Lựa chọn thức ăn để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài đã xác định được các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của sâu khoang trên các loại thức ăn khác nhau để từ đó đưa ra được loại thức ăn phù

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn :TS Nguyễn Thị Hai

TP Hồ Chí Minh, 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn :TS Nguyễn Thị Hai

TP Hồ Chí Minh, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nguyên cứu này là do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Hai, bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

TPHCM, Ngày tháng năm

Sinh viên thực hiện đồ án

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em trân trọng bày tỏ lòng biết ơn đến Cô TS Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian học, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất về tinh thần và vật chất trong quá trình nguyên cứu, chỉnh sửa chu đáo nội dung và hình thức luận văn Đặt biệt, Cô đã tận tâm động viên, lo lắng những lúc em gặp khó khăn trong quá trình hoàn thành đồ án này

Nhân đây, em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô của Khoa Công Nghệ Sinh Học đã cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành và bảo vệ đồ án

Cuối cùng, con xin chân thành biết ơn Ba, Mẹ, Em đã khuyến khích, động viên

và chăm lo các công việc gia đình để con hoàn thành đồ án này

TPHCM, Ngày tháng năm

Sinh viên thực hiện đồ án

TÓM TẮT

Việc nhân nuôi sâu khoang trên thức ăn nhân tạo từ sâu tuổi 1 đến trưởng thành được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 270 ± 10 C, ẩm độ 65 ± 5% Kết quả đã xác định được thành phần thức ăn gồm đậu trắng (200g), đậu nành(10g), tinh bột (30g), men bánh mì (30g), Vitamin E (10ml), Vitamin tổng hợp(10ml), Methyl paraben (2.5g), Ascorbic acid (1.5g), agar (10g), formalin 40% (1ml),

nước cất (1000ml) là thích hợp nhất để sản xuất sâu khoang (Spodoptera litura)

với các chỉ tiêu trọng lượng sâu 10 ngày tuổi đạt 0.53 g; thời gian phát dục của sâu non là 15,25 ngày; tỷ lệ sâu vào nhộng đạt 91,33%; tỷ lệ nhộng vũ hóa là 92,96%; khả năng đẻ trứng là 6.33 ổ trứng/con cái; giá thành cho một mẻ thức

ăn của công thức này là 26.578đ, nuôi được 200 sâu

Từ khóa: Sâu khoang Spodoptera litura, thức ăn nhân tạo sâu non

ABSTRACT SELECTION OF ARTIFICIAL DIET FOR MASS REARING OF

THE TOBACCO CATERPILLAR, SPODOPTERA LITURA

The aim of research is evaluate a artificial diet for mass rearing of Spodoptera

littoralis The result showed that ingredients consisted of cowpea (200g), soybean

(10 g), Starch (30g), yeast (30g), vitamin E (10ml), synthetic vitamin(10ml), Ascorbic acid (1.5g), Methyl paraben (2.5g), agar (10g), formalin 40% (1ml),

Distilled water (1000ml) was the best for mass rearing of Spodoptera littoralis This

artificial diet successfully supported the growth and development with larval weight (10 days old) was 0.53g, larval period were 15.25 days respectively

, the Percentage to Pupation and Adult emergence were 91.33 and 92.96%

respectively The Fecundity was 6.33 egg mass per femalen The cost of 1 batch of

diet was VND 26.578, on which 200 neonate larvae can be reared

Key words: tobacco bollworm Spodoptera litura, artifical diet, caterpillar

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiển của đề tài 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ SÂU KHOANG 3

1.1.1 Đặc điểm gây hại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Đặc tính sinh học 7

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỨC ĂN NHÂN TẠO NHÂN NUÔI SÂU Ở NƯỚC NGOÀI 9

1.2.1 Nghiên cứu thức ăn nhân tạo nhân nuôi sâu ở nước ngoài 9

1.2.2Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn thêm đến sự phát triển của trưởng thành 18

1.3 Tình hình nghiên cứu thức an nhân tạo nhân nuôi sâu khoang Ở Việt Nam 19

1.4 Kỹ thuật nuôi nhân sâu hàng loạt 21

1.4.1 Các biện pháp vệ sinh phòng bệnh khi nuôi nhân sâu 22

1.4.2 Biện pháp chống thoái hóa quần thể sâu nuôi 22

1.4.3 Kỹ thuật nhân nuôi sâu khoang 23

1.5 Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng 24

1.5.1 Đặc điểm hình thái: 24

1.5.2 Cấu trúc NPV 24

1.5.3 Quy trình sản xuất NPV 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật Liệu Và Đối Tượng Nguyên Cứu 28

2.1.1 Nguồn sâu làm thí nghiệm 28

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 28

2.2 Nội Dung Nguyên Cứu 29

2.3 Phương Pháp Nghiên Cứu 29

2.3.1 Xác định công thức thành phần thức ăn nhân tạo để nhân nuôi ấu trùng sâu khoang (Spodoptera litura) 29

2.3.2 Xác định thức ăn thêm để nuôi trưởng thành sâu khoang (Spodoptera litura) 33

2.3.3 Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học NPV 34

CHƯƠNG 3 37

KẾT QUẢ NGUYÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Xác định thức ăn tổng hợp để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn 37

3.1.1 Trọng lượng sâu tuổi 3 37

3.1.2 Trọng lượng nhộng 39

3.1.3.Thời gian phát dục của sâu non 39

3.1.4 Tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa của sâu khoang 40

3.1.5.Thời gian sống của trưởng thành 43

3.1.6 Khả năng sinh sản của trưởng thành 43

3.2 Xác định nồng độ và loại thức ăn thêm phù hợp để nuôi trưởng thành 45

3.2.1 Thời gian sống của trưởng thành được cho ăn thêm 45

3.2.2 Khả năng sinh sản của trưởng thành được cho ăn thêm 46

3.3 Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học

NPV 47

3.3.1 Số sâu chết 47

3.3.2 Hiệu lực gây chết 48

3.3.3 Trọng lượng sâu 48

3.3.4 Lượng virus/ sâu 49

3.4 Giá thành nuôi sâu ở các công thức 51

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần môi trường thức ăn nhân tạo cải tiến của Shorey và Hale (1965)

10

Bảng 2.1: Thành phần công thức thức ăn dùng trong thí nghiệm 31

Bảng 3 1: Trọng lượng sâu tuổi 3 37

Bảng 3 2: Trọng lượng nhộng 39

Bảng 3 3: Thời gian phát dục của sâu non 40

Bảng 3 4: Tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa của sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo 41

Bảng 3 5: Thời gian sống của trưởng thành 43

Bảng 3 6: Khả năng sinh sản của trưởng thành ở các công thức 44

Bảng 3 7: Thời gian sống của trưởng thành trên các công thức cho ăn thêm 45

Bảng 3 8: Khả năng sinh sản của trưởng thành trên các công thức cho ăn thêm 47

Bảng 3 9: Số sâu chết khi cho ăn thức ăn nhiễm NPV 48

Bảng 3 10: Trọng lượng của sâu chết sau khi được cho ăn thức ăn nhiễm NPV 49

Bảng 3 11: Sản lượng virus đạt được khi nhiễm sâu trên các loại thức ăn 50

Bảng 3 12: Chi phí thức ăn nhân tạo để nuôi sâu khoang của các công thức 52

Bảng 3 13: Chi phí thức ăn nhân tạo nuôi nhộng bằng các công thức 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 : Trưởng thành sâu khoang (EPPO,2015) 4

Hình 1.2 : Trứng sâu khoang (A)Trứng được đẻ thành ổ , (B) Trứng được nhìn dưới kính hiển vi (EPPO,2015) 5

Hình 1.3:Ấu trùng sâu khoang Spodoptera litura(EPPO,2015) 6

Hình 1.4 : Nhộng sâu khoang (EPPO,2015) 6

Hình 1 5 Vòng đời sâu khoang ( Spodoptera litura) 7

Hình 1.6: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al, 2003) 25

Hình 2.1:Công thức thức ăn nhân tạo và công thức đối chứng (A: công thức 1, B: công thức 2, C: công thức 3,D: công thức 4; E: công thức lá thầu dầu) 32

Hình 2.2: Lây nhiễm vi rút lên thức ăn nhân tạo 35

Hình 3.1: Sâu khoang được nuôi bằng các công thức ( A : công thức 1; B: công thức 2; C: công thức 3; D: công thức 4; E: công thức lá thầu dầu) 38

Hình 3 2: Biểu đồ tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa cảu sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo 41

Hình 3.3: Trưởng thành chết sau khi sinh sản 43

Hình 3 5: Ổ trứng sâu khoang (A) sâu khoang mới nở (B) 44

Hình 3 6: Sâu chết do nhiễm NPV 51

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong xu hướng hội nhập với quốc tế, hiện nay nhu cầu đòi hỏi của sản xuất nông nghiệp hữu cơ là rất lớn, cần thiết phải sản xuất ra các chế phẩm vi sinh trừ sâu, bệnh hại nhằm thay thế thuốc trừ sâu hóa học Tuy các chế phẩm sinh học trừ sâu, bệnh hại cây trồng ở nước ta mới chỉ đạt một số lượng ở mức khiêm tốn Nhưng thực tế các chế phẩm sinh học đã mang lại hiệu quả vô cùng to lớn cả về kinh tế, kỹ thuật, xã hội đặc biệt là môi trường, được xã hội công nhận và nhiều nông dân ở các địa phương triển trai ứng dụng Trong đó, việc kiểm soát sâu khoang bằng thuốc hóa học đã gây

nhiều khó khăn vì tính kháng thuốc của sâu rất cao Sâu khoang, Spodoptera

litura Fabriciusn, là loài sâu ăn tạp có phổ ký chủ rộng, gây hại trên nhiều loại cây

trồng, đặc biệt là các loại rau ăn quả và ăn lá Việc quản lý đối tượng này bằng thuốc trừ sâu ngày một khó khăn do sâu có khả năng kháng thuốc rất cao Sử dụng thuốc hóa học ngoài việc gây tác động xuất đến môi trường hệ sinh thái, thuốc hóa học còn gây nên tồn lưu trong nông sản Vì thế, biện pháp sinh học là một trong những giải pháp thích hợp

NPV (Nucleopolyhedrosis ký sinh sâu khoang) là tác nhân sinh học được chứng

minh có hiệu quả cao đối với sâu khoang ăn tạp (Nguyễn Thị Hai, Nguyễn Hoài Hương 2015) Việc nghiên cứu thức ăn nhân tạo nhằm cung cấp một lượng sâu khỏe, đồng đều để phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học là rất cần thiết Chính vì vậy, học viên tiến hành nghiên cứu đề tài “Lựa chọn thức ăn để nhân nuôi sâu khoang

Spodoptera litura Fabricius phục vụ sản xuất chế phẩm NPV”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định thức ăn tổng hợp để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn

Xác định nồng độ và loại thức ăn thêm phù hợp để nuôi trưởng thành

Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học NPV

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài đã xác định được các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của sâu khoang trên các loại thức ăn khác nhau để từ đó đưa ra được loại thức ăn phù hợp để nhân nuôi và lây nhiễm sâu khoang cũng như nồng độ thức ăn thêm để nuôi trưởng thành

sâu khoang Spodoptera litura, phục vụ cho sản xuất NPV (Nucleopolyhedrosis virus)

trừ sâu khoang hại cây trồng thay thế cho thuốc hóa học, bảo đảm an toàn cho con người, gia súc và hệ thiên dịch, chống ô nhiễm môi trường, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ SÂU KHOANG

Tên khoa học: Spodoptera litura Fabricius, thuộc họ: Ngài đêm (Noctuidae), bộ: cánh vảy (Lepidoptera)

1.1.1 Đặc điểm gây hại

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) là loài sâu gây hại nguy hiểm cho nền

nông nghiệp của nhiều nước ở châu Á, châu Phi và vùng Thái Bình Dương Sâu khoang phân bố khắp nơi trên thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt đới như:

Ấn Độ, Pakistans, Triều Tiên, Banglades, Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, Bắc Phi, Ai Cập, châu Âu và các nước Đông Nam Á như Lào, Campuchia, Mianma, Malaysia (Nadeem et al.,2008; Shivayogeshwar, 1991; Hill, 1993; Singh and Jalali,1997) Ở Ai Cập, sâu hại bông

chính là Spodoptera littoralis(Boisd) và cần áp dụng nhiều loại thuốc trừ sâu (Sorour

et al,2011; Shaurub et al, 2014) Ở nước ta sâu khoang có mặt ở hầu hết các tỉnh thành Sâu khoang là loài đa thực, còn được gọi là sâu ăn tạp gây hại trên tất cả các loại cây trồng, là đối tượng gây hại nặng trên rau, trong đó có nhiều loại rau như: Bắp cải, rau diếp, su hào, xà lách, súp lơ, cà chua, cà bát, đậu đũa, đậu vàng, khoai tây, khoang lang, khoai sọ, rau muống, bầu bí, bông, thuốc lá, lạc, thầu dầu, đậu tương…(Gao et al, 2004;Qin et al,2004;Hilll, 1993; Rao et al,1993), (Nguyễn Văn Đỉnh và CTV, 2012) Sâu khoang có thể gây hại trên 200 loại cây trồng (Sigh, Jalali,1997), (Lê Thị Sen và Nguyễn Văn Huỳnh,2004) Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng Sâu cắn phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn nắp Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm

Sâu non tuổi nhỏ thường gây hại nghiêm trọng nhất bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh chóng làm lá cây xơ xác Sâu non còn có thể gặm ăn

vỏ quả làm giảm phẩm chất Sâu non ưa điều kiện nóng ẩm Nên ở Việt Nam sâu khoang phát triển quanh năm và phát sinh thành dịch ở nhiểu vùng như Bắc Cạn (năm 2011), sâu tàn phá hết những cánh đồng khoai môn ở Quảng Nam Đà Nẵng ( Theo

báo Quảng Nam năm 2013) và gần đây chúng phát sinh sinh thành dịch và gây hại nặng lên cây ớt, đậu, dưa hấu ở các tỉnh miền Trung Năm 2016, tại thành phố Hồ Chí Minh, sâu khoang xuất hiện và gây hại trên 360ha rau (Báo của Sở Nông Nghiệp

và Phát Triển nông thôn thành phố Hồ Chí Minh, 2016) Đặc biệt trên cây rau muống nước, sâu khoang là đối tượng dịch hại chính (Chi cục Bảo vệ Thực vật thành phố Hồ Chí Minh) Để trừ sâu khoang hại rau muống nước, nông dân sử dụng và pha trộn nhiều chủng loại thuốc khác nhau ( Theo kết quả điều tra của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn) không những làm tăng chi phí sản xuất mà còn làm tăng tồn

dư hóa chất trên cây rau muống, tăng nguy cơ ngộ độc cho người tiêu dùng và làm ô nhiễm môi trường

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Trưởng thành có chiều dài thân khoảng 20-25mm, sải cánh rộng từ 35-45mm Cách trước màu nâu vàng, giữa cánh có vân trắng, cánh sau màu trắng óng ánh.(EPPO)

Hình 1.1 : Trưởng thành sâu khoang (EPPO,2015)

Trứng được đẻ thành ổ, bên trên có phủ lớp lông từ cơ thể của trưởng thành cái Trứng có hình bán cầu, đường kính từ 0,4 - 0,5mm Bề mặt trứng có những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ô nhỏ Trứng mới nở có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu vàng tro, lúc sắp nở có màu tro đậm Ổ trứng có phủ lớp lông màu nâu vàng từ bụng bướm

mẹ (EPPO,2015)

Hình 1.2 : Trứng sâu khoang (A) Trứng được đẻ thành ổ , (B) Trứng được nhìn dưới kính hiển vi

(EPPO,2015)

Sâu non mới nở màu xanh sáng, dài khoảng 1mm, đầu to Sâu non đẩy sức có màu xám tro đến nâu đen, vạch lưng màu vàng ở đốt bụng thứ nhất có khoang đen to nên được gọi là sâu khoang Sâu có 5- 6 tuổi, đẫy sức trước khi hóa nhộng dài 38-50 mm Sâu làm nhộng trong đất (EPPO,2015)

A

C

B

Hình 1.3:Ấu trùng sâu khoang Spodoptera litura(EPPO,2015)

Nhộng dài từ 18-20mm, có màu xanh nõn chuối, rất mềm ngay khi mới được hình thành, sau đó chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng có màu nâu, thân cứng dần

và có màu nâu đỏ Khi sắp vũ hoá, nhộng có màu nâu đen, các đốt cuối của nhộng có thể cử động được Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh mép trước đốt bụng thứ 5-7 có nhiều chấm lõm, cuối bụng có một đôi gai ngắn.(EPPO,2015)

Hình 1.4 : Nhộng sâu khoang (EPPO,2015)

1.1.3 Đặc tính sinh học

Hình 1 5 Vòng đời sâu khoang ( Spodoptera litura)

Trưởng thành sống từ 5 đến 8 ngày, thời gian trứng kéo dài từ 2 đến 6 ngày, Sâu non có 5 đến 6 tuổi Thời gian phát dục cùa sâu non là 12-37 ngày, tiền nhộng

từ 1 đến 4 ngày, nhộng từ 4 đến 14 ngày và vòng đời của sâu khoang từ 20-64 ngày

Sâu mới nở ăn một phần vỏ trứng và sống tập trung 1-2 ngày Sâu tuổi 1-2 chỉ

ăn gặm phần diệp lục của lá và chừa lại lớp biểu bì trắng, từ tuổi 3 trở đi sâu ăn phá mạnh cắn thủng lá và gân lá Ở tuổi lớn sâu không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân, cành, trái non

Trưởng thành sâu khoang thường bay hoạt động về chiều và đêm Ban ngày,trưởng thành thường đậu ở mặt sau lá hoặc những nơi kín đáo của bụi cây, ngọn

cỏ Trưởng thành bay khỏe, mỗi lần có thể bay xa đến vài chục mét và cao đến 6-7 mét Trưởng thành ưu các chất mùi chua ngọt và ánh sáng đèn Trưởng thành cái sau khi vũ hoá một vài giờ có thể giao, sau đó ngài đẻ trứng ngay hoặc vào đêm sau Trưởng thành đực trong 1-2 đêm có thể giao phối được với 8 con cái Con cái qua giao phối trong một đêm thì có được số lượng tinh trùng đủ để hình thành trứng thụ

tinh trong 7 ngày Trưởng thành sâu khoang ưa thích đẻ trứng ở nơi tối và đẻ một vài

ổ trong một đêm Con cái không giao phối cũng đẻ trứng nhưng số lượng trứng đẻ ra

ít hơn so với số lượng trứng đẻ ra của con cái giao phối Tần suất giao phối không ảnh hưởng tới thời gian đẻ trứng, sự giao phối nhiều không ảnh hưởng tới tuổi thọ con cái mà kích thích con cái đẻ trứng (On Yang S.C., et al 1991) (Chu Y.I et al 1991)

Trưởng thành sâu khoang có khả năng chọn lọc cây ký chủ để đẻ trứng, chúng thích đẻ trứng trên cây thầu dầu hơn là trên cây đậu đũa, bông…Nhiệt độ ảnh

hưởng đến tuổi thọ của trưởng thành: Ở nhiệt độ cao trưởng thành sống thời gian ít hơn so với trưởng thành sống ở nhiệt độ thấp Thức ăn cũng ảnh hưởng đến tuổi thọ của trưởng thành: Trưởng thành nuôi bằng mật ong 20% sống lâu hơn so với trưởng thành nuôi bằng nước đường 20%

Trưởng thành sâu khoang đẻ trứng thành ổ Ổ trứng thường được tìm thấy ở mặt dưới lá, phần lớn ở những nơi phân nhánh của gân lá Sâu non mới nở sống tập trung với nhau, nếu bị khua đông nhẹ sâu có thể bò phân tán ra xung quanh hoặc nhả tơ dong mình rơi xuống Sâu non khi lớn lên thì có phản ứng đối với ánh sáng rỏ rệt, có nghĩa là sâu có hiện tượng trốn tránh ánh sáng cho nên về ban ngày sâu thường ẩn náu ở những nơi tối như khe nứt nẻ của đất Trong những ngày trời mưa râm hoặc mưa nhẹ thì ban ngày người ta cũng thấy sâu non bò hoạt động trên cây Thời gian sinh trưởng và phát dục của sâu non phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và thức

ăn Sâu khoang phát triển đến tuổi 6 thì chui xuống đất làm kén hình bầu dục và nằm yên trong đó hóa nhộng Đất có hàm lượng nước 20% thích hợp cho sâu hóa nhộng, nếu đất quá khô hoặc quá ướt điều không thuận lợi cho việc hóa nhộng của sâu Sâu khoang ưa nhiệt độ ấm nóng, độ ẩm cao Nhiệt độ thích hợp cho các pha phát dục của sâu khoang 270 ± 10 C và độ ẩm thích hợp 65 ± 5%

Đối với sâu nuôi trong phòng thí nghiệm thì ngài thích đẻ trứng trên giấy xù xì hơn

là trên giấy trơn nhẵn Ngài có thể đẻ được trung bình 200 đến 3000 trứng, tùy thuộc vào từng loại thức ăn mà ngài ăn thêm thì ngài đẻ ít hay nhiều trứng

Thiên địch của sâu sâu khoang như các loài ăn mồi (bọ rùa, kiến, bọ xít ăn thịt,

bọ cánh cứng), ong kí sinh (Cotesia prodeniae, Telenomus remus), Vi khuẩn BT,

virus nhân đa diện (NPV)

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỨC ĂN NHÂN TẠO NHÂN NUÔI

SÂU Ở NƯỚC NGOÀI

1.2.1 Nghiên cứu thức ăn nhân tạo nhân nuôi sâu ở nước ngoài

Nuôi nhân côn trùng hàng loạt các loại sâu hại họ Ngài đêm (Noctuidae) đã được bắt đầu từ lâu, nhưng chỉ nuôi sâu non bằng lá cây, thân cây và các bộ phận sinh dưỡng của các cây ký chủ như lá cây, hoa, quả bông…Các loại thức ăn tự nhiên này

được để trong hộp nhựa cùng với sâu non

Nhân nuôi côn trùng là một công việc phức tạp, đòi hỏi nhiều chi phí, một trong những chi phí nhiều là chi phí về thức ăn cho việc nuôi nhân côn trùng Tùy theo từng loại côn trùng nuôi nhân mà tiêu tốn thức ăn khác nhau Trong những năm 60 của thế kỷ này, sâu non họ Ngài đêm (Noctuidae) được nuôi nhân hàng thức ăn nhân tạo Môi trường thức ăn nhân tạo ra đời lúc đầu làm giảm bớt công trồng các loại cây thực liệu, giải quyết được việc khan hiếm thức ăn trong những mùa vụ không thích hợp, làm tăng sản lượng sâu nuôi Tuy nhiên vẫn chưa nuôi được sâu ở quy mô lớn (Harell E A., et al., 1973)

Bottger (1942) là người đầu tiên đã tiến hành nuôi sâu cánh vảy, cụ thể là loài

sâu đục thân bắp (Ostrinia nubilalis) bằng thức ăn nhân tạo Sau đó, sâu hồng

Pectinophora gossypiella là loài sâu đa thực đầu tiên được nuôi trên thức ăn nhân tạo

có cơ chất chính là lúa mì bởi Vanderant và Reiser (1956) Từ đó, nhiều loại thức ăn nhân tạo đã được phát triển để nuôi nhiều loài sâu bộ cánh vảy khác

Giống như các loài động vật khác, ấu trùng bộ cánh vảy cũng đòi hỏi nguồn protein, carbohydrate, lipid, vitamin, muối khoáng và nước để phát triển Đối với

nguồn protein, nhiều tác giả sử dụng casein, sữa bột, bột đậu nành hay men(yeast) (

Lucas et al, 2016) Nguồn carbohydrate có thể là đường sucrose hoặc nguồn đường khác Lipid được cung cấp bởi phôi lúa mì (wheat germ), lá phơi khô, dầu bắp Vitamin được cung cấp dưới dạng hỗn hợp các vitamin hoặc sử dụng men hoặc dịch

chiết men Muối khoáng thường được cung cấp theo thành phần của muối Wesson

Ngoài ra, hầu hết các loài côn trùng đều cần vitamin C và choline (Morton, 1979)

Thức ăn phải được chế biến ở dạng đặc mềm thích hợp với kiểu miệng nhai của côn trùng Lúc đầu, người ta thêm gellatin nhưng không thích hợp cho việc bảo quản và do vậy, người ta đã thay thế bằng agar

Năm 1962, Erma S Vanderzant đã thí nghiệm nuôi sâu xanh đục quả

Helicoverpa armigera bằng thức ăn nhân tạo với thành phần gồm: 3g phôi lúa mì;

3,5g casein; 3,5g sucrose; 1g muối Wesson; 1ml vitamin và inositol; 0,1g cholin chloride; 0,4g ascorbic acid; 2,5g agar và 85ml nước Để hạn chế các vi sinh vật lây nhiễm, tác giả cho thêm 0,2g potasium sorbate và 0,2g methyl parahydroxy benzoate Sau đó, khi thức ăn nguội xuống đến 400C, tác giả còn bổ sung thêm vitamin C Kết quả cho thấy, tỷ lệ hóa trưởng thành lên đến 67 – 88% Thời gian phát dục của sâu non, nhộng tương ứng là 12 ngày và 9 ngày và vòng đời kéo dài 25 ngày

Năm 1965, Shorey và Hale đã cải tiến hai khẩu phần thức ăn nhân tạo đã được công bố trước đó, bằng cách thay thế agar với tinh bột theo tỷ lệ nhất định từ một thành phần thức ăn nhân tạo chuẩn, nhằm đánh giá sự thay thế agar bằng tinh bột ảnh

hưởng như thế nào đến sự sinh trưởng của Spodoptera littoralis

Bảng 1.1: Thành phần môi trường thức ăn nhân tạo cải tiến của Shorey và

Hale (1965)

Thành phần Công thức gốc

Công thức thay đổi A

Công thức thay đổi B

Kết quả cho thấy rằng, Spodoptera littoralis khi nuôi trên ba loại môi trường

cho tỷ lệ khác biệt đáng kể (p-value < 0,05) Trọng lượng sâu trung bình ở công thức gốc là 191,94±104,61 mg và 739,05±274,26 mg, ở công thức thay đổi A là 249,16±99,35 mg và 935,67±283,51 mg, và công thức thay đổi B là 208,93±101,51

mg và 892,97±209,36 mg Tỷ lệ sâu hóa nhộng ở các công thức lần lượt là: 97,22±3,02 %, 97,03±2,53 %, 98,23±2,73 % Tỷ lệ nhộng vũ hóa ở công thức gốc đạt 96,14±2,47 %, công thức thay đổi A đạt 97,50±2,61 % công thức thay đổi B đạt 98,04±1,96 % Thời gian phát dục của sâu ở từng công thức đạt lần lượt là: 14,15; 13,78; 14,15 ngày

Nghiên cứu công thức tạo thức ăn nhân tạo nuôi sâu khoang Spodoptera

littoralis(Boisd) được thực hiện bởi các tác giả Gupta et (2006), Sorour M.A et al

(2006) hay lựa chọn thức ăn nhân tạo với chi phí thấp để nhân sâu xanh (Elvisa S.et

al, 2010) Nhằm hoàn thiện công nghệ nuôi nhân hàng loạt nhiều loại côn trùng, trên thế giới đã có nhiều công trình nguyên cứu về môi trường thức ăn nhân tạo nuôi sâu Môi trường thức ăn nhân tạo nuôi sâu được chia làm môi trường thức ăn tổng hợp và môi trường thức ăn bán tổng hợp Lúc đầu người ta sử dụng môi trường thức ăn nhân tạo tổng hợp có từ 30-35 chất để nuôi sâu Các chất này là những nguồn protein, lipid, glucide, hỗn hợp muối khoáng, các kháng sinh và các vitamin Về sau người ta cảm thấy thức ăn nhân tạo rất đắt tiền và rất khó tìm kiếm các chất để pha chế nên đã cải tiến thành môi trường thức ăn nhân tạo bán tổng hợp chì có tối đa 25-30 chất, trong

đó nguyên liệu chính lấy từ cây ký chủ đã phơi khô và các nguyên liệu khác có nguồn gốc từ thực vật Môi trường thức ăn nhân tạo bán tổng hợp cũng chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng: protein, lipid, glucide, cellulose, hỗn hợp muối khoáng, chất kháng sinh

và các vitamin cần thiết cho sự phát triển toàn diện côn trùng nuôi nhân So với môi trường thức ăn nhân tạo tổng hợp thì môi trường thức ăn nhân tạo bán tổng hợp rẻ hơn vì thế nó được sử dụng rộng rãi trong nhân nuôi hàng loạt nhiều loại côn trùng

Bên cạnh dùng agar là chất dinh dưỡng và kết dính môi trường, người ta còn thay thế agar bằng những chất khác như gelatine, chất keo có trong tảo biển, casein thủy phân, bột ngũ cốc các loại và các phế thải trong công nghiệp chế biến như bã củ

cải đường…Môi trường thức ăn nhân tạo bán tổng hợp có chứa các chất có nguồn gốc thực vật như các loại: bột cám, bột mì, bột ngô, lõi ngô, mầm lúa mì, mầm mạch nha và các loại lá cây táo, mơ, mận, đào,bột lá khoai lang, bột cây mía, mầm đậu xanh, men, các loại dầu… Sau đó, để giảm hơn nữa giá thành thức ăn người ta đã đơn giản hóa môi trường bằng cách sử dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên và không những để nuôi nhân côn trùng hại mà còn dùng để nuôi các loại côn trùng ký sinh, ăn thịt

Nhiều tác giả nghiên cứu về thức ăn môi trường nhân tạo nuôi sâu lại cho rằng thay thế phần cây ký chủ được nuôi vào thức ăn nhân tạo tổng hợp hay thức ăn nhân tạo bán tổng hợp sẽ làm cho việc nuôi sâu được thuận lợi hơn Tuy nhiên không phải bao giờ thay thế cây ký chủ bằng thức ăn nhân tạo cũng làm giảm giá thành mà nhiều khi lại làm tăng giá thành Thay thế hoàn toàn thức ăn tự nhiên bằng thức ăn nhân tạo không phải bao giờ cũng hợp lý Trong nhiều trường hợp chỉ thay thế một thành phần hóa học trong môi trường bằng sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên rẻ tiền đã làm giảm giá thành môi trường thức ăn nhân tạo xuống hoặc đôi khi thêm một ít thức ăn tự nhiên lại làm tăng khả năng đẻ trứng và sức sống của thế hệ sau

Năm 1970, Dimetry đã đưa ra công thức thức ăn nhân tạo nuôi sâu khoang

Spodoptera littoralis với thành phần như sau: 120g đậu Vicia faba; 15g men bia; 1,5g

ascorbic acid; 1g sodium benzoate; 0,5g sorbic acid; 1ml formaldehyde 40%; 6g agar; 325ml nước cất

Sau khi nuôi sâu qua 3 thế hệ, tác giả cho biết: thời gian phát triển của giai đoạn ấu trùng, nhộng và khả năng sinh sản là bình thường so với kết quả nuôi trên lá thầu dầu Ấu trùng và nhộng sống sót là 73%, trung bình số trứng của một bướm cái

là 2.045 trứng trong 4 ngày đẻ

Năm 1997, Seth và Sharma đã cải tiến khẩu phần ăn bán tổng hợp để phù hợp cho nhân nuôi số lượng lớn sâu khoang Sự kết hợp khác nhau giữa các thành phần đều được đánh giá dựa trên khả năng tăng trưởng và phát triển tối ưu của loài sâu này Các công thức bán tổng hợp bao gồm: đậu cheakpea, lúa mì, mầm lúa mì, đậu tương được trộn với nấm men và các chất phụ gia tổng hợp cùng với agar Trong đó, đậu

cheakpea được sử dụng như là nguồn bổ sung carbohydrate chính Thành phần thức

ăn bán tổng hợp được tác giả đề xuất nuôi Spodoptera litura có thành phần như sau:

93,5g hạt đậu cheakpea; 44g casein; 12,5g muối khoáng; 1,25g cholesterol; 19g men bia; 1,25 methyl-p-hydroxybenzoate; 39g đường; 2g sorbic acid; 6,25ml KOH 4M; 2,5ml dầu bắp; 2,5ml dầu hạt lanh; 5,5ml formaldehyde 10%; 3,53ml sinigrin 1%; 7,5g antibiotic và multivitamin; 1,25g choline chloride; 25g agar; 115ml nước cất

Kết quả nghiên cứu cho biết, sâu khoang nuôi bằng thức ăn này có chỉ số tăng trưởng là 2,61; tương đương với nuôi trên lá thầu dầu và cao hơn 20% so với ăn trên thức ăn có cơ chất chính là đậu tương

So sánh khả năng đẻ của trưởng thành có giai đoạn ấu trùng nuôi trên các cơ chất chính là lúa mì, đậu tương và đậu chicpea so với lá thầu dầu, Seth và Sharma (1979) còn cho biết, số trứng đẻ cao nhất ở bướm có sâu nuôi trên đậu chickpea (tương đương với trưởng thành có sâu ăn lá thầu dầu), tiếp đến là đậu tương và sau cùng là lúa mì Vì vậy, các tác giả cho rằng, thức ăn nhân tạo có cơ chất chính là đậu chickpea

là thích hợp nhất để nuôi sâu khoang Spodoptera litura

Nghiên cứu của R.K Seth và V.P Sharma đã cho thấy sự cải tiến trong khẩu phần thức ăn nhân tạo đối với sâu khoang Tuy nhiên, thành phần nguyên liệu trong thức ăn có chứa nồng độ agar cao, tăng nguy cơ làm đông môi trường Chính vì vậy trong nghiên cứu vào năm 1998 của Ahmed và cộng sự đã thay thế thành phần nguyên liệu agar bằng bột sắn để khắc phục hạn chế này

Bảng 1.2 Thành phần thức ăn dựa trên môi trường agar và bột sắn của Ấn Độ

(Ahmed và cộng sự, 1998)

Thành phần

Trọng lượng ( g) các chất ở các môi

trường Ahmed et al

(1998)

Seth et al (1979)

Theo Ahmed và cộng sự (1989), thành phần bột sắn là một lựa chọn thích hợp

để nuôi liên tục năm thế hệ Spodoptera litura Tác giả đã thay 7,1g agar bằng 60g bột

sắn, tổng hàm lượng của các thành phần còn lại thay đổi khoảng 20% Đối với khẩu phần ăn dựa trên tinh bột sắn cho mỗi gram thức ăn mà ấu trùng tiêu thụ, thì hàm lượng protein ít hơn gần 20% so với chế độ ăn dựa trên agar Sự giảm tương tự cũng xảy ra đối với thành phần lipid, vitamin, nhưng gia tăng thành phần carbohydrate Hàm lượng nước giảm từ 84% của chế độ ăn agar đến khoảng 80% chế độ ăn bột sắn,

là một sự thay đổi quan trọng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của côn trùng Kết quả cho thấy, không có sự sai khác về sự sinh trưởng và phát triển của sâu khi nuôi trên các công thức thức ăn trên

Nuôi các loài côn trùng hại trong phòng thí nghiệm cũng tiêu tốn một lượng thức ăn

đáng kể như: Nuôi sâu xám bắp cải (Mamestra brassicae) tiêu tốn 5-10 kg môi trường

thức ăn nhân tạo agar mớỉ nuôi được 1000 sâu(CrapeII B.A., 1981) Để thu được

1000 nhộng sâu xanh (H.armigera) cần phải có 15-20 kg môi trường thức ăn nhân tạo

agar hoặc môi trường thức ăn nhân tạo không agar (Mohactbipckhh A.,1991) Môi trường thức ăn nhân tạo không những để nuôi nhân côn trùng hại mà còn để nuôi các loài côn trùng ký sinh, ăn thịt (Xie Zhongneng et al.,1989); (Dai Kai jia et al.,1985)

Một trong những khó khăn trong nuôi nhân côn trùng họ Ngài đêm (Noctuidạẹ)

là tính ăn thịt lẫn nhau của một số loài ở pha sâu non, sự phát sinh nhiều loại bệnh côn trùng trong khi nuôi nhân Cho đến nay, nhiều loại côn trùng thuộc họ Ngài đêm (Noctuidae) đã nuôi được bằng thức ăn nhân tạo Trong một số trường hợp côn trùng nuôi bằng thức ăn nhân tạo có ưu điểm hơn so với nuôi côn trùng bằng thức ăn tự

nhiên như: Việc sản xuất chế phẩm NPV từ sâu khoang (Spodoptera littoralis) nuôi

bằng thức ăn nhân tạo cho sản lượng chế phẩm nhiều hơn so với việc sản xuất chế

phẩm NPV từ sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) nuôi hàng thức ăn tự nhiên

castor oil; 2ml ABDEC drops; 1,8g methyl-p-hydroxybenzoate; 1,3g sorbic acid;

0,25g streptomycin sulphate; 2ml formaldehyde solution; 16,4g agar; 820ml nước cất

Kết quả cho thấy, sâu nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo này có thể phát triển được 10 thế hệ với khả năng phát triển quần thể cao hơn, khả năng hóa nhộng (89,2%), vũ hóa (97,2%), sống sót (86,6%) và sinh sản (2486,2 trứng) cao hơn so với khi nuôi trên thức ăn tự nhiên là lá thầu dầu (với các chỉ số tương ứng là 80, 75, 60%

và 480 trứng)

Tuy nhiên, lượng agar trong các thành phần thức ăn nhân tạo kể trên chiếm một tỷ lệ khá cao, điều này dẫn đến giá thành của thức ăn cao Vì vậy, năm 2011, M.A.Sorour và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu giảm lượng agar bằng việc bổ sung

tinh bột để nuôi sâu Spodoptera littoralis Trên cơ sở công thức thức ăn nuôi sâu khoang Spodoptera littoralis của Shorey và Hale (1965), tác giả đã thay thế 20g agar

bằng 150g tinh bột Kết quả cho thấy, sâu nuôi qua năm thế hệ mà không gặp phải tác dụng phụ nào Trọng lượng của sâu non, nhộng và ấu trùng cũng như tỷ lệ sâu vào nhộng, tỷ lệ nhộng hóa trưởng thành đều tốt hơn so với công thức ban đầu của Shorey

và Hale (1965) Hơn thế nữa, giá thành của nguyên liệu cũng giảm 45.6% Kết quả này đã đưa ra một công thức mới có tính chất kinh tế đầy tiềm năng trong việc sản

xuất môi trường nuôi S littoralis trên diện rộng Công thức thức ăn nhân tạo của

M.A.Sorour và cộng sự gồm các thành phần như sau: 1000g đậu trắng; 20g agar; 150g tinh bột; 150g men bánh mì; 15g ascobic acid; 9,5g methyl-p-hydroxy benzoate; 5g sorbic acid; 10g formaldehyde 40%; 2000ml nước cất

Người ta đưa vào môi trường thức ăn nhân tạo dung dịch muối Wesson (năm

2010) gồm: 1,55g CaCO3; 0,0029g CuSO4.5H2O; 0,1103g FePO4; 0,0015g MnCl2; 0,675g MgSO4; 0,007g KAI(SO4), 0,9g KCl; 2,325g KH2PO4; 0,0038g KCl; 0.785g NaCl; 0.0043 NaF; 1,12g Ca3(PO4)2

Các chất hóa học chống khuẩn và các chất kháng sinh để chống, ngăn ngừa các loại vi sinh vật gây bệnh cho sâu và làm ô nhiễm môi trường thức ăn Những vi sinh vật này ảnh hưởng trực tiếp hay gián tiếp đến sâu nhân nuôi Các vi sinh vật gây bệnh cho sâu nuôi trong quá trình nhân nuôi bao gồm vi khuẩn, nấm, vi rút, các loại nguyên sinh động vật Nhiều khi chúng làm sâu nuôi nhân bị chết hoàn toàn

- Vi khuẩn là những tác nhân thường gây thối rữa môi trường thức ăn nhân tạo Khi môi trường thức ăn nhân tạo bị nhiễm khuẩn, sâu nhân nuôi ăn phải thức ăn này, vi khuẩn sẽ xâm nhập vào ruột và sinh sản trong cơ thể sâu nuôi Những loại vi khuẩn

gây bệnh cho sâu nuôi như: Streptococcus spp, Aerobacter spp, Proteus spp,

Micrococcus spp…

- Các loại nấm mốc (Aspergillus, Rhizopus, Pennicilium) và nấm men (Saccharomyces) thường sinh sống trên môi trường thức ăn nhân tạo, trên xác và phân sâu…Loài nấm Aspergillus thường gây bẩn thức ăn nhân tạo và cản trở sự

phát triển của sâu non

- Vi rút gây bệnh thường gặp trong quá trình nhân nuôi các loài sâu non bộ Cánh vẩy (Lepidoptera) Vi rút bền vững với các điều kiện ngoại cảnh Chúng tồn tại trong phòng nuôi nhân và lan truyền qua không khí Vi rút còn lan truyền từ sâu non tuổi nhỏ sang sâu non tuổi lớn, từ trưởng thành qua trứng mà truyền bệnh cho sâu non ở thế hệ kế tiếp.Vi rút gây bệnh cho sâu nuôi nhân tồn tại ở hai dạng : dạng tích cực và dạng tiềm ẩn Vi rút tiềm ẩn trở thành vi rút tích cực gây bệnh cho sâu nuôi khi sâu nuôi nhân gặp những điều kiện bất lợi như sâu nuôi bị đói, độ ẩm không khí cao, nhiệt độ phòng nhân nuôi quá cao hoặc quá thấp

- Nhiều loài nguyên sinh động vật thường gặp trong quần thể nuôi nhân sâu như:

Microsporidia, chúng gây cho sâu nuôi mất khả năng sinh sản và lan truyền từ thế

hệ này qua thế hệ khác

Một trong những con đường lan truyền của vi sinh vật gây bệnh cho sâu nuôi

là qua thức ăn Để hạn chế vi sinh vật gây bệnh cho sâu nuôi trong các môi trường thức ăn nhân tạo người ta thường đưa vào các chất hóa học chống khuẩn, chống nấm, tác dụng của chúng như: Parapen, acid sorbic…có tác dụng chống nấm mốc, nấm men, vi khuẩn; formalin chống nấm mốc và vi rút NPV

- Acid sorbic có tác dụng trừ nấm Acid sorbic có hiệu quả cao nhất khi độ chua pH của thức ăn là 6,5

- Methyl-p-hydroxybenzoate (metaben, nipagin) trừ nấm mốc, vi khuẩn thường được sử dụng phổ biến trong hầu hết các loại thức ăn nhân tạo để nuôi các loại côn

trùng như: bọ cánh cứng (Poecilus capreus), sâu hại đào màu vàng (Conogethes

punctiferalis), sâu đục thân (Chilo partellus), sâu xám (Agrotis ypsilon Hubner),

sâu xanh (Heliothis armigera), sâu keo da láng (Spodoptera exigua), sâu khoang (Spodoptera littoralis) Metaben tan ít trong nước vì thế người ta thường hòa tan

vào dung dịch cồn sau đó mới trộn vào môi trường thức ăn nhân tạo

- Axit propionic được đưa vào thức ăn nhân tạo để chống nấm như đưa vào thức ăn

nhân tạo nuôi dâu tằm (Bombyx mori L), sâu xám hại bắp cải (Mamestra brassicae)

- Formalin được đưa vào thức ăn nhân tạo để chống nấm và vi rút gây bệnh cho sâu

như đưa vào thức ăn nhân tạo nuôi sâu xanh (Heliothis armigera), sâu tơ (Plutella

Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn thêm đến thời gian sống, khả năng sinh sản của

trưởng thành của loài Spodoptera exigua (Hübner), Tisdale và Sappington (2001) cho

biết, thời gian đẻ, số trứng đẻ của trưởng thành ăn mật ong 10% cao hơn so với ăn nước cất

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của thức ăn nuôi trưởng thành đến khả năng

sinh sản của một số loài sâu cánh vảy: Anticarsia gemmatalis Hübner, Heliothis

virescens (Fabr.), Spodoptera frugiperda (J E Smith) thuộc họ Noctuidae, Diatraea saccharalis (Fabr.) (Crambidae), Gymnandrosoma aurantianum Lima (Tortricidae)

và Stenoma catenifer Walsingham (Họ Elachistidae) Milano et al (2010) cho biết, thời gian sống của trưởng thành của các loài : Anticarsia gemmatalis Hübner,

Heliothis virescens (Fabr.), Spodoptera frugiperda thuộc họ Noctuidae khi ăn mật

ong 10% loài tăng rõ rệt so rệt so với chỉ ăn nước Sức sinh sản của A gemmatalis và

H virescens giảm mạnh khi trưởng thành cái chỉ ăn với nước Trong khi đó, sức sinh

sản của các loài Spodoptera frugiperda, G aurantianum, D Saccharalis, S catenifer

không khác nhau khi ăn với nước và mật ong 10% Tác giả kết luận rằng việc bổ sung carbohydrates không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của các loài này

Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn đến khả năng sống và đẻ trứng của trưởng

thành sâu xanh Helicoverpa armigera, Song et al (2007) đã bố trí thí nghiệm bằng

cách cho trưởng thành ăn thêm nước cất, mật ong 10%, dung dịch nước đường 5, 10,

15 và 20% Kết quả cho biết, thời gian sống và số trứng đẻ ở các công thức có ăn thêm mật ong và nước đường đều cao hơn so với chỉ ăn nước cất Trong đó, số trứng đẻ và thời gian sống ở công thức ăn mật ong 10% thấp hơn so với các công thức chỉ

ăn dung dịch nước đường từ 5-20% và không có sự sai khác về khả năng đẻ trứng và thời gian sống giữa các công thức ăn dung dịch nước đường 5,10,15 và 20%

1.3 Tình hình nghiên cứu thức an nhân tạo nhân nuôi sâu khoang Ở Việt Nam

Ở trong nước, nhiều nơi đã nuôi những loài côn trùng trùng để nguyên cứu đặc tính sinh học, cung cấp nguyên liệu cho thử nghiệm đánh giá hiệu lực của thuốt trừ sâu, đánh giá khả năng ký sinh và bắt mồi của các loài thiên địch ( Hà Hùng, 1985), (Phạm Văn Lầm,1994)

Từ năm 1989 đến nay, nuôi sâu hàng thức ân nhân tạo cũng được nhiều nhà

nghiên cứu quan tâm như: Nuôi sân cắn gié (Mythimna unipuncta) bằng môi trường thức ăn bản tổng hợp (Nguyễn Văn Cảm và CI'V, 1989), nuôi sâu xanh (H -

armigera), sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius), sâu đục thân ngô bằng môi

trường thức ăn bán tổng hợp không agar (Nguyễn Văn Cảm và CTV, 1991; Nguyễn Văn Hoa và CTV ,1994) Kỹ thuật nuôi nhân côn trùng đúng sẽ đảm bảo cho tỷ lệ chết thấp (Hà Hùng, 1985)

Từ 1989 - 1990, tại trung tâm Nha Hố - Ninh Thuận (dẫn theo Ngô Trung Sơn,

1998) đã thử nghiệm tìm ra thức ăn nhân tạo phù hợp cho sâu xanh Helicoverpa

armigera hại bông với các công thức như sau:

- Công thức 1 gồm: 100g đậu trắng; 7g muối khoáng hỗn hợp; 30g men bánh mì; 2g methyl paraben; 1g sorbic acid; 13g agar; 2ml formalin 40%; 7g choline chloride; 2ml multivitamin; 0,5g streptomicine; 3g ascorbic acid; 720ml nước cất

- Công thức 2 gồm: 150g đậu xanh; 2,5g methyl paraben; 1,5g sorbic acid; 12g agar; 12g men bánh mì; 3g casein; 3g ascorbic acid; 2ml formalin 40%; 10ml vitamin stock; 0,5g choline chloride; 750ml nước cất

Kết quả thí nghiệm cho thấy, trong hai công thức thức ăn nhân tạo được đưa vào nuôi sâu xanh, thì công thức 2, có cơ chất chính là đậu xanh nuôi sâu tốt hơn hẳn

so với công thức 1, có cơ chất chính là đậu trắng Tỷ lệ sâu tuổi 1 lớn hơn bình thường đến tuổi 4 ở công thức thức ăn 2 đạt 88,5%, trong khi đó ở công thức 1chỉ đạt 45,3% Năm 2002, Phạm Văn Thành và các cộng sự đã nuôi sâu tơ và sâu xanh trên môi trường thức ăn nhân tạo tại phòng sinh học thuộc trung tâm nghiên cứu và phát triển nông dược của công ty thuốc sát trùng Việt Nam với mục đích thử hiệu lực trừ sâu của một số loại thuốc hóa học Thành phần MTTANT gồm: 150g bột đậu nành; 15g men rượu; 2g methyl paraben; 1g sorbic acid; 12g agar; 2ml formaline 40%; 0.5g streptomicine; 3g ascorbic acid; 720ml nước cất

Năm 2011, Quách Hải Trí đã thử nghiệm nuôi thành công sâu khoang

(Spodoptera litura) trên môi trường thức ăn nhân tạo tại phòng thí nghiệm Công nghệ

sinh học, Trường đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM với mục đích tìm ra môi trường thức ăn nhân tạo thích hợp để nhân nuôi sâu khoang Thành phần MTTANT gồm: 150g đậu xanh ngâm; 15g men bánh mì; 2,5g methyl paraben; 1,5g sorbic acid; 3g ascorbic acid; 10ml vitamin tổng hợp; 2 viên vitamin E; 15g casein; 12g agar; 2ml formaline 40%; 800ml nước cất

Kết quả thí nghiệm cho biết: trọng lượng sâu trung bình 666,21 mg/ sâu, tỉ lệ sống và hóa nhộng của sâu là 55,53%, tỉ lệ vũ hóa của nhộng 68,50%, và khoảng 178 trứng/ bướm cái trong một ngày đẻ

Năm 2012, Phạm Thị Thùy Dương đã thử nghiệm nuôi thành công sâu khoang

(Spodoptera litura) trên môi trường thức ăn nhân tạo tại phòng thí nghiệm Công nghệ

sinh học, Trường đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM với mục đích tìm ra môi trường thức ăn nhân tạo thích hợp để nhân nuôi sâu khoang Thành phần môi trường thức ăn nhân tạo gồm: 150g đậu nành hạt ngâm; 15g men bánh mì; 2,5g methyl-

paraben; 1,5g sorbic acid; 10ml multivitamin (Vitaral); 3g ascorbic acid; 3g casein; 12g agar; 2ml formaline 40%; 750ml nước cất

Kết quả thí nghiệm cho biết: tỷ lệ sâu sống tuổi 3 đạt 93,33 %, trọng lượng sâu tuổi 4 đạt 688,52 mg/sâu, thời gian phát dục của sâu và nhộng lần lượt 12,17, 8,55 ngày, tỷ lệ sâu phát dục 85,35 %, tỷ lệ nhộng vũ hóa 90,18 %, khả năng đẻ trứng là 448,67 trứng/bướm cái

Tóm lại, việc nuôi nhân hàng loạt côn trùng bằng thức ăn nhân tạo đã được phát triển ở hầu hết các nước trên thế giới và đạt nhiều thành tựu đáng kể Ở nước ta, đã

có một số cơ quan nghiên cứu vấn đề này.Qua đó cho thấy việc nguyên cứu công nghệ nuôi nhân hàng loạt một số loài côn trùng đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước quan tâm Tuy nhiên, đối vói từng loài sâu, cần có công thức khác nhau Đặc biệt việc lựa chọn công thức phù hợp rẻ tiền cũng rất quan trọng để giảm giá thành sâu nuôi

1.4 Kỹ thuật nuôi nhân sâu hàng loạt

Tùy theo đặc điểm sinh học của từng loại sâu và mục đích việc nuôi nhân mà có các phương pháp nuôi nhân khác nhau Nuôi tập thể và nuôi cá thể Có loại sâu thì nuôi tập thể ở tuổi nhỏ và nuôi cá thể khi sâu ở tuổi lớn Nuôi cá thể ở độ tuổi lớn được áp dụng đối với những loài sâu có tính ăn thịt lẫn nhau ở giai đoạn sâu non tuổi lớn

1.4.1 Các biện pháp vệ sinh phòng bệnh khi nuôi nhân sâu

Một trong những điều kiện để nuôi nhân sâu thành công là phải nắm được các biện pháp phòng bệnh Trong quá trình nhân nuôi, sâu thường bị nhiều loại bệnh gây ảnh hưởng lớn đến hiệu suất nhân nuôi Để giảm bớt nguồn bệnh, ngoài việc cho sâu

ăn thức ăn có thêm chất kháng sinh, người ta thường áp dụng các biện pháp như chọn giống sâu khỏe, vệ sinh và xử lý ở giai đoạn trứng, nhộng:

- Chọn giống sâu khỏe và vệ sinh: chọn các sâu nuôi có khả năng tái sinh sản cao, sức sống tốt, loại bỏ các ổ trứng từ những con cái ốm yếu Thức ăn tốt , đầy đủ chất cũng là yếu tố quan trọng làm cho côn trùng sinh trưởng, phát triển tốt Môi trường dinh dưỡng không cân đối làm cho côn trùng dễ bị bệnh tật Mỗi loài sâu phải được nuôi trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng thích hợp

- Để phòng bệnh cho sâu nuôi khỏi bị nhiễm vi khuẩn, vi rút thì ngoài việc cho hóa chất và kháng sinh vào môi trường thức ăn nhân tạo, ngoài ra còn xữ lý trứng nhộng bằng dung dịch formalin nồng độ 10%

- Phòng nhân nuôi được vệ sinh vô trùng, dụng cụ nuôi nhân được vô trùng bằng cách sấy ổn định ở nhiệt độ 150oC trong thời gian 1 giờ Bên cạnh đó, để phòng bệnh vi rút cho sâu thì áp dụng các biện pháp như sau:

1 Chọn những cặp bố mẹ có sức sống tốt, khả năng tái sinh sản cao bằng cách ghép trưởng thành từng đôi một, những đôi đẻ ít trứng thì loại bỏ

2 Khử trùng trứng bằng dung dịch fomalin 5%, để ráo và xữ lý nhộng cũng bằng dung dịch fomalin 10% ngoài việc cho hóa chất, chất kháng sinh vào môi trường thức ăn nhân tạo (trình bày ở mục 1.2) để phòng cho sâu không bị nhiễm vi khuẩn, vi rút Hơn nữa, thêm các vitamin E, vitamin tổng hợp để hạn chế vi rút phát triển

1.4.2 Biện pháp chống thoái hóa quần thể sâu nuôi

Khi nuôi nhân côn trùng qua nhiều thế hệ trong phòng thí nghiệm, thường thấy hiện tượng giảm sức sống và khả năng đẻ trứng sẽ dẫn đến tiêu vong quần thể nuôi nhân Sự giảm sức sống của côn trùng là do nhiều yếu tố chi phối như nội phối làm

tích tụ những gen bất lợi hay do sự thay đổi ngẩu nhiên của gen cũng như giảm tính

đa dạng gen Vì vậy thay đổi định kỳ sâu nuôi hay là giao phối định kỳ giữa những

cá thể nuôi trong phòng thí nghiệm với những cá thể ngoài tự nhiên

1.4.3 Kỹ thuật nhân nuôi sâu khoang

Phương pháp nuôi cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của sâu khoang

(Spodoptera litura Fabricius) nên điều kiện tiện nghi môi trường trong phòng thí

nghiệm được kiểm soát chặt chẽ Sâu được nuôi ở điều kiện nhiệt độ 270 ± 10 C và độ

ẩm 65 ± 5% Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) nuôi trong phòng thí nghiệm

được chia làm 4 công đoạn theo 4 pha phát triển của sâu: Sâu non, nhộng, trưởng thành, trứng

Nuôi sâu: Lá thầu dầu được rửa sạch, để ráo rồi cho vào hộp để ủ cho trứng nở

Cho ổ trứng vào lá thầu dầu tươi và để ở nhiệt độ phòng cho sâu nở Sau đó dùng chổi lông, nhẹ nhàng bắt sâu tuổi 1 và chuyển vào hộp kích thước là (21x12x8) có chứa thức ăn nhân tạo Mỗi công thức nuôi 20-30 sâu, lặp lại 3 lần Đậy nắp hộp và nuôi sâu ở nhiệt độ phòng cho đến cuối tuổi 3 Chuyển sâu tuổi 3 sang hộp sạch và bổ sung thức ăn, nuôi cho đến khi sâu hóa nhộng

Thu và nuôi nhộng: nhộng được thu hằng ngày và xử lý trước khi cho vào hộp:

Xử lý nhộng: Cho nhộng vào dung dịch formalin 1% và ngâm trong 1 phút để tiêu diệt virus bám bên ngoài vỏ nhộng Tiếp đến tách nhộng đực và nhộng cái để

riêng rẽ và theo dõi

− Nuôi nhộng: Cho nhộng vào hộp nuôi, xung quanh được bọc kín bằng giấy tối màu, bên dưới có lót giấy thấm Thấm nước miếng bông hút ẩm cho vào hộp để giữ ẩm cho nhộng (hằng ngày thay bông ẩm mới) Giữ hộp nhộng ở nhiệt độ phòng Sau 7 – 10 ngày nhộng sẽ vũ hóa

Ghép cặp trưởng thành: Tỷ lệ ghép cặp đực : cái là 1 : 1 hoặc 2 : 3 hoặc 3 : 4

tùy theo lượng bướm vũ hóa

Nuôi trưởng thành: Thức ăn cho trưởng thành là mật ong 5%, 10% Cho thức

ăn vào miếng bông hút ẩm rồi đặt vào trên đĩa nhỏ và cho vào hộp nuôi để cung cấp thức ăn cho bướm Hằng ngày theo dõi để thu nhận trứng và thay thức ăn cho bướm

Xung quanh hộp nuôi có lót giấy để thu nhận trứng Dùng kéo cắt mảnh giấy có ổ trứng và dán giấy mới và chỗ bị cắt

1.5 Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng

Nuclear polyhedrosis virus (NPV) thuộc họ Baculoviridea là một trong 7 thành

viên thuộc nhóm virus ký sinh côn trùng Virus NPV có dạng hình que, kích thước

330-80nm Baculovirus thuộc họ Baculoviridae chỉ có 1 chi Chi này được chia thành

các nhóm phụ là virus đa nhiệm nhân (NPV), virus hạt (GV) và Oryctes giống virus (OV)

Các hạt virus có 1 lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsid Hơn nữa NPV có 1 đặt tính là hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào côn trùng với kích thước 0,5-15 nm

1.5.1 Đặc điểm hình thái:

NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau

Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi

1.5.2 Cấu trúc NPV

Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích thước từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ lipoprotein bao quanh một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nucleocapsid), trong có chứa các virion, các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide Trong số polypeptide đó thì có khoảng

4 - 11 polypeptide được kết hợp với nucleocapsid và số polypeptide còn lại kết hợp với capside DNA ở dạng sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x

106 các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi

Hình 1.6: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al, 2003)

Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắc là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu

là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn - Single Nucleocapsid (NPV

- SNPV); nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid - Multiple

Phân tử DNA gồm hai sợi có dạng vòng, dài khoảng 40 µm (Burgess, S.,

1977)

Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một phân tử DNA, phân tử DNA có chiều dài gấp

2 - 3 lần chiều dài nucleocapsid (Skuratovskaya et al, 1977)

Cấu tạo deoxyribo nucleo protein (DNP): Theo kết quả nghiên cứu của Bud, H.M

et al (1977) DNP được tạo thành do sự kết hợp giữa DNA và protein, sự kết hợp này không đồng nhất Đường kính DNP đo được 32 nm DNP ở trong capsid được sắp xếp chắc chắn, gọn gàng

Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong, đường

kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid) Nucleocapsid bao gồm hai

loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al, 1978)

Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc,

mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid Lớp vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972., Kelly, D.C., 1982, 1985)

Cấu tạo của khối đa diện (polyhedra): Theo Crook, N.E et al (1982) thì

polyhedra là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo Polyhedra còn bao gồm nhiều polypeptide Protein polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972) Polyhedra có đặc điểm là ổn định ở pH trung tính pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust, R.M et al , 1966) Minon, F et al (1979) còn cho biết polyhedra hoàn thiện được một lớp vỏ có hình thái riêng biệt vây quanh, chức năng của lớp vỏ này chưa được xác định

1.5.3 Quy trình sản xuất NPV

Điểm đặc trưng của virus NPV là chỉ nhân lên ở tế bào sống của ký chủ nên việc sản xuát virus ở quy mô công nghiệp cũng khá là khó khăn Có 2 phương pháp sản xuất virus NPV: Sản xuất invitro trên tế bào ký chủ và Sản xuất in vivo trên sâu

ký chủ Trong luận văn này, chỉ đề cấp đến quy trình sản xuất invitro trên sâu ký chủ

Quy trình sản xuất chế phẩm NPV invitro trên sâu ký chủ gồm 2 bước chính: Nhân nuôi số lượng lớn sâu ký chủ và nhiễm virus cho sâu ký chủ

Nhân nuôi số lượng lớn sâu ký chủ:

Nguồn sâu giống đầu tiên được bắt từ ngoài đồng trên những cánh đồng không phun thuốc và được nhân nuôi trong phòng

Sâu non sau khi hóa nhộng sẽ được thu nhận, xử lý rồi cho vào trong những hộp chứa có bông ẩm Tách riêng nhộng đực và nhộng cái để khi nhộng vũ hóa dễ thu nhận và ghép cặp Sau khi nhộng vũ hóa phải được ghép cặp ngay

Sau khi trưởng thành cái đẻ trứng, trứng phải được thu nhận ngay và để riêng từng ngày Trứng sâu thường nở vào ban đêm Để sâu nở ra có thức ăn ngay, người

ta thường cho trứng vào hộp thức ăn trước khi nở vài giờ

Sâu ký chủ được nuôi bằng thức ăn nhân tạo, bảo đảm cho chúng sinh trưởng

và phát triển bình thường Nuôi sâu bằng thức ăn nhân tạo sẽ hạn chế được sự lây nhiễm, tấn công của các yếu tố tự nhiên có thể gây chết sâu thông qua nguồn thức ăn

tự nhiên Mặt khác, việc sử dụng thức ăn nhân tạo để nuôi sâu sẽ không phải thay thức ăn hằng ngày, tiết kiệm được công thức và chi phí khác trong quy trình sản xuất

Nhiễm virus cho sâu ký chủ:

Sau khi sâu ký chủ đạt đến tuổi 4 là tuổi thích hợp để sản xuất virus Quá trình sản xuất virus trong sâu ký chủ được bắt đầu từ việc cho sâu ăn thức ăn đã bị phơi nhiễm virus (tạm gọi là nhiễm virus cho sâu ký chủ) Có thể tóm tắt quá trình này như sau:

Cho dịch virus lên bề mặt thức ăn và dùng chổi lông đã khử trùng trãi đều dịch lên bề mặt thức ăn Cho sâu ăn thức ăn đã nhiễm virus trong vòng 24h-48h ở điều kiện nhiệt độ 26oC

Chuyển sâu sang thức ăn mới không nhiễm virus và ủ ở nhiệt độ 26oC, theo dõi hàng ngày cho đến khi sâu bị chết

Thu sâu chết trước khi cơ thể sâu bị vỡ và cất đông lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi đồng nhất và lọc

Sau khi lọc ta li tâm, thêm chất phụ gia và đem đi sấy Kiểm tra lượng virus sau khi sấy và đóng gói sản phẩm

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật Liệu Và Đối Tượng Nguyên Cứu

2.1.1 Nguồn sâu làm thí nghiệm

Nguồn sâu khoang giống được bắt trên các ruộng rau cuối vụ ngừng phun thuốc hóa học Sâu khoang sau khi thu ngoài tự nhiên về lựa chọn những cá thể có độ tuổi tương đương nhau, chia làm 5 nhóm và nuôi bằng 5 công thức thức ăn (trong đó

có 4 công thức thức ăn nhân tạo và một công thức thức ăn là lá thầu dầu) trong điều kiện phòng thí nghiệm

Sơ đồ 1.1: Nguồn sâu làm thí nghiệm 2.1.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

Những trang thiết bị và dụng cụ nuôi sâu trong phòng thí nghiệm :

- Phòng nuôi sâu có trang bị máy điều hòa nhiệt độ

- Chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang với thời gian 16 giờ/ngày