XÁC NHẬN GIÁ TRỊ sử DỤNG PHƯƠNG PHÁP xét NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG FT4, TSH TRÊN hệ THỐNG ATELLICA SOLUTION

Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm định lượng FT4 trên hệ thống Atellica Solution...35 3.1.1.. Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm định lượng TSH trên hệ thống A

.……  ……

PHẠM NGỌC MAI LY

X¸C NHËN GI¸ TRÞ Sö DôNG PH¦¥NG PH¸P XÐT NGHIÖM §ÞNH L¦îNG FT4, TSH TR£N

HÖ THèNG ATELLICA SOLUTION

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2015 – 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

.……  ……

PHẠM NGỌC MAI LY

X¸C NHËN GI¸ TRÞ Sö DôNG PH¦¥NG PH¸P XÐT NGHIÖM §ÞNH L¦îNG FT4, TSH TR£N

HÖ THèNG ATELLICA SOLUTIONNgành đào tạo: Xét nghiệm Y học

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ThS.BS Nguyễn Thị Ngọc Lan – Giảng viên Bộ môn Hóa Sinh, trường Đại học Y Hà Nội, Phó Trưởng Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và TS Nguyễn Trọng Tuệ

– Giảng viên Bộ môn Khoa học Xét nghiệm, khoa Kỹ thuật Y học, trường Đạihọc Y Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp emhoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các các thầy cô, các anh chịnhân viên trong Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tìnhhướng dẫn, giúp đỡ để em có thể thực hiện khóa luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng quản lý đào tạođại học, Bộ môn Khoa học xét nghiệm, khoa Kỹ thuật Y học, trường Đại học

Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian em học tập tạitrường

Cuối cùng em xin cảm ơn bố mẹ, anh chị và người thân, bạn bè đã luônđộng viên, giúp đỡ, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho em học tập thật tốt

Dù đã rất cố gắng để thực hiện khóa luận một cách hoàn chỉnh nhất,nhưng do mới lần đầu thực hiện nghiên cứu cũng như kiến thức còn hạnchế nên khóa luận của em vẫn còn những thiếu sót Em rất mong nhậnđược những đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn để khóa luận đượchoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan tất cả số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưatừng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên Phạm Ngọc Mai Ly

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Quản lý chất lượng xét nghiệm 3

1.1.1 Hệ thống quản lý chất lượng PXN 3

1.1.2 Khái niệm về quản lý quá trình 4

1.1.3 Các yêu cầu về quản lý quá trình và xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm 5

1.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 6

1.2.1 Khái niệm 6

1.2.2 Tại sao phải xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp? 7

1.2.3 Khi nào cần xác nhận giá trị sử dụng phương pháp? 7

1.2.4 Các tiêu chuẩn thường được sử dụng để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 8

1.2.5 Nội dung của xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 9

1.3 Tổng quan về FT4 và TSH 16

1.3.1 Tổng quan về FT4 16

1.3.2 Tổng quan về TSH 17

1.3.3 Vai trò của bộ xét nghiệm FT4, TSH trong thực hành lâm sàng .18 1.3.4 Các phương pháp định lượng TSH, FT4 19

1.4 Hệ thống Atellica Solution 21

1.4.1 Giới thiệu về công nghệ của IM Analyzer Atellica Solution 21

1.4.2 Phương pháp xét nghiệm định lượng FT4 trên hệ thống Atellica Solution 22

1.4.3 Phương pháp xét nghiệm định lượng TSH trên hệ thống Atellica Solution 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử nghiên cứu: 27

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

2.3 Sơ đồ nghiên cứu 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 28

2.4.1 Thực nghiệm đánh giá độ chụm 28

2.4.2 Thực nghiệm đánh giá độ đúng 31

2.4.3 Thực nghiêm đánh giá độ tuyến tính 32

2.4.4 Thực nghiệm xác nhận khoảng tham chiếu 33

2.5 Bộ công cụ nghiên cứu 34

2.6 Kinh phí thực hiện đề tài 34

2.7 Đạo đức nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm định lượng FT4 trên hệ thống Atellica Solution 35

3.1.1 Đánh giá độ chụm 35

3.1.2 Đánh giá độ đúng 37

3.1.3 Đánh giá khoảng tuyến tính 39

3.1.4 Xác nhận khoảng tham chiếu 40

3.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm định lượng TSH trên hệ thống Atellica Solution 41

3.2.1 Đánh giá độ chụm 41

3.2.2 Đánh giá độ đúng 43

3.2.3 Đánh giá khoảng tuyến tính 45

3.2.4 Xác nhận khoảng tham chiếu 46

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 47

KẾT LUẬN 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AE Acridinium ester

CLIA Chemiluminescanse immuno assay

Miễn dịch hóa phát quangCLSI Clinical and Laboratory Standards Institute –

Viện tiêu chuẩn lâm sàng và phòng xét nghiệm y học

CV Coefficient of Variation (Hệ số biến thiên)

DCLIA Direct-chemiluminescense immuno assay

Phương pháp miễn dịch hóa phát quang trực tiếpECLIA Electro chemiluminescence immunoassay

Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang

FT4 Free Thyroxin

FT3 Free Triiodothyronin

MEIA Micro particle enzyme immune assay

Miễn dịch vi hạtPMP Hạt thuận từ

PXN Phòng xét nghiệm

QC Quality Control – Kiểm tra chất lượng

SD Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)

TSH Thyroid Stimulating Hormone

T3 Triiodothyronin

Bảng 1.1 Nồng độ TSH và FT4 trong một số tình trạng bệnh lý 18Bảng 3.1 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ chụm xét nghiệm định lượng

FT4 ở mức nồng độ 1 35Bảng 3.2 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ chụm xét nghiệm định lượng

FT4 ở mức nồng độ 2 35Bảng 3.3 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ chụm xét nghiệm định lượng

FT4 ở mức nồng độ 3 36Bảng 3.4 Kết quả thực nghiệm đánh giá độ chụm của kỹ thuật định lượng

FT4 36Bảng 3.5 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm định

lượng FT4 ở mức nồng độ 1 37Bảng 3.6 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm định

lượng FT4 ở mức nồng độ 2 37Bảng 3.7 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm định

lượng FT4 ở mức nồng độ 3 37Bảng 3.8 Kết quả thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm định lượng

FT4 38Bảng 3.9 Kết quả đánh giá khoảng tuyến tính của kỹ thuật định lượng FT4

trên hệ thống Atellica Solution 39Bảng 3.10 Kết quả đánh giá khoảng tham chiếu của xét nghiệm định lượng

FT4 trên hệ thống Atellica Solution 40Bảng 3.11 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ chụm của xét nghiệm định

lượng TSH ở mức nồng độ 1 41Bảng 3.12 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ chụm của xét nghiệm định

lượng TSH ở mức nồng độ 2 41

Bảng 3.14 Kết quả thực nghiệm đánh giá độ chụm của của xét nghiệm định lượng

TSH trên hệ thống Atellica Solution 42Bảng 3.15 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm định

lượng TSH ở mức nồng độ 1 43Bảng 3.16 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm định

lượng TSH ở mức nồng độ 2 43Bảng 3.17 Bảng số liệu thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm định

lượng TSH ở mức nồng độ 3 43Bảng 3.18 Kết quả thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm định lượng

TSH trên hệ thống Atellica Solution 44Bảng 3.19 Kết quả đánh giá khoảng tuyến tính của của xét nghiệm định

lượng TSH trên hệ thống Atellica Solution 45Bảng 3.20 Kết quả đánh giá khoảng tham chiếu của xét nghiệm định lượng

TSH trên hệ thống Atellica Solution 46

Biểu đồ 3.1 Biểu đồ đánh giá khoảng tuyến tính của kỹ thuật định lượng FT4

trên hệ thống Atellica Solution 39Biểu đồ 3.2 Biểu đồ đánh giá khoảng tuyến tính của kỹ thuật định lượng TSH

trên hệ thống Atellica Solution 45

Hình 1.1 Hình biểu diễn khái niệm độ lệch 13

Hình 1.2 Hình biểu diễn mối liên hệ giữa độ chụm, độ đúng và độ xác thực 13

Hình 1.3 Các hạt thuận từ (PMP) tự do 22

Hình 1.4 Kháng nguyên được gắn nhãn AE 23

Hình 1.5 Kháng nguyên được gắn nhãn AE trong cuvet 23

Hình 1.6 Dạng xét nghiệm phức hợp sandwich 24

Hình 1.7 Dạng xét nghiệm phức hợp sandwich với pha rắn 24

Hình 1.8 Xét nghiệm dạng sandwich trong cuvet 25

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, xét nghiệm cận lâm sàng có ý nghĩa vô cùng quan trọng trongchẩn đoán và điều trị bệnh Kết quả xét nghiệm đáng tin cậy giúp chẩn đoánchính xác bệnh, xác định căn nguyên để quyết định điều trị cũng như giúpđánh giá hiệu quả điều trị và tiên lượng bệnh Vì vậy, các kết quả xét nghiệmyêu cầu có sự chính xác cao, sai sót của kết quả xét nghiệm cũng có thể dẫnđến những hậu quả nghiêm trọng trong chẩn đoán và điều trị Để đáp ứng vớinhu cầu đó, các hệ thống máy móc hiện đại, áp dụng những kỹ thuật tiên tiếnđược đưa vào sử dụng nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm

Tuy nhiên, với những thiết bị hay phương pháp mới này, liệu chất lượng

có đạt như những gì nhà sản xuất công bố? Để trả lời câu hỏi này, mỗi thiết bịhay phương pháp mới trước khi đưa vào sử dụng, phòng xét nghiệm cần xâydựng thực nghiệm xác nhận giá trị sử dụng phương pháp, chứng minh các đặcđiểm của máy móc/ phương pháp này có thể đáp ứng được các yêu cầu cụ thểnhất định [1] Kết quả của xác nhận giá trị sử dụng phương pháp dùng đểđánh giá sai số có thể xảy ra trong phòng xét nghiệm và để đảm bảo kết quảđáng tin cậy cho bệnh nhân và bác sĩ lâm sàng

Tại Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Đại học Y Hà Nội hệ thống AtellicaSolution được đưa vào sử dụng trong thời gian gần đây Đây là hệ thống phântích hóa sinh, miễn dịch mới có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian phân tíchđược rút ngắn Trước khi đưa vào sử dụng hệ thống này cần phải xác nhận giátrị sử dụng của phương pháp, hay nói cách khác là kiểm tra các thông số kỹthuật là đủ tin cậy, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm

Mặt khác, bộ xét nghiệm FT4 và TSH là một trong những bộ xét nghiệmthường được sử dụng tại khoa xét nghiệm Bộ xét nghiệm này có ý nghĩa

quan trọng nhất trong việc phát hiện, chẩn đoán và theo dõi điều trị các bệnh

lý về tuyến giáp – bệnh gây rối loạn nội tiết thường gặp

Vì vậy, đề tài “Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp xét nghiệm địnhlượng FT4, TSH trên hệ thống Atellica Solution” được tiến hành với mục tiêu:

1 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm định lượng FT 4 theo hướng dẫn của Viện tiêu chuẩn Lâm sàng và Cận lâm sàng (CLSI)

2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm định lượng TSH theo hướng dẫn của Viện tiêu chuẩn Lâm sàng và Cận lâm sàng (CLSI).

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Quản lý chất lượng xét nghiệm

1.1.1 Hệ thống quản lý chất lượng PXN.

Hệ thống quản lý chất lượng PXN là cách thức tiếp cận có hệ thống baogồm việc mô tả, lập tài liệu, thực thi các biện pháp, giám sát hiệu quả vậnhành của PXN, nhằm đáp ứng các yêu cầu của quốc tế, quốc gia, khu vực, địaphương và tổ chức, thúc đẩy sử dụng có hiệu quả các nguồn lực Mục tiêucuối cùng của tất cả các hoạt động này là đáp ứng được mong đợi của kháchhàng [2]

Các thành tố của hệ thống quản lý chất lượng được áp dụng phổ biếnđối với bất kì quy mô phòng xét nghiệm nào, dù đơn giản hay phức tạp Cácthành tố hệ thống quản lý chất lượng bao gồm:

- Quản lý thông tin

- Tài liệu và hồ sơ

Việc quản lý chất lượng, hạn chế sai sót trong phòng xét nghiệm là mộtnhiệm vụ vô cùng quan trọng Chất lượng của xét nghiệm đóng vai trò rất lớntrong việc chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh Kết quả xét nghiệm sẽ quyếtđịnh 80% kết quả chẩn đoán và điều trị của bác sĩ Vì vậy, các kết quả xétnghiệm yêu cầu về sự chuẩn xác rất cao, chỉ cần một sai sót nhỏ trong kết quảxét nghiệm cũng có thể dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng [4]

Quản lý chất lượng xét nghiệm là các hoạt động phối hợp để địnhhướng và kiểm soát của phòng xét nghiệm về chất lượng xét nghiệm, baogồm lập kế hoạch, kiểm soát, bảo đảm và cải tiến chất lượng xét nghiệm [5]

Theo thông tư số 01/2013/TT-BYT, điều 4 khoản 1 và 2 của Bộ Y tế:

Cơ sở khám bệnh, chữa bệnh thực hiện quản lý chất lượng xét nghiệm phùhợp với chính sách pháp luật, tuyên bố (cam kết) chất lượng, mục tiêu chấtlượng, quy mô, điều kiện của cơ sở khám bệnh, chữa bệnh và của phòng xétnghiệm Cơ sở khám bệnh, chữa bệnh xây dựng kế hoạch và lộ trình thực hiệnquản lý chất lượng xét nghiệm đạt và duy trì theo quy định của quy chuẩn kỹthuật quốc gia về phòng xét nghiệm sau khi được Bộ Y tế ban hành, khuyếnkhích đạt được các yêu cầu của tiêu chuẩn quốc gia và tiêu chuẩn quốc tế vềphòng xét nghiệm [6] Do đó, quản lý chất lượng là một nhiệm vụ quan trọnghàng đầu đối với mỗi PXN

1.1.2 Khái niệm về quản lý quá trình.

Quản lý quá trình là một thành tố của hệ thống quản lý chất lượng, đểđảm bảo kết quả trả cho khách hàng là chính xác cần đảm bảo từ đầu vào làmẫu bệnh phẩm của bệnh nhân, đến các bước trong toàn bộ quá trình xétnghiệm Chẩn đoán phòng xét nghiệm trải qua ba giai đoạn: trước xét nghiệm,trong xét nghiệm và sau xét nghiệm Quản lý chất lượng xét nghiệm luôn gắnliền trong các giai đoạn của quá trình xét nghiệm để các lỗi xảy ra là khôngđáng kể, không tác động đến chất lượng xét nghiệm và bệnh nhân [5]

Quá trình quản lý gồm:

- Phân tích, thiết lập xây dựng các tài liệu về luồng công việc và cácthành tố của hệ thống chất lượng

- Quản lý mẫu

- Kiểm soát quá trình

- Xác nhận giá trị sử dụng và kiểm tra xác nhận

- Quản lý sự thay đổi

Trong đó việc xác nhận giá trị sử dụng và kiểm tra xác nhận là vô cùng cầnthiết và quan trọng để đảm bảo chất lượng xét nghiệm, đặc biệt là khi có sựthay đổi trong PXN

1.1.3 Các yêu cầu về quản lý quá trình và xác nhận giá trị sử dụng phương pháp xét nghiệm

Theo Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, banhành kèm theo ngày 12 tháng 6 năm 2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc Banhành Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, quản lý quátrình xét nghiệm là một yêu cầu lớn và quan trọng nhất trong bộ tiêu chí này.Xét cho cùng thì hệ thống quản lý chất lượng sinh ra để cuối cùng đảm bảođược chất lượng kết quả xét nghiệm là tốt nhất Quản lý quá trình xét nghiệmđược chia làm 3 giai đoạn với 6 bộ hồ sơ: quá trình trước xét nghiệm, phêduyệt phương pháp xét nghiệm, đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm, sauxét nghiệm, trả kết quả xét nghiệm và công bố kết quả xét nghiệm

Cũng theo bộ tiêu chí này, chương VIII Quản lý quá trình xét nghiệm,giai đoạn trong xét nghiệm, mục 8.16 quy định: PXN phải có quy định bằngvăn bản, thực hiện, và lưu hồ sơ về xác nhận giá trị sử dụng/ thẩm địnhphương pháp xét nghiệm trước khi đưa trang thiết bị hoặc sinh phẩm mới vào

sử dụng [7]

Đây là phần tương đối khó và phức tạp với hầu hết các PXN Tuynhiên, trải qua nhiều năm xây dựng và quá trình cải tiến thường xuyên, Việntiêu chuẩn lâm sàng và phòng xét nghiệm y học (CLSI) đã đưa ra nhữnghướng dẫn chuẩn được công nhận trên toàn thế giới, tạo thuận lợi cho cácphòng xét nghiệm hiện nay Nhìn chung các PXN cần phải xây dựng quytrình cho việc lựa chọn và xác nhận giá trị sử dụng của các quy trình, phươngpháp xét nghiệm Tùy thuộc xét nghiệm đó là định tính hay định lượng để đưa

ra các thông số xác nhận phù hợp: độ chụm (độ lặp lại, độ tái lặp), độ đúng,khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, độnhạy, độ đặc hiệu, độ lệch dương, độ lệch âm…

1.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

1.2.1 Khái niệm

Xác nhận giá trị sử dụng và/hoặc thẩm định phương pháp của phươngpháp là một quá trình mà một phương pháp được xác định là phù hợp với mụcđích và dự định sử dụng [8, 9]

Thẩm định và/hoặc xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là khẳngđịnh bằng kiểm tra và cung cấp các bằng chứng khách quan cho các yêu cầu

cụ thể của một phương pháp định sử dụng có thể đáp ứng được Khi mộtphương pháp đã được nhà sản xuất hoặc tác giả công bố, phòng xét nghiệmphải lấy thông tin từ nhà sản xuất để xác nhận rằng các đặc tính hiệu năng củaphương pháp là phù hợp với mục đích sử dụng của nó Khi thay đổi được thựchiện cho một thủ tục kiểm tra xác nhận, ảnh hưởng của những thay đổi đóphải được ghi chép và, nếu thích hợp, một quy trình thẩm định và/hoặc xácnhận mới sẽ được thực hiện Thủ tục kiểm tra từ nhà sản xuất sử dụng màkhông sửa đổi phải được thẩm định trước khi đưa vào sử dụng thường xuyên.Việc xác nhận phải được công nhận, thông qua việc cung cấp các bằng chứngkhách quan, chứng minh yêu cầu thực hiện cho phương pháp kiểm tra đãđược đáp ứng [10]

Mặc dù xác nhận giá trị sử dụng và thẩm định là hai khái niệm đôi khiđược dùng như nhau, nhưng thẩm định (validication) thường được áp dụngvới các phương pháp tự chế hoặc được cải tiến, trong khi đó xác nhận(verification) áp dụng lại để kiểm tra khả năng thực hiện của phương phápđược công bố hoặc phương pháp không có cải biến [8, 9]

1.2.2 Tại sao phải xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp?

Kết quả của một xét nghiệm bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: sự thayđổi hay mở rộng về đối tượng áp dụng, thay đổi về địa lý phòng xét nghiệm,thay đổi nhân viên, chỉnh sửa/ cải tiến các thiết bị, thay đổi các điều kiện môitrường Sự khác nhau này thường không đáng kể, tuy nhiên vẫn cần phảichứng minh phương pháp được thực hiện trong môi trường phòng xét nghiệmhiện tại phù hợp với những tuyên bố của nhà sản xuất Thứ hai, xác nhận giátrị sử dụng còn đánh giá hiệu năng phương pháp đang sử dụng tại các thờđiểm khác nhau như là một quy định thường quy Thứ ba, trước khi đưa vào

sử dụng các máy móc, thiết bị, cần chứng minh những kết quả của nhà sảnxuất báo cáo là đáng tin cậy để phục vụ cho bệnh nhân [8, 9, 11] Vì vậy xácnhận giá trị sử dụng của phương pháp là công việc vô cùng quan trọng củamỗi phòng xét nghiệm, là trách nhiệm nghề nghiệp và thực hành tốt phòng xétnghiệm Đây cũng là một đòi hỏi bắt buộc cho hệ thống các phòng xét nghiệm

y khoa để có thể được công nhận ISO 15189 hoặc các chứng chỉ công nhậncủa các tổ chức khác (CAP, JC, NATA…) hay là những quy định của ngànhcần phải tuân thủ như quyết định số 2429/QĐ-BYT…

1.2.3 Khi nào cần xác nhận giá trị sử dụng phương pháp?

Xác nhận giá trị sử dụng/ thẩm định cần phải tiến hành trước khi đưamột phương pháp mới, máy móc thiết bị mới vào sử dụng [8, 9, 11] Ngoài

ra, việc xác nhận không phải chỉ cần thực hiện một lần khi phát triển phươngpháp ban đầu mà cần thực hiện trong suốt quá trình áp dụng, thường là đánh

giá định kỳ hàng năm vì đa số các điều kiện thực hiện phương pháp có sựthay đổi về cơ sở vật chất, về con người, về trang thiết bị và hóa chất thuốcthử… Hay trong trường hợp kết quả phân tích mẫu kiểm tra chất lượng hoặckết quả đáng giá sự phù hợp của hệ thống nằm ngoài giới hạn cho phép thìphương pháp cũng cần được xác nhận lại.

Vì vậy, xác nhận giá trị sử dụng phương pháp cần được tiến hành trướckhi đưa xét nghiệm mới vào phục vụ bệnh nhân, sau khi có bất kì chỉnh sửa/cải tiến từ nhà sản xuất hoặc di chuyển thiết bị và tại các khoảng thời giannhất định để đánh giá hiệu năng phương pháp đang sử dụng Tuy nhiên, cácthông số cần xác nhận lại phụ thuộc vào mức độ ảnh hưởng của các thay đổiđến các thông số của phương pháp [8]

1.2.4 Các tiêu chuẩn thường được sử dụng để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Để tiến hành thẩm định phương pháp, phòng xét nghiệm có thể triểnkhai bằng nhiều cách khác nhau, có thể tiến hành dựa trên các phương pháptiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như ISO, TCVN, AOAC,…hoặc tiến hành dựa trên các phương pháp không tiêu chuẩn do nội bộ PXN tựxây dựng hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất, theo các tạp chí, tài liệuchuyên ngành [1] Tuy nhiên, các phương pháp tiêu chuẩn được ưu tiên sửdụng nhiều hơn

Tại Việt Nam, các tiêu chuẩn thường được sử dụng nhiều nhất là ISO,TCVN Tuy nhiên, để PXN đạt được các tiêu chuẩn này, tổ chức CLSI đã đưa

ra những hướng dẫn chi tiết, dễ hiểu và có khả năng thực hiện tại PXN y học.Viện tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng xét nghiệm (CLSI) là tổ chức phi lợinhuận, thiết lập và duy trì các tiêu chuẩn, thúc đẩy kiểm tra chất lượng, tăngcường cung cấp dịch vụ chăm sóc bệnh nhân và cải thiện sức khỏe cộng đồngtrên toàn thế giới CLSI tham gia xây dựng các tiêu chuẩn quốc tế với tư cách

là Ban thư ký của Ủy ban kỹ thuật ISO So sánh giữa bộ tiêu chuẩn TCVNISO 15189:2014 và tiêu chuẩn ISO 15189:2012, thì các hướng dẫn của CLSI

có số thực nghiệm và thời gian phân tích ít hơn Vì vậy, trong đề tài nàychúng tôi sử dụng các hướng dẫn của CLSI để xác định giá trị sử dụngphương pháp để tiết kiệm hơn về chi phí và thời gian

1.2.5 Nội dung của xác nhận giá trị sử dụng phương pháp

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là một công việc rất khókhăn, đôi khi nhàm chán và tốn kém, tuy nhiên lại là một nội dung quan trọngảnh hưởng đến độ chính xác, tin cậy của kết quả xét nghiệm

Việc lựa chọn các thông số xác nhận giá trị sử dụng của phương pháptùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng trong phòng xét nghiệm, yêu cầu của phươngpháp, điều kiện và nguồn lực của phòng xét nghiệm [1, 9]

Khi thực hiện xác nhận phương pháp thường bao gồm 4 thực nghiệm sau:

- Thực nghiệm so sánh phương pháp để ước tính độ lệch

- Thực nghiệm độ lặp lại để ước tính độ chụm

- Thực nghiệm đánh giá khoảng tuyến tính

- Xác nhận khoảng tham chiếu [8, 9, 11]

Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phòng xét nghiệm Bệnh viện Đại học Ylựa chọn các thông số xác nhận phương pháp là:

- Độ chụm (Precision)

- Độ xác thực (Accuracy)

- Khoảng tuyến tính (Lineariry range)

- Xác nhận khoảng tham chiếu (verifying a reference interval)

1.2.5.1 Độ chụm (Precision)

Độ chụm (còn gọi là độ tập trung) là mức độ gần đúng giữa các kết quảthực hiện độc lập trên cùng một mẫu và trong cùng một điều kiện thực hiện

Độ chụm tương ứng với khoảng cách giữa kết quả xét nghiệm riêng lẻ với trị

số trung bình Lý tưởng nhất, biến thiên giữa các kết quả là nhỏ, tức là tất cảcác kết quả trên các phép đo lặp đi lặp lại nên gần như nhau Sự phân tán củacác kết quả xét nghiệm thu được càng nhỏ thì độ chụm càng cao và ngược lại.[10-12] Độ chụm chịu ảnh hưởng của các sai số ngẫu nhiên Thực nghiệmđánh giá độ chụm ước tính sai số ngẫu nhiên gây ra bởi các yếu tố khác nhautrong quá trình tiến hành của các phương pháp, chẳng hạn như trộn mẫu, phamẫu, điều kiện phản ứng như thời gian, nhiệt độ và hệ thống ỷ ấm, và thậmchí cả sai số trong chính phép đo Với các xét nghiệm thủ công, sự thay đổitrong kỹ thuật của nhân viên xét nghiệm đóng vai trò quan trọng trong sai sốngẫu nhiên Với hệ thống tự động, thiếu sự đồng nhất và sự không ổn địnhcủa công cụ và điều kiện phản ứng vẫn có thể gây ra các biến đổi nhỏ, có thểảnh hưởng làm tăng hoặc giảm kết quả cuối cùng của xét nghiệm Mặc dù tácđộng chính xác không thể được dự đoán ở từng thời điểm, nhưng sự phân bốcủa các ảnh hưởng theo thời gian có thể được dự đoán, mô tả mức độ sai sốngẫu nhiên [11, 12]

Đây được xem như thực nghiệm đầu tiên trong đánh giá một phươngpháp mới Một phương pháp không chụm thì nó thường không xác thực, dovậy nếu phương pháp không chụm thì không còn cần phải tiến hành tiếp cácthực nghiệm khác nữa hoặc các nguyên nhân của những sai số ngẫu nhiên cầnđược xác định và loại bỏ trước khi thử nghiệm được tiếp tục thực hiện.[8, 13]

Có hai loại độ chụm cần đánh giá: độ chụm ngắn hạn (short – termprecision) hay độ lặp lại; độ chụm dài hạn (long – term precision) hay giữacác lần chạy (between – day precision, day – to – day precision) hay độ táilặp Độ chụm toàn bộ bao gồm cả độ chụm ngắn hạn và dài hạn [8, 9, 11]

Độ chụm ngắn hạn (độ lặp lại) được đánh giá bằng mức độ gần nhaugiữa các kết quả của những lần chạy độc lập trên cùng một mẫu với điều kiện

như nhau trong một thời gian ngắn Vì vậy, nó được dùng để kiểm tra khảnăng lặp lại kết quả của một phương pháp với chính mẫu đó Độ lặp lại cầnđược kiểm tra ở ít nhất hai mức nồng độ khác nhau Các mức nồng độ này cầnnằm trong khoảng tuyến tính để tránh những sai số không cần thiết, thườngthì các mức nồng độ này sẽ liên quan đến các điểm quyết định y học

Độ chụm dài hạn (độ tái lặp) được đánh giá bằng mức độ lặp lại kết quảcủa cùng một mẫu khi chạy nhiều lần khác nhau trong một thời gian dài hơn Độtái lặp cũng cần phải được kiểm tra ở ít nhất hai mức nồng độ khác nhau Cácnồng độ này đặc trưng cho các giá trị thấp, trung bình, cao trong khoảng tuyếntính đã thiết lập được và tương ứng với các giá trị gặp ở bệnh nhân.[9, 14]

Có thể sử dụng mẫu chuẩn, QC hoặc mẫu bệnh phẩm, mẫu trộn để đánhgiá độ chụm Mỗi loại mẫu có ưu và nhược điểm riêng, điều quan trọng là cần

sử dụng loại mẫu có chất nền càng giống như mẫu thực càng tốt Mẫu bệnhphẩm rất tốt để đánh giá độ lặp lại, tuy nhiên tính ổn định của mẫu cần đượcxem xét cẩn thận khi sử dụng đánh giá độ tái lặp Thông thường, 2 hay 3 mứcnồng độ có tính quyết định y khoa được lựa chọn để đánh giá độ chụm Số lầnchạy lặp lại tối thiểu là 20 lần trong ngày với độ lặp lại và trong 10 – 20 ngàyvới độ tái lặp Tính SD và CV từ các kết quả chạy lặp lại thu được, so sánh

SD, CV nhà sản xuất để xác nhận độ chụm ngắn hạn và dài hạn [8, 9]

So với các quy trình trước, hướng dẫn EP15 của CLSI quy trình đánh giáđơn giản, tiết kiệm hơn mà vẫn đảm bảo tính nghiêm ngặt để đưa ra nhữngkết quả thống kê hợp lệ cho việc xác nhận phương pháp Quy trình này có thể

áp dụng cho các xét nghiệm khác nhau về mức độ phức tạp, và có thể áp dụngđối với tất cả các PXN từ nhỏ đến lớn

Theo EP15-A3, độ chụm ngắn hạn và độ chụm dài hạn được đánh giáchung trong một quy trình duy nhất: phân tích lặp lại 5 lần hai mức nồng độ

trong 5 ngày Các mức nồng độ của vật liệu kiểm tra nên gần với điểm quyếtđịnh lâm sàng Vật liệu kiểm tra ở đây có thể là mẫu nội kiểm, mẫu bệnh nhânhoặc mẫu ngoại kiểm đã biết trước giá trị Tính giá trị trung bình, độ lệchchuẩn SD, hệ số biến thiên CV từ đó tính toán SD của PXN Nếu SD củaPXN thấp hơn giá trị xác nhận thì độ chụm được xác nhận [15].

1.2.5.2 Độ đúng (Trueness)

Viện tiêu chuẩn Lâm sàng và Cận lâm sàng (CLSI) định nghĩa độ đúng(trueness) là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa kết quả đo và giá trị thựccủa phép đo Mỗi mẫu bệnh phẩm đều có giá trị thực của nó, tuy nhiên việcxác định được giá trị thực này là không thể, ta chỉ có thể quy ước một giá trịtrung bình được lặp lại nhiều nhất là giá trị thực hay còn gọi là giá trị quychiếu Mục đích của việc kiểm tra độ đúng của phương pháp nhằm phát hiện

và loại bỏ sai số hệ thống [1, 9, 16] Sai số hệ thống luôn gây ra một xuhướng cho tất cả các kết quả xét nghiệm hoặc cao hơn hoặc thấp hơn giá trịthực Mức độ cao hơn hay thấp hơn được mô tả bằng độ lệch (bias), được tínhbằng sự chênh lệch giữa trung bình các giá trị của phòng xét nghiệm và giá trịthực Độ lệch càng lớn thì sai khác giữa kết quả và giá trị càng lớn [1]

Trước đây, theo định nghĩa của IFCC (International Federation ofClinical Chemistry and Laboratory Medicine) độ đúng (truenesss) được hiểutương đương như độ xác thực (accuracy) [17] Tuy nhiên, độ đúng chỉ mô tảsai số hệ thống còn độ xác thực thì mô tả cả sai số hệ thống lẫn sai số ngẫunhiên Có thể coi độ xác thực (accuracy) là sự kết hợp giữa độ chụm(precision) và độ đúng (trueness) Vì vậy, một phương pháp được đánh giá làxác thực khi cả độ chụm và độ đúng của phương pháp đó đều được xác nhận

Hình 1.1 Hình biểu diễn khái niệm độ lệch (Bias)

Hình 1.2 Hình biểu diễn mối liên hệ giữa độ chụm, độ đúng và độ xác thực

Hướng dẫn EP15-A3 của CLSI hướng dẫn việc sử dụng cùng bộ số liệuchạy thực nghiệm của đánh giá độ chụm để đánh giá độ đúng, ngoài ra còn bỏviệc sử dụng mẫu bệnh nhân Dựa vào kết quả thực nghiệm đánh giá độ chumtính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn SD, sai số chuẩn của trung bình (SE ofMean), giới hạn tin cậy trên và dưới Sử dụng giá trị SD ấn định kết hợp vớisai số chuẩn của trung bình để tính độ không đảm bảo đo, từ đó tính giới hạnxác nhận trên và dưới Tiêu chuẩn chấp nhận của độ đúng là giá trị ấn địnhcủa mẫu vật liệu tham chiếu nằm trong khoảng giới hạn tin cậy và/hoặckhoảng giới hạn xác nhận Nếu giá trị ấn định của vật liệu tham chiếu nằm

ngoài khoảng giới hạn tin cậy nhưng vẫn vẫn nằm trong khoảng giới hạn xácnhận thì độ đúng của phương pháp vẫn được chấp nhận Khoảng giới hạn xácnhận bao hàm cả độ không đảm bảo của phép đo, vì vậy nó có giới hạn rộnghơn so với khoảng giới hạn tin cậy [15].

1.2.5.3 Khoảng tuyến tính (Linearity range)

Khoảng tuyến tính (linearity range) của một phương pháp phân tích

là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được

và nồng độ chất phân tích, nói một cách đơn giản hơn là các kết quả xétnghiệm nhỏ nhất và cao nhất có thể đủ tin cậy để thông báo Khoảng tuyếntính còn được gọi là khoảng đo lường phân tích (Analytical MeasurementRange – AMR), là khoảng giá trị đo của thiết bị có thể sử dụng để báo cáotrực tiếp (reportable range), không đòi hỏi phải pha loãng hay cô đặc mẫuxét nghiệm [8, 18, 19]

Đối với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xácđịnh khoảng tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính đặc biệt quan trọng vớihai điểm là giới hạn định lượng (limit of quantitation - điểm thấp nhất) và giớihạn tuyến tính (upper limit of reportable range - điểm cao nhất) [8, 18, 19] Mẫu

sử dụng đánh giá khoảng tuyến tính có thể là các dung dịch chuẩn, vật liệu đánhgiá khoảng tuyến tính mua từ nhà sản xuất Mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu trộn cũng

có thể sử dụng, sẽ tiện lợi và kinh tế khi có mẫu bệnh phẩm ở mức độ cao

Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn

có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của trị số đo được vào nồng độ.Theo khuyến cáo của CLSI, mỗi mức nồng độ cần phân tích lặp lại 4 lần, tuynhiên 3 lần lặp lại là chấp nhận được Tính giá trị trung bình của mỗi nồng độ.Xác định giá trị mong đợi (lý thuyết) cho mỗi nồng độ: sử dụng nồng độ biếttrước nếu có Khi vật liệu sử dụng là mẫu bệnh phẩm chưa biết nồng độ thìnồng độ trung bình của hỗn hợp có nồng độ thấp nhất và hỗn hợp có nồng độcao nhất được dùng để tính nồng độ của hỗn hợp còn lại Vẽ đường cong phụ

thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khikhông còn tuyến tính [18] Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vàonhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích vàphương pháp phân tích được sử dụng Các chất khác nhau có khoảng tuyếntính khác nhau do sự khác nhau về tính chất lý hóa Trong khi các kỹ thuật sửdụng khác nhau ảnh hưởng lớn đến độ dài ngắn của khoảng tuyến tính.

1.2.5.4 Khoảng tham chiếu

Khoảng tham chiếu là khoảng phân bố đặc trưng của giá trị ở mộtquần thể tham chiếu sinh học Khoảng tham chiếu là đặc tính cuối cùngđược đánh giá trong quá trình thẩm định phương pháp vì khoảng thamchiếu không phải là yếu tố quyết định hiệu năng của phương pháp có chấpnhận được hay không Nếu phương pháp chấp nhận được thì điều quantrọng tiếp theo là xây dựng khoảng tham chiếu hoặc đánh giá khoảng thamchiếu để hỗ trợ cho việc diễn giải kết quả xét nghiệm của bệnh nhân [8, 9]

Hướng dẫn EP28 – A3C đưa ra quy trình chi tiết giúp phòng xétnghiệm có thể thiết lập hoặc xác nhận khoảng tham chiếu Thiết lập khoảngtham chiếu là quá trình thực hiện để tạo ra khoảng tham chiếu bao gồm cácbước lựa chọn đối tượng tham chiếu, mô tả chính xác các phương phápphân tích xét nghiệm, thu thập số liệu và xử lý số liệu Thực tế, việc thiếtlập khoảng tham chiếu đòi hỏi nguồn lực lớn do vậy phòng xét nghiệmthường chỉ xác nhận khoảng tham chiếu xem có thích hợp không trước khiđưa vào sử dụng

Xác nhận khoảng tham chiếu (verifying a reference interval): là quátrình đánh giá, xác nhận giá trị khoảng tham chiếu đã được xây dựng ở nơikhác, hoặc tại một nghiên cứu khác bằng cách sử dụng một nhóm nhỏ đốitượng tham chiếu (khoảng 20 đối tượng tham chiếu) để đảm bảo khoảng thamchiếu là phù hợp, có thể sử dụng được với phòng xét nghiệm hiện tại

Thực nghiệm xác nhận khoảng tham chiếu có thể thực hiện bằng việcthu thập và phân tích 20 mẫu thu thập từ các cá nhân đại diện Nếu có hai

hoặc ít hơn hai kết quả nằm ngoài khoảng giới hạn thì khoảng tham chiếu đóđược tuyên bố hoặc báo cáo thì khoảng tham chiếu đó được xác nhận (các kếtquả rơi ra ngoài khoảng tham chiếu không lớn hơn 10% so với số mẫu mẫu).Thực nghiệm này rất đơn giản, nó yêu cầu một lượng mẫu tối thiểu và cungcấp những tiêu chí rõ ràng để diễn giải kết quả xét nghiệm Việc lựa chọnmẫu đơn giản hơn ở người trưởng thành, dễ thực hiện hơn đối với trẻ em Nếu18/20 mẫu có kết quả nằm trong khoảng tham chiếu thì có thể sử dụngkhoảng tham chiếu đó Nếu có lớn hơn hai mẫu nằm ngoài khoảng thì tiếnhành thu thập thêm 20 mẫu nữa và phân tích 20 mẫu này Nếu có 36/40 mẫu

có kết quả nằm trong khoảng thì có thẻ sử dụng khoảng tham chiếu này Nếuđến 60 mẫu được phân tích mà kết quả của khoảng tham chiếu đó vẫn không

sử dụng được thì cân nhắc sử dụng khoảng tham chiếu khác hoặc tự thiết lậpkhoảng tham chiếu cho phòng xét nghiệm [20]

1.3 Tổng quan về FT 4 và TSH

1.3.1 Tổng quan về FT 4

1.3.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo

Thyroxine (T4) là nội tiết tố tuyến giáp chính được tiết vào hệ tuần hoànbởi tuyến giáp – một trong những tuyến nội tiết lớn nhất và quan trọng nhấtcủa cơ thể

T4 lưu thông trong máu là một hỗn hợp cân bằng của nội tiết tố tự do vànội tiết tố liên kết trong huyết thanh T4 tự do (FT4) là dạng không liên kết và

có hoạt tính sinh học, tương ứng với chỉ 0.03 % T4 toàn phần T4 còn lại làdạng không có hoạt tính và gắn kết với protein huyết thanh như globulin gắnkết thyroxine (75 %), pre-albumin (15 %), và albumin (10 %) [21]

1.3.1.2 Tác dụng

Cùng với triiodothyronine (T3), T4 đóng một vai trò sống còn trong điềuhòa tốc độ chuyển hóa của cơ thể, ảnh hưởng đến hệ tim mạch, chuyển hóatăng trưởng và xương, và quan trọng cho sự phát triển bình thường của chứcnăng sinh dục và hệ thần kinh [21, 22]

Ưu điểm của phương pháp đo T4 tự do là không phụ thuộc vào sự thay đổinồng độ hay đặc tính liên kết của các protein liên kết; việc định lượng thêmthông số gắn (T-uptake, TBG) do vậy là không cần thiết Do đó T4 tự do là mộtcông cụ hữu ích trong chẩn đoán lâm sàng thường quy để đánh giá tình trạngtuyến giáp T4 tự do nên được đo cùng với TSH nếu nghi ngờ rối loạn [21].

1.3.2 Tổng quan về TSH

1.3.2.1 Nguồn gốc, cấu tạo

TSH (Hormon kích thích tuyến giáp [Thyroid Stimulating Hormone])

là một glycoprotein có trọng lượng phân tử 28 000 dalton do thùy trước tuyếnyên tiết ra dưới sự kiểm soát của một hormon của vùng dưới đồi (TRH)

Hormon kích thích tuyến giáp (TSH) bao gồm hai chuỗi peptid alpha,bêta và một nhóm hydrocarbon Trình tự các axit amin của chuỗi nhỏ alpha(sous unité alpha) giống hệt nhau giữa TSH, FSH, LH và HCG vì vậy có thểgặp các phản ứng chéo nhất là ở phụ nữ sau tuổi mãn kinh Trái lại, trình tựcác các axit amin của chuỗi nhỏ bêta (sous-unité beta) và nhóm hydrocarboncủa các hormon tuyến yên khác biệt nhau, vì vậy đảm bảo tính đặc hiệuhormon và miễn dịch học [21]

1.3.2.2 Tác dụng

TSH có tác dụng lên cấu trúc tuyến giáp: tăng số lượng và kích thước tếbào tuyến giáp trong mỗi nang giáp, tăng biến đổi các tế bào nang giáp từdạng khối sang dạng trụ (dạng bài tiết), tăng phát triển hệ thống mao mạchcủa tuyến giáp

TSH có tác dụng lên chức năng tuyến giáp: làm tăng hoạt động gắnbơm iod do đó làm tăng khả năng bắt iod của tế bào tuyến giáp, TSH làm tănggắn iod vào thyroxin để tạo hormon tuyến giáp, TSH còn làm tăng phân giảithyroglobulin được dự trữ trong lòng nang để giải phóng hormon tuyến giápvào máu và do đó làm giảm chất keo trong lòng nang giáp [22]

1.3.3 Vai trò của bộ xét nghiệm FT4, TSH trong thực hành lâm sàng [23]

Vì sự giải phóng TSH từ tuyến yên được kiểm soát qua cơ chếfeedback âm tính bởi hormon tuyến giáp, việc định lượng TSH có thể dùngnhư một chỉ điểm cho việc đánh giá chức năng tuyến giáp Tuy nhiên, việc đolường thêm cả FT4 là cách thức tốt hơn để đánh giá Sự kết hợp hai xétnghiệm còn cần để theo dõi các bệnh nhân đang được điều trị bệnh tuyếngiáp, đặc biệt có ý nghĩa ở giai đoạn sớm

Suy giáp có bùtrừ

Suy giáp (tiên phát)Hồi phục sau ốm không

do bệnh tuyến giáp

Bình

thường

Tuyến giápbình thường

Tự kháng thể

T4 (không haygặp)

Tuyến giáp bìnhthường

Ốm không do tuyếngiáp (FT3 giảm)Suy tuyến yên (cáchormone khác củatuyến yên)

Thấp

Cường tuyếngiáp (FT3

tăng)

Nhiễm độc giáptăng T3 (FT3

tăng)

Cường giápkhông có triệuchứng lâm sàng(FT3 bìnhthường/ giảm)

Suy tuyến yên (cáchormone khác củatuyến yên giảm)

Ốm nặng không dotuyến giáp (FT3 giảm)

1.3.4 Các phương pháp định lượng TSH, FT 4

1.3.4.1 Miễn dịch men vi hạt (MEIA)

Nguyên lý của kỹ thuật miễn dịch men vi hạt (MEIA: micro-particleenzyme immuno assay): phương pháp này dựa trên nguyên tắc dùng haikháng thể đơn dòng “kẹp” vào 2 đầu của chất thử Một trong hai kháng thểđược đánh dấu bằng enzyme Nồng độ phức hợp đánh dấu sau phản ứng tỷ lệvới lượng kháng nguyên có mặt [24, 25]

Ưu điểm: do có pha rắn là các vi hạt lơ lửng trong dung dịch giúp tăngdiện tích tiếp xúc kháng nguyên, kháng thể, làm giảm thời gian phản ứng

Nhược điểm: có độ nhạy kém

1.3.4.2 Miễn dịch ánh sáng huỳnh quang (FIA)

Nguyên lý của kỹ thuật miễn dịch ánh sáng huỳnh quang (FIA: fluoroimmuno assay): Các chất đánh dấu huỳnh quang phản ứng cạnh tranh với chấttrong mẫu thử Các chất đánh dấu khi gắn với kháng thể sẽ chuyển động ít, ánhsáng sẽ đi thẳng, cường độ ánh sáng tăng (ít phân cực) và ngược lại [24, 25]

Nhược điểm: vấn đề nhiễu do các chất huỳnh quang có thể hiện diệntrong tự nhiên Do đó, tín hiệu huỳnh quang phát ra phải cao hơn hẳn so vớinhiễu, nên độ nhạy của thử nghiệm không cao

1.3.4.3 Miễn dịch phóng xạ (RIA)

Nguyên lý của kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA: radio immuneassay): Chất cần định lượng đóng vai trò là kháng nguyên (T3, T4, TSH) cạnhtranh với các phân tử kháng nguyên đồng nhất về mặt miễn dịch đã đượcđánh dấu bằng đồng vị phóng xạ (I125 – T3…) để gắn với một lượng hạn chếcác phân tử kháng thể tương ứng tham gia phản ứng Phát hiện chất đo dựatrên máy đếm phóng xạ (Geiger meter) [24, 25]

Ưu điểm: độ nhạy cao

Nhược điểm: tốc độ phản ứng chậm, cần nhiều thời gian để đếm bức xạphát ra Ngoài ra, việc an toàn cho người sử dụng và xử lý chất thải phóng xạgặp nhiều khó khăn

1.3.4.4 Miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA)

Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA: Electrochemiluminescence immunoassay) dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên vàkháng thể, được phát hiện (định lượng) bằng chất đánh dấu là một chất phátquang Kích hoạt phát quang bằng cách tạo điện áp trong dung dịch phản ứng.Ánh sáng này sẽ được đo bằng bộ phận quang phổ của máy (luminometer).Cường độ ánh sáng tỷ lệ với nồng độ chất phân tích trong mẫu thử [26]

Ưu điểm: phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gianphân tích ngắn

1.3.4.5 Miễn dịch hóa phát quang trực tiếp (DCLIA)

Phương pháp miễn dịch hóa phát quang trực tiếp (DCLIA:

Direct-chemiluminescense immuno assay) được thực hiện dựa trên nguyên lý kết hợp

kháng nguyên – kháng thể Chất đánh dấu là một phân tử acridinium ester(AE), có khả năng phát quang khi thay đổi pH môi trường Chất phân tích cótrong huyết thanh (huyết tương) kết hợp với vi hạt thuận từ phủ kháng thể.Sau đó kháng thể có đánh dấu AE được cho vào tiếp tục kết hợp với khángnguyên, tạo phức hợp kháng thể - kháng nguyên – kháng thể gắn acridinium.Phức hợp này sau khi rửa sẽ thêm vào một chất axit, sau đó khi cho vào chấtkiềm, trong vòng 2 giây phân tử AE sẽ phát quang Để định lượng ánh sángphát ra, cần dùng 1 buồng nhân quang (luminometer) trong buồng tối, lượngánh sáng phát ra tỉ lệ với nồng độ cơ chất cần phân tích có trong mẫu thử.Phản ứng hóa phát quang hình thành được tính bằng đơn vị ánh sáng tươngđối (RLUs) [26]

Đây là phương pháp mới tiên tiến hiện nay, có độ nhạy phân tích cực caovượt trội hơn hẳn so với những phương pháp cũ như miễn dịch phóng xạ,miễn dịch enzyme hay miễn dịch đo độ đục Phương pháp này có ưu điểm làlàm tăng diện tích tiếp xúc kháng nguyên và kháng thể lên khoảng 50 lần, làm

tăng độ nhạy, giảm thời gian ủ Kỹ thuật này cũng giúp tự động hóa kỹ thuậtrửa, giúp sạch hơn, vào giai đoạn rửa từ trường được áp vào cạnh của ốngnghiệm phản ứng, giữ lại tất cả các vi hạt nhiễm từ Mặt khác khi so sánh vớiphương pháp miễn dịch men: phân tử AE có trọng lượng phân tử nhỏ (480),nhỏ hơn đáng kể khi so sánh với kỹ thuật EIA (Alkaline phosphatase có trọnglượng 68000) gia tăng khả năng thâm nhập vào cơ chất và giảm thiểu hiệuứng che lấp vị trí gắn kết (binding site) kháng nguyên – kháng thể Phươngpháp này cũng có thời gian phân tích ngắn Vì vậy công suất đạt được là rấtlớn, nó giúp các bác sĩ lâm sàng đưa ra những chẩn đoán nhanh hơn và chínhxác hơn

Xét nghiệm định lượng FT4, TSH trên hệ thống Atellica Solution cũngđược thực hiện theo phương pháp miễn dịch hóa phát quang

1.4 Hệ thống Atellica Solution [27]

1.4.1 Giới thiệu về công nghệ của IM Analyzer Atellica Solution

Máy miễn dịch IM Analyzer của hệ thống Atellica Solution có côngsuất tối đa 440 xét nghiệm/ giờ, sử dụng công nghệ hóa phát quang Khi kếthợp với công nghệ miễn dịch, ánh sáng mà phản ứng này tạo ra cho biếtlượng chất phân tích trong mẫu đó

IM Analyzer áp dụng các nguyên lý liên kết đối với xét nghiệm miễn dịchcủa kháng thể bằng các dạng sau:

Mặt khác, hệ thống sẽ sử dụng hạt thuận từ (PMP) để phân tách phứchợp kháng nguyên, kháng thể đã liên kết với kháng thể và kháng nguyên tự dokhông liên kết Hạt thuận từ (PMP) có bản chất là các tinh thể oxit sắt Cáchạt PMP được phủ kháng thể hoặc kháng nguyên sẽ tạo thành pha rắn củathuốc thử chính Trong quá trình ủ với mẫu cần phân tích, các PMP được bọcbởi kháng thể trong cuvet liên kết với kháng nguyên hoặc kháng thể mục tiêu.

Hệ thống để cuvet tiếp xúc với trường từ tính và hút các PMP được liên kếtkháng nguyên hoặc kháng thể về phía nam châm Trong khi nam châm giữPMP ở vị trí, hệ thống sẽ loại bỏ mẫu và thuốc thử không liên kết

1 Hạt thuận từ (PMP) 2 Kháng thể

Hình 1.3 Các hạt thuận từ (PMP) tự do 1.4.2 Phương pháp xét nghiệm định lượng FT 4 trên hệ thống Atellica Solution

Xét nghiệm Atellica IM FT4 là xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh dạngkháng nguyên được gắn nhãn AE

Hệ thống bổ sung vào mẫu:

 Thuốc thử Lite, chứa T4 được gắn nhãn AE

 Pha rắn, chứa PMP được gắn nhãn kháng thể

Hệ thống ủ cuvet ở 37oC (98,6oF) T4 được gắn nhãn AE cạnh tranh vớikháng nguyên đặc hiệu với T4 trong mẫu để giành được các vị trí gắn kết cógiới hạn trên PMP được liên kết kháng thể

1 Kháng thể, 2 PMP, 3 FT 4 trong mẫu, 4 T 4 được gắn nhãn AE

Hình 1.4 Kháng nguyên được gắn nhãn AE

Hệ thống để cuvet tiếp xúc với trường từ tính và hút các PMP được liênkết kháng nguyên – kháng thể có gắn nhãn AE về phía nam châm Trong khinam châm giữ các PMP ở vị trí, hệ thống sẽ loại bỏ mẫu và thuốc thử khôngliên kết Kháng nguyên đặc hiệu với PMP - kháng thể - chất gắn kết từ phứchợp kháng nguyên được gắn nhãn AE-mẫu và kháng nguyên đặc hiệu vớiPMP - kháng thể - chất gắn kết từ phức hợp mẫu ở nguyên trong cuvet

1 Phức hợp PMP – Kháng thể - Kháng nguyên,

2 Phức hợp PMP – Kháng thể - Kháng nguyên – AE

Hình 1.5 Kháng nguyên được gắn nhãn AE trong cuvet

1.4.3 Phương pháp xét nghiệm định lượng TSH trên hệ thống Atellica Solution

Xét nghiệm Atellica IM TSH3 - UL thuộc dạng xét nghiệm miễn dịchsandwich

Hệ thống bổ sung vào mẫu:

 Thuốc thử Lite, chứa kháng thể kháng TSH được gắn nhãn AE

 Pha rắn, chứa PMP được gắn nhãn kháng thể

Hệ thống bổ sung thuốc thử Lite, chứa kháng thể được gắn nhãn AE vàomẫu Kháng thể được gắn nhãn AE liên kết với kháng nguyên đặc hiệu vớiTSH trong mẫu.

1 Acridium ester (AE), 2 Kháng thể

3 Kháng nguyên đặc hiệu với TSH trong mẫu, 4 Các kháng nguyên khác

Hình 1.6 Dạng xét nghiệm phức hợp sandwich

Hệ thống bổ sung pha rắn chứa các hạt thuận từ (PMP) được phủ khángthể đặc hiệu với kháng nguyên trong mẫu Sau đó, cuvet ủ ở 37oC (98,6oF) CácPMP liên kết với các kháng nguyên liên kết với kháng thể được gắn nhãn AE

1 Phức hợp PMP-Kháng thể-Kháng nguyên-Kháng thể AE

Hình 1.7 Dạng xét nghiệm phức hợp sandwich với pha rắn

Hệ thống để cuvet tiếp xúc với trường từ tính và hút các PMP được liênkết kháng nguyên hoặc kháng thể về phía nam châm Trong khi nam châmgiữ các PMP ở vị trí, hệ thống sẽ loại bỏ mẫu và thuốc thử không liên kết.Phức hợp sandwich được tạo thành từ PMP – Kháng thể - Kháng nguyên –Kháng thể - AE ở nguyên trong cuvet

1 Nam châm, 2 Phức hợp PMP-Kháng thể-Kháng nguyên-Kháng thể -AE, 3 Cuvet

Hình 1.8 Xét nghiệm dạng sandwich trong cuvet

Hệ thống bổ sung axit và bazơ để kích hoạt phản ứng hóa phát quang

và đo ánh sáng phát ra bằng đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) Hệ thốngđịnh lượng ánh sáng mà quá trình oxy hóa AE tạo ra và tính toán nồng độTSH trong mẫu

Ở dạng phức hợp sandwich, nồng độ kháng nguyên đặc hiệu với chất phân tích trong mẫu tỷ lệ thuận với lượng ánh sáng phát ra bằng RLU

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

Mẫu kiểm tra chất lượng (QC BioRad L1,2,3 – Lot 40340 – Ngày hếthạn 30/11/2019)

Mẫu chuẩn có nồng độ biết trước (Atellica IM TSH3-UL Cal, Atellica

IM Cal A)

Mẫu: Huyết thanh thừa của bệnh nhân, thu thập từ các mẫu máu sau khi

đã được phân tích tại phòng xét nghiệm Bệnh viện Đại học Y Hà Nội

 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu:

- 20 đối tượng là người khỏe mạnh cho mỗi thử nghiệm xác nhận khoảngtham chiếu, tuổi 18 – 65, giới tỉ lệ nam:nữ = 1:1

- Đối tượng lựa chọn có hồ sơ bệnh án khám sức khỏe là khỏe mạnh,không có tiền sử mắc bệnh lý tuyến giáp

- Dùng các loại thuốc ảnh hưởng đến hormone tuyến giáp: dùng thuốckháng giáp trạng tổng hợp, hormone giáp, dopamine, corticoid …

 Tiêu chuẩn loại trừ khỏi đối tượng nghiên cứu:

- Các bệnh lý mãn tính: xơ gan, suy thận, suy tim, suy dinh dưỡng…

- Bệnh lý về mạch máu: nhồi máu cơ tim, đột quỵ, viêm tắc động tĩnhmạch