơi ít người qua

lại;

- Trước khi vào phòng thí nghiệm phải qua phòng đệm Phòng đệm phải

có áp suất thấp hơn so với bên ngoài;

- Phòng thí nghiệm phải bảo đảm kín để tiệt trùng; áp suất không khí

trong phòng thí nghiệm phải thấp hơn áp suất không khí trong phòng đệm;

- Hệ thống cửa phải bảo đảm các điều kiện sau:

+ Toàn bộ cửa sổ và cửa ra vào phải sử dụng vật liệu chống cháy, vỡ;

+ Có biển báo nguy hiểm sinh học theo quy định tại trên cửa ra vào

của phòng thí nghiệm;

+ Phải có hệ thống đóng mở tự động đối với cửa phòng đệm và phòng thí nghiệm Hệ thống này phải bảo đảm nguyên tắc trong cùng một thời điểm chỉ

có thể mở được cửa phòng đệm hoặc cửa phòng thí nghiệm;

- Hệ thống thông khí phải bảo đảm các điều kiện sau:

+ Phải thiết kế theo nguyên tắc một chiều; không khí ra khỏi phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp III phải qua hệ thống lọc đạt quy chuẩn kỹ thuật quốc gia trước khi thải ra môi trường;

+ Có hệ thống kiểm soát hướng của luồng khí cung cấp vào phòng thí nghiệm;

+ Có hệ thống báo động khi nhiệt độ, áp suất của phòng thí nghiệm không đạt chuẩn;

- Có vòi tắm cho trường hợp khẩn cấp trong khu vực phòng thí nghiệm và lối thoát hiểm trong trường hợp khẩn cấp

Điều kiện về trang thiết bị:

- Có tủ an toàn sinh học cấp II trở lên và nồi hấp ướt tiệt trùng đặt trong phòng thí nghiệm;

- Các trang thiết bị bảo hộ cá nhân phù hợp với phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp III

Điều kiện về nhân sự: Người phụ trách và nhân viên của phòng thí nghiệm phải có văn bằng, chứng chỉ đào tạo phù hợp và có giấy xác nhận đã qua tập huấn về an toàn sinh học từ cấp III trở lên do cơ quan có thẩm quyền trong

nước hoặc nước ngoài cấp

Hình 2 Phòng an toàn sinh học mức III điển hình 3.4 Phòng an toàn sinh học mức IV (Biosafty Level IV – BLIV)

Phòng an toàn sinh học mức IV sử dụng cho các thao tác đối với các tác nhân thuộc nhóm nguy cơ rủi ro loại 4 Điều kiện của phòng thí nghiệm phải đảm bảo các yêu cầu sau:

Điều kiện về cơ sở vật chất:

- Các điều kiện quy định đối với phòng an toàn sinh học cấp III và;

- Phải có phòng tắm và thay đồ giữa phòng đệm và phòng thí nghiệm;

- Hệ thống thông khí của phòng thí nghiệm còn phải bảo đảm các điều kiện sau:

+ Có hệ thống thông khí không tuần hoàn riêng cho tủ an toàn sinh học cấp III

+ Có hệ thống cung cấp khí độc lập cho bộ quần áo bảo hộ có khả năng cung cấp thêm 100% lượng khí trong trường hợp xảy ra sự cố về an toàn sinh học

Điều kiện về trang thiết bị:

- Các điều kiện về trang thiết bị như quy định đối với phòng an toàn sinh học mức III và;

- Có tủ an toàn sinh học cấp III và tủ hấp ướt hai cửa;

- Các trang thiết bị bảo hộ cá nhân phù hợp với phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp IV

Điều kiện về nhân sự: Người phụ trách và nhân viên của phòng thí nghiệm phải có văn bằng, chứng chỉ đào tạo phù và có giấy xác nhận đã qua tập huấn về an toàn sinh học cấp IV do cơ quan có thẩm quyền trong và ngoài nước cấp

Phần II

LÝ THUYẾT CÔNG NGHỆ CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1 KHÁI NIỆM

Trong công nghệ sinh học thực vật, nuôi cấy mô (tissue culture) là khái niệm chung của quá trình nuôi cấy trong ống nghiệm từ các nguyên liệu thực vật tách rời (dòng tế bào, mô, cơ quan, bộ phận…) trên môi trường nhân tạo ở điều kiện vô trùng Nuôi cấy mô được sử dụng cho nhân giống cây trồng, tạo cây sạch bệnh, tạo nguồn vật liệu cho cải biến di truyền thực vật, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh từ thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gene quý… Trong đó, ứng dụng phổ biến nhất của nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay là

phục vụ nhân giống vô tính in vitro

Nhân giống vô tính in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân

giống (micropropagation) là thuật ngữ chỉ việc tạo số lượng lớn cá thể thực vật

từ một hoặc nhiều bộ phận khác nhau của cây ban đầu bằng kỹ thuật nuôi cấy

mô Như vậy, nhân giống vô tính in vitro là một ứng dụng của nuôi cấy mô tế

bào thực vật Trong thực tế, thuật ngữ nuôi cấy mô và thuật ngữ nhân giống vô

tính in vitro đôi khi được sử dụng với hàm nghĩa như nhau

2 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết

về tính toàn năng (totipotence) của tế bào Theo nhà thực vật học người Đức Haberlandt G (1902), mỗi tế bào bất kỳ lấy từ một cơ thể đa bào đều mang toàn

bộ thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Khi tế bào chuyển sang giai đoạn biệt hóa, chỉ một tỷ lệ rất nhỏ các gene trong bộ gene phục vụ cho chức năng biệt hóa của tế bào còn các gene khác ở trạng thái ngủ nhưng chúng hoàn toàn giữ nguyên hoạt tính và trong điều kiện nhất định chúng sẽ bộc lộ và phát triển từ một tế bào thành cơ

hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ, hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy bộ phận, cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo ở điều kiện vô trùng

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là

kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ

tế bào phôi sinh Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là tế bào đã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia

Ví dụ như khi nuôi cấy mảnh lá hay đốt thân cây thuốc lá, ở điều kiện môi trường thích hợp, các tế bào đã phân hóa của lá, đốt thân sẽ phản phân hóa, phân chia trở lại thành mô sẹo, không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá, đốt thân nữa Nếu chuyển sang môi trường khác thì tùy theo thành phần môi trường

mà các tế bào mô sẹo có thể phân hóa theo các hướng khác nhau (hình thành rễ, chồi hay cây hoàn chỉnh )

- Tính toàn năng di truyền ở tế bào động vật

Ở động vật, những đường hướng để tế bào phát triển thành một cá thể mới gặp nhiều khó khăn vì nuôi cấy tế bào động vật thường phân chia thành một quần thể đồng nhất Trước năm 1997 nhiều tài liệu vẫn cho rằng tính toàn năng

di truyền của tế bào chỉ có ở thực vật và đặc tính này không có ở động vật bậc cao (động vật có vú) Trong tự nhiên, phương thức sinh sản vô tính khá phổ biến

ở thực vật (giâm cành, rễ, chồi ) và ở động vật bậc thấp như động vật ruột khoang, giun dẹp…Bởi vậy khi nói đến tính toàn năng di truyền của tế bào động vật nghĩa là nói đến khả năng nhân bản vô tính ở động vật bậc cao

Trong cơ thể sinh vật tế bào phát triển qua nhiều giai đoạn nhưng nhìn chung được phân làm hai dạng Tế bào chưa bị biệt hóa là dạng tế bào của hợp

tử, phôi, tế bào biệt hóa là dạng tế bào đã phân hóa có trong các mô cơ quan đảm nhận chức năng chuyên biệt

Năm 1968 J.B Gurdon – nhà khoa học người Mỹ đã thành công trong việc nhân vô tính tạo ra ếch trưởng thành từ tế bào biệt hóa của ruột ếch Gurdon lấy nhân của tế bào ruột ếch đưa vào tế trứng có nhân bị phá hủy bằng tia tử ngoại 1% tế bào trứng được ghép nhân sau đó phát triển thành ếch trưởng thành Điều này chứng tỏ, tế bào ruột ếch tuy đã bị biệt hóa theo chức năng của bộ máy tiêu hóa nhưng vẫn giữ nguyên thông tin di truyền và trong điều kiện nhất định đã bộc lộ để tạo ra ếch trưởng thành

Đối với động vật bậc cao, từ năm 1983 các nhà khoa học đã thực hiện thành công nhân vô tính đối với tế bào soma lấy ở giai đoạn phôi nang

Năm 1984 thực hiện ở cừu, 1986 thực hiện ở bò và sau đó là hang trăm con

bê đuợc tạo ra bằng nhân bản vô tính từ các tế bào ở giai đoạn phôi (chủ yếu ở giai đoạn phôi sớm) Tuy nhiên những nghiên cứu trong nhân bản vô tính ở động vật có vú trước năm 1997 chỉ thành công với tế bào soma ở giai đoạn phôi sớm (các tế bào chưa bị biệt hóa), nhân bản vô tính với tế bào soma ở giai đoạn

năm 1997 nhiều nhà sinh học cho rằng tế bào biệt hóa ở động vật bậc cao không

có tính toàn năng di truyền

Cừu Dolly – tác phẩm của nhân bản vô tính đầu tiên ở động vật bậc cao từ tế bào biệt hóa

Sự ra đời của cừu Dolly được công bô vào thang 2 năm 1997 tại Scotland thì mọi khái niệm về tính toàn năng di truyền của tế bào đông vật bậc cao mới thực sự thay đổi

Kỹ thuật nhân bản cừu Dolly được tóm tắt như sau:

Các tế bào trứng ở cừu cái được thu bằng các kích thích trứng chín và rụng Sau đó đựoc rửa và hút ra khỏi cơ thể cừu mẹ, phải tính toán thời gian để trứng làm thí nghiệm đang ở giai đoạn trung kỳ của phân bào giảm nhiễm lần hai nên chứa một lượng nhiễm sắc thể đơn bội Ở giai đoạn này nhiễm sắc thể tập trung trên một mặt phẳng nên rất rễ phát hiện dưới kính hiển vi, do vậy có thể dễ dàng loại bỏ chúng bằng vi phẫu thuật Sau đó các tế bào chứng đã hút nhân được nuôi cấy trong môi trường thích hợp như nhiệt độ nuôi cấy 370C, trứng nuôi cấy được hoạt hóa bằng xung điện để có thể thu nhận nhân lạ Hai nhà khoa học I Wilmut và K Camphell – tác giả của nhân bản cừu Dolly đã lấy nhân từ tế bào trứng đã bị hút nhân như đã nêu ở trên và chuyển nhân (2n) là nhân của tế bào tuyến vú đã bị biệt hóa Tháng 1 năm 1996 hai nhà khoa học đã tạo ra được 277 phôi, đưa các phôi này vào ống dẫn trứng của cừu cái Trong số đó chỉ có 29 phôi phát triển đến phôi đầu hoặc phôi nang 29 phôi tiếp tục được đem cấy vào

dạ con của 13 cừu mẹ để chúng mang thai và chỉ có duy nhất một phôi phát triển thành cừu con đó chính là cừu Dolly ra đời vào ngày 5-7-1996 Sự ra đời của cừu Dolly đánh giá một bước ngoặt trong phát triển công nghệ sinh học và cũng

là bằng chứng về tính toàn năng di truyền ở tế bào động vật bậc cao

Tuy nhiên cừu Dolly và những động vật nhân bản vô tính theo phương pháp trên đều có tuôi thọ không cao (cừu Dolly chết sau đó 5 năm) điều này cho thấy động vật nhân bản chưa phải là những cơ thể phát triển bình thường và hoàn chỉnh

3 QUY TRÌNH NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm các bước cơ bản như sơ

đồ tóm tắt sau:

Hình 2 Tóm tắt quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Chuẩn bị mẫu cấy: Đây là giai đoạn quan trọng quyết định quá trình

nuôi cấy mô thực vật Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng Mẫu cấy bao gồm các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân, củ… Tùy theo sự tiếp xúc với môi trường ngoài mà các bộ phận này sẽ có thể chứa vi khuẩn và nấm ở mức độ khác nhau do đó mẫu phải được vô trùng trước khi nuôi cấy Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến nhất hiện nay là sử dụng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn Hiệu lực diệt nấm và vi khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ hóa chất và khả năng thấm truyền của chúng vào mẫu cấy Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt vi khuẩn và nấm Trước khi xử lý dung dịch diệt khuẩn, vật liệu nuôi cấy thường được rửa bằng cồn 70% trong thời gian vài phút Đồng thời, người ta thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80

vô trùng mẫu là Ca(OCl)2 9 – 10%, HgCl2 01 - 1% Đối với các bộ phận bám nhiều bụi đất, trước khi xử lý mẫu cần được rửa kỹ bằng nước xà phòng loãng rồi rửa lại bằng nước máy

Trường hợp, mẫu cấy thu thập nhưng chưa sử dụng ngay, mẫu có thể được bảo quản và xử lý Mỗi loại cây đều có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm khi bảo quản Với cây nhiệt đới và á nhiệt đới, nhiệt độ 25oC và độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp

- Tái sinh mẫu nuôi cấy: Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ

quan từ mẫu nuôi cấy Quan trọng nhất là cần chú ý đến trạng thái sinh lý của mẫu Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu thì nuôi cấy càng có khả năng thành công bấy nhiêu Như vậy, tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào đỉnh sinh trưởng đang hoạt động (đỉnh ngọn, đầu rễ), sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách) Môi trường sử dụng để tái sinh mẫu nuôi cấy là môi trường cơ bản được bổ sung và điều chỉnh hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng phù hợp (tỷ lệ auxin/cytokinin)

- Nhân nhanh chồi: Mục tiêu chính của giai đoạn này là nhân nhanh số

lượng chồi, thể hiện tính ưu việt của phương pháp nhân giống vô tính in vitro

Môi trường nhân nhanh chồi thường là môi trường cơ bản được bổ sung hormone sinh trưởng như auxin, cytokinin, nước dừa, dịch chiết nấm men… kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Thời gian chiếu sáng thường khoảng 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux Ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hóa mạnh, nhiệt độ thích hợp từ 20-30o

C

- Tái sinh rễ, tạo cây hoàn chỉnh: Khi chồi đạt đến một kích thước nhất

định, mẫu được chuyển sang môi trường tái sinh rễ để tạo cây hoàn chỉnh Môi trường tái sinh rễ thường là môi trường cơ bản được bổ sung auxin (IBA, α-NAA, 2,4-D…) ở liều lượng thích hợp Tuy nhiên, ở một số cây như chuối thì

sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng

- Đưa cây ra đất: Ở giai đoạn này, cây được chuyển từ trạng thái dị dưỡng

sang tự dưỡng Vì vậy, cần phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến đổi của môi trường, thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây con để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất

4 MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài, bộ phận và mục đích nuôi cấy Thành phần môi trường còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như: duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy gồm: đường làm nguồn cung cấp carbon, khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng Ngoài ra, tùy thuộc và mục đích nuôi cấy có thể thêm một vài chất hữu

cơ có thành phần hóa học xác định như amino acid hoặc không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men hoặc các chất độn như agar

Một số loại môi trường cơ bản thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm: môi trường Murashige – Skoog (môi trường MS) phù hợp cho

cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm, môi trường Anderson (môi trường A) chuyên dùng cho việc nhân giống các cây thuộc họ Mẫu đơn (Rohododendron)

và một số loại cây gỗ thân nhỏ, môi trường Gramborg (môi trường G) sử dụng trong nuôi cấy mô cây đậu tương, nuôi tế bào trần, môi trường của hãng Sigma (môi trường V) và môi trường Phytamax (môi trường P) sử dụng trong nuôi cấy phong lan

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài, bộ phận và mục đích nuôi cấy vì vậy thành phần của môi trường là khác nhau Thành phần môi trường còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như: duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tọa mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh

- Đường làm nguồn cung cấp cacbon

- Khoáng đa lượng

- Khoáng vi lượng

- Các vitamin

- Chất điều hòa sinh trưởng

Ngoài ra, tùy thuộc vào mục đích cấy có thể thêm một vài chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định (axit amin ) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men), hoặc chất độn như thạch

4.1 Đường:

Trong nuôi cấy nhân tạo, đường cung cấp nguồn cacbon để mô tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối khi tế bào chưa có khả năng quang hợp hoặc chưa đảm nhận hoàn toàn chức năng quang hợp Hai dạng đường hay sử dụng nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn Tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ sucrose biến đổi từ 1 – 6%, thông dụng nhất là từ 2-3%

4.2 Các khoáng đa lượng:

Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ, Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino axít, vitamin, protein và các axít nucleic Tương tự,

Fe, Zn và Mo cũng là thành phần của một số enzym

Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy

mô và tế bào thực vật:

- Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P ) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ Nitơ, lưu huỳnh, phốtpho là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các axít nucleic và nhiều chất hữu cơ khác Canxi và axít boric

được tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màng sinh học

- Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzym (là các co-factor): magiê, kẽm, sắt và nhiều nguyên tố vi lượng là những phần quan trọng của các enzym

- Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật Ví dụ, K

và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzym

Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng

- Các nguyên tố đa lượng gồm 6 nguyên tố: Mg, Ca, P, S, N và K

- Các nguyên tố vi lượng gồm: Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Co, B, I, Ni, Cl, Al, Việc chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng chủ yếu dựa trên nhu cầu của thực vật đối với các chất này Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên

tố đa lượng là lớn hơn, với nồng độ  0,5 mM Các nguyên tố vi lượng được sử dụng trong môi trường ở nồng độ  0,5 mM

Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng lớn hơn Nguyên tố

đa lượng có nồng độ cao nhất trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nhìn chung cả phần anion và cation của các nguyên tố đa lượng đều quan trọng đối với tế bào thực vật Ví dụ như KNO3, cả K+

và NO3 là cần thiết Trong nhóm các nguyên tố đa lượng, các muối có chứa nitơ chủ yếu ở dạng kali nitrat, amonium hoặc canxi nitrat

Nguyên tố khoáng đa lượng gồm N, P, K, S, Mg và Ca, sử dụng với nồng

độ 30 mg/l môi trường nhằm cung cấp chất khoáng để cấu tạo tế bào, mô thực vật

như axit amin Tỷ lệ giữa Nitơ dạng amôn và nitrat thích hợp tùy loại cây và trạng thái phát triển mô

Nitrat được cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat Ca(NO3)2 4H2O, Kali nitrat KNO3, natri nitrat NaNO3 hoặc amôn nitrat NH4NO3 Amon cung cấp dưới dạng muối amon sulphat (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3 Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urê Tổng nồng độ của NO-3 và NH+4 trong môi trường thay đổi từ 3 đến 6 µM, thông thường khoản 20 µM Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ Nitrat có thể được vận chuyển theo mạch xylem đến các bộ phận của cây, tại đó nó sẽ tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ Nitrat có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng

Nguồn Phốtpho (P): Hai dạng phốtpho thường dùng nhất là NaH2PO4 7H2O và KH2PO4 với nồng độ môi trường từ 0,15 – 4 µM Phospho ở dạng

2

4

HPO  được hấp thụ nhờ hệ thống rễ của thực vật và ngược lại với nitrat, sunfat,

nó không bị khử Nó có thể có mặt trong thực vật dưới dạng P vô cơ hoặc dạng hợp chất este (R-O-P) Năng lượng thu được khi giải phóng một nguyên tử P khỏi các liên kết (cao năng lượng) là rất quan trọng đối với quá trình trao đổi chất của tế bào Trong tế bào bao gồm hai vùng dự trữ phosphat khác nhau Vùng trao đổi, chủ yếu phosphat ở dạng este, nằm trong tế bào chất và ty thể Vùng không trao đổi, chủ yếu là dạng P vô cơ, nằm trong không bào Nếu ngừng cung cấp P cho cây, nồng độ P vô cơ trong không bào ngay lập tức sẽ giảm trong khi ở vùng trao đổi tốc độ giảm chậm hơn nhiều Khi tăng cường cung cấp

P, nồng độ P chứa trong các cơ quan của tế bào cũng tăng theo, tuy nhiên khi tăng quá mức bình thường thì chỉ có P vô cơ trong không bào tăng lên Vì vậy

có thể nói, P dư thừa được dự trữ ở không bào dưới dạng P vô cơ

Nguồn Kali (K): Cung cấp cho môi trường nuôi cấy ở dạng kali nitrat KNO3, kali clorua KCl2, kali photphat (KH2PO4) Nồng độ K+ trong môi trường

từ 2 đến 25 µM Trong thực vật, K+ là một cation có tính linh động cao, ở cả mức độ tế bào cũng như trong quá trình vận chuyển qua các khoảng cách dài