Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm NPV (nucleo polyherosis) trên ký chủ sâu khoang spodoptera litura

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NPV NUCLEO POLYHEDROSIS VIRUS TRÊN KÝ CHỦ SÂU KHOANG SPODOPTERA LITURA Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NPV (NUCLEO

POLYHEDROSIS VIRUS) TRÊN KÝ CHỦ SÂU

KHOANG SPODOPTERA LITURA

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện:

LÊ THỊ HOÀNG NHƯ 1411100083

Lớp: 14DSH01

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của chúng tôi dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kỳ hình thức nào

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Hoàng Như

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình chúng em Cảm ơn bố mẹ đã nuôi nấng và tạo điều kiện cho chúng em học tập để chúng em có thành quả như ngày hôm nay

Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng em đã được các Thầy Cô trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đồ án Chúng em xin chân thành cám ơn đến Thầy Cô, nhờ có Thầy

Cô đã trang bị kiến thức cho chúng em để có thể thực hiện đồ án này Chúng em cũng xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thí nghiệm và các bạn cùng khóa đã quan tâm, giúp đỡ

và tạo điều kiện để chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này Chúng em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe trân trọng nhất

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Hoàng Như

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Mục tiêu nghiên cứu 1

4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG I 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về sâu khoang Spodoptera litura 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái của sâu khoang 3

1.1.2 Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại 4

1.1.3 Mức độ gây hại 6

1.2 Các biện pháp phòng trừ sâu khoang 6

1.2.1 Biện pháp canh tác, kỹ thuật 6

1.2.2 Biện pháp sinh học 6

1.3 Giới thiệu về Nucleo Polyhedrosis Virus 7

1.3.1 Giới thiệu chung 7

1.3.2 Đặc điểm hình thái của NPV 9

1.3.3 Cơ chế diệt sâu của NPV 11

1.3.4 Hiệu lực diệt sâu của NPV 13

1.3.5 Ưu điểm và nhược điểm của NPV 14

1.3.5.1 Ưu điểm của chế phẩm NPV 14

1.3.5.1 Nhược điểm của chế phẩm NPV 15

1.4 Các nghiên cứu sử dụng NPV để trừ sâu khoang 15

1.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước 15

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước 17

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm NPV 18

1.5.1 Nồng độ lây nhiễm 18

1.5.2 Tuổi sâu 19

1.5.3 Thời gian thu hoạch sâu chết 19

1.6 Quy trình sản xuất chế phẩm NPV 20

1.7 Các sản phẩm NPV trên thị trường 22

CHƯƠNG II 23

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 23

2.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

2.1.2 Vật liệu 23

2.1.3 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 23

2.1.3.1 Hóa chất 23

2.1.3.2 Dụng cụ 23

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV 24

2.2.1.1 Chuẩn bị dịch huyền phù NPV 25

2.2.1.2 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ 26

2.2.1.3 Các nghiệm thức bố trí 28

2.2.2 Ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu 30

2.2.2.1 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ 31

2.2.2.2 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 33

2.2.3 Ảnh hướng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV 35

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG III 37

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV 37

3.1.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ trên sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi và 11 ngày tuổi 37

3.1.2 Đánh giá sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây nhiễm 39

3.2 Ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu 40

3.2.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm 40

3.2.2 Khối lượng sâu chết (g/sâu) ở công thức dịch thô và dịch ly tâm 42

3.2.3 Tổng vi sinh vật hiếu khí có trong thức ăn sau khi nhiễm 01 ngày 43

3.2.4 Đánh giá sản lượng virus có trong mỗi sâu chết (PIB/sâu chết) giữa công thức dịch thô và dịch ly tâm 44

3.3 Ảnh hướng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV 43

3.3.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm 43

3.3.2 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm……… 46

CHƯƠNG IV 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1 Kết luận 47

4.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

Tài liệu Tiếng Việt 48

Tài liệu Tiếng Anh 48

Tài liệu Internet 56

PHỤ LỤC 1 57

DANH MỤC HÌNH ẢNH 57

Công thức 1 – Dịch thô 57

Công thức 2 – Dịch ly tâm 58

Công thức 3 – Đối chứng 58

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 58

Sâu chết ở công thức ảnh hưởng về thời gian……… … 62

PHỤ LỤC 2 63

SỐ LIỆU THÔ 63

1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm 63

1.1 Hiệu lực diệt sâu……….……….…… 63

1.2 Sản lượng virus thu được trên tổng số sâu chết……….67

2 Ảnh hưởng của dịch thời gian lây nhiễm 68

2.1 Số sâu chết 68

2.2 Khối lượng sâu ở các công thức 71

2.3 Sản lượng virus ở các công thức 72

3 Ảnh hưởng của dịch ly tâm và dịch thô 75

3.1 Số sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm 75

3.2 Khối lượng sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm 76

3.3 Sản lượng virus ở công thức dịch thô và dịch ly tâm 77

3.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở công thức dịch thô và dịch ly tâm 77

PHỤ LỤC 3 78

XỬ LÝ SỐ LIỆU 78

1 Hiệu lực diệt sâu sau 8 ngày lây nhiễm của các nồng độ ở sâu 7, 9, 11 ngày tuổi 78 2 Sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây nhiễm 80

3 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm 801

4 Khối lượng (g) sâu chết ở công thức dịch thô và dịch ly tâm 86

5 Sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở công thức dịch thô và dịch ly tâm 87

6 Tổng vi sinh vật hiếu khí sau khi nhiễm 1 ngày 87

7 Hiệu lực diệt sâu ở công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h 889

8 Khối lượng (g) sâu chết ở công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h 90

9 Sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h 912

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Spodoptera litura 3

Hình 1.2 Vòng đời sâu khoang 4

Hình 1.3 Cấu tạo của Nucleo Polyhedrosis Virus 8

Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của virus NPV vào côn trùng 12

Hình 1.5 Chu trình sống của virus côn trùng 12

Hình 1.6 Biểu hiện của sâu chết do NPV 13

Hình 1.7 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm virus trừ sâu 20

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV 24

Hình 2.2 Sơ đồ các bước tinh sạch dịch NPV 25

Hình 2.3 Nguồn sâu làm thí nghiệm 26

Hình 2.4 Thức ăn nhân tạo 27

Hình 2.5 Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm 27

Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm 28

Hình 2.7 Quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus 30

Hình 2.8 Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm 31

Hình 2.9 Sâu tuổi 4 32

Hình 2.10 (A) CT1-Dịch thô; (B) CT2-Dịch ly tâm; (C) CT3-Đối chứng 33

Hình 2.11 Quy trình định lượng vi sinh vật hiếu khí 34

Hình 2.12 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV 35

Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở công thức dịch thô, dịch ly tâm 42

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở công thức 6h, 12h, 24h, 48h, 96h 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm 29

Bảng 3.1 Hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ NPV trên sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi, 11 ngày tuổi 37

Bảng 3.2 Sản lượng NPV thu được ở các độ tuổi và nồng độ nhiễm 39

Bảng 3.3 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thô và dịch ly tâm 41

Bảng 3.4 Khối lượng sâu chết nhiễm NPV của dịch thô và dịch ly tâm 42

Bảng 3.5 Kết quả định lượng vi sinh vật hiếu khí sau 01 ngày nhiễm giữa các công thức dịch thô và dịch ly tâm 43

Bảng 3.6 Sản lượng virus có trong mỗi sâu ở công thức dịch thô và dịch ly tâm 44

Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu (%) ở các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm 44

Bảng 3.8 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus PIB/sâu chết ơ các công thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm 46

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Sâu khoang S.litura là loài sâu ăn tạp, gây hại trên nhiều loài cây trồng (Matsuura

and Naito 1997; Sahayaraj and Paulraj 1998) Các nghiên cứu cho biết, sâu khoang đã kháng lại với nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học dẫn đến sự bùng phát thành dịch và sự thất bại của biện pháp quản lý loài sâu hại này (Ahmad et al 2007, Hong Tong et al, 2013) Biện pháp sinh học đã được quan tâm và sử dụng để quản lý sâu khoang ăn tạp, trong đó

có virus côn trùng thuộc họ Baculovirus Nucleopolyhedrosis thuộc họ Baculovirus đã

được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu do khả năng gây chết sâu cao nhưng lại an toàn đối với thiên địch và và các sinh vật khác bao gồm động vật có vú và thực vật (Tohnishi

et al., 2005; Shaurub et al., 2014; Nasution et al., 2015) Vì vậy, NPV (Nucleo

Polyhedrosis Virus), được khuyến cáo sử dụng trong hệ thống phòng trừ tổng hợp

Tại trường đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, SLNPV (NPV

Spodoptera liturI đã được phân lập và đã được chứng minh có hiệu quả cao đối với sâu

khoang ăn tạp (Nguyễn Thị Hai và Nguyễn Hoài Hương, 2015) Tuy nhiên, quy trình sản xuất và tạo chế phẩm vẫn chưa hoàn thiện Trên cơ sở đó, nhóm sinh viên tiến hành

đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất NPV (Nucleo polyhedrosis

virus) trên ký chủ sâu khoang Spodoptera litura”

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định tuổi sâu, nồng độ lây nhiễm, thời gian và loại dịch gốc lây nhiễm để sản xuất SLNPV

3 Mục tiêu nghiên cứu

Đưa ra được tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm phù hợp để sản xuất NPV

Đưa ra được thời gian phơi nhiễm sâu đạt tỷ lệ chết cao

Xác định được loại dịch giống để nhân virus

4 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu và liều lượng nhiễm đến sản lượng NPV

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến hiệu lực gây chết và sản

lượng NPV

Khảo sát ảnh hưởng của dịch thô và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về sâu khoang Spodoptera litura

Tên khoa học: Spodoptera litura

Tên thường gọi: Sâu khoang, Sâu bông, Sâu thuốc lá, Sâu bông Ai Cập,

Họ: Noctuidae

Bộ: Lepidoptera

Hình 1.1 Spodoptera litura (Ahmad cheraghian, 2014)

1.1.1 Đặc điểm hình thái của sâu khoang

Trứng có hình cầu, kích thước khoảng 0,35-0,45mm Trứng được đẻ thành ổ, từ 20-350 trứng mỗi ổ Thông thường mỗi ổ trứng được bao phủ bằng lông tơ từ bụng con cái, có màu trắng kem tới nâu nhạt; lớp lông tơ này thường rất rõ ràng, nhưng đôi khi chỉ

có một ít xuất hiện trên ổ trứng Bề mặt trứng có những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ô nhỏ (Pearson, 1958; CABI, 2009)

Sâu non mới nở có màu xanh sáng, dài khoảng 1mm, đầu to đen bóng Sâu non đẫy sức có màu xám tro đến nâu đen, vạch lưng màu vàng ở đốt bụng thứ nhất có khoang đen to nên được gọi là sâu khoang Sâu có 5- 6 tuổi, đẫy sức trước khi hóa nhộng dài 38-

50 mm Sâu làm nhộng trong đất (Hill, 1975; USDA, 1982; CABI,2009)

Nhộng dài từ 15-22mm, có màu xanh nõn chuối, rất mềm ngay khi mới được

hình thành, sau đó chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng có màu nâu, thân cứng dần và có màu nâu đỏ Khi sắp vũ hoá, nhộng có màu nâu đen, các đốt cuối của nhộng

có thể cử động được Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh mép trước đốt bụng thứ 5-7 có nhiều chấm lõm, cuối bụng có một đôi gai ngắn (USDA, 1982; CABI, 2009)

Trưởng thành có chiều dài thân khoảng 14-18 mm, sải cánh rộng từ 35-45mm Cánh trước màu nâu vàng, giữa cánh có vân trắng, cánh sau màu trắng óng ánh Ngực

và bụng màu màu nâu nhạt với những chùm lông trên bề mặt lưng (Hill, 1975; USDA, 1982)

1.1.2 Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại

Vòng đời của sâu khoang được ghi nhận như sau:

Thời gian trứng: 2-6 ngày;

Sâu non có 6 tuổi: 12-37 ngày;

Tiền nhộng: 1-4 ngày;

Nhộng: 4-14 ngày;

Trưởng thành: 5-8 ngày;

Vòng đời trung bình của sâu khoang từ 25-48 ngày

Hình 1.2 Vòng đời sâu khoang

(http://tiennong.vn/w79/sau-khoang-sau-an-tap-hai-rau-dau-spodoptera-litura.aspx)

Hai đến năm ngày sau khi vũ hóa, trưởng thành cái bắt đầu đẻ trứng, một trưởng thành cái đẻ từ 50 đến 300 trứng theo từng ổ ở mặt dưới của lá (ký chủ) Trứng nở trong ba đến bốn ngày (Chari và Patel, 1983) Một trưởng thành cái có thể đẻ là 1.500 đến 2.500 trứng trong khoảng sáu đến tám ngày Cây thầu dầu là loại vật chủ được ưa chuộng nhất cho các con cái đẻ trứng (Chari và Patel, 1983) Các cánh đồng mới được tưới nước cũng rất hấp dẫn đối với những con cái đẻ trứng

Sâu khoang thường trải qua 6 tuổi Sâu tuổi 1 đến tuổi 3 không lẩn trốn ánh sáng Sâu từ tuổi 4 đến tuổi 6 chui xuống đất, có hiện tượng lẫn trốn ánh sáng nên ban ngày thường ẩn nấp ở những chỗ kín trên mặt đất, hoặc chui xuống những khe nẻ ở dưới mặt đất và đến tối thì chui lên để gây hại Khi sâu đẫy sức thì chui xuống đất hoá nhộng, trước khi hoá nhộng nó làm một kén bằng đất có hình bầu dục rồi chui vào đó hoá nhộng (Chari và Patel, 1983)

Nhộng thường vũ hoá vào buổi chiều mát và vào lúc chập tối, sau khi vũ hoá vài giờ trưởng thành có thể bắt đầu giao phối và vào đêm hôm sau thì bắt đầu đẻ trứng Tuổi thọ trung bình của trưởng thành cái là 8,3 ngày và có thể đẻ được 2.673 trứng Tuổi thọ trung bình của trưởng thành đực là 10,4 ngày (Yamanaka và cộng sự, 1975; Ahmed và cộng sự, 1979) Theo Yamanaka et al (1975), trung bình một trưởng thành cái có thể đẻ được 2000 – 2600 quả, thời gian đẻ trong trong khoảng 5 ngày ở 25 ° C (77 ° C)

Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng Sâu cắn phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng, sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn nắp Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm Sâu vừa nở gặm vỏ trứng và sống tập trung 1-2 ngày, nếu bị động sâu bò phân tán hoặc nhả tơ buông mình xuống đất Sâu tuổi 1-2 chỉ ăn gặm phần diệp lục của lá và chừa lại lớp biểu bì trắng, từ tuổi 3 trở đi sâu ăn phá mạnh cắn thủng lá và gân lá Ở tuổi lớn khi thiếu thức ăn, sâu còn tập tính ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân, cành, trái non Sâu non phát triển thích hợp ở nhiệt độ và ẩm độ cao Khi làm nhộng, sâu chui

xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong có hóa nhộng (Nguyễn Văn Huỳnh

và Lê Thị Sen, 2004)

1.1.3 Mức độ gây hại

Sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) là loài sâu hại nguy hiểm cho nền nông

nghiệp của nhiều nước ở châu Á, châu Phi và vùng Thái Bình Dương Loài sâu này ăn tạp và gây hại cho hơn 150 loài cây trồng khác nhau và là loài sâu hại chính trên các loài cây trồng có giá trị kinh tế như bông, đậu nành, cà chua, thuốc lá, bắp, khoai tây và các loài cây rau ăn lá (Hill, 1993 ; Rao et al, 1993) Sâu khoang phân bố khắp nơi trên thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt đới như: Ấn Độ, Pakistans, Banglades, Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, các nước Đông Nam Á (Hill, 1993; Singh and Jalali, 1997)

1.2 Các biện pháp phòng trừ sâu khoang

1.2.1 Biện pháp canh tác, kỹ thuật

Vệ sinh đồng ruộng trước và sau khi trồng, cày ải phơi đất, phơi và xử lý thuốc trừ sâu hoặc cho ruộng ngập nước 2-3 ngày để diệt nhộng, sâu non có trong đất

Phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu, ngắt bỏ ổ trứng hoặc tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phân tán đi xa

1.2.2 Biện pháp sinh học

Hạn chế phun thuốc để bảo tồn các loài thiên địch thường xuất hiện trên ruộng Nhiều tác nhân sinh học đã được sử dụng để trừ sâu khoang ăn tạp như: các loại nấm côn

trùng Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosorosea (Asi et

al, 2013), vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Agsaoay, 1998)

Ngài sâu khoang có khuynh hướng thích mùi chua ngọt và ánh sáng đèn, do đó

có thể dùng bẫy bả chua ngọt để thu hút bướm khi chúng phát triển rộ Bả chua ngọt gồm

4 phần giấm + 1 phần mật + 1 phần rượu + 1 phần nước Sau đó đem bả mồi vào chậu rồi đặt ở ngoài ruộng vào buổi tối nơi thoáng gió có độ cao 1m so với mặt đất Dùng bẫy pheromone để dự báo trước sự đẻ trứng của sâu ăn tạp Hàng ngày theo dõi dự báo sự

phát triển của sâu qua bẫy pheromone, thường xuyên ngắt bỏ ổ trứng và diệt ấu trùng trên những ruộng dẫn dụ

Dùng hoa hướng dương hay các loài cây có thể dẫn dụ sâu ăn tạp trồng xung quanh ruộng canh tác để dễ dàng tiêu diệt

Dùng sản phẩm sinh học có nguồn gốc nấm, vi khuẩn khi có những dấu hiệu cắn phá lá đầu tiên Thông thường 10 ngày sau phải phun thuốc lại

Các loại chế phẩm vi sinh: thuốc có nguồn gốc từ Bt như V-BT; Biocin 8000 SC, Dipel 32 WP hoặc thuốc thảo mộc như Rotenone hoặc Neem Có thể dùng thuốc gốc Cúc tổng hợp như Karate 2.5 EC, SecSaigon 5 EC… / các loại thuốc có hoạt chất Emamectin; Lufenuron hay hỗn hợp (Chlorantraniliprole + Abamectin)…

1.3 Giới thiệu về Nucleo Polyhedrosis Virus

1.3.1 Giới thiệu chung

Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) thuộc nhóm Baculovirus, là virus ký sinh trong

nhân tế bào chủ và có thể vùi hình đa diện Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) là virus có

thể bao hàm (một tập hợp các hạt virus hay còn gọi là virion và được bao bọc bởi một lớp vỏ protein) hình đa diện còn gọi là PIB (Polyhedral inclusion body) Virus nhân lên

và tạo các thể bọc trong nhân của tế bào vật chủ Thể bao hàm của NPV có kích thước

từ 0,15 - 15µm bên trong chứa nhiều hạt virus (virion) có vỏ bọc Loại virus này có thể gây hại trên 400 loài côn trùng và lây bệnh rất mạnh với nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera, tập trung ở 2 họ chủ yếu ngài đêm Noctuidae, ngài sáng Pyralidae Ngoài ra chúng còn gây chết trên các bộ khác như bộ cánh màng (31 loài), bộ 2 cánh (27 loài) (Grzywacz et al, 2005)

Hình 1.3 Cấu tạo của Nucleo Polyhedrosis Virus (Jean Adams, 2012)

(A) Các hạt Baculovirus, hay được gọi là thể vùi (PIBs)

(B) Mặt cắt ngang của PIB (C) Sơ đồ mặt cắt đa diện hoặc mặt cắt PIB hiển thị nhiều nucleocapsids bên trong mỗi virion, các virion được bao bọc bởi lớp vỏ protein NPV có tính chuyên hóa rất cao Thông thường, NPV của loài sâu nào chỉ ký sinh

và gây chết loài sâu đó (chuyên tính cho từng loài, theo FAO, 2003) Chỉ có một số có phổ ký chủ tương đối rộng như AcMNPVgây nhiễm hơn 30 loài thuộc 10 họ của bộ cánh

vảy, Anagrapha falcifera NPV gây nhiễm 31 loài thuộc 10 họ của cánh vảy Lepidoptera

và MbMNPV gây nhiễm 32 loài thuộc bộ cánh vảy (Gröner, 1986; Doyle et al., 1990,

Hostetter and Puttler, 1991) NPV của sâu thuộc chi Helicoverpa có thể gây chết 5 loài

sâu thuộc chi này

Khả năng phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV: Kinh nghiệm của các nước trên thế giới cho thấy, việc sử dụng bừa bãi thuốc hóa học đã không thể quản lý được sự bùng phát và gây hại của các loài sâu bộ cánh vảy nói chung và sâu khoang nói riêng Các nghiên cứu cho thấy, sâu khoang ăn tạp đã kháng lại với nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học thuộc nhóm Carbamate, lân hữu cơ và Pyrethroid (Venkateswarlu và cộng sự, 2005)

Nhiều biện pháp thay thế mang tính thân thiện với môi trường đã được sử dụng Trong số đó, NPV được coi là tác nhân hứa hẹn nhất và cho kết quả tương đương với

thuốc hóa học (Rober et al, 1991; Ravishanka and Venkatesha, 2010; Hochberg, 1991; Gitanjali et al, 1994; Vinay, 1997) Virus côn trùng đặc biệt là NPV có hiệu quả cao đối

với các loài sâu bộ cánh vảy như sâu xanh Helicoverpa armigera, sâu khoang Spodoptera

litura, sâu xanh da láng Spodoptera exigua (Vinod Kumari and Singh, 2009) Các nghiên

cứu chỉ ra rằng, sâu khoang ăn tạp rất mẫn cảm với NPV và NPV này đã được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc trừ sâu khoang ở nhiều quốc gia trên thế giới (Jayaraj et al,

1980, Ravishanka and Venkatesha, 2010)

1.3.2 Đặc điểm hình thái của NPV

NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi

Theo Nguyễn Thị Như Quỳnh (2014), NPV có cấu tạo gồm: vỏ ngoài, vỏ capsid,

và lõi acid nucleic

Vỏ ngoài: là một lớp màng nhầy ngoài cùng có tính chất là protein và gọi là protein

ngoài Protein ngoài mang trính kháng nguyên và có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ

Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp keo dính Protein cấu tạo nên vỏ Capsid được gọi là protein trong Protein trong mang tính kháng nguyên làm tăng khả năng gây bệnh của virus

Genom: Genom của virus NPV là một phân tử DNA gồm 2 mạch xoắn kép (DNAds) Khi nhiễm vào tế bào vật chủ virus tuồn lõi DNA vào tế bào vật chủ, DNA của virus sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của DNA Mặt khác khi tế bào bị nhiễm virus, DNA của vi rút sinh ra men azenaza ức chế DNA của tế bào chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do

Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, DNA (lõi ), virus tiến hành lắp ráp

để tạo thành thể virus mới

Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích thước

từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ lipoprotein bao quanh một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nucleocapsid), trong có chứa các virion, các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide Trong số polypeptide đó thì có khoảng 4 - 11 polypeptide được kết hợp với nucleocapsid và số polypeptide còn lại kết hợp với capside DNA ở dạng sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x 106 các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi

Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắt là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn, nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid – Multiple

Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong, đường kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid) Nucleocapsid bao gồm hai loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al, 1978)

Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc, mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid Lớp

vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972., Kelly, D.C.,

1982, 1985)

Cấu tạo của khối đa diện (Polyhedra): Theo Crook, N.E et al (1982) thì polyhedra

là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus

đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo Polyhedra còn bao gồm nhiều polypeptide Protein polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972) Polyhedral có đặc điểm là ổn định

ở pH trung tính pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust, R.M et al , 1966) Minon, F et al (1979) còn cho biết polyhedra hoàn thiện được một lớp vỏ có hình thái riêng biệt vây quanh, chức năng của lớp vỏ này chưa được xác định

1.3.3 Cơ chế diệt sâu của NPV

Khi sâu non ăn thức ăn vào ruột có chứa virus (NPV) lẫn với thức ăn, các thể bao

hàm (PIB) của virus sẽ đi vào ruột giữa của côn trùng và sẽ bị phân giải dưới tác động

của điều kiện môi trường kiềm (pH 9 – 11) Các thể bao hàm sẽ bị hòa tan để giải phóng

ra các virion Các virion này đi vào các tế bào ruột giữa Ở đây, chúng sử dụng bộ máy của tế bào vật chủ thực hiện quá trình sao chép, phiên mã và tạo ra các virion mới Từ

đó, các virion mới này sẽ tiếp tục tấn công sang các tế bào khác của cơ thể như huyết tương, ống tiêu hóa, biểu bì Trong các tế bào này, xảy ra quá trình hình thành lớp vỏ protein, bao bọc các virion để tạo thành hàng triệu các thể bao hàm (PIB) và cũng là lúc toàn bộ cơ thể sau đã bị phá hủy và sâu non bị chết Các thể bao hàm giải phóng ra bên ngoài để lây nhiễm cho các tế bào khác (Kalmakoff và Ward, 2003) Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hóa

bị biến dạng) Nếu ngài vũ hóa được thì ở giai đoạn trưởng thành (khả năng đẻ trứng sẽ giảm) và ảnh hưởng tới các thế hệ sau Nguồn virus tồn động trong tự nhiên lại lây nhiễm cho các thế hệ mới Trên cơ sở khoa học này, virus gây bệnh cho côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp sinh học để phòng chống sâu hại cho cây trồng (Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014)

Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của virus NPV vào côn trùng

(Kalmakoff và Ward, 2003)

Hình 1.5 Chu trình sống của virus côn trùng (Jim McNeil 2010)

Sâu non không có biểu hiện gì rõ rệt và không thay đổi về thức ăn Sau 5-7 ngày các đốt thân sưng phồng lên, căng mộng nước Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục,

da bở, dễ bị vỡ Trước khi chết sâu thường leo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây, trút đầu xuống đất Dịch chiết trắng chảy ra ngoài và sâu chết (hiện tượng sâu chết treo) Dịch trắng tiếp tục chảy (Phạm Thị Thùy, 2010)

Hình 1.6 Biểu hiện của sâu chết do NPV

(Nguồn:

https://sinhhoc247.com/virus-gay-benh-va-ung-dung-cua-virus-trong-thuc-tien-a5088.html)

1.3.4 Hiệu lực diệt sâu của NPV

Phụ thuộc vào điều kiện bảo quản chế phẩm Mẫu NPV được lưu trữ trong điều kiện lạnh, có thể duy trì hiệu quả của nó lên đến 8 tháng (100%), và đến tháng thứ mười,

có một sự suy giảm nhẹ (97,50%) nhưng nó không đáng kể, trong khi mẫu NPV được lưu trữ trong nồi đất và ở nhiệt độ phòng (cả trong chai màu hổ phách và chai thủy tinh) hiệu quả được duy trì lên đến 4 tháng và sau đó độc lực bắt đầu giảm do tăng hoạt tính của vi khuẩn

Sự thay đổi trong pH của huyền phù virus được lưu trữ trong điều kiện lạnh là rất chậm từ axit đến bình thường (5-7) pH như chống lại kiềm ở điều kiện môi trường xung quanh Chủ yếu là do sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác và điều kiện ấm, dẫn đến giảm độc lực của các cơ quan virus Nhiều nhà khoa học đã báo cáo rằng virus có thể

được bảo quản trong hơn 10 năm ở mức 40C mà không bị mất độc lực Độc lực hiệu quả nhất khi pH trung tính và giảm khi pH cao

Độc lực của virus phụ thuộc vào chất lượng của virus, điều kiện bảo quản và thời gian lưu trữ, nhiệt độ và độ pH của sản phẩm

Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang Sâu càng nhỏ mức độ mẫn cảm càng cao (Boucias et al, 1980; Bucher and Turnck, 1983; Smith and Vlak, 1988; Mohammad et al, 2002) Giá trị LC50 NPV trên sâu khoang từ tuổi 1 đến tuổi 4 được ghi nhận tương ứng là 3,2 x 106; 1,1 x 107; 1,3 x 107 và 4,7 x

107 PIB/ml (Mahammad et al, 2002)

1.3.5 Ưu điểm và nhược điểm của NPV

1.3.5.1 Ưu điểm của chế phẩm NPV

Hiệu lực diệt sâu của NPV tương đương như thuốc hóa học Ngoài chỉ tiêu về hiệu lực diệt sâu, nuclear polyhedrosis được sử dụng rộng rãi là do chúng rất an toàn với môi trường Theo Szewczyk và cộng sự (2009), Baculovirus nói chung và NPV nói riêng chỉ gây bệnh cho duy nhất ngành chân đốt mà không làm ảnh hưởng đến động vật có

xương sống, cây trồng và các vi sinh vật khác Vì tính chuyên hóa cao nên NPV không

gây độc cho các loài thiên địch, các động vật máu nóng và con người (Ignoffo, 1997; Monobrullah et al, 2000) Mặt khác, các loài thiên địch không những không bị hại bởi NPV mà chúng còn có vai trò phát tán NPV trong quần thể sâu hại, góp phần quan trọng trong việc phát triển dịch bệnh cho sâu hại trên đồng (Trang và cộng sự, 2003) Do NPV không độc đối với các loài côn trùng có ích và các sinh vật khác, bao gồm động vật có

vú và cây trồng (Groner, 1986; Payne,1986; Carbonell, 1987) nên chúng được sử dụng trong chương trình phòng trừ tổng hợp sâu hại cây trồng (Monobrullah và Nagata, 2000) Mặt khác, việc sử dụng NPV để trừ sâu trên các loại cây trồng không để lại dư lượng độc hại (toxic residue) trong nông sản, cho phép nông dân có thể xử lý sâu hại bằng NPV trước khi thu hoạch một thời gian ngắn (Monobrullah và Nagata, 2000)

Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007) cho biết BaculoNPV rất thuận lợi khi

sản xuất chế phẩm thương mại vì thường có thể đạt nồng độ cao trong mô của ấu trùng Chế phẩm có thể duy trì hoạt tính trong thời gian rất dài (10-15 năm) ngoài cơ thể côn trùng

1.3.5.1 Nhược điểm của chế phẩm NPV

Chế phẩm NPV rất khó bảo quản Ngoài ra, so với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ sâu của NPV chậm hơn nhiều

Do NPV rất đặc hiệu đối với ký chủ, mà thường trên cùng một mùa vụ có nhiều loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một loài dịch hại riêng biệt Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm NPV cũng khó khăn hơn thuốc hóa học vì NPV phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng không thể phát triển trong môi trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên

Vì là tác nhân sinh học nên NPV dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài đồng không thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm,…) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi bằng thuốc hóa học (Phạm Thị Thùy, 2004)

NPV có thể sản xuất bằng phương pháp invivo và invitro Tuy nhiên, NPV được thương mại hóa hiện nay trên thế giới chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp invivo

vì tính hiệu quả kinh tế (Tuan S.J W.L Chen, và S.S Kao 1998; Monobrullah M et al, 2000; FAO, 2011) Trong đó, NPV của các loài thuộc chi Spodoptera được sử dụng nhiều nhất trên phạm vi toàn thế giới (Monobrullah, M.; Nagata, M., 2000) Nhiều chế phẩm đã được thương mại hóa để trừ sâu khoang ăn tạp là SOMSTAR TM–SL,

SpodopterinTM, Spodoptera litura NPV, sử dụng trên rau, cà chua, bắp, bông vải (Giupta

và cộng sự, 2005)

1.4 Các nghiên cứu sử dụng NPV để trừ sâu khoang

1.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Hiệu lực diệt sâu khoang ăn tạp của các chủng NPV: Các nghiên cứu đều chỉ

ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang Sâu càng nhỏ mức độ mẫn

cảm càng cao (Boucias et al, 1980; Bucher và Turnck, 1983; Smith và Vlak, 1988; Mohammad et al, 2002) Giá trị LC50 của NPV trên sâu khoang từ tuổi 1 đến tuổi 4 được ghi nhận tương ứng là 3,2x106; 1,1x107; 1,3x107 và 4,7x107 PIB/ml (Mahammad et al, 2002)

Nghiên cứu, sản xuất Nucleopolyhedrosis NPV: So sánh sản lượng NPV đạt

được khi dùng sâu 7, 8, 9 và 10 ngày tuổi để sản xuất NPV, Monobrullah và Nagata (2000) cho biết, sản lượng NPV cao nhất khi sử dụng sâu 9 ngày tuổi (trọng lượng 125 – 155mg) để nhiễm NPV Sản lượng NPV cao nhất được cho biết là 3,91x109 PIB/sâu với lượng nhiễm là 4,8 x 106 PIB/sâu

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sản xuất NPV: Các tác giả cho rằng,

NPV bị ảnh hưởng rất rõ bởi yếu tố nhiệt độ Mohammad (2002), Sajap et al (2007) cho biết, tỷ lệ sâu chết tăng khi tăng nhiệt độ nuôi ủ sâu và giá trị LT50 thì ngược lại Giá trị

LT50 khi nhiễm sâu ở 200C tăng 4 lần so với khi nuôi ở nhiệt độ 300C (Mohammad, 2002) Cũng theo tác giả này, điều kiện thích hợp tối thiểu để sản xuất invitro NPV trên sâu khoang là 300C

Nghiên cứu tăng cường hiệu lực diệt sâu của NPV: Tiêu chí để tạo chế phẩm

NPV trừ sâu là kéo dài hoạt lực cũng như sự bền vững của NPV trên đồng (Jones et al , 1997) Việc tạo chế phẩm có thể cải thiện đáng kể hiệu quả của NPV Các chất phụ gia cho vào NPV nhằm kích thích sự ăn của sâu ký chủ hoặc tăng cường hiệu lực gây chết

của NPV ( Bell và Kanavel , 1975; Burges và Jones , 1998)

Để tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ bệnh do NPV, các tác giả đã phối trộn NPV với nhiều sản phẩm khác như: thuốc trừ sâu, chế phẩm Neem, acid boric, rỉ đường… Rabindra và cộng sự (1997) cho biết phối hợp NPV (liều lượng 5 x 105

PIB/ml) + mật đường (1%) + dịch chiết neem (0,1%) cho hiệu quả diệt sâu khoang tăng hơn so với không trộn Tuy nhiên, tác giả cho biết, nếu không bổ sung rỉ đường thì sự phối hợp này không có hiệu quả Tương tự như vậy, Baskaran và cộng sự (1999) cho biết, phối trộn NPV (2 X 104 PIB/ml) với dầu neem 1% và dịch chiết bánh dầu neem 5%

cũng làm tăng hiệu quả diệt sâu của NPV Các tác giả thống nhất rằng, việc bổ sung dịch chiết neem vào chế phẩm NPV làm cho sâu khoang chết nhanh hơn so với không bổ sung và quan trọng hơn cả là làm giảm được tác động của neem đối với các loài thiên địch Seon-Gon Kim và ctv (2001) cho biết, phối trộn nồng độ 1x108 PIB/ml với NeemAZA-T/S nồng độ 200 ppm có giá trị LT50 và LT90 là 1,94 ngày và 8,33 ngày Hiệu

lực diệt sâu của Spodoptera litura NPV (SLNPV) nồng độ 1x108 PIB/ml với T/S nồng độ 75–200 ppm cho kết quả diệt sâu chết 100% sau 9 ngày thí nghiệm

NeemAZA-1.4.2 Các nghiên cứu trong nước

NPV được ghi nhận là một trong những loài thiên địch xuất hiện khá phổ biến trên đồng ruộng ở Việt Nam (Nguyễn Văn Cảm và cộng sự, 1992; Nguyễn Thị Hai, 1996) Sâu khoang trên lạc có tỷ lệ chết NPV khá cao, có khi lên tới 50 – 60% (Phạm Văn Lầm, 2004)

Nghiên cứu NPV có hiệu lực trừ sâu tương đương hoặc cao hơn so với thuốc hóa học (Phạm Hữu Nhượng và CTV, 2005; Hoàng Thị Việt và cộng sự,1999, 2000; Ngô Trung Sơn, 2001; Nguyễn Thị Hai, 2004; Phạm Văn Lầm, 2004; Nguyễn Văn Tuất, 2004)

Bằng phương pháp thu thập, tuyển chọn và khai thác khả năng phòng trừ sinh học

của các chủng Nucleopolyhedrosis NPV (NPV), nhóm tác giả Nguyễn Thị Hai, Nguyễn

Hoài Hương (2016) đã phân lập được 2 chủng NPV phòng trừ sâu khoang ăn tạp

(Spodoptera litura) hại rau, đậu tại TP.HCM

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl (Nucleo Polyhedrosis Virus) từ tế bào

gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp (Nguyễn Thị Như Quỳnh,

2014)

Một số NPV đã được thương mại hóa để trừ sâu ở Việt Nam (Lê Quang Quyến et

al, 2002; Nguyễn Văn Tuất, 2004) NPV trừ sâu khoang đã được tiến hành tại Viện Bảo

vệ Thực vật (Nguyễn Văn Tuất, 2004) Thử nghiệm trên đồng ruộng cho biết, Sử dụng chế phẩm NPV, V-Bt trừ sâu xanh, sâu khoang hại lạc cho hiệu quả 76-77%

Tại các tỉnh phía Nam, gần đây các chủng NPV sâu khoang cũng được trường được phân lập tại trường Đại học Cần Thơ Kết quả cho biết, độ hữu hiệu của 2 dòng NPV thu thập tại Trà Vinh và An Giang đối với sâu khoang ăn tạp cho hiệu quả trên 90% sau 9 ngày xử lý (Trần Văn Hai, 2010)

Đánh giá hoạt lực trừ sâu của NPV trên sâu khoang, Tran Thi Kieu Trang et al (2002) cho biết, sâu 2 ngày tuổi mẫn cảm gấp 1.500.000 lần so với sâu 8 ngày tuổi Nghiên cứu sử dụng các chất lọc tia cực tím trên HaNPV, Ngô Trung Sơn (2001) cho biết, sữa lọc béo, than hoạt tính và rỉ đường có khả năng giảm được tác hại của tia cực tím Theo tác giả, nếu phơi HaNPV ngoài nắng 1 giờ, hiệu lực diệt sâu xanh của chúng chỉ còn 37%, song nếu dịch HaNPV có trộn 3% sữa lọc béo thì hiệu lực diệt sâu vẫn còn 81%, còn trộn 3% than hiệu tính thì hiệu lực của HaNPV cũng còn 50%

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm NPV

1.5.1 Nồng độ lây nhiễm

Sản lượng tối đa của virus có liên quan chặt chẽ đến tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm virus Tổng số virus được sinh ra tương quan thuận với trọng lượng sâu đem đi nhiễm (Jones, 2000) Mối tương quan giữa nồng độ nhiễm và sản lượng virus đã được nhiều tác giả nghiên cứu (Shapiro, 1986) với nhiều phương pháp khác nhau Nếu nhiễm với nồng độ thể vùi cao, virus sẽ gây hại cho các cơ quan nội tạng và gây chết sâu trước khi virus nhân lên đủ nhiều Trái lại, nếu nhiễm với nồng độ quá thấp, thì sản lượng virus sẽ không tối ưu bởi vì sâu vào nhộng Để xác định nồng độ lây nhiễm thích hợp cho từng loài sâu, người ta phải xác định giá trị LC50, LC90 cho từng tuổi sâu Giá trị LC50 và LC90

sẽ giúp xác định được nồng độ lây nhiễm thích hợp cho từng tuổi sâu Giá trị LC50, LC90

thay đổi tùy thuộc vào từng tuổi sâu, từng loài sâu và từng chủng NPV tương ứng

Bên cạnh đó, độ sạch của dịch nhiễm ban đầu đóng vai trò rất quan trọng trong quy trình sản xuất virus Theo FAO 2011, sử dụng dịch không ly tâm khi nhiễm cho sâu, chỉ có 10% sâu chết do NPV và 90% sâu chết do các tác nhân lây nhiễm khác Vì

vậy, các tác giả khuyến cáo nên sử dụng dịch ly tâm để nhiễm virus (Grzywacz et al 2011)

1.5.2 Tuổi sâu

Thông thường nếu nhiễm sâu tuổi quá nhỏ chúng sẽ chết nhanh trước khi cơ thể đạt sinh khối tối đa nhưng nếu nhiễm sâu càng lớn thì khả năng kháng với virus càng cao (Briese, 1986) và cả hai trường hợp đều đạt sản lượng không cao Thông thường, người ta thường nhiễm sâu vào thời điểm trước khi lột xác sang tuổi cuối 2 ngày

(O‘Reilly et al., 1994) Xác định tuổi sâu xanh (Helicoverpa armigera) thích hợp nhất

để nhiễm H.armigera NPV (HearNPV), Gupta et al (2007) đã làm thí nghiệm nhiễm sâu

với nồng độ 1 x 104PIB/sâu cho sâu 5,7,8,9,10 và 11 ngày tuổi Sản lượng virus đạt cao nhất khi ở công thức nhiễm sâu 7 và 8 ngày tuổi Sâu càng nhỏ lượng virus/sâu càng thấp hơn có ý nghĩa so với sâu tuổi lớn Sâu càng lớn tỷ lệ vào nhộng càng cao Sản lượng

virus đạt cao nhất của HearNPV đạt được khi nhiễm trên sâu tuổi 5 với nồng độ nhiễm

là 5 x 105OB/sâu (Mehrvar et al., 2007) Trong khi đó, (Ziemnicka, 2008) lại cho rằng,

tuổi 4 là tuổi tối ưu để nhiễm Leucorma salicis NPV đối với sâu Leucoma salicis Nhiều

tác giả khác lại cho rằng, nhiễm sâu tuổi 3 cho sản lượng virus cao nhất (Li và Skinner, 2005) Vì vậy, để đạt hiệu suất tối đa, cần phải xác định tuổi sâu tương ứng với từng nồng độ nhiễm cho từng loài sâu hại

1.5.3 Thời gian thu hoạch sâu chết

Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, trong điều kiện invivo, sản lượng virus đạt cao nhất khi thu sâu chết (Gupta, 2007; Mehrvar et al., 2007) Thời gian thu hoạch đóng

vài trò quan trọng trong quy trình sản xuất Spodoptera littoralis NPV trong sâu khoang

S.littoralis (Grzywacz et al., 1998) Nếu thu hoạch quá sớm, hoạt tính sinh học của virus

sẽ giảm Trái lại, nếu để các mô vỡ ra trước khi thu hoạch thì virus sẽ phát tán ra thức ăn rất khó thu hoạch Tốt nhất là nên thu hoạch sớm ngay sau khi sâu chết Các nghiên cứu cho thấy, đối với NPV gây chết sâu khoang ăn tạp, sâu vừa mới chết cho sản lượng virus cao nhất Ở sâu sống vào thời điểm 8 ngày sau khi sâu chết, lượng virus cũng còn đạt

khá cao nhưng virus chưa thành thục nên hoạt tính diệt sâu không cao Trái lại nếu để quá muộn, da sâu vỡ ra thì lượng virus sẽ giảm đi hơn 1/2 ( Nguyễn Thị Hai, 2014) Vì vậy, thường trong sản xuất, người ta phải thu sâu chết hàng ngày, thậm chí 2 lần/ngày

1.6 Quy trình sản xuất chế phẩm NPV

Điểm đặc trưng của virus NPV là chỉ nhân lên ở tế bào sống của ký chủ nên việc sản xuất virus ở quy mô công nghiệp cũng khá là khó khăn Có 2 phương pháp sản xuất virus NPV: Sản xuất invitro trên tế bào ký chủ và Sản xuất in vivo trên sâu ký chủ Trong

đồ án này, chỉ đề cập đến quy trình Sản xuất in vivo trên sâu ký chủ

Hình 1.7 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm virus trừ sâu

(Nguồn:

https://hoc247.net/cong-nghe-10/bai-20-ung-dung-cong-nghe-vi-sinh-san-xuat-che-pham-bao-ve-thuc-vat-l6549.html) Quy trình sản xuất chế phẩm NPV in vivo trên sâu ký chủ gồm 2 bước chính: nhân nuôi số lượng lớn sâu ký chủ và nhiễm virus cho sâu ký chủ

Nhân nuôi số lượng lớn sâu ký chủ:

Nguồn sâu giống đầu tiên được bắt từ ngoài đồng trên những cánh đồng không phun thuốc và được nhân nuôi trong phòng

Sâu non sau khi hóa nhộng sẽ được thu nhận, xử lý rồi cho vào trong những hộp chứa có bông ẩm Tách riêng nhộng đực và nhộng cái để khi nhộng vũ hóa dễ thu nhận

và ghép cặp Sau khi nhộng vũ hóa phải được ghép cặp ngay

Sau khi trưởng thành cái đẻ trứng, trứng phải được thu nhận ngay và để riêng từng ngày Trứng sâu thường nở vào ban đêm Để sâu nở ra có thức ăn ngay, người ta thường cho trứng vào hộp thức ăn trước khi sâu nở vài giờ

Sâu ký chủ được nuôi bằng thức ăn nhân tạo, bảo đảm cho chúng sinh trưởng và phát triển bình thường Nuôi sâu bằng thức ăn nhân tạo sẽ hạn chế được sự lây nhiễm, tấn công của các yếu tố tự nhiên có thể gây chết sâu thông qua nguồn thức ăn tự nhiên Mặt khác, việc sử dụng thức ăn nhân tạo để nuôi sâu sẽ không phải thay thức ăn hằng ngày, tiết kiệm được công lao động và chi phí khác trong quá trình sản xuất

Nhiễm virus cho sâu ký chủ: Sau khi sâu ký chủ đạt đến tuổi 3 hoặc 4 là tuổi thích hợp

để sản xuất virus Quá trình sản xuất virus trong sâu ký chủ được bắt đầu từ việc cho sâu

ăn thức ăn đã bị phơi nhiễm virus (tạm gọi là nhiễm virus cho sâu ký chủ) Có thể tóm

tắt quá trình này như sau:

Cho dịch virus lên bề mặt thức ăn và dùng chổi lông đã khử trùng trãi đều dịch lên bề mặt thức ăn

Cho sâu ăn thức ăn đã nhiễm virus trong vòng 24h-48h ở điều kiện nhiệt độ 26oC Chuyển sâu sang thức ăn mới không nhiễm virus và ủ ở nhiệt độ 26oC, theo dõi hàng ngày cho đến khi sâu bị chết

Thu sâu chết trước khi cơ thể sâu bị vỡ và cất đông lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi đồng nhất và lọc

Sau khi lọc ta li tâm, thêm chất phụ gia và đem đi sấy Kiểm tra lượng virus sau khi sấy và đóng gói sản phẩm

1.7 Các sản phẩm NPV trên thị trường

Trên thế giới các nước có các nghiên cứu tạo ra các chế phẩm Cụ thể như ở Nga

có chế phẩm NPV dạng bột: VIRIN Ha; VIRIN Dp, trừ sâu xanh, sâu róm thông, Còn ở Trung Quốc có chế phẩm sinh học kết hợp virus và vi khuẩn với hiệu quả trừ sâu hại trên hàng vạn ha bông, cà chua, Cũng như ở Mỹ, Úc, dùng công nghệ tế bào nhân nuôi virus côn trùng để sản xuất chế phẩm virus dùng trong nông-lâm nghiệp

Còn ở Việt Nam có chế phẩm dạng dịch thể trừ sâu xanh, sâu khoang, từ đề tài KC.08-14 (giai đoạn 1990-1995) của Viện Bảo vệ thực vật

Đề tài KHCN.02-07 (giai đoạn 1996 – 2000) do Viện Bảo vệ thực vật nghiên cứu

sử dụng chế phẩm virus đơn lẻ hoặc phối hợp trong phòng trừ dịch hại cây trồng Sản xuất được chế phẩm Vi-Bt dạng bột đa chức năng so với giai đoạn trước (Chu Thị Thơm, 2006)

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

2.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành 15 tuần (03/2018-07/2018) tại Viện Khoa Học Ứng Dụng trường ĐH Công Nghệ Tp.HCM

2.1.2 Vật liệu

Sâu khoang được bắt ngoài đồng ruộng rau muống tại đường Bùi Công Trừng,

Xã Nhị Bình, Huyện Hóc Môn về nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm, cho ăn thức

ăn nhân tạo đến khi sâu hóa nhộng, vũ hóa, đẻ trứng và nở sâu đến độ tuổi thích hợp thì tiến hành thí nghiệm

Nguồn NPV (Nuclear polyhedrosis virus) do phòng thí nghiệm của Viện Khoa

Học Ứng Dụng, Đại học Công Nghệ Tp.HCM cung cấp

2.1.3 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

2.1.3.1 Hóa chất

BPW (Buffered Peptone Water)

PCA (Plate Count Agar)

Nước cất Nước muối sinh lý

Giấy báo Kẹp inox Kéo

Cọ quét,

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV

Hình 2.1Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu và

nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV

2.2.1.1 Chuẩn bị dịch huyền phù NPV

Lấy 50 sâu chết do NPV, bổ sung 50ml nước cất để ở nhiệt độ phòng 01 ngày cho sâu rã ra rồi lọc bỏ xác sâu để lấy dịch huyền phù virus Sau đó hút 5ml đem đi ly tâm theo phương pháp của Karma et al (2012) Cụ thể như sau:

Ly tâm lần đầu với 500 vòng trong 10 phút để lấy phần dịch nổi

Ly tâm lần thứ hai 5000 vòng trong 15 phút lấy phần cặn lắng

Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm hàm lượng thể vùi, tính lượng virus có trong dịch huyền phù

Phương pháp xác định hàm lượng thể vùi: Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml

dịch đã ly tâm + 9ml nước muối sinh lý rồi pha loãng 2-3 lần Kiểm tra mật độ thể vùi trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi Đếm số lượng thể vùi có trong 5 ô nhỏ rồi tính trung bình

Hàm lượng thể vùi (PIB/ml) = A/5 x N x 25x104 = 5 x A x N x 104

Trong đó: A: tổng số thể vùi (PIB/ml) đếm lượng trong 5 ô nhỏ

N: hệ số pha loãng 2.2.1.2 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ

Sâu khoang S.litura được thu thập trên các cây trồng và đem về phòng thí nghiệm

nuôi bằng thức ăn nhân tạo để lấy sâu thế hệ F1 Sâu tuổi 7, 9, 11 ngày tuổi được thu nhận và tiến hành thí nghiệm trong cùng một ngày

Hình 2.3 Nguồn sâu làm thí nghiệm

(A) Sâu 7 ngày tuổi; (B) Sâu 9 ngày tuổi; (C) Sâu 11 ngày tuổi

Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3,5g ascorbic acid, 2,0g methyl-paraben, 1,0g sorbic acid, 2,5ml formaldehyde, 10g agar, 750ml nước cất và 1% vitamin E

Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào

máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men bánh

mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau Đun agar với nước cho sôi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu còn lại vào xay đều Sau đó đổ thức ăn vào hộp nhựa 18x10x6 (cm) để nguội rồi cho sâu vào nuôi đến khi sâu hóa nhộng, vũ hóa, đẻ trứng và nở sâu đến khi sâu đủ 7, 9, 11 ngày tuổi thì tiến hành thí nghiệm Chọn sâu ở mỗi độ tuổi có cùng kích thước, khối lượng, tốt nhất là nên lấy sâu trong cùng một ổ trứng

Hình 2.4 Thức ăn nhân tạo

Hình 2.5 Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm

Sâu thu ở ngoài đồng

Nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo theo công thức cải tiến của Ahmad et al.(2015)

2.2.1.3 Các nghiệm thức bố trí

Thức ăn để nhiễm virus được chế biến theo công thức của Ahmad et al (2015)

không bổ sung Formaldehyde: Đậu xanh 200g, men bánh mì 30g, Ascorbic acid 3,5g,

Methyl-paraben 2,0g, Sorbic acid 1,0g, Agar 10g, Nước cất 750ml, 1% vitamin E

Lây nhiễm sâu: Lây nhiễm bề mặt bằng cách phun đều dịch trên thức ăn nhân tạo

theo phương pháp của FAO (2011) và Lawrenceet et al (2007) Cắt thức ăn thành 40 miếng đều nhau với kích thước 2,25x2 (cm) rồi dùng kẹp gắp thức ăn cho vào chén nhỏ (d=5cm) Sâu được nhiễm với nồng độ 1x102; 1x103; 1x104; 1x105; 1x106; 1x107; 1x108 PIB/sâu Thức ăn sau khi nhiễm để khô bề mặt trong 15 phút (Karma et al 2012) rồi sau

đó dùng kẹp gắp sâu nhẹ nhàng hạn chế gây tổn thương đến sâu

Số lượng sâu: 30 sâu/công thức, lặp lại 3 lần

Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố, cụ thể như sau:

Yếu tố 1: Tuổi sâu: Sâu 7, 9, 11 ngày tuổi

Yếu tố 2: Nồng độ dịch nhiễm: 1x102; 1x103; 1x104; 1x105; 1x106; 1x107; 1x108

PIB/sâu và công thức đối chứng phun nước cất

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm Nồng độ nhiễm

al (2012) rồi đếm thể vùi và tính sản lượng virus thu nhận được

Tính toán hiệu lực diệt sâu theo công thức Abbott (1925)

Hiệu lực (%)= (1 −𝑆ố 𝑠â𝑢 𝑠ố𝑛𝑔 ở 𝑙ô 𝑡ℎí 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚

𝑆ố 𝑠â𝑢 𝑠ố𝑛𝑔 ở 𝑙ô đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔) x 100 Sản lượng virus trên sâu nhiễm được tính theo công thức của Mehrvar et al (2007)

Sản lượng NPV (PIB/sâu chết) =𝑃𝐼𝐵/𝑚𝑙 x 𝑇ℎể 𝑡í𝑐ℎ ℎ𝑢𝑦ề𝑛 𝑝ℎù

𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑠â𝑢 𝑐ℎế𝑡

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết (%)

Sản lượng PIB thu được