Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic trong bảo quản hạt đậu phộng

DANH MỤC B NG Bảng 1.1: Tóm tắt các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn Bảng 1.2: Text sinh hóa của Lactobacillus Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng k

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Sinh viên thực hiện luận văn

Trần Thanh Thảo

ỜI C M N

Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ

TP HCM đã tạo điều kiện cho chúng em được học tập tại Trường Em cũng xin chân thành biết ơn sự dạy dỗ tận tình của toàn thể quý thầy cô Viện Khoa học Ứng dụng Hutech, Trường Đại học Công nghệ TP HCM đã cho chúng em những kiến thức quan trọng trong suốt thời gian qua, nhờ vậy chúng em mới có được những tri thức quý giá

để làm hành trang cho con đường sự nghiệp phía trước

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Hoài Hương đã trang bị cho

em những kiến thức bổ ích và luôn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời hướng dẫn cũng như khắc phục những lỗi sai để công việc đạt kết quả tốt nhất Cô luôn chia sẽ cũng như động viên em khi công việc chưa ổn và giúp em tìm được niềm vui khi thấy được thành quả mình sắp gặt hái được

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã tiếp cho em nghị lực, sự bình yên trong tâm hồn, luôn bên em những lúc khó khăn Em cũng xin được cảm ơn tới những người bạn đã gắn bó, động viên và giúp đỡ em suốt quãng thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp

Cuối c ng, em xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận x t đồ án tốt nghiệp này Em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe va Trong quá tr nh làm đồ án, do kinh nghiệm c n thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các Thầy Cô bỏ qua

Sinh viên thực hiện Trần Thanh Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC B NG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯ NG I: TỔNG QUAN 6

1.1.Tổng quan về nấm 6

1.1.1.Tổng quan về Aspergillus sp 6

1.1.1.1.Phân loại khoa học 6

1.1.1.2.Đặc điểm hình thái 7

1.1.1.3.Quá trình dinh dưỡng và sinh trưởng 7

1.1.2.Tác hại của độc tố Aflatoxin 8

1.1.2.1.Tác hại của nấm gây ra cho con người 9

1.1.2.2.Tác hại của nấm gây ra cho động vật 9

1.1.3.Các phương pháp khử nhiễm độc tố 9

1.1.3.1.Phương pháp vật lý học 9

1.1.3.2.Phương pháp hóa học 11

1.1.3.3.Phương pháp sinh học 12

1.2.Tổng quan về bảo quản hạt giống 15

1.3.Tổng quan về vi khuẩn lactic 16

1.3.1.Giới thiệu chung 16

1.3.2.Đặc điểm hình thái 17

1.3.3.Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 19

1.3.4.Nhu cầu dinh dưỡng 20

1.3.4.1.Nguồn cacbon 20

1.3.4.2.Nguồn nito 20

1.3.4.3.Nguồn vitamin 21

1.3.4.4.Các chất hữu cơ khác 21

1.3.4.5.Các muối vô cơ khác 21

1.3.4.6.Nguồn oxy 22

1.3.5.Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic và các hợp chất kháng nấm 22

1.3.5.1.Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 22

1.3.5.2.Các hợp chất kháng nấm 23

CHƯ NG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1.Địa điểm nghiên cứu 29

2.2.Thời gian thực hiện 29

2.3.Vật liệu nghiên cứu 29

2.3.1.Vật liệu 29

2.3.2.Hóa chất sử dụng 29

2.3.3.Môi trường sử dụng 30

2.3.4.Thiết bị 30

2.4.Phương pháp luận 30

2.4.1.Mục tiêu đồ án 30

2.4.2.Nội dung 30

2.5.Phương pháp nghiên cứu 31

2.5.1.Sơ đồ nghiên cứu 31

2.5.2 Phương pháp khảo sát độ thuần khiết của các chủng vi khuẩn lactic Lactobacilus sp (L5), Lactobacillus sp (L3), Lactobacillus sp (L2N) và chủng nấm mốc Aspergillus sp CDP1 32

2.5.2.1.Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic 33

2.5.2.2.Chủng nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 38

2.5.3 Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus spp 39

2.5.4.Phương pháp khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic 40

2.5.5.Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 43

CHƯ NG III: KẾT QU VÀ TH O LUẬN 51

3.1.Khảo sát tính thuần khiết của 3 chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L2N 51

3.1.1.Quan sát hình thái khuẩn lạc 51

3.1.2.Nhuộm gram 52

3.1.3.Nhuộm bào tử 53

3.1.4.Thử nghiệm Catalase 54

3.1.5.Thử nghiệm khả năng lên men đường 55

3.1.6.Thử nghiệm khả năng di động 57

3.2.1.Xác định hàm lượng acid tổng 59

3.2.2.Khả năng tạo màng biofilm 63

3.3.Khảo sát sự phát triển của chủng Aspergillus sp CĐP1 và khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 63

3.3.1.Sự phát triển của nấm CĐP1 63

3.3.2.Khả năng kháng nấm trực tiếp của vi khuẩn lactic 65

3.4.Lên men vi khuẩn lactic 66

3.4.1.Sinh khối của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường MRS và bắp cải 66

3.4.2.Hàm lượng acid tổng (%) của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường MRS và bắp

cải 68

3.4.3.Sự tạo màng biofilm của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS và bắp cải 70

3.4.4.Khả năng kháng nấm CĐP1 của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS và bắp cải 71

3.5.Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng 73

3.6.Sơ đồ quy trình bảo quản hạt đậu phộng từ 3 chủng Lactobacillus sp L5, L2N, L3

77

CHƯ NG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79

4.1 Kết luận 79

4.2 Kiến nghị 79

TÀI LIỆU THAM KH O 80

PHỤ LỤC 82

DANH MỤC B NG

Bảng 1.1: Tóm tắt các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn

Bảng 1.2: Text sinh hóa của Lactobacillus

Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998)

Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất được tóm tắt qua bảng dưới đây Bảng 1.5: Bảng tóm tắt về 3 chủng vi khuẩn lactic L5, L3 và L2N

Bảng 1.6: Acid lactic và giá trị OD ở bước sóng 6 nm sau 66 giờ nuôi cấy của

các chủng Lactobacillus spp

Bảng 1.7: Số liệu thống kê tỉ lệ phần trăm ức chế sự phát triển của nấm CĐP1

Bảng 1.8: Số ngày mọc nấm ở 2 thí nghiệm không cảm nhiễm và cảm nhiễm

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu

Hình 3.1: Khuẩn lạc của chủng Lactobacillus spp trên đĩa MRS Agar

Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn (từ trái qua phải) vi khuẩn E.coli gram

âm, vi khuẩn Bacillus subtilis gram dương, vi khuẩn Lactobacillus sp L5

Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn (từ trái qua qua phải) vi khuẩn

Bacillus subtilis sinh bào tử, vi khuẩn Lactobacillus sp L5 không sinh bào tử

Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 (trái qua phải: thử

nghiệm âm tính vi khuẩn L5, đối chứng âm vi khuẩn lactic trong nước cất, thử nghiệm

dương tính với vi khuẩn Bacillus subtilis)

Hình 3.5: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn Lac obacillus sp L3 A –

Glucose; B – Fructose; C – Sucrose; D – Manose; E – Manitol; F – Galactoe

Hình 3.6: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp L5 và chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus subtilis

Hình 3.7: So sánh acid lactic và giá trị OD ở bước sóng 6 nm sau 24 giờ nuôi cấy

của các chủng Lactobacillus spp

Hình 3.8: Đồ thị so sánh 3 chủng vi khuẩn lactic tạo màng ở điều kiện lắc và không lắc

Hình 3.9: (trái qua phải Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 trên

môi trường MRS Agar cải tiến và PDA

Hình 3.1 : Đồ thị so sánh sự kháng nấm trực tiếp của 3 chủng vi khuẩn

Hình 3.11: Độ đục dịch nuôi cấy của Lactocbacillus sp L5 trên 2 môi trường

Hình 3.12: Độ đục dịch nuôi cấy của Lactocbacillus sp L2N trên 2 môi trường

Hình 3.13: Độ đục dịch nuôi cấy của Lactocbacillus sp L2N trên 2 môi trường

Hình 3.14: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp L5 trên 2 môi trường

Hình 3.15: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp L2N trên 2 môi trường

Hình 3.16: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp L3 trên 2 môi trường

Hình 3.17: Đồ thị so sánh khả năng tạo màng biofilm của 3 chủng vi khuẩn trên 2 môi trường

Hình 3.18: Khả năng kháng nấm mốc của chủng vi khuẩn L5 trên 2 môi trường nuôi cấy so với đối chứng + Daconil .5g l và đối chứng (- nước cất (A – đối chứng (+),

B – đối chứng (-), C – môi trường MRS, D – môi trường bắp cải)

Hình 3.19: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ kháng nấm (%) của 3 chủng vi khuẩn trên 2 môi trường với đối chứng (+) Daconil

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, với sự phát triển của nhiều lĩnh vực khoa học – kỹ thuật nhằm phục vụ cho con người, cùng với cuộc cách mạng 4 đã đưa con người tới nên nền văn minh hiện đại Nhờ sự phát triển đó thì con người ngày càng chú trọng tới sức khỏe của mình hơn, do vậy vấn đề an toàn thực phẩm lại trở nên cần thiết và quan trọng

Song song với việc phát triển kinh tế, chính trị và xã hội thì lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng đang được phát triển và mở rộng ở nước ta

Ở nước ta, nông nghiệp đóng vai tr chủ yếu và những người nông dân phải luôn đảm bảo năng suất và nhu cầu lương thực cho người tiêu d ng trong và ngoài nước Đa

số các loại cây trồng đều sử dụng hạt giống và khi gieo trồng sẽ chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: thời tiết khí hậu, điều kiện đất, … ngoài những yếu tố đó c n có vi sinh vật, côn trùng, nấm mốc làm ảnh hưởng đến sự phát triển của cây

Có khoảng 50 loài nấm mốc có mặt trong thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn ngũ cốc) gây hại cho vật nuôi và con người vì chúng sản sinh ra đốc tố, người ta thường gọi tên chúng là độc tố nấm mốc (mycotoxin) Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) thì khoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxin làm thiệt hại kinh

tế nặng nề, nhiều nhất là các nhà chăn nuôi, sản xuất thức ăn gia súc và thực phẩm cho con người

Điều kiện khí hậu nóng ẩm ở Châu Á thuận lợi cho việc nấm mốc phát triển như trong lúc canh tác, lúc thu hoạch, lúc dự trữ, lúc chế biến thức ăn, lúc bảo quản, lúc vận chuyển và ngay trong cả quá trình cho ăn Họ biết sự có mặt độc tố trong thức ăn không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà c n sản sinh ra các độc tốt

gây bệnh cho vật nuôi Có thể kể điển hình là Aflatoxin – là độc tố của nấm Aspergillus flavus và parasiticus – có nhiều ở hạt bắp, đậu phộng và một vài loại hạt khác có chứa

dầu Nó không chỉ là độc tố nấm mốc gây nhiễm độc, gây rối loạn chức năng, gây suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà còn gây chết gia súc Aflatoxin c n được chứng minh là chất độc gây ung thư cho động vật, do đó rất nguy hiểm cho con người

Các nhà nghiên cứu đã ứng dụng từ những kiến thức và những tư liệu trên Thế Giới, bên cạnh đó kết hợp với những kỹ thuật tiên tiến cho ra các sản phẩm ưu việt hơn như giống cây trồng, vật nuôi, thức ăn mới, các loại thuốc chữa bệnh, các loài vi sinh vật sử dụng trong chế biến – bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa các loại vi khuẩn, nấm mốc gây bệnh nhằm phục vụ đời sống cho con người, phát triển kinh tế - xã hội và bảo

vệ môi trường

Trước thực trạng đó, con người luôn tìm kiếm những vi sinh vật có khả năng bảo vệ thực phẩm mà cũng bảo vệ sức khỏe con người và động vật Theo các nghiên cứu thì vi khuẩn sinh acid lactic được ứng dụng nhiều nhất Vi khuẩn này có hoạt tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêu diệt những vi sinh vật có hại và cũng là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn đường ruột

Từ những lợi ích của vi khuẩn lactic, chúng còn có khả năng ức chế sự phát triển

của nấm mốc Do đó, đây cũng chính là lý do em chọn để thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng ứng dụng vi khuẩn lên men lactic trong bảo quản hạt đậu phộng.”

2 Tình hình nghiên cứu

Trên thế giới, có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng về khả năng kháng nấm

do vi khuẩn lactic sinh ra

 ―Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium

in vitro trong nấu mạch nha lúc mạch‖ của A Laitila và cộng sự (2002)

 ―Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm‖ của Cassandra De Muynck và cộng sự (2004)

 ―Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi

kháng Aspergillus fumigatus‖ của Kim Jeong Dong (2005)

 ―Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus nomius của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae‖ của R Muñoz và cộng sự (2010)

Ở nước ta, cũng có một vài nghiên cứu về khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic

 ―Khả năng giảm hàm lượng Aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm

Trichoderma‖ của Lương Thị Phương Thảo (2015)

 ―Chủng nấm men Saccharosemyces cerevisae sử dụng bổ sung vào thức ăn

chống tác hại của Aflatoxin và bệnh đường tiêu hóa‖ của Đậu Ngọc Hào và Phạm Minh Hằng

3 Mục đích nghiên cứu

Ứng dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt đậu phộng khỏi sự phát triển nấm mốc sinh Aflatoxin

4 Mục tiêu nghiên cứu

Ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản hạt giống

5 Nội dung nghiên cứu

Hoạt hóa các chủng lactic Lactobacillus sp L5, Lactobacillus sp L3, Lactobacillus

Khảo sát hoạt tính sinh học của 3 chủng vi khuẩn vi khuẩn lactic (sinh khối, tổng hợp acid lactic, tạo biofilm, ức chế nấm mốc) khi nuôi cấy trên môi trường bắp cải so sánh với môi trường MRS

Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng khi xử lý với các tổ hợp vi khuẩn lactic

6 Tính mới của đề tài

Đã tuyển chọn và kết hợp được 3 chủng vi khuẩn lactic Lactocbacillus sp L5, L3

và L2N

Xây dựng được quy trình để bảo quản hạt đậu phộng từ 3 chủng lactic

Tạo sản phẩm hạt đậu phộng xử lý vi khuẩn lactic kéo dài thời gian bảo quản khỏi nấm mốc sinh Aflatoxin

7 Phương pháp nghiên cứu

7.1 Phương pháp luận

Để ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản hạt đậu phộng thay cho chất bảo quản hóa học, các vi khuẩn lactic có nguồn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống được khảo sát tuyển chọn theo khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm và đối kháng nấm Đồng thời ảnh hưởng của các môi trường lên men lên các tính chất trên cũng được khảo sát

Cuối cùng khả năng chống mốc của hạt đậu phộng xử lý dịch nên cấy trong môi trường tối ưu sẽ được chứng minh

7.2 Phương pháp xử lý số liệu

 Phần mềm Excel 2 16 để vẽ đồ thị

 Phần mềm thống kê SAS 9.1

8 Kết quả đạt được

Xác định khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm và đối kháng nấm của

3 chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus sp L5, L3, L2N đối với chủng nấm mốc Aspergillus sp CĐP1

Xác định môi trường lên men thích hợp của các chủng vi khuẩn lactic

Xây dựng được quy trình bảo quản hạt đậu phộng

CHƯ NG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm

Nấm (tên khoa học: Fungi) là một giới trong năm giới theo hệ thống phân loại của

R.H.Whittaker (1996) Nấm tồn tại và phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, xác sinh vật chết, động vật, thực vật,… chúng đóng vai tr quan trọng trong việc phân giải các hợp chất trong tự nhiên như Cellulose, Protein, Lipid, Chitin,… đảm bảo vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Chúng còn có khả năng sinh độc tố gây hại cho con người, động vật và thực vật

1.1.1 Tổng quan về Aspergillus sp

Aspergillus là một chi gồm vài trăm khuôn loài được tìm thấy ở vùng khí hậu

khác nhau trên thế giới, được nhà hóa học và nhà sinh học người Ý Pier Antonio Micheli xếp vào danh mục đầu tiên vào năm 1729

1.1.1.1 Phân loại khoa học

Aspergillus gồm hơn 185 loài, nhiều loài gây bệnh cho con người và động thực vật

Nhiều loài được con người ứng dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh, có vách ngăn ngang hoàn chỉnh

Nhiều khuẩn ty phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng, đặc biết vách ngăn ngang có 1 lỗ nhỏ để cho tế bào chất trao đổi qua lại giữa hai tế bào Khuẩn ty đứt thành khúc, và mỗi khúc hay đoạn đều có thể phát triển cho ra một khuẩn ty mới

Hình 1.1: Hình dáng tế bào Aspergillus

1.1.1.3 Quá trình dinh dưỡng và sinh trưởng

Các loài nấm sinh trưởng không cần ánh sáng Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2 – 500C, tối ưu từ 22 – 270C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được 35 – 400C Nói chung, nấm có thể phát triển ở môi trường acid nhưng pH tối ưu

là 5 – 6.5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 Oxy cũng cần cho sự phát triển của nấm vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và nước là yếu tố cần thiết cho sự phát triển

Nấm có thể phát triển liên tục trong 4 năm hoặc hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát triển của chúng Nấm mốc không có diệp lúc tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót

và phát triển nhờ khả năng ký sinh sống ký sinh trong cơ thể động vật hoặc thực vật) hay hoại sinh trên xác,… Nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm là C, O, H, N, P, K, Mg,

S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn

vô cơ đơn giản như Glucose, muối Ammino,… sẽ được hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp

để cắt các đại phân tử thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào

1.1.2 Tác hại của độc tố Aflatoxin

Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân thử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật và con người Điểm đặc biệt ở độc tố nấm mốc là chúng có thể gây hại ở nồng độ thấp

Các loại đốc tố do Aspergillus sp tiết ra: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),

Ochratoxin A, Stermatocystin, Acid cyclopianxoic

Độc tố gây ngộ độc và nguy hại là Aflatoxin Chúng là độc tố vi nấm do nấm

mốc A flavus, A parasiticus, A nomius sản sinh, thường gây ô nhiễm trên một số hạt

Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan, nếu mức độ ô nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản và về lâu dài sẽ gây ung thư

Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 Giữa 4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004)

1.1.2.1 Tác hại của nấm gây ra cho con người

Aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều lượng cao trong thời gian ngắn Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm: xuất huyết, hủy hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hóa thức ăn k m, sụt cân, nhưng rõ nhất chính lả ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư gan

1.1.2.2 Tác hại của nấm gây ra cho động vật

Các triệu chứng nhiễm độc Aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc

tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật Sự nhiễm độc mãn tính Aflatoxin có tính di truyền theo 3 kiểu: gây ung thư, quái thai, đột biến Hậu quả của việc nhiễm Aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm với tác nhân càng cao

 Aflatoxin B1 là độc tố quan trọng nhất và là chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong

số các Aflatoxin Chúng có thể tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh

1.1.3 Các phương pháp khử nhiễm độc tố

1.1.3.1 Phương pháp vật lý học

Phân hủy Aflatoxin bằng không khí nóng: dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa Aflatoxin để làm giảm liều lượng Aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt độ không khí nóng đưa vào là 1 0

C – 1450C ở ngô hạt thì lượng Aflatoxin có thể giảm tử 877 ppb còn

452 ppb, tử 378 ppb còn 223 ppb Nếu nhiệt độ tang lên tới 1650C có thể làm cho lượng Aflatoxin B1 giảm đến 65 Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Phân hủy Aflatoxin bằng hấp ướt ở áp xuất cao: phương pháo hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này nhanh chóng phá hủy vòng lacton trong cấu trúc phân tử của Aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm Aflatoxin từ 40 – 4 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 1200C thêm nước vào gạo tỉ lệ 1:4) có thể làm giảm hàm lượng Aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7 ppb Aflatoxin B1 được hấp ướt ở 1200C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng Aflatoxin thấp 76 ppb được hấp ở 1.5 atm trong vòng 1 giờ đã phân hủy hoàn toàn Aflatoxin Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Làm giảm Aflatoxin bang các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả năng hấp phụ Aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer hữu

vô cơ có bản chất aluminosilicate như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino – silicate), một số chất s t đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl, polypyrrolidone) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Phân hủy Aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím

Ở bước song 365 nm, khả năng hấp phụ Aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận thấy lượng Aflatoxin ở bắp (150ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức Aflatoxin thấp hơn 4 µg kg

Phương pháp sử dụng các chất oxy hóa – khử: các chất oxy hóa – khử như Natri Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2 được sử dụng để làm mất độc tính của Aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaoCl để sử lý hạt nhiễm Aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí Ozone (O3 cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy Aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng

là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein và vitamin

Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Amonium Hydroxide (NH4OH) và Natri Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hạt Aflatoxin Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của Aflatoxin

Phương pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt Aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0.5 – 1.5% và nhiệt

độ bên ngoài là 250C, trong 14 ngày liên tiếp, lượng Aflatoxin từ 200 ppb có thể giảm xuống c n 1 ppb Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.1.3.3 Phương pháp sinh học

Khử nhiễm độc tố Aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật

Hiện nay, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Aflatoxin dễ bị một số vi sinh vật như nấm, vi khuẩn và nấm men phân hủy sinh học Một số loài vi khuẩn, chẳng hạn

như Lactobacilli, Bacillus, Pseudomonas, Ralstonia và Burkholderia spp đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của nấm và sự sản xuất Aflatoxin bởi Aspergillus sp

trong phòng thí nghiệm (Reddy và cộng sự, 2010)

Streptomyces sp tổng hợp được Aflastatin A, là hợp chất có bản chất là protein,

ức chế một số enzyme esterase tham gia quá trình tổng hợp Aflatoxin của nấm A paraciticus (Ono M và cộng sự, 1997)

Độc tố Aflatoxin bị ức chế bởi các vi khuẩn lactic như Lactobacillus casei có

hoạt động mạnh chống sự phát triển của nấm và sự này mầm của bào tử nấm (Kim, 2007)

Petchkongkaew và cộng sự 2 8 xác định B licheniformis có khả năng ức chế

sự phát triển của A flavus và loại bỏ được 74% Aflatoxin B1, còn B subtilis có thể ức chế sự tang trưởng của A flavus và loại bỏ 85% Aflatoxin B1

Taylor và cộng sự 2 1 đã nghiên cứu một số enzyme thuộc nhóm

Actinomicetales ở Mycobacterium smegmatis có khả năng tác động vào nhóm este của

Aflatoxin bằng cách kích hoạt các phân tử cho quá trình tự thủy phân và khử nhiễm

Theo Niu và cộng sự (2008), một số vi sinh vật sử dụng coumarin như một nguồn cacbon, kết quả chỉ ra rằng tác động làm giảm Aflatoxin được thực hiện bởi enzyme protease

Phương pháp kiểm soát Aflatoxin bằng vi sinh vật rất đáng được quan tâm sử dụng

vì giá thành rẻ, sử dụng thuận tiện, có lợi cho sản xuất, tạo ra sản phẩm sạch, đảm bảo sức khỏe và quyền lợi cho người tiêu d ng Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Bảng 1.1: Tóm tắt các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn

Bacillus

pumilus

Aspergillus parasiticus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào, sinh ra trong

quá trình nuôi cấy B pumilus,

ức chế sự phát triển và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp

Streptomyces sp tổng hợp được

aflastatin A, là hợp chất có bản chất là protein, ức chế 1 số enzyme esterase tham gia quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp

Lactobacillus

casei

Aspergillus flavus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi

chất ngoại bào, sinh ra trong

quá trình nuôi cấy L casei, ức

chế sự phát triển và quá trình tổnghợp độc chất aflatoxin của

B subtilis tổng hợp các

protease, chitinase, 1,3glucanase làm ức chế sự

β-phát triển của nấm Asp flavus

R Thakaew và cộng sự, 2013

Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa Chỉ tính riêng cà phê, Việt Nam hiện có năng suất cao trên thế giới, 8 đến 10 tấn cà phê/hecta Để đạt được năng suất ấy, người nông dân phải

sử dụng đến 2 tấn urê/1 ha cùng với rất nhiều phân bón hóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng

có những ưu điểm sau:

 Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất

 Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

 Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

 Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm

 Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất Tác dụng của CPSH đến từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu

 Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

 Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng

1.2 Tổng quan về bảo quản hạt giống

Hạt giống là yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu quả gieo trồng bởi chất lượng hạt giống có tốt thì khả năng nảy mầm và phát triển mới cao Muốn đảm bảo chất lượng hạt giống cây trồng, có thể sử dụng sang vụ sau ta cần phải bảo quản hạt giống đúng cách

Mục đích của bảo quản hạt giống là phải giữ được độ nảy mầm của hạt, hạn chế tổn thất về số lượng và chất lượng hạt giống, duy trì tính đa dạng sinh học của hạt giống Tiêu chuẩn hạt giống phải có chất lượng cao, thuần chủng và không bị sâu bệnh

Trước khi đem hạt giống đi bảo quản ta cần phải loại bỏ các hạt không đạt yêu cầu, tạo môi trường sạch không cho vi sinh vật và côn trùng xâm nhiễm Sau đó làm khô hạt bằng cách phơi hoặc sấy, đây là bước không thể bỏ qua khi bảo quản hạt giống Để tránh hạt giống bị mối mọt, ẩm mốc ta cần phải phơi – sấy hạt đúng cách, thóc khi sấy phải ở nhiệt độ từ 40 – 450C đến khi độ ẩm đạt 13%, có các loại hạt có dầu thì sấy ở nhiệt độ từ 30 – 400C đến khi độ ẩm đạt 8 – 9 Không nên phơi trực tiếp hạt dưới ánh nắng quá to hay trên nền sân bê tông, sân gạch bởi có thể làm biến dạng hạt Sau khi phơi sấy hạt giống, tốt nhất nên để hạt nguội trước khi đem đi bảo quản Việc để nguội

hạt giống sẽ tránh hạt giống hô hấp, thoát hơi nước, tránh hiện tượng ẩm hạt, ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm

Trước khi cho hạt vào bảo quản thì các phương tiện bảo quản phải được làm sạch (Bộ Nông Nghiệp)

 Phương pháp truyền thống: chum, vại bịt kín hoặc đóng bao treo nơi khô ráo

 Phương pháp hiện đại: kho mát, kho lạnh, kiểm soát chặt chẽ bằng thiết bị tự động

Các phương pháp bảo quản hạt giống (Bộ Nông Nghiệp)

 Phương pháp bảo quản dưới 1 năm

Hạt giống được cất giữ trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm bình thường (26 – 280C)

để ở nơi khô ráo

 Phương pháp bảo quản trung hạn dưới 2 năm

Bảo quản hạt giống trong điều kiện lạnh, nhiệt độ thích hợp là 00C, độ ẩm không khí từ 35 – 40%

 Phương pháp bảo quản dài hạn trên 2 năm

Hạt giống được bảo quản ở điều kiện lạnh đông, nhiệt độ là -100C, độ ẩm không khí

từ 35 – 40%

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.3.1 Giới thiệu chung

Vi khuẩn lactic acid là vi khuẩn chiếm ưu thế có trong hầu hết các loại thực phẩm lên men truyền thống và vai trò của chúng trong quá trình lên men được biết đến

từ rất lâu (Anandharaj và Sivasankari, 2013)

Lactic acid được phân lập lần đầu tiên bởi nhà hóa học người Thụy Điển Carl Wilhelm Scheele vào năm 178 từ sữa chua Cấu trúc của nó được thiết lập bởi Johannes Wislicenus vào năm 1873 Vào năm 1856, Louis Pasteur phát hiện ra

Lactobacillus và vai trò của nó trong việc tạo ra acid lactic Lactic acid bắt đầu được

sản xuất thương mại bởi nhà thuốc người Đức Boehringer Ingelheim vào năm 1895

Lactobacillus được sử dụng để sản xuất sữa chua, pho mát, bia và các loại thực

phẩm lên men khác, cũng như thức ăn chăn nuôi như ủ chua và acid hóa gây ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng Trong những năm gần đây nhiều sự quan tâm đã

được thể hiện trong việc sử dụng Lactobacillus như một probiotic để phòng bệnh ở người và động vật Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Lactobacillus có vai trò hữu ích

trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm tr ng đường ruột, tiêu chảy do

dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không

dung nạp lactose, bệnh về da như sốt bang đỏ, viêm lo t da và ngăn ngừa nhiễm trùng

đường hô hấp, … Lactobacillus cũng được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản

phẩm chứa lactic được tạo ra như một sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và kết thúc của quá trình lên men carbohydrat

Trong một nghiên cứu mới nhất, lactic acid đã được báo cáo là một chất kháng

nấm chính được sản suất bởi Lact plantarum UFG 108, Lact plantarum UFG 121 ức chế sự phát triển của một loạt các loại nấm, cụ thể như A niger, A flavus, F culmorum, P roqueforti, P expansum, P chrysogenum và Cladosporium sp (Russo et

al (2016).x

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Lactobacillales là vi khuẩn Gram dương, hàm lượng GC (guanine-cytosine)

thấp, tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn dạng hình cầu (cầu khuẩn) và hình que (trực khuẩn), kỵ khí tùy ý hoặc vi hiếu khí, không di động, không

Đường kính của dạng cầu khuẩn từ 0.5 – 1.5 µm, các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn từ 1 – 8 µm, trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

Vi khuẩn lactic có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 – 350C, chúng chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic Nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 – 10% NaCl Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease, phân hủy protein thành peptide, acid amin Hoạt tính này ở các loài khác nhau thì sẽ khác nhau, thường ở trực khuẩn cao hơn

 Chi: Lactobacillus

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài: L acidophilus, L casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus,

Các loài Lactobacillus được tìm thấy ở sản phẩm lên men từ động vật và thực vật,

đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người

Các vi khuẩn lactic thường được sử dụng: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum

1.3.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrat, có thể chia làm 3 nhóm

 Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, được gọi là Thermobacterium, có fructose-1,6-diphosphate aldolase FDP aldolase nhưng không có phosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 450C

 Nhóm II: Lên men dị hình t y ý, được gọi là Streptobacterium (có FDP aldolase và cảm ứng với phosphoketolase Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic

 Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, được gọi là Betabacterium (có phosphoketolasse nhưng không có FDP aldolase , quá trình trao đổi chất ca hexose và pentose

Bảng 1.2: Text sinh hóa của Lactobacillus

1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì sẽ có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau

1.3.4.1 Nguồn cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,…

1.3.4.2 Nguồn nito

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nito khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nito

Vì vậy, để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nito có sẵn trong môi trường Các nguồn nito mà vi khuẩn có thể sử dụng: cao thịt, cao nấm men, tryptone, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone,…

1.3.4.3 Nguồn vitamin

Vitamin đóng vai tr là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin

Vì vậy, cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường được sử dụng như dịch chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men

1.3.4.4 Các chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin thì vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như base nito hay acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic

Nên hiện nay, người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

1.3.4.5 Các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như Cu, Fe, Na, K, P, S, Mn, Mg Đặc biệt là Mn và Mg, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

1.3.4.6 Nguồn oxy

Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường có oxy hay không có oxy Tuy nhiên trong điều kiện hiếu khí thì vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kỵ khí

1.3.5 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic và các hợp chất kháng nấm 1.3.5.1 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic

Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và được công nhận trong nhiều nghiên cứu

Các vi khuẩn lactic có thể sản xuất một số chất kháng sinh như lactic acid và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxide hydro, bacteriocine kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm Các vi khuẩn lactic đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai tr quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men Lợi ích sức khỏe của vi khuẩn lactic được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự năm 2 1

Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng

khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại một loạt các nấm làm hỏng thực phẩm Hoạt

động kháng nấm của L coryniformis ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH

3 – 4.5 (Magnusson và Schnurer, 2001)

Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các vi khuẩn

lactic như L plantarum và L sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc

tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự, 1998) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học

(biopreservative) duy nhất – nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự năm 2 , Corcoran và cộng sự năm 2 4

Caproic-, propionic-, butyric-,

acetic-, formic- và n-valeric acid

Lactibacillus sanfranciscensis CB1

Corsetti et al., 1998

a b c d

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm: (a) 4-hydroxy-phenyllactic

acid, (b) 3-phenyllactic acid, (c) 3-hydroxydecanoic acid, (d) 3-hydroxydodecanoic

acid, e) 3-hydroxytetradecanoic acid, (f) 3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid, (g) Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin mevalonolactone, (h) methylhydantoin, (i) mevalonolactone, (j) Caproic acid, (k) Propionic acid, (l) Butyric acid, (m) Acetic aicd,

(n) Formic acid, (o) n-valeric acid Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất được tóm tắt qua bảng dưới

đây Acid hữu cơ  Tổng hợp của lactic acid và acid acetic là một trong những

nhân tố chủ yếu chịu trách nhiệm về việc bảo tồn sinh học (Trias, Baneras, Badosa và Montesinos, 2008a) Sản xuất acid trong môi trường gây ra sự suy giảm pH dẫn đến sự ức chế của nấm, các phân tử acid gây ra sự phá vỡ màng tế bào pH thấp

sẽ chuyển đổi các phân tử acid phân ly thành các phân tử acid không phân ly khi pH giảm xuống dưới pKa của acid tương ứng (Piper, Calderon, Hatzixanthis và Mollapour, 2001) Các phân tử acid hoạt động ở dạng không phân tách, vì chúng là lipo-philic và do đó có thể đi qua màng tế bào chất Do pH nội bào cao, acid phân ly giải phóng proton và anion cơ sở tiếp hợp làm gián đoạn lực chuyển động của proton màng (Adams

và Hall, 1988)

 Sự ức chế tác nhân gây bệnh nấm bằng acid hữu cơ có thể liên quan đến sự ức chế hoạt động của enzyme, bên cạnh cơ chế phá vỡ màng tế bào gây ra bởi các cấu tử hoạt động không liên kết của các acid hữu cơ này Gerez, Carbajo, Rollan, Torres,

và Font de Valdez, 2010) Baek, Kim, Choi, Yoon, Kim (2012)

và Lan et al (2012) báo cáo việc sản suất hỗn hợp các acid hữu

cơ của Leuconostoc và Weissella sp việc sử dụng chúng trong

việc bảo tồn sinh học để ngăn chặn sự phát triển của nấm gây

hư hỏng thực phẩm

 Acid 3-phenyllactic PLA cũng ức chế nấm và vi khuẩn PLA

ức chế sự phát triển của nấm Candida pulcherrima, C parapsilosis và Rhodotorula mucilaginosa (Schwenninger và

cộng sự, 2008) Trong số vi khuẩn lactic, hoạt động của PLA

từ Lact plantarum 21B được chứng minh bởi Lavermicocca et

al (2000) và Lavermicocca, Valerio và Visconti (2003) lần đầu

tiên chỉ ra rằng PLA được sinh ra từ Lactobacillus plantarum

có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của 23 chủng

nấm mốc thuộc 14 loài của chi Aspergillus, Penicillium và Fusarium đặc biệt có những loài sinh độc tố như Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Penicillium roquefoti, Penicillium verrucosum và Penicillium citrium phân lập từ các

sản phẩm như bánh, bột, ngũ cốc Một số vi khuẩn lactic đã

được chứng minh là có khả năng tổng hợp các axit PLA và

4-hydroxy-phenyllactic acid (Valerio, Lavermicocca, Pascale

3-acid, đã được phân lập từ dịch nuôi cấy nổi phía trên của Lact

plantarum MiLAB 14 (Sjogren, Magnusson, Broberg và

Schnurer, 2003) Tất cả các HFA được tổng hợp trong giai

đoạn tăng trưởng logarit Điều này cho thấy HFA không xuất hiện từ màng tế bào lysed của tế bào vi khuẩn Cơ chế hoạt động chính xác của hoạt động của HFA không được hiểu rõ

Cơ chế chung có thể là, chúng thể hiện hoạt động giống như chất tẩy rửa và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn Do đó, tính thấm của màng tăng lên và giải phóng các chất điện giải nội bào và protein từ tế bào nấm

 Lact sanfrancisco CB1 từ bột chua sản xuất axit butyric,

caproic, propionic và valeric ức chế sự phát triển của

Fusarium sp., Penicillium sp., Aspergillus sp và Monilia sp

(Corsetti, Gobbetti, Rossi và Damiani, 1998) Trong số này, axit caproic là hợp chất kháng nấm chính hoạt động kết hợp với các axit khác

 Gần đây, Ryu, Yang, Woo và Chang 2 14 đã tinh chế thuốc

kháng nấm 3-hydroxy-decanoic acid, 5-oxododecanoic acid

và 3-hydroxy-5-dodecenoic từ Lact plantarum phân lập từ

kim chi

Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc từ phô mai cũ và sữa

trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD – 28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A flavus NCIM 555, A parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này

(Roy và cộng sự, 1996)

Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất Các chủng

kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy

và cộng sự, 1996)

Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính acid

và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid b o hydroxyl,…

CHƯ NG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Viện Khoa Học Ứng Dụng Hutech trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

2.2 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ 12 2 17 đến 7/2018

2.3 Vật liệu nghiên cứu

Hạt đậu phộng được mua tại vườn, thành phố Hồ Chí Minh

Bắp cải được mua ở chợ, thành phố Hồ Chí Minh

2.3.3 Môi trường sử dụng

 Môi trường MRS broth, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic

 Môi trường PDA để nuôi cấy các chủng nấm mốc

2.3.4 Thiết bị

 Tủ cấy vi sinh (Brlad France)

 Tủ ủ (Memmert Germany)

 Tủ lạnh Toshiba

 Tủ sấy (Memmert Germany)

 Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

 Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)

 Autoclave (Memmert - Đức)

 Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England)

 Máy nước cất (Branstead USA)

Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic:

Lactobacillus sp L5, Lactobacillus sp L3, Lactobacillus sp L2N

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với Aspergillus sp

CĐP1