PHÂN TÍCH đa HÌNH đơn NUCLEOTID RS1801320 của GEN RAD51 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ BUỒNG TRỨNG

cDNA Complementary DNA DNA bổ sungDNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate HR Homologous Recombination PCR Polymerase Chai

-*** -NGUYỄN THỊ THU LÊ

PH¢N TÝCH §A H×NH §¥N NUCLEOTID RS1801320

CñA GEN RAD51 TR£N BÖNH NH¢N UNG TH¦ BUåNG TRøNG

Chuyên ngành : Hóa sinh

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Trần Huy Thịnh

HÀ NỘI - 2019 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung)

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate

HR Homologous Recombination

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen)

RFLP Restriction fragment length polymorphism (Hiện tượng đa hình

chiều dài của các đoạn DNA do enzym giới hạn tạo nên)SHPT Sinh học phân tử

SNP Single nucleotide polymorphism (Hiện tượng đa hình thái đơn

nucleotide)UTBT Ung thư buồng trứng

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm bệnh lý ung thư buồng trứng 3

1.1.1 Dịch tễ học 3

1.1.2 Các yếu tố liên quan 3

1.1.3 Chẩn đoán 4

1.1.4 Điều trị 10

1.2 Tổng quan về gen RAD51 ở người 10

1.2.1 Vị trí và cấu trúc 10

1.2.2 Chức năng 11

1.2.3 Cơ chế sửa chữa hư hỏng DNA thông qua tái tổ hợp tương đồng 11

1.3 Tính đa hình thái đơn nucleotide 14

1.3.1 Đa hình thái đơn là gì? 14

1.3.2 Tính đa hình thái đơn nucleotide của gen RAD51 15

1.4 Các kỹ thuật SHPT phát hiện tính đa hình thái đơn nucleotide 15

1.4.1 Kỹ thuật PCR 15

1.4.2 Kỹ thuật RFLP-PCR 17

1.5 Kỹ thuật giải trình tự gen 18

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng 23

2.3.1 Dụng cụ 23

2.3.2 Trang thiết bị 24

2.3.3 Hóa chất 24

2.4.2 Quy trình tách chiết DNA và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch 26

2.4.3 Quy trình khuếch đại gen và điện di kiểm tra sản phẩm 28

2.4.4 Quy trình cắt enzym và điện di kiểm tra sản phẩm 30

2.4.5 Quy trình giải trình tự gen 33

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Kết quả xác định đa hình rs1801320 của gen RAD51 trên nhóm bệnh và nhóm chứng 35

3.2 Kết quả tỷ lệ kiểu gen, tần số alen đa hình đơn rs1801320 của gen RAD51 35

Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 37

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 37

DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Phân loại ung thư buồng trứng theo FIGO 2013 9

Bảng 1.2 Một số đa hình của gen RAD51 15

Bảng 2.1 Đặc điểm mồi cho phản ứng PCR 25

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 29

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 29

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng RFLP-PCR 31

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng giải trình tự gen 33

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng giải trình tự 33

Bảng 3.1 Kết quả xác định tính đa hình rs1801320 của gen RAD51 35

Bảng 3.2 Tỷ lệ kiểu gen đa hình rs1801320 trên nhóm bệnh và nhóm chứng .35

Bảng 3.3 Tần số alen đa hình rs1801320 trên nhóm bệnh và nhóm chứng .36

Bảng 3.4 Nguy cơ mắc bệnh của các cặp kiểu gen đa hình rs1801320 ở nhóm nghiên cứu 36

Hình 1.1 Vị trí gen RAD51 trên NST số 15 11

Hình 1.2 Cơ chế sửa chữa đứt gãy sợi đôi DNA của protein RAD51 12

Hình 1.3 Minh họa hiện tượng đa hình thái đơn 14

Hình 1.4 Sơ đồ chu trình phản ứng PCR 17

Hình 1.5 Quy trình thực hiện RFLP-PCR 18

Hình 1.6 Nguyên lý giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học 19

Hình 1.7 Nguyên lý giải trình tự gen bằng phương pháp enzym 20

Hình 1.8 Giải trình tự gen bằng máy tự động 21

Hình 2.1 Minh họa vị trí cắt của enzym BstNI trên đoạn gen được khuếch đại 31

Hình 2.2 Minh họa kết quả điện di sản phẩm cắt enzym 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư buồng trứng là một trong năm nguyên nhân hàng đầu gây tửvong do ung thư xảy ra ở phụ nữ và là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong doung thư phụ khoa [1] Khoảng 225.500 trường hợp mắc mới và 140.200trường hợp tử vong do ung thư buồng trứng được báo cáo trên thế giới hàngnăm [2,3] Sau nhiều nghiên cứu, cơ chế bệnh sinh của ung thư buồng trứngvẫn chưa được hiểu đầy đủ Các nghiên cứu dịch tễ học mở rộng đã chỉ rarằng một số yếu tố có khả năng dẫn đến ung thư buồng trứng như tuổi tác,tình trạng sinh nở, vô sinh, yếu tố chế độ ăn uống và các bệnh phụ khoa (lạcnội mạc tử cung, u nang buồng trứng, bệnh viêm vùng chậu) [4] Tuy nhiên,một số phụ nữ tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ tương tự có thể không pháttriển ung thư buồng trứng trong khi nhiều trường hợp ung thư phát triển ở các

cá nhân mà không có các yếu tố nguy cơ đã biết Điều này cho thấy rằng đahình gen có thể giải thích sự khác biệt cá nhân trong nguy cơ ung thư buồngtrứng Việc phân tích mối liên quan giữa bệnh và các yếu tố nguy cơ giúp chocác nhà khoa học có thể đưa ra các phương pháp theo dõi hoặc can thiệp sớmvới những người có nguy cơ cao mắc bệnh Gần đây, nhiều nghiên cứu chothấy các yếu tố di truyền cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển củaung thư buồng trứng [5, 6]

Hệ thống sửa chữa DNA đã được xem xét để duy trì tính toàn vẹn của bộgen Sửa chữa đứt gãy hai sợi là một trong những cơ chế chính của sửa chữaDNA, nó có thể sửa chữa đứt gãy hai sợi thông qua hai con đường chính: tái

tổ hợp tương đồng (HR) và tái kết hợp không tương đồng [7] Protein RAD51đóng vai trò không thể thay thế trong quá trình sửa chữa HR thông qua liên

kết với DNA để thúc đẩy các phản ứng ghép cặp tương đồng phụ thuộc ATP

và các phản ứng chuyển sợi [8] Gen RAD51 nằm ở nhiễm sắc thể người15q15.1 và được cho là tham gia vào quá trình sửa chữa nhân sự Dạng đahình gen RAD51 135G / C (rs1801320) là sự chuyển đổi từ G sang C ở vị trí

135 của RAD51 cDNA của con người [9] Các phân tích tổng hợp trước đây

đã chứng minh rằng tính đa hình của gen RAD51 135G / C có liên quan đến

sự nhạy cảm với ung thư vú và ung thư đầu cổ [10, 11 ]

Trong thập kỷ qua, một số nghiên cứu dịch tễ học phân tử đã được thựchiện để đánh giá mối liên quan giữa đa hình gen RAD51 135G / C(rs1801320) và nguy cơ ung thư buồng trứng nhằm làm sáng tỏ nguy cơ vàmối liên hệ giữa 2 hiện tượng này nhưng tại Việt Nam chưa có một công trình

nào được tiến hành Do vậy, đề tài nghiên cứu “Phân tích đa hình đơn

nucleotid rs1801320 của gen RAD51 trên bệnh nhân ung thư buồng trứng”

được tiến hành nhằm mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ đa hình đơn rs1801320 của gen RAD51 trên một số bệnh nhân ung thư buồng trứng và người bình thường.

2 Bước đầu xác định tỷ lệ kiểu gen, tần số alen đa hình rs1801320 của gen RAD51 ở bệnh nhân ung thư buồng trứng và người bình thường.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm bệnh lý ung thư buồng trứng

1.1.1 Dịch tễ học

Ung thư buồng trứng là khối u xuất phát từ buồng trứng Theo số liệucủa Quỹ nghiên cứu ung thư quốc tế (WCRF) ung thư buồng trứng xếp hàngthứ 7 trong số 18 loại ung thư hay gặp nhất trên thế giớiở phụ nữ Năm 2012

có 239.000 ca mới được phát hiện Tỉ lệ sống trên 5 năm là 30-50% Trong 20quốc gia có tỉ lệ mắc ung thư buồng trứng cao nhất thì Fiji đứng đầu với tỉ lệmắc là 14,9/100.000 dân; Latvia và Bulgaria đứng tiếp sau với tỉ lệ mắc lầnlượt là 14,2 và 14,0/100.000 dân Hay gặp nhất là ở các nước châu Âu vàNam Mỹ Các nước chấu Phi và châu Á có tỉ lệ mắc thấp nhất [12]

Tại Anh, năm 2013 đã ghi nhận có 7284 ca mắc mới Số lượng phụ nữmắc ung thư buồng trứng chiếm 2% tổng số mắc ung thư nói chung Năm

2014 có 4128 ca tử vong chiếm 5% trong số các ca tử vong nguyên nhân vìung thư ở phụ nữ Nước Anh đã dự phòng được cho 21% các ca bệnh

Tại Việt nam, vào năm 2000, tỷ lệ UTBT tại Hà Nội là 4,4/100.000 dân

và tại thành phố Hồ Chi Minh là 3,7/100.000 dân [13] Theo Nguyễn Bá Đức,trong giai đoạn 2001 – 2004, tỉ lệ mắc ung thư buồng trứng tại Hà Nội, HảiPhòng, Thái Nguyên, Thừa Thiên Huế và Cần Thơ lần lượt là 4,7; 2,5; 1,2;2,1; 6,5 [14]

1.1.2 Các yếu tố liên quan

21% các ca bệnh ung thư buồng trứng tại Anh phần lớn liên quan đến lốisống và các yếu tố nguy cơ Nguy cơ mắc ung thư buồng trứng đã đượcchứng minh là có liên quan đến nhiều yếu tố[15]

1.1.2.1 Tuổi cao

Tỉ lệ mắc ung thư buồng trứng tăng lên ở những phụ nữ cao tuổi Hầuhết các ca bệnh phát hiện trên những bệnh nhân sau mãn kinh[16]

1.1.2.2 Yếu tố gen

Khoảng 5%-15% ung thư buồng trứng là do di truyền Trong đó, phần

lớn là vai trò của đột biến gen BRCA1/BRCA2 và các gen sửa chữa, TP53

trong dòng mầm, hội chứng Li-Fraumeni và hội chứng Pautz-Jeghers Ungthư vòi trứng và carcinoma màng bụng một phần cũng do liên quan đến gen

BRCA[17].

1.1.2.3 Tiền sử sinh sản

Có giả thuyết cho rằng ung thư biểu mô buồng trứng xuất phát từ các tổnthương liên tục bề mặt biểu mô của buồng trứng trong quá trình rụng trứng vàsửa chữa, liền sẹo Quá trình này làm tăng khả năng phát sinh đột biến gendẫn đến việc xuất hiện ung thư Trong thời gian mang thai và cho con bú quátrình này bị ngưng lại, yếu tố này được cho là giảm nguy cơ mắc bệnh Hoặc

ở những người phụ nữ có kinh sớm, mãn kinh muộn làm gia tăng nguy cơmắc bệnh [18]

1.1.3 Chẩn đoán

1.1.3.1 Chẩn đoán xác định

Dựa vào các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng:

Triệu chứng lâm sàng

Bao gồm triệu chứng cơ năng và triệu chứng thực thể

Giai đoạn đầu: các triệu chứng thường mơ hồ và không đặc hiệu như

đầy tức bụng, ăn không tiêu, buồn nôn, nôn,… đau bụng ở các mức độ khácnhau Khoảng 75% BN lúc chẩn đoán đã có các triệu chứng trên 6 tháng do

đó hơn 70% các trường hợp khi phát hiện thì đã ở giai đoạn muộn

Giai đoạn muộn: các triệu chứng thường rầm rộ, tiến triển nhanh như

gầy sút, kém ăn, bụng chướng, bệnh nhân tự sờ thấy khối u, các triệu chứngchèn ép hoặc xâm lấn các cơ quan lân cận như chèn ép bàng quang gây cáctriệu chứng kích thích, tắc nghẽn bàng quang hoặc trực tràng gây tắc ruột, rốiloạn tiêu hóa

Giai đoạn cuối: ung thư buồng trứng tế bào mầm thường có biểu hiện

căng xoắn, gây đau vì vậy thường được phát hiện ở những giai đoạn đầu dobệnh nhân đến sớm Các u thuộc nhóm dây sinh dục - đệm thường đi kèm vớirối loạn nội tiết như dậy thì sớm hoặc chảy máu âm đạo kéo dài sau mãn kinh.Khi thăm khám vùng tiểu khung, âm đạo trực tràng có thể đánh giá: vịtrí, thể tích, mật độ cũng nhưng mức độ xâm lấn của khối u Khám bụng cóthể thấy hiện tượng đóng bánh mạc nối lớn.Giai đoạn cuối: bệnh nhân thường

có cổ chướng Khám toàn thân có thể phát hiện: hạch bẹn, hạch thượng đòn,dịch màng phổi, gan to

Cận lâm sàng

* Siêu âm ổ bụng

- Siêu âm ổ bụngkết hợp siêu âm đầu dò âm đạo với định lượng nồng độCA-125 huyết thanh có ý nghĩa trong việc sàng lọc và phát hiện sớmUTBMBT đối với các phụ nữ có nguy cơ cao, tuy nhiên sự kết hợp này khôngđược khuyến cáo trong sàng lọc đối với những phụ nữ không có các yếu tốnguy cơ rõ ràng

* Dấu ấn sinh học: xét nghiệm CA-125 và HE4 huyết thanh

- CA-125 bản chất là một loại glycoprotein, nồng độ trong máu bìnhthường < 35U/ml

- Nồng độ CA-125 huyết thanh tăng cao ở khoảng 80% - 85% bệnh nhânUTBMBT Tuy nhiên xấp xỉ 50% trường hợp UTBMBT giai đoạn sớm nồng

độ CA-125 huyết thanh không tăng, điều này làm hạn chế giá trị của nó trongsàng lọc UTBMBT.

- Hiện nay, đối với UTBT loại xuất phát từ biểu mô, ngoài dấu ấn sinh họcCA-125 thì dấu ấn sinh học HE4 cũng đang được sử dụng để chẩn đoán sớm loạiung thư này Sự kết hợp giữa HE4 và CA-125 được dùng để tính chỉ số nguy cơ

ác tính của u buồng trứng (Risk of Ovarian Malignancy Algorithm) ROMA đểlựa chọn phương pháp điều trị thích hợp với u buồng trứng

* Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác

- Chụp X - quang ngực thẳng, nghiêng để phát hiện di căn phổi

- Chụp khung đại tràng: đánh giá xâm lấn của các khối UTBT vào lòngđại tràng

- Nội soi dạ dày, đại - trực tràng được chỉ định cho BN có biểu hiện lâmsàng của UTBT giúp phân biệt với các khối u di căn buồng trứng từ ống tiêuhóa (u Krukenberg)

- Chụp bụng không chuẩn bị được chỉ định trong các trường hợp UTBTnghi ngờ có biến chứng tắc ruột

- Chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp cộng hưởng từ (MRI) cho phép đánhgiá tổn thương tốt hơn các phương pháp thông thường đặc biệt là những tổnthương vượt quá tiểu khung, những trường hợp có tổn thương nghi ngờ màkhôngxác định được một cách chính xác bằng siêu âm hoặc chụp X - quangthường quy

- PET (Positron Emission Tomography) đơn độc chưa có bằng chứng rõràng trong chẩn đoán và theo dõi sau điều trị UTBMBT nhưng phối hợp PETvới CT làm tăng hiệu quả trong việc đánh giá đáp ứng và theo dõi tái phát sauđiều trị

* Các xét nghiệm hoặc thăm dò khác

Bao gồm các xét nghiệm tế bào học, nội soi ổ bụng, phẫu thuật thăm dò

1.1.3.2 Chẩn đoán mô bệnh học

Ung thư buồng trứng có thể tiên phát hoặc thứ phát do di căn từ cơ quankhác đến Chẩn đoán mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán quyếtđịnh và là cơ sở đến các nhà lâm sàng tiến hành lựa chọn phương pháp điềutrị cho người bệnh Nguyên tắc khi sinh thiết để có thể lấy được chính xác mô

u là tránh lấy vào vùng hoại tử, lấy nhiều vùng khác nhau và sử dụng dungdịch formol trung tính 10% để cố định bệnh phẩm ngay sau khi lấy ra khỏi cơthể trước khi gửi xuống khoa Giải phẫu bệnh Ung thư buồng trứng tiên phát

có ba loại chính:

- Ung thư biểu mô buồng trứng được chia thành các dưới type và dưới

type khác nhau dựa vào sự xuất hiện loại tế bào biểu mô có mặt trong khối u

- Ung thư tế bào mầm, có nguồn gốc từ những tế bào mầm.

- Ung thư mô đệm - dây sinh dục, phát sinh từ mô đệm của buồng trứng,

từ nguồn gốc của dây sinh dục hoặc cả hai

Hiện nay Việt Nam áp dụng phân loại mô bệnh học của Tổ chức Y tếThế giới năm 2003 để chẩn đoán định typ cho bệnh lý ung thư buồng trứng.Các typ mô bệnh học như sau:

Những u thanh dịch ác tính

- Ung thư biểu mô tuyến

- Ung thư biểu mô tuyến nhú bề mặt

- Ung thư biểu mô tuyến xơ

Những u dạng nội mạc ác tính

- Ung thư biểu mô tuyến không kể tên

- Ung thư biểu mô tuyến xơ

- U hỗn hợp Muller ác tính

- Saccôm tuyến

- Saccôm mô đệm dạng nội mạc tử cung (độ thấp)

- Saccôm buồng trứng không biệt hoá

Những u chế nhầy ác tính

- Ung thư biểu mô tuyến

- Ung thư biểu mô tuyến xơ

Những ung thư tế bào sáng

- Ung thư biểu mô tuyến

- Ung thư biểu mô tuyến xơ

Những ung thư tế bào chuyển tiếp

- Ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp (không phải loại Brenner)

- U Brenner ác tính

Ung thư biểu mô tế bào vảy

Ung thư biểu mô không biệt hóa

U tế bào steroid (Biệt hóa cao và ác tính)

U tế bào mầm ác tính: Bao gồm ung thư tế bào mầm nguyên thủy và u

quái không thành thục [19]

1.1.3.3 Chẩn đoán giai đoạn

Theo tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnhsản phụ khoa” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 315/QĐ-BYT ngày29/01/2015 [20], Việt Nam phân loại các giai đoạn lâm sàng theo FIGO 2013như sau:

Bảng 1.1 Phân loại ung thư buồng trứng theo FIGO 2013

I U giới hạn ở buồng trứng hoặc vòi tử cung

IA U giới hạn ở một buồng trứng (vỏ bọc còn nguyên vẹn) hoặc vòi tử

cung; không có khối u trên bề mặt buồng trứng hoặc vòi tử cung;không có tế bào ác tính ở dịch ổ bụng hoặc dịch rửa màng bụng

IB U còn giới hạn ở cả hai buồng trứng (vỏ bọc còn nguyên vẹn) hoặc

vòi tử cung; không có u ở bề mặt buồng trứnghoặc vòi tử cung;không có tế bào ác tính ở dịch ổ bụng hoặc dịch rửa màng bụng

IC U giới hạn ở một hoặc cả hai buồng trứng hoặc vòi tử cung không

có kèm theo bất kỳ dấu hiệu nào dưới đây:

IC 1 Vỡ khối u trong phẫu thuật

IC 2 Vỡ vỏ khối u trước phẫu thuật hoặc có khối u trên bề mặt buồng

trứng hoặc vòi tử cung

IC 3 Có tế bào ác tính ở dịch ổ bụng hoặc dịch rửa màng bụng

II U ở một hoặc hai buồng trứng hoặc vòi tử cungcó lan tràn vào

khung chậu (dưới giới hạn của tiểu khung) hoặc khối u bắt đầu dicăn phúc mạc

IIA Lan đến và/hoặc xâm lấn vào tử cung và/hoặc ống dẫn trứng và/

hoặc buồng trứng

IIB Xâm lấn những tổ chức trong phúc mạc tiểu khung

III U ở một hoặc hai buồng trứng hoặc vòi tử cung hoặc khối u bắt đầu

di căn phúc mạc với tế bào học hoặc giải phẫu bệnh khẳng định cólan tràn đến phúc mạc ngoài tiểu khung và/hoặc di căn hạch lymphosau phúc mạc

IIIA1 Chỉ có hạch lympho sau phúc mạc dương tính (tế bào học hoặc giải

phẫu bệnh minh chứng)

IIIA1 (i) Đường kính lớn của hạch di căn ≤ 10mm

Giai đoạn Mô tả

IIIA1 (ii) Đường kính lớn của hạch di căn > 10mm

IIIA2 Di căn vi thể phúc mạc ngoài tiểu khung (trên giới hạn của TK)

cùng với hoặc không có hạch sau phúc mạc dương tính

IIIB Di căn đại thể ở phúc mạc ngoài tiểu khung có đường kính lớn ≤

2cmcùng với hoặc không có hạch sau phúc mạc dương tính

IIIC Di căn phúc mạc ngoài tiểu khung, có đường kính lớn > 2cm cùng

với hoặc không có hạch sau phúc mạc dương tính (bao gổm khối ulan tới vỏ của gan và lách, chưa lan đến nhu mô các cơ quan này)

IV Di căn xa ngoại trừ di căn phúc mạc

IVA Tràn dịch màng phổi với tế bào học dương tính

IVB Di căn tới nhu mô và di căn cơ quan ngoài ổ bụng (bao gồm hạch

bẹn và hạch ngoài ổ bụng)

1.1.4 Điều trị

Lựa chọn phương pháp điều trị cho bệnh nhân UTBT phụ thuộc vào giaiđoạn mô bệnh học và độ biệt hóa Các biện pháp điều trị bao gồm: phẫu thuật,hóa trị, xạ trị hoặc kết hợp các biện pháp này, trong đó phẫu thuật là ưu tiênhàng đầu và phương pháp thường được tiến hành là cắt tử cung toàn bộ, cắtbuồng trứng, vòi trứng 2 bên và mạc nối lớn Tuy nhiên, hiện nay, các thửnghiệm lâm sàng vẫn đang được tiến hành nhằm tìm ra biện pháp hiệu quảnhất cho từng giai đoạn [19]

1.2 Tổng quan về gen RAD51 ở người

1.2.1 Vị trí và cấu trúc

Gen RAD51 có vị trí 15q15.1 (cánh dài NST 15, vùng 1, băng 5, băng

phụ 1), bắt đầu từ cặp base40.694.774 và kết thúc ở cặp base40.732.340.Gengồm 37.567cặp base và có 14 exon

Hình 1.1 Vị trí gen RAD51 trên NST số 15

(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov)

1.2.2 Chức năng

RAD51 mã hóa cho một protein là thành viên của họ protein RAD51.

Protein được mã hóa có 339 acid amin, khối lượng phân tử 36.966 Da.Cácthành viên trong họ protein RAD51 rất giống với RecA của vi khuẩn và

RAD51 của nấm men Saccharomyce, và được biết là có liên quan đến việc tái

tổ hợp tương đồng và sửa chữa thương tổn DNA sợi đôi

1.2.3 Cơ chế sửa chữa hư hỏng DNA thông qua tái tổ hợp tương đồng

Trong tế bào động vật có vú, sự tái tổ hợp tương đồng (Homologousrecombination - HR) được coi như là cơ chế chính cho việc sửa chữa sự đứt

gãy sợi đôi DNA – DSB (double-strand break) Hoạt động trung tâm của HR

được tạo ra bởi protein RAD51, nó xúc tác cho sự xâm nhập của các đầu mút

bị cắt bỏ của DSB vào các nhiễm sắc thể còn nguyên vẹn [21]

DSB được tạo ra khi hai chuỗi bổ sung của sợi đôi DNA bị đứt gãy đồngthời tại các vị trí đủ gần với nhau, cấu trúc cặp base và chromatin không đủ đểgiữ hai đầu DNA kết hợp lại Kết quả là, hai đầu DNA có khả năng tách rờikhỏi nhau, làm cho việc sửa chữa tiếp theo trở nên khó thực hiện và tạo cơ hộitái tổ hợp không thích hợp với các vị trí khác trong bộ gen[22] Nguyên nhângây ra DSB có thể là do bức xạ ion hóa, do phản ứng oxy hóa diễn ra trong cơthể hoặc là do các enzym hạt nhân trên DNA vô tình gây ra… [23]

Họ protein RecA/Rad51 tạo nên một xoắn ốc nucleoprotein trên sợiDNA[24] Protein này còn có thể tương tác với protein gắn kết ssDNA RPA,BRCA1, BRCA2, PALB2 [25] và RAD52.

Hình 1.2 Cơ chế sửa chữa đứt gãy sợi đôi DNA của protein RAD51

(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov)

Khi DSB xảy ra, sự sửa chữa sẽ diễn ra như sau:

Đầu tiên, phức hợp MRX (phức hợp MRN ở người) liên kết với DNA ởhai bên Tiếp theo là sự cắt bỏ bớt DNA xung quanh đầu tận 5' ở vị trí bị đứtgãy, và được thực hiện theo hai bước riêng biệt:

+ Trong bước đầu tiên, phức hợp MRX bổ sung thêm protein Sae2.Sau đó, hai protein cắt tỉa đầu 5' tận ở hai bên vị trí bị đứt gãy để tạo phần nhô

ra ngắn đầu 3'của DNA sợi đơn

+ Trong bước thứ hai, sự cắt theo chiều 5' → 3' được tiếp tục bởihelicase Sgs1 và các nuclease Exo1 và Dna2 Là một helicase, Sgs1 "giảiphóng" DNA sợi đôi, trong khi đó hoạt động của nucleaseExo1 và Dna2 là cắtDNA sợi đơn do Sgs1 tạo ra [26].

Protein RPA, có ái lực cao đối với DNA sợi đơn, sẽ gắn kết với đầu 3'nhô ra [27].Một phức hợp khác, phức hợp BRCA1-PALB2-BRCA2, và các

bản sao gen RAD51 góp phần vận chuyển RAD51vào ssDNA đã gắn với RPA

để tạo thành trung gian tái kết hợp thiết yếu, đó là sợi nhỏ nucleoproteinRAD51-ssDNA [25] Sau đó, sợi này bắt đầu tìm kiếm các chuỗi DNA tương

tự như chuỗi 3'nhô ra Và khi tìm ra trình tự như vậy,nó sẽ di chuyển (xâmnhập) vào DNA sợi kép giống hệt hoặc tương tự đó

Một vòng lặp dịch chuyển (D-loop) được hình thành trong quá trìnhxâm nhập của sợi nucleoprotein vào nhiễm sắc thể tương đồng Ngay sau đó,một DNA polymerase kéo dài chuỗi 3' xâm nhập bằng cách tổng hợp DNAmới Điều này làm thay đổi vòng lặp D thành một cấu trúc chéo được gọi làđường giao nhau Holliday Cuối cùng, kết quả của quá trình tổng hợp DNAxảy ra trên chuỗi xâm nhập là khôi phục lại sợi DNA bị đứt gãyở nhiễm sắcthể tương đồng đã bị di dời trong quá trình xâm nhập [28]

RAD51 thực sự đóng một vai trò quan trọng trong tái tổ hợp tương đồng

để sửa chữa thương tổn DNA Có nhiều bằng chứng cho thấy các biến thể đahình của gen liên quan đến sửa chữa thương tổn DNA có thể điều chỉnh khảnăng sửa chữa DNA và do đó có tác động lớn đến sự ổn định của gen vàphòng chống ung thư Trong đa hình rs1801320, mặc dù hệ quả chức năngG>C chưa thật sự rõ nhưng người ta suy đoán rằng nó làm thay đổi mô hìnhhòn đảo CpG trong vùng promoter, và có thể điều chỉnh sự biểu hiện của

RAD51 cùng các mức mRNA [29].

1.3 Tính đa hình thái đơn nucleotide

1.3.1 Đa hình thái đơn là gì?

Hiện tượng đa hình thái đơn (Single Nucleotide Polymorphism – SNPs)

là những biến thể trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide đơn A, T, G, C ởtrong bộ gen bị thay đổi so với bộ gen chung của loài Một biến thể được coi

là một SNP thì nó phải xảy ra ở ít nhất 1% dân số[30]

Hình 1.3 Minh họa hiện tượng đa hình thái đơn (SNPs)

(Nguồn: https://www.natera.com)

SNPs là một hiện tượng tương đối phổ biến diễn ra trong suốt chiều dàiDNA của một người, trung bình xảy ra một lần sau mỗi 300 nucleotide nghĩa

là bộ gen người có khoảng 3 tỷ bp sẽ có khoảng 10 triệu SNPs[31] Sự phân

bố SNPslà không đồng nhất, nó có thể xảy ra ở bất kỳ vị trí nào trên hệ gen, ởvùng mã hóa hay không mã hóa, tuy nhiên người ta thường tìm thấy SNPs vớitần suất cao ở các đoạn DNA nằm giữa các gen [32]

Mặc dù hơn 99% trình tự DNA của con người là giống nhau, nhưng chỉ một

sự thay đổi nhỏ trong hệ gen cũng có thể tác động lớn đến tính nhạy cảm của mỗi

cá thể khác nhau với bệnh tật, sự đáp ứng với các liệu pháp điều trị cũng như khảnăng thích nghi với các yếu tố từ môi trường như: chất độc, vi khuẩn, virus…Điều này làm cho SNPs có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực y sinh học Tuyvậy, cho đến nay ứng dụng quan trọng nhất của tính đa hình thái đơn nucleotide làdùng để so sánh vùng gen giữa các nhóm người với nhau để xác định mối liênquan giữa SNPs với sự hình thành và phát triển ung thư [33].

1.3.2 Tính đa hình thái đơn nucleotide của gen RAD51

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về mối quan hệ giữa sự đa hình

của gen RAD51 và nguy cơ bị ung thư buồng trứng Các đa hình đã được nghiên cứu và chi tiết của nó được trình bày trong Bảng 1.3:

Bảng 1.2 Một số đa hình của gen RAD51

1.4 Các kỹ thuật SHPT phát hiện tính đa hình thái đơn nucleotide

1.4.1 Kỹ thuật PCR

Khái niệm:

Phản ứng chuỗi polymerase (Tiếng anh: Polymerase Chain Reaction,viết tắt: PCR) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếchđại (tạo ra nhiều bản sao) của một đoạn DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt[35]

Thành phần và các bước tiến hành

Muốn tiến hành phản ứng PCR phải có các thành phần sau:

DNA khuôn: Là DNA cần khuếch đại, có thể là mạch thẳng, mạchvòng, DNA plasmid, cDNA hay RNA đều được

Cặp mồi đặc hiệu: Gồm mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) Nó gắn chặtvới DNA khuôn ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA polymerasenối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới

DNA polymerase: Là enzym xúc tác quá trình lắp ráp các nucleotide A,

T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp Thường gặp là Taq polymerase.

Các dNTP: Gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu thamgia tạo nên mạch DNA mới

MgCl2 và dung dịch đệm (Buffer): Thành phần dung dịch của phản ứngPCR thường phụ thuộc vào loại enzym DNA polymerase sử dụng trong PCR,quan trọng nhất là ion Mg2+ Mg2+ cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP,

xúc tác cho Taq polymerase làm tăng Tm của DNA mạch kép Mg2+ còn là

Co-factor của Taq polymerase.

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại Mỗi chu kỳ gồm có 3 giaiđoạn được điều hòa bởi nhiệt độ:

Giai đoạn biến tính (92 – 95oC): Chuỗi xoắn kép DNA bị biến tính,tách thành 2 sợi đơn

Giai đoạn gắn mồi (50 – 52oC): Đoạn DNA mồi được lai ghép với sợiđơn của DNA ban đầu

Giai đoạn tổng hợp (70 – 72oC): DNA polymerase điều khiển sự gắntiếp các dNTP vào đoạn DNA mồi dựa trên DNA khuôn ban đầu

Enzym cắt giới hạn

Enzym cắt giới hạn (Restriction Enzyme hay Restriction Endonuclease)

là một enzym endonuclease tác động lên phân tử DNA và có vị trí nhận biếtđiểm cắt DNA đặc hiệu

Các enzym này phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA màkhông gây tổn hại đến các base

Enzym giới hạn có 2 kiểu cắt:

Cắt cả 2 mạch DNA cùng ở một điểm tạo các đoạn cắt có đầu bằng.Các đoạn DNA đầu bằng không có khả năng tự dính lại với nhau, để nối cácđoạn DNA đầu bằng cần sử dụng enzym nối DNA ligase hoặc các adaptorchuyên dụng cho mỗi loại enzym

Nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí khác nhau giữa 2 mạch đơnDNA sẽ tạo nên các đoạn cắt có đầu so le (hay đầu dính) Các đoạn DNA cóđầu so le có thể tự nối lại với nhau mà không cần enzym nối DNA ligase, do

đó các enzym giới hạn cắt tạo đầu sole được sử dụng nhiều trong kỹ thuậtsinh học phân tử