Nghiên cứu sự ảnh hưởng của axid salicylic và aspirin lên sự tăng tăng trưởng của cây lan gấm ( anoectochilus roxburghii) trong điều kiện in vitro

Để khắc phục những nhược điểm này người ta tiến hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, sạch bệnh, khôn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC

VÀ ASPIRIN LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY

LAN GẤM (Anoectochilus Roxburghii) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS ĐỖ ĐĂNG GIÁP

Sinh viên thực hiện : VÕ HỒNG LÊ MSSV: 1411100053 Lớp: 14DSH01

Tp Hồ Chí Minh, năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC

VÀ ASPIRIN LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY

LAN GẤM (Anoectochilus Roxburghii) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn:

TS ĐỖ ĐĂNG GIÁP

Sinh viên thực hiện:

VÕ HỒNG LÊ

MSSV: 1411100053Lớp: 14DSH01

Tp Hồ Chí Minh, năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của

acid salicylic và aspirin lên sự tăng trưởng của cây lan gấm (Anoectochilus

roxburghii) trong điều kiện in vitro” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn trực tiếp của T.S Đỗ Đăng Giáp Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực, khách quan và chưa được công bố trong các công trình khác trước đây

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về công trình nghiên cứu của mình

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018

Sinh viên thực hiện

Võ Hồng Lê

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp của mình, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới các thầy cô trong trường Đại học Công Nghệ TP.HCM – HUTECH nói chung và các thầy cô trong Viện khoa học ứng dụng nói riêng đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong thời gian qua

Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến T.S Đỗ Đăng Giáp đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn trực tiếp cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp này Thời gian làm việc với thầy không những giúp tôi trao dồi thêm kinh nghiệm mà còn học tập được tinh thần làm việc cũng như thái độ nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học để đạt hiệu quả, đây là những kiến thức cần thiết để tôi làm tốt hơn các công việc trong tương lai

Bên cạnh đó, xin cám ơn các anh chị và các bạn đã đồng hành và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Rất mong nhận được đóng góp ý kiến của các Thầy Cô để tôi hoàn thiện hơn

đề tài báo cáo của mình

Xin chân thành cám ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018

Sinh viên thực hiện

Võ Hồng Lê

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

I Đặt vấn đề 1

II Mục đích nghiên cứu 3

III Nội dung thực hiện 3

IV Phương pháp nghiên cứu 3

V Yêu cầu của đề bài 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu về cây lan gấm 5

1.1.1 Phân loại thực vật 5

1.1.2 Đặc điểm hình thái 6

1.1.3 Đặc điểm phân bố 8

1.2 Thành phần và giá trị dược liệu của lan gấm 8

1.3 Lan gấm trên thị trường 10

1.4 Nhân giống cây lan gấm 10

1.4.1 Nhân giống bằng hạt 10

1.4.2 Nhân giống bằng cây con 11

1.4.3 Phương pháp giâm cây 11

1.4.4 Nhân giống in vitro 11

1.5 Nuôi cấy mô thực vật 16

1.5.1 Ứng dụng nuôi cấy mô thực vật 16

1.5.2 Định nghĩa 17

1.5.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của thực vật in vitro 18

1.6 Vai trò của môi trường khoáng đến sự phát triển của mẫu cấy in vitro 21

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 23

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 23

1.7.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 24

1.8 Giới thiệu Salicylic Acid (SA) 25

1.9 Giới thiệu Aspirin (ASA) 28

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30

2.2 Vật liệu 30

2.2.1 Nguồn mẫu lan gấm 30

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, và hóa chất 30

2.3 Điều kiện nuôi cấy 32

2.4 Nội dung nghiên cứu 32

2.4.1 Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 32

2.4.2 Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 34

2.4.3 Thí nghiệm 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 35

2.4.4 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 38

2.5 Phương pháp thu chỉ tiêu theo dõi 39

2.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm in vitro 41

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên khả năng sinh trưởng của

cây lan gấm 46

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 48

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

4.1 Kết luận 55

4.2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 2: Thành phần dinh dưỡng và amino acid trong cây lan gấm 9

Bảng 2 1: Bảng thiết bị 30

Bảng 2 2: Bảng dụng cụ 31

Bảng 2 3: Bảng hóa chất 31

Bảng 2 4: Bảng bố trí nghiệm ảnh hưởng của SA sử dụng trong thí nghiệm 1.1 33

Bảng 2 5: Bảng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của SA sử dụng trong thí nghiệm 1.2 35

Bảng 2 6: Bảng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của ASA sử dụng trong thí nghiệm 2.1 37

Bảng 2 7: Bảng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của ASA sử dụng trong thí nghiệm 2.2 38

Bảng 3 1: Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA (ở các nồng độ 0 mg/L; 1 mg/L; 2 mg/L; 3 mg/L) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 41

Bảng 3 2: Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA (ở các nồng độ 0 mg/L; 1,0 mg/L; 1,2 mg/L; 1,4 mg/L; 1,6 mg/L; 1,8 mg/L; 2,0 mg/L) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 46

Bảng 3 3: Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA (ở các nồng độ 0 mg/L; 1 mg/L; 2 mg/L; 3 mg/L) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 49

Bảng 3 4: Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA (ở các nồng độ 0 mg/L; 1,0 mg/L; 1,2 mg/L; 1,4 mg/L; 1,6 mg/L; 1,8 mg/L; 2,0 mg/L) lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Cây lan gấm 6

Hình 1 2: Hoa lan gấm 8

Hình 1 3: Quy trình nuôi cấy sinh khối cây lan gấm bằng kỹ thuật bioreactor a: mẫu cấy ban đầu b, b1: mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy c, c1: khối lượng sinh khối thu nhận 20

Hình 1 4: a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Salicylic acid 26

Hình 1 5: a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Aspirin 28

Hình 2 1: Vật liệu lan gấm ban đầu 30

Hình 2 2: Quy trình thực hiện thí nghiệm 1.1 32

Hình 2 3: Hình mô phỏng bố trí thí nghiệm SA 33

Hình 2 4: Quy trình thực hiện thí nghiệm 1.2 34

Hình 2 5: Quy trình thực hiện thí nghiệm 2.1 36

Hình 2 6: Hình mô phỏng bố trí thi nghiệm ASA 37

Hình 2 7: Quy trình thực hiện thí nghiệm 2.2 38

Hình 3 1: Đo chiều cao cây lan gấm 42

Hình 3 2: Thu trọng lượng tươi cây lan gấm 43

Hình 3 3: Cây lan gấm sau khi sấy khô 44

Hình 3 4: Đo chlorophyll ở lá 45

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3 1: Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan gấm41 Biểu đồ 3 2: Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên trọng lượng của cây lan gấm 43 Biểu đồ 3 3: Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên hàm lượng chlorophyll của cây lan gấm 44 Biểu đồ 3 4: Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên chiều cao của cây lan gấm 46 Biểu đồ 3 5: Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên trọng lượng của cây lan gấm 47 Biểu đồ 3 6: Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên hàm lượng chlorophyll của cây lan gấm 48 Biểu đồ 3 7: Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan gấm 49 Biểu đồ 3 8: Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên trọng lượng của cây lan gấm 50 Biểu đồ 3 9: Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên hàm lượng chlorophyll của cây lan gấm 51 Biểu đồ 3 10: Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên chiều cao của cây lan gấm 52 Biểu đồ 3 11: Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên trọng lượng của cây lan gấm 53 Biểu đồ 3 12: Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên hàm lượng chlorophyll của cây lan gấm 54

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MS Murashige và Skoog (1962)

SA Salicylic acid

ASA Acetylsalicylic acid (Aspirin)

NAA α - Naphthaleneacetic acid

LỜI MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Từ trước đến nay cứ nhắc đến lan người ta sẽ nghĩ ngay đến loài hoa đã chinh phục người phương Đông và cả phương Tây bởi cấu trúc kì diệu và sự đa dạng về màu sắc, hình dáng vầ cả hương thơm quyến rũ Nhưng không nhiều người biết rằng lan còn có cả giá trị dược liệu Một trong số đó là cây lan gấm, đối tượng

mà tôi hướng đến để nghiên cứu trong bài viết này

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều người sử dụng các loại thảo dược truyền thống để phòng và chữa bệnh Viện thực vật học Trung Quốc cho rằng, cùng với Trung Quốc, Lào và Việt Nam là một trong những nước có tài nguyên cây thuốc phong phú nhất Tuy nhiên, nguồn cây thuốc của Việt Nam đang dần cạn kiệt vì các hoạt động khai thác bừa bãi và công tác bảo tồn ngay cả ở các khu bảo tồn thiên nhiên và rừng quốc gia đều chưa được đẩy mạnh Còn một điều đáng chú ý là việc khai thác tài nguyên rừng trong đó có cây thuốc là kế sinh nhai chủ yếu của các dân tộc thiểu số mà các thương nhân khai thác nhưng trả lại bằng một mức giá rất thấp Bên cạnh đó, các dự án trồng rừng chủ yếu chỉ quan tâm đến cây gỗ, cây nguyên liệu và cây ăn quả mà chưa chú ý đến cây dược liệu, loại cây có giá trị hàng hóa cao Ví dụ: lan gấm xuất xứ Việt Nam đang được thương gia Đài Loan chào bán trên Alibaba với giá 2800 – 4000 nhân dân tệ/ 1 kg (tương đương 8,5 – 12 triệu đồng), hầu như cao hơn các loại cây khác Vì vậy trông điều kiện kinh tế như hiện nay, việc mở rộng khu vực trồng cây thuốc không chỉ nhằm phát triển nguồn dược liệu, mà còn là biện pháp hữu hiệu để xóa đói giảm nghèo tại địa phương

Cây lan gấm hay còn gọi là lan Kim tuyến, cỏ nhung, cây kim cương,… Họ Lan (Orchidaceae) là họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi Có nhiều loài Lan thuộc họ thực vật này còn là những vị thuốc chữa

bẹnh rất hay Chi lan gấm Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan gấm Anoectochilus setaceus Blume được biết đến nhiều không

những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó (Nguyễn Tiến Bân,

2005) Đây là một loài dược liệu đặc biệt quý hiếm, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam

Tại Việt Nam, có nhiều loài lan rất quý, được nước ngoài biết đến và đặt mua với số lượng lớn nhưng thực tế nhu cầu người tiêu dùng quá cao trong khi lan gấm chủ yếu bị thu hái trong tự nhiên nên không đáp ứng được nhu cầu của khách hàng, đồng thời sản lượng cây trong tự nhiên rất ít nên loài lan gấm đang bị đe doạ nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ - CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại; và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d trong sách đỏ Việt Nam năm 2007, phần thực vật (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2007; Chính Phủ Nước Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam, 2006) Vì thế chúng ta cần có biện pháp bảo tồn loài dược liệu quý này Hiện nay nhà nước ta cũng đang có những công trình nghiên cứu để nhân giống loài dược liệu quý hiếm này

Trước đây người ta đã có những phương pháp nhân giống các loài lan như gieo hạt, tách mầm nhưng vẫn còn nhược điểm là mất thời gian, dễ bị thoái hóa qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, Để khắc phục những nhược điểm này người ta tiến hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, sạch bệnh, không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết và được bán ra với giá cả hợp lí Nhờ vậy mà đáp ứng được nhu cầu ngày một tăng của thị trường

Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời là một hy vọng mới cho việc bảo tồn những loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng như lan gấm Với ưu điểm là có thể nhân nhanh số lượng trong một thời gian ngắn, không bị phụ thuộc vào thời gian và điều kiện khí hậu bên ngoài nên nuôi cấy mô ngày càng khẳng định tính ưu việt trong việc nhân nhanh cũng như bảo tồn những loài cây có nguy cơ tuyệt chủng (Bektas và cộng sự, 2013) Việc nghiên cứu nhân giống cây lan gấm là việc cấp thiết góp phần bảo vệ nguồn gen quý hiếm, không những nhân nhanh mà còn phải sinh trưởng nhanh để

kịp thời cung cấp cho thị trường và có thể xuất khẩu ra thị trường nước ngoài trong tương lai

Đề tài “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của acid Salicylic và Aspirin lên sự tăng

trưởng của cây lan gấm (Anoectochilus roxburghii) trong điều kiện in vitro” được

thực hiện là bước đầu xây dựng quy trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy

mô lan gấm Góp phần trồng trọt và phát triển cây dược liệu quý hiếm mà trước đó chỉ khai thác trong tự nhiên, trên cơ sở đó bảo tồn nguồn gen quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng và cung cấp nguồn sinh khối lan gấm tốt hơn cho thị trường trong và ngoài nước Cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc phát triển các nghiên cứu sau này

II Mục đích nghiên cứu

Với mục đích nhân nhanh với năng suất cao loài lan gấm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo tồn nguồn dược liệu quý và tạo ra nguồn sinh khối lan gấm dồi dào cung cấp rộng rãi cho người sử dụng

Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh, giá cả phù hợp, đáp ứng nhu cầu của thị trường, tạo nguồn nguyên liệu quý cho ngành Dược

III Nội dung thực hiện

- Khảo sát ảnh hưởng của SA lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm trên hai dãy nồng độ

- Khảo sát ảnh hưởng của ASA lên khả năng sinh trưởng của cây lan gấm trên hai dãy nồng độ

- Tìm nồng độ thích hợp nhất của SA và ASA tạo ra kết quả tối ưu nhất cho

sự tăng trưởng của cây lan gấm in vitro

IV Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần Các số liệu thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm SAS và

sử dụng các hàm trong excel

V Yêu cầu của đề bài

Xác định được công thức tối ưu của môi trường nuôi cấy MS kết hợp SA và

ASA thích hợp nhất cho cây lan gấm in vitro tăng trưởng tốt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây lan gấm

Cây lan gấm (Anoectochilus sp) còn gọi là cây kim cương, kim tuyến, mộc sơn thạch tùng, thuộc họ Orchidaceae, gồm bốn chi: Ludisia, Anoectochilus,

Goodyera, Macodes và trên 50 loài (Ormerod Paul, 2005) Lan Anoectochilus có tên

thường gọi là lan lá gấm, nhưng trong giới sưu tập thì cây này còn có tên là Lan giải thùy hay Lan sứa (Phạm Hoàng Hộ, 2003) Chúng được biết đến bởi giá trị làm cảnh do hoa và lá đẹp và còn có giá trị làm thuốc, là loại thảo dược có giá trị và tiềm năng lớn

Chi Anoectochilus thuộc họ lan có hơn 40 loài có mặt ở hầu khắp các nước

nhiệt đới trải dài từ dãy Himalaya của Ấn Độ đến vùng Đông Nam Á và kéo dài tới

Hawai Trong chi Anoectochilus có một số loài được sử dụng để làm thuốc ở Trung Quốc như: A formosanus Hayata, A koshunesis Hayata và A roxburghii (Zhong HJ

và cộng sự, 2000)

1.1.1 Phân loại thực vật

Cây lan gấm có tên khoa học là: Anoectochilus roxburghii

Đồng danh là (Anoectochilus setaceus Blume)

Giới Plantae (Thực vật)

Ngành Angiospermae (Thực vật hạt kín)

Lớp Monocots (Một lá mầm)

Bộ Asparagales (Bộ măng tây)

Họ Orchidaceae (Họ phong lan)

Chi Anoectochilus

Loài A roxburghii

(Nguồn: https://caythuoc.org) (Nguồn: http://www.vast.ac.vn)

Hình 1 1: Cây lan gấm 1.1.2 Đặc điểm hình thái

1.1.2.1 Đặc điểm của cây trưởng thành

Lan gấm là cây thân thảo, thân mọng nước, mang từ 2 đến 6 lá mọc xòe sát đất Lá có nhiều hình dạng khác nhau nhưng dần tròn ở cuống, đầu lá hơi nhọn Lá

có màu nâu đỏ ở mặt dưới, màu xanh xẫm ở mặt trên, gân lá thường nhẵn và có màu hồng đỏ Hoa từng chùm mọc ở đầu ngọn thân, thường phủ lông màu nâu đỏ (Phùng Văn Phê và cộng sự, 2010)

1.1.2.2 Đặc điểm thân rễ

Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài Chiều dài thân

từ 5 – 12 cm, đường kính từ 2,5 – 3,5 mm Thân rễ thường có màu trắng có lúc nâu

đỏ và không phủ lông Số lóng trên thân thay đổi tùy từng cây và giao động trong khoảng từ 3 – 7 lóng, chiều dài mỗi lóng từ 1 đến 5 cm (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

1.1.2.3 Đặc điểm thân khí sinh

Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng Chiều dài thân từ 3 – 7 cm, đường kính từ 2,5 – 3,5 mm Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau, số lóng và chiều dài lóng thay đổi lần lượt từ

2 – 5 lóng và chiều dài lóng từ 1,5 – 4 cm, thân mọng nước, nhẵn, không phủ lông,

thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt (Phùng Văn Phê và cộng sự, 2010)

1.1.2.4 Đặc điểm của rễ

Rễ mọc ra từ các mấu trên thân Đôi khi rễ cũng được hình thành từ rễ khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất, thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, thỉnh thoảng có nhiều hơn Số lượng và khích thước rễ khác nhau cho từng cá thể Số lượng rễ trong khoảng từ 2 – 9 Chiều dài thay đổi từ 1 – 9 cm (Phùng Văn Phê và cộng sự, 2010)

1.1.2.5 Lá cây

Lá lan gấm mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 – 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 – 4 cm, trung bình là 3,12 cm Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ Các gân bên

ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,6 – 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn

Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6, thông thường có 4 lá Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

1.1.2.6 Đặc điểm hoa, quả

Hoa lan gấm dạng cụm, dài 10 – 20 cm ở ngọn thân, mang 4 – 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi Mùa hoa tháng 10 – 12 Mùa quả chín tháng 12 – 3 năm sau (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

(Nguồn: http://lankimtuyendalat.blogspot.com)

Hình 1 2: Hoa lan gấm 1.1.3 Đặc điểm phân bố

Theo Đỗ Đức Thăng (2017), Lan gấm một loài đặc hữu ở Đài Loan chúng sinh

sống ở độ cao 800 – 1500 m trong dãy núi trung tâm của Đài Loan và các đảo ngoài

khơi của Lanyu Nó cũng được tìm thấy trong quần đảo Ryukyu của Nhật Bản, và tỉnh Phúc Kiến tại Trung Quốc (Anon, 1999) Ở Việt Nam lan gấm mọc trên các dãy núi thuộc một số tỉnh như: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)

1.2 Thành phần và giá trị dược liệu của lan gấm

Hợp chất metanol được tách chiết từ lan gấm có khả năng gây ra hiện tượng apoptpsis đối với tế bào MCF – 7, kinsenone được tách chiết từ lan gấm được báo cáo là có tác dụng chống oxi hóa Ngoài ra, một số hợp chất chuyển hóa như flavonoid (kaempferol – 3 – O – β – D – [glucopyranoside], kaemferol – 7β – D – [glucopyranoside], isorhamnetin – 3 – β – D – [rutinnoside], hydroxybenzylquercetin, quercetin – 7 – O – β D – [6” – O – [transferuloyl] – glucopyranoside, 5 – hydroxy – 3’,4’,7 trimethoxyflavonod – 3 – β – D – [rutinnoside], isorhamnetin – 3 – O β – D – [glicopyranoside], isorhamnetin – 7 O –

β – D [glucopyranoside]) theo một số nghiên cứu là có tác dụng chống oxi hóa

Theo dược học dân gian, lan gấm có vị ngọt, hơi chát, tính mát Tại Đài

Loan, cây A formosanus tươi hoặc khô đun sôi trong nước và lấy nước uống dùng

điều trị đau ngực và đau bụng (Hu 1971), bệnh tiểu đường, viêm thận (Chiu và

Chang 1995), sốt, tăng huyết áp, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và đau phế mạc, thần kinh suy nhược, viêm gan mãn tính, tăng cường sức khỏe, khí huyết lưu thông (Kan 1986) Cây tươi được áp dụng bên ngoài như là một loại thảo mộc điều trị rắn

cắn (Kan 1986) Tại Mã Lai, những cây khác thuộc chi Anoectochilus được dùng để

trị lao phổi

Lan gấm có tác dụng chống ung thư (Tseng và cộng sự, 2006; Yang và cộng

sự, 2013), ngoài ra theo nhóm tác giả thì lan gấm còn có tác dụng tăng khả năng miễn dịch Lan gấm có tác dụng điều trị bệnh hen xuyễn, đóng vai trò như một hepatoprotective, chống lại sự tăng glucose trong máu, chống loãng xương, trong nghiên cứu này thì các polysacharide là một loại prebiotic giúp tăng sự phát triển

của các chế phẩm sinh học in vitro và in vivo (Yang và cộng sự, 2013) Theo y học

dân gian thì lan gấm còn có tác dụng chữa trị một số bệnh như đau ngực, đau bụng, sốt, Cây lan gấm có tác dụng bảo vệ gan (Wu và cộng sự, 2007)

Các kết quả nghiên và phân lập đã cho thấy trong chi lan gấm có chứa nhiều loại hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học như: Kinsenoside, glycosidic, adenosine, narcissin, roseoside và triterpene… Bên cạnh đó, thành phần của cây lan gấm còn chứa rất nhiều amino acid và dinh dưỡng khoáng có lợi cho sức khỏe con người Thành phần amino acid và dinh dưỡng khoáng trong cây lan gấm được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1 1: Thành phần dinh dưỡng và amino acid trong cây lan gấm

Thành phần Amino acid Thành phần dinh dưỡng Amino

acid

Hàm lượng (%)

Amino acid

Hàm lượng (%)

1.3 Lan gấm trên thị trường

Theo TS Võ Đình Quang, giám đốc Viện ứng dụng công nghệ tại TP.HCM

và Nguyễn Ngọc Quỳnh (Viện khoa học KTNN miền Nam) đã cung cấp thông tin thú vị về lan gấm tại Việt Nam, không chỉ trồng trang trí mà còn dùng làm thuốc chữa nhiều loại bệnh hiểm nghèo Nhờ quý hiếm và có tính dược liệu cao nên lan gấm cũng có giá khá cao (200 – 300 USD/kg tươi, 3200 USD/kg khô) Nếu được đầu tư một cách đúng mức thì lợi nhuận thu lại từ loài lan này là rất lớn Trên thế giới cũng có một số quốc gia như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật đã trồng và đã xuất khẩu lan gấm mang lại nguồn thu nhập khá lớn

Lan gấm trên thị trường không chỉ là những sản phẩm thô (tươi hoặc khô) nữa, ngày nay cũng đã có sản phẩm được kinh doanh từ lan gấm như viên nén lan gấm búp xanh, sản phẩm langambianG có tác dụng giúp bảo về và tăng cường chức năng của gan, giúp hạn chế sự tổn thương gan do dùng nhiều bia, rượu; sản phẩm langambianM có tác dụng hàn khí, ôn trung, sát trùng, giải độc, ngoài ra sản phẩm langamG còn có tác dụng điều trị cảm cúm, ho gà, viêm phế quản, thường bị đau tức do đầy hơi Ngoài ra trên thị trường còn có sản phẩm lá kim cương Kon Tum có tác dụng trong việc điều trị các bệnh thần kinh, đau họng, đau lưng, phong thấp,…

1.4 Nhân giống cây lan gấm

1.4.1 Nhân giống bằng hạt

Theo Phí Thị Cẩm Miện (2012) Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa

Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây

Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống Tuy nhiên trong thực tế hạt l an gấm rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt

1.4.2 Nhân giống bằng cây con

Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3 – 5 lá, cây cứng cáp có thể tách

để trồng riêng Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

1.4.3 Phương pháp giâm cây

Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới

Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2 – 4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

1.4.4 Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống

- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ

- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus

- Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen

1.4.4.1 Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức Haber Landt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật Theo ông, mỗi tế bào được lấy

từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của

tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của

cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Murashige, 1974)

Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của

mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con

người Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta hãy xem xét

những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại

1.4.4.2 Ý nghĩa của nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao,

gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là

công cụ vô cùng hữu ích Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu

tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là

do các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Phí Thị Cẩm Miện, 2012) Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3%, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78%; cây bạc hà nhân giống hữu tính có

sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được

áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính

Ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền

do duy trì được các tính trạng của cây mẹ nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định, rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo

điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 – 7, bạc hà piperita là 2 – 3, … Hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng

như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều

ưu điểm nổi trội như:

- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2 tỉ củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều

có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế

- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset

và Cornuet (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các

bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952) Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1957)

- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém

trong những điều kiện sinh thái nhất định Như ở cây cọ dầu, phải mất 10 – 15 năm mới cho thu hoạch Việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn

Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được

500.000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục

- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội

- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen

Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một

số nhược điểm như:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật

- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy từ callus)

Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật

1.4.4.3 Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

Theo Phí Thị Cẩm Miện (2012), quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo

ra các dòng vô tính Dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau,

chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau:

- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách

- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo

- Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất

về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ Tái sinh trực tiếp cũng

có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên

- Con đường tái sinh gián tiếp là khi mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma Từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo

1.5 Nuôi cấy mô thực vật

1.5.1 Ứng dụng nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô ra đời và có nhiều ứng dụng khác nhau như vi nhân giống, tạo cây đơn bội, chọn dòng tế bào thực vật (chọn dòng chịu bệnh, chọn dòng chịu stress, nuôi cấy protoplast khắc phục hiện tượng lai xa, chuyển gen thực vật,…) đặc biệt ứng dụng nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn cũng như chọn dòng có năng

suất về hợp chất thứ cấp đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sinh khối thực vật (sinh khối là dạng vật liệu sinh học từ sự sống, hay gần đây là sinh vật sống, đa

số là các cây trồng hay vật liệu có nguồn gốc từ thực vật)

Sinh khối có thể sử dụng trực tiếp và cũng có thể sử dùng một cách gián tiếp Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật chỉ sau 1 thời gian ngắn có thể tạo

ra một lượng sinh khối lớn có hoạt chất cao, thực vật nuôi cấy in vitro vẫn có thể tạo

ra sinh khối có hoạt chất cao, nghĩa là thực vật nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng

tổng hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steroid dùng trong y học,…

1.5.2 Định nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu từ thực vật hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Văn Đồng và Ngô Xuân Bình, 2010)

- Thao tác hoàn toàn trong điều kiện vô trùng, cây con sẽ tránh được các tác nhân bất lợi từ môi trường bên ngoài

- Sử dụng vật liệu ban đầu sạch virus có thể tạo ra được rất nhiều cây sạch virus

- Cây nếu như không cần sử dụng ngay có thể bảo quản với số lượng lớn trong một thời gian dài

- Các tế bào thực vật có thể được cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lí Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

- Có thể kiểm soát được chất lượng và hiệu suất của sản phầm bằng cách loại

bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật như là chất lượng nguyên liệu thô

và đồng nhất giữa các lô sản xuất

- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy huyền phù

tế bào có chất lượng cao hơn so với trong cây hoàn chỉnh (Ngô Xuân Bình, 2010)

Hạn chế:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến

nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

- Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như thiết, ghép và nhân giống bằng hạt

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình, cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền (Ngô Xuân Bình, 2010)

1.5.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của thực vật in vitro

1.5.3.1 Nuôi cấy trên môi trường rắn

Độ cứng của môi trường có ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy in

vitro Có một số chất có tác dụng làm đông đặc môi trường như agar, agarose,

gellan gum Trong đó agar được sử dụng khá rộng rãi Agar là một loại polysacharide được thu nhận từ rong biển và được biết đến như là một chất làm

đông đặc môi trường trong nuôi cấy mô in vitro Agar hòa tan trong nước ở nhiệt độ

từ 60 – 100oC và đông đặc ở khoảng nhiệt độ 45oC Agar không phản ứng với các

thành phần môi trường cũng như không bị triệt tiêu bởi các hoocmon thực vật và được sử dụng trong khoảng 0,8 – 1% Ưu điểm của agar khi bổ sung vào môi trường là hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể trong quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, môi trường chứa agar cũng có một số mặt bất lợi như môi trường bán rắn sẽ hạn chế sự di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do đó mẫu cấy chỉ hấp thụ được một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó Khi cây sử dụng hết chất dinh dưỡng xung quanh, cây khó có thể hấp thu phần dinh dưỡng phân bố ở những vị trí xa mẫu, do vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu bị giảm sút Ngoài ra, các độc tố do mô thực vật tiết ra (thường gặp là hiện tượng cây tiết ra phenol) sẽ tập trung quanh nó gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chính mẫu cấy Môi trường bán rắn chỉ được sử dụng một lần, vì không thể thay đổi thành phần của môi trường để phù hợp với từng thời kỳ phát triển của thực vật vì vậy phải cấy chuyền liên tục

1.5.3.2 Nuôi cấy lỏng

Hệ thống nuôi cấy lỏng ra đời đã đem lại nhiều triển vọng cho nuôi cấy mô Trong nuôi cấy lỏng có ba loại: hệ thống nuôi cấy lỏng tĩnh, hệ thống nuôi cấy lỏng lắc và hệ thông nuôi cấy bioreactor

Nuôi cấy lỏng tĩnh: các tế bào được ngập chìm và để tĩnh trong môi trường

nuôi cấy, sau thời gian nuôi cấy nhất định thì các tế bào được chuyển qua môi trường khác để có thể đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Ưu điểm của phương pháp này là việc chuẩn bị và sử dụng môi trường khá dễ dàng (Shakti và cộng sự, 2007) Nuôi cấy trong môi trường lỏng cho phép kiểm soát một cách chủ động các thông số lý hóa, là tiền đề cho xây dựng hệ thống tự động, triển khai trong quy mô công nghiệp Chi phí sản xuất thấp hơn so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn, tiết kiệm được thời gian và lao động Do không cần sử dụng chất làm đặc môi trường như agar vì thế sẽ giảm thiểu được nguồn chi phí cũng như nguồn nhân lực trong quá trình sản xuất Do là môi trường lỏng nên các chất dinh dưỡng sẽ phân bố đều môi trường giúp cây tiếp xúc hoàn toàn với nguồn dinh dưỡng vì thế giảm thời gian nuôi cấy đi đáng kể Tuy nhiên, trong môi trường lỏng tĩnh sự trao đổi không khí rất hạn chế, điều này sẽ làm cho mẫu cấy chậm phát triển,

đôi khi chết (đối với mẫu mô sẹo, protocorm,…) Mẫu cấy trong môi trường lỏng một thời gian sẽ xảy ra hiện tượng thủy tinh thể (Shakti và cộng sự, 2007)

Hình 1 3: Quy trình nuôi cấy sinh khối cây lan gấm bằng kỹ thuật bioreactor a:

mẫu cấy ban đầu b, b1: mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy c, c1: khối lượng sinh khối

thu nhận

Nuôi cấy lỏng lắc: các tế bào được ngập chìm trong môi trường và sự thông

khí nhờ máy lắc với tốc độ 100 – 150 vòng/phút Nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc có những ưu điểm sau: các chất dinh dưỡng được khuếch tán trong môi trường với độ đồng đều cao tạo điều kiện cho mẫu hấp thu triệt để Hơn nữa, toàn bộ bề mặt cây tiếp xúc với môi trường sẽ làm tăng hiệu quả hấp thu dinh dưỡng giúp cây sinh trưởng tốt hơn, giảm thời gian nuôi cấy Do trong môi trường được lắc liên tục nên không có sự hạn chế về trao đổi khí nên cây phát triển tốt hơn môi trường lỏng tĩnh Nuôi cấy lỏng lắc dễ dàng cho nhân giống với số lượng lớn cũng như tạo ra nhiều sinh khối Nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo được nhiều chồi hơn Ngoài ra, nuôi cấy lỏng lắc còn khắc phụ được hiện tượng thủy tinh thể trên môi trường lỏng tĩnh Hạn chế của phương pháp này là trong quá trình lắc liên tục trong một thời gian có thể tạo ra các bọt khí nhỏ gây giảm nồng độ oxy hòa tan

trong môi trường, ngoài ra nuôi cấy lỏng (hoặc lỏng lắc) trong khoảng thời gian sẽ khiến môi trường bay hơi (Shakti và cộng sự, 2007) Vì thế, cần bổ sung hoặc cấy chuyển mẫu cấy sang môi trường khác để đảm bảo sự phát triển của mẫu cấy

1.6 Vai trò của môi trường khoáng đến sự phát triển của mẫu cấy in vitro

Vai trò của môi trường khoáng đến sự phát triển của thực vật trong nuôi cấy

mô là không thể phủ nhận Môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định đến sự thành công hay thất bại của mẫu cấy, nó quyết định đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Có nhiều loại môi trường khoáng khác nhau và sự ảnh hưởng đến từng đối tượng ở những giai đoạn khác nhau cũng khác nhau Tuy có nhiều loại môi trường khoáng khác nhau nhưng thành phần của một môi trường nuôi cấy chủ yếu gồm những nhóm sau: các chất khoáng đa lượng và vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng, ngoài ra trong môi trường còn có các chất làm đông đặc môi trường như agar hay các chất bổ sung từ nguồn hữu cơ khác Mỗi nhóm khác nhau thì đóng vai trò khác nhau trong môi trường nuôi cấy:

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô hay tế bào thực vật nuôi cấy

cũng không khác biệt nhiều so với việc trồng trong tự nhiên Các nguyên tố đa

lượng cần phải cung cấp cho cây trồng in vitro bao gồm nitơ, phospho, kali, canxi,

Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy như nitơ tạo các liên kết hữu cơ, sinh tổng hợp các amino acid và protein, và làm chất mang một số cation như đồng, mangan vận chuyển qua hệ thống màng Phospho là một trong những thành phần quan trọng trong môi trường cấy, phospho tham gia vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucletic, tham gia cấu trúc của màng tế bào

Khoáng vi lượng: trước đây, các nguyên tố vi lượng không được nghiên cứu

và đưa vào môi trường Đến những năm gần đây thì các nguyên tố khoáng vi lượng mới được nghiên cứu và đưa vào môi trường Một số nguyên tố vi lượng như Fe, Cu

Bo, Zn, Mn, Clo,… Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên

tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993) Các nguyên tố này tuy chứa một lượng nhỏ nhưng không thể phủ nhận

vai trò quan trọng của các nguyên tố này đối với các hoạt động với enzyme Sắt tham gia vận chuyển các chất qua màng, ngoài ra sắt đóng vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp chlorophyll,…

Vitamin: thông thường cây có khả năng tự tổng hợp những vitamin cơ bản cho

quá trình phát triển của chúng, tuy nhiên để đảm bảo quá trình phát triển của mẫu cây thì chúng ta cần cung cấp một vài loại vitamin khác (một số loại vitamin thường sử dụng như B1, B2, B6,…) Vitamin rất cần thiết cho các phản ứng sinh hóa bên trong thực vật

Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tùy theo từng giai đoạn nuôi cấy Các vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1 – 1 mg/L (Trần Văn Minh, 1994)

Các chất điều hòa sinh trưởng: là nhóm chất được bổ sung vào môi trường

nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển của mẫu cấy Có 5 nhóm chất điều hòa sinh trưởng khác nhau là auxin, cytokinin, gibberellin, abscisis acid và ethylen Mỗi nhóm đều có sự ảnh hưởng riêng đến mẫu cấy.Tùy vào mục đích nghiên cứu mà chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung được bổ sung ở những nồng độ khác nhau

Đường: Trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng

hợp nên các chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất carbon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô Đường là nguồn cung cấp carbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết môi trường trong nuôi cấy mô, kể cả khi nuôi cấy chồi non hoặc tế bào Khi hấp khử trùng, đường bị phân hủy một phần, thuận lợi cho cây hấp thụ Có nhiều loại đường khác nhau được sử dụng trong nuôi cấy mô và sự ảnh hưởng của nó cũng khác nhau đến mẫu cấy Tùy thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu có thể lựa chọn loại đường và nồng độ bổ sung vào môi trường nuôi cấy Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994)

Nước dừa: Thường chứa các acid amin, acid hữu cơ, đường, ARN, AND

Đặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro

đó là: myo – inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosid của cytokinin

Do vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nước dừa kích thích sự phân chia, sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào, mô nuôi cấy Nước dừa thường được

sử dụng rất hiệu quả trong việc thay thế các hợp chất điều tiết sinh trưởng tổng hợp nhân tạo khi nuôi cấy hoa lan (Mamoru Kusomoto, 1980)

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Yih - Juh Shiau và cộng sự (2001), đã nghiên cứu và nhân giống thành công

loài lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường

vào mẫu là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối Môi trường được

sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA

Ông Chun-nian He và cộng sự (2006) đã nghiên cứu các hợp chất có trong

loài lan gấm (Anoectochilus roxburghi) và tìm ra đặc tính lâm sàng cụ thể và hiệu

quả của loại cây thảo dược này

Yoon và cộng sự, 2007 đã nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy như mật độ, nồng độ sucrose và cường độ ánh sáng lên sự nhân nhanh sinh khối cây

lan gấm Anoectochilus formosanus nuôi cấy trong hệ thống bioreactor Kết quả

nghiên cứu cho thấy mật độ nuôi cấy thích hợp cho sự nhân nhanh chồi cây lan gấm trong bioreactor là 8 g/L, môi trường nuôi cấy được bổ sung 30 g/L đường sucrose

là tối ưu cho cây phát triển của chồi Chồi phát triển tốt nhất khi được chiếu sáng với cường độ ánh sáng là 50 mol m-2s-1

Jin và cộng sự, 2017 đã nghiên cứu nuôi cấy chồi cây lan gấm A roxbughii

bằng hệ thống bioreactor và phân tích hàm lượng polysaccharide và kinsenoside trong khối Sinh khối nuôi cấy sau 30 ngày tích lũy tối đa kinsenoside và polysaccharide Với khối lượng mẫu cấy ban đầu là 12,5 g/L cho sự phát triển sinh khối tốt nhất, lưu lượng khí đưa vào bioreactor với tốc độ 500 mL/phút thích hợp cho cây lan gấm phát triển và hệ thống được nuôi cấy dưới cường độ ánh sáng 45

mol m-2 s-1 sinh khối lan gấm tích lũy hợp chất thứ cấp tốt nhất Sinh khối thu nhận được có hàm lượng kinsenoside đạt 200 mg/g và polysaccharide đạt 500 mg/g

1.7.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan gấm này như:

Phùng Văn Phê và cộng sự, 2010 đã nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in

vitro loài lan gấm Anoectochilus roxburghii Môi trường phù hợp nhất để nhân

nhanh chồi lan gấm in vitro là Knud Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chiều

cao chồi từ 2 - 3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường Knud được bổ sung 0,5 mg/L BAP + 0,3 mg/L Kinetin + 0,3 mg/L NAA + 100 ml/l ND + 100 g/L dịch chiết khoai tây + 20 g/L sucrose + 7 g/L agar + 0, 5 g/L than hoạt tính

Nguyễn Trung Thành và cộng sự (2012) đã nghiên cứu vai trò của môi trường khoáng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh chồi loài lan

quý (Anoectochilus setaceus Blume) với mục đích tạo ra được nguồn sinh khối lớn

loài lan này cung cấp cho thị trường dược liệu Hai loại môi trường khoáng được khảo sát là MS và Knud Môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất là MS với số chồi đạt được là 3,5 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 4,4 cm và số lượng lá đạt 7,5 lá trên cây Vai trò của 6 - Benzylaminopurine (BAP) lên hệ số nhân nhanh chồi cũng được khảo sát, nồng độ BAP thích hợp cho sự nhân nhanh chồi cây lan gấm là 0,6 mg/L trong môi trường MS số chồi đạt được là 3,8 chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi đạt 6,6 cm Ảnh hưởng tích cực của kinetin lên sự nhân nhanh chồi cây lan gấm cũng được khảo sát, kết quả cho thấy ở nồng độ 1,0 mg/L KIN cho sự nhân nhanh chồi cao nhất với số chồi đạt được là 3,2 chồi/mẫu cấy, chiều cao trung bình chồi đạt 6,1 cm

Đỗ Mạnh Cường và cộng sự, 2015 đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và các điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển cây lan

gấm (Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro Sau 2 tháng nuôi cấy, kết

quả cho thấy, trên môi trường SH có bổ sung 1,0 mg/L BA cây có sự sinh trưởng và phát triển tốt nhất với chiều cao chồi, khối lượng tươi và khối lượng khô (6,70 cm; 1,41 g và 0,1751 g; tương ứng), đặc biệt số đốt (6,33 đốt/mẫu) đạt cao nhất so với các nghiệm thức khác Sau đó, các đốt thân tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường

bổ sung 1,0 mg/L BA kết hợp αNAA ở các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi cây lan gấm Sau 2 tháng nuôi cấy, trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L αNAA các chồi có sự sinh trưởng và phát triển tốt (chiều cao chồi: 9,03 cm; số đốt: 9,33 đốt/mẫu; khối lượng tươi: 2,63 g và khối lượng khô: 0,2187g), hệ rễ phát triển mạnh (số rễ: 7,33 rễ/mẫu; chiều dài rễ: 1,36 cm) Tuy nhiên, mẫu bị nâu hóa do lượng phenol trong mẫu tiết ra nhiều Để tối ưu hóa môi trường, các điều kiện nuôi cấy: lỏng tĩnh, lỏng lắc, agar, bông gòn đã được khảo sát Kết quả cho thấy, các chồi trên môi trường lỏng có bông gòn sinh trưởng tốt, to khỏe, hệ rễ phát triển mạnh và đặc biệt không còn hiện tượng nâu hóa

1.8 Giới thiệu Salicylic Acid (SA)

Công thức hóa học: C7H6O3

Điểm sôi: 211oC

Salicylic acid (SA) là một chất giống như hormone đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự tăng trưởng và phát triển của thực vật (Raskin, 1992) Trong hai thập kỷ qua, SA đã nhận được nhiều sự chú ý vì sự tham gia của nó vào các cơ chế bảo vệ thực vật dưới áp lực sinh học và phi sinh học Các cơ chế bảo vệ này bao gồm việc thành lập hệ thống kháng tập nhiễm (systemic acquired resistance-SAR) (Mecroux và cộng sự, 1990), tạo nên protein gây tính kháng bệnh

ở cây chủ (pathogenesis – related proteins –PR) (Malamy và cộng sự, 1990) cũng như là tạo ra tính "siêu mẫn cảm" ở thực vật ("hypersensitive response") (Horváth

và cộng sự, 2007) Tác dụng bảo vệ của SA đối với các yếu tố stress phi sinh học như kim loại độc (Strobel và Kuc, 1995), stress nhiệt (Dat và cộng sự, 1998), nhiệt

độ thấp (Janda và cộng sự, 1999, Mora Herrera và cộng sự, 2005), và oxy hoá gây hại (Strobel và Kuc, 1995; Kusumi và cộng sự, 2006) đã được chứng minh Hơn nữa, vai trò của SA trong việc tạo ra khả năng chịu mặn đã được nghiên cứu chi tiết

ở nhiều loài thực vật SA đã được báo cáo đã tạo ra khả năng chịu mặn trong cà chua (Stevens và cộng sự, 2006), ngô (Gunes và cộng sự, 2007), cà rốt (Eraslan và cộng sự, 2007) và lúa mỳ (Arfan và cộng sự, 2007) Nó cũng đã được sử dụng để

tăng cường tái tạo in vitro ở một số loài thực vật (Quiroz Figueroa và cộng sự,

2001, Luo và cộng sự, 2001, Hao và cộng sự, 2006) Tuy nhiên, không có nghiên

cứu nào được thực hiện ở các loài Hibiscus, bao gồm Hibiscus acetosella và

Hibiscus moscheutos, có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới ở phía tây châu Phi (Menzel

và Wilson, 1961) và Bắc Mỹ

SA (Salicylic acid) là một acid monohydroxybenzoic béo, một loại acid phenolic và một acid beta hydroxy Acid hữu cơ kết tinh không màu, được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ và có chức năng như một hormone thực vật Nó có nguồn gốc từ sự trao đổi chất của salicin Ngoài việc giữ vai trò là một chất chuyển hóa có hoạt tính quan trọng của ASA (acid acetylsalicylic), mà hoạt động một phần như là một tiền chất của SA, có lẽ nó được biết đến nhiều nhất vì nó được sử dụng như là một thành phần quan trọng trong các sản phẩm chống mụn trứng cá (WHO,

SA là một trong những nguyên liệu ban đầu để sản xuất ASA năm 1897 SA

là một chất điều chỉnh tăng trưởng nội sinh và có thể điều chỉnh sự phát triển của

thực vật in vitro bằng cách ảnh hưởng đến chức năng sinh lý và sinh hóa của chúng

(Agami và Mohamed, 2013) Vai trò của SA trong sự tăng trưởng mô, sự phát triển

nhiều chồi, rễ và xơ cứng của cây con có nguồn gốc in vitro đã được quan sát thấy ở

Ziziphus spina-christi (Galal, 2012), Hibiscus acetosella và Hibiscus moscheutos

(Sakhanokho và Kelley, 2009)

Ảnh hưởng sinh lý ở thực vật:

Theo Nguyễn Minh Chơn (2005), SA đã cho thấy có ảnh hưởng trên nhiều quá trình của thực vật Sự trổ hoa, sự phát sinh nhiệt trong những cây sinh nhiệt, và kích thích tính kháng bệnh là những quá trình mà SA có những ảnh hưởng chính

Ứng dụng của SA trong nuôi cấy mô:

Việc bổ sung SA cải thiện sự tăng trưởng của chồi so với mẫu đối chứng và sản sinh nhiều chồi hơn trong môi trường không có muối SA thúc đẩy tăng trưởng

và chống lại sự ức chế tăng trưởng gây ra bởi các stress phi sinh học (Sakhanokho, Kelley, 2009)

SA là một chất giống như hormone đã được báo cáo để tăng cường tái tạo in

vitro ở một số loài thực vật, bao gồm cà phê arabica (Quiroz Figueroa và cộng sự,

2001), đậu ván dầu adsurgen (Luo và cộng sự, 2001), và yến mạch nuda (Hao và cộng sự, 2006)

Hiệu quả tích cực của SA đối với sự hình thành và tăng trưởng của rễ là mối

quan tâm đặc biệt, vì một số báo cáo về các nghiên cứu khả năng chịu mặn in vitro

cho thấy rằng sự hình thành và phát triển của rễ không chỉ bị ảnh hưởng bởi muối

mà còn tương quan với khả năng chịu mặn ở cả cây trồng (Martinez, 1996; Cano và cộng sự, 1998) Hơn nữa, sử dụng SA ngoại sinh tác động qua rễ đã tạo ra khả năng chống chịu đối với các stress phi sinh học bao gồm khả năng chịu nhôm của cây

Muồng ngủ (Cassia tora) (Yang và cộng sự, 2003), chịu cadmium của lúa (Guo và

cộng sự, 2007) và chịu mặn của lúa mì (Arfan và cộng sự, 2007)

Theo Nguyễn Thị Phương Dung và cộng sự (2016), cây có bổ sung thêm SA chiều cao cây tăng vượt trội, gấp hơn 2 lần công thức hạn (2,09 lần ở công thức 0,25

mM SA) và cao hơn cả đối chứng Khi có SA trong môi trường hạn đã cải thiện chiều cao cây, tăng lên 1,2; 1,3 lần so với điều kiện hạn không có SA

Theo Judy Jernstedt, các giáo sư trong khoa thực vật và đất đai tại Đại học California, Davis cho biết SA làm giảm việc sản xuất ethylene, quá trình héo của hoa bị chậm lại, và các cành cắt có thể kéo dài sự tươi dài hơn

Ngoài ra, các đặc tính kháng nấm của SA, khi hòa tan vào trong nước làm chậm sự tăng trưởng của nấm mốc làm tắc nghẽn các mô mạch của hoa

1.9 Giới thiệu Aspirin (ASA)

Công thức hóa học: C9H8O4

Điểm sôi: 140oC

Aspirin, hay acetylsalicylic acid (ASA), là một dẫn xuất của SA Khi nghe đến ASA chúng ta sẽ nghĩ ngay đến thuốc chống viêm, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm Theo như một vài nghiên cứu gần đây chúng ta sẽ bất ngờ khi biết rằng thuốc ASA có thể là “thần dược” giúp cho cây cối xanh tốt, ASA có khả năng chống nấm, chống hạn cho cây và có thể giúp cây tăng trưởng nhanh hơn

Hình 1 5: a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Aspirin

(Nguồn: https://vi.wikipedia.org/wiki/Aspirin) Các nhà nghiên cứu từ Kings Park, Western Australia đã phát hiện ra rằng thành phần chính của thuốc ASA là SA có vai trò quan trọng trong quá trình thoát hơi nước ở thực vật trong điều kiện khô hạn SA có khả năng bảo vệ hệ thống quang hợp, cho phép thực vật tăng trưởng, mặc dù có tình trạng thiếu nước Điều này có

thể do vai trò của ASA trong việc hỗ trợ quá trình điều chỉnh các lỗ khí khổng ngăn ngừa sự mất nước quá nhiều Thử nghiệm xử lý với ASA ở thực vật cho thấy với điều kiện tưới một lít nước trong một tháng, 40% số cây sống sót so với 3% ở những cây không được xử lý Kết quả của nghiên cứu này rất quan trọng trong các

dự án phục hồi thực vật tại Nature Park Thumama, Riyadh

Tại trường Đại học Rhode Island, những người làm vườn đã thử nghiệm nghiền 4 viên ASA hòa trong 15 lít nước rồi phun vào một phần của vườn rau 3 tuần/1 lần trong suốt mùa vụ Kết quả thật tuyệt, cuối mùa vụ họ thấy rằng cây trồng tăng trưởng tốt hơn và cho năng suất cao hơn so với nhóm cây không được phun ASA

Các nhà khoa học sau nghiên cứu này họ tuyên bố ASA có chứa một hoạt chất gọi là SA Nó có nguồn gốc từ vỏ cây liễu Loại acid này giúp tăng cường hệ thống miễn dịch của cây Cây được sử dụng thuốc giúp gia tăng về điện năng miễn dịch, giúp chúng trong cuộc chiến chống dịch hại và tấn công vi khuẩn và ngăn chặn sự hình thành của nấm