Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây ba kích tại quảng nam đà nẵng bằng chỉ thị phân tử RAPD

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG LÊ HOÀNG KHẨN NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD Đà Nẵn

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

LÊ HOÀNG KHẨN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI

TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI

QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ

PHÂN TỬ RAPD

Đà Nẵng – Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

LÊ HOÀNG KHẨN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI

TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI

QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ

PHÂN TỬ RAPD

Đà Nẵng – Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây Ba kích tại Quảng

Nam-Đà Nẵng bằng chỉ thị phân tử”là do nhóm chúng tôi thực hiện Mọi số liệu, hình ảnh, kết quả là hoàn toàn lấy từ các thí nghiệm sau khi thực hiện Các tài liệu có trong bài được tìm trong các sách, bài báo, tạp chí… trong nước và thế giới đáng tin cậy và chính xác

Tác giả

Lê Hoàng Khẩn

LỜI CẢM ƠN

Chúng em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Sinh học-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng đã tận tình giúp đỡ chúng em trong suốt 4 năm học qua

Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Lý

và Th.S Vũ Đức Hoàng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp này

Cũng xin được gửi lời cảm ơn đến Hội động vật FrankFurt đã hỗ trợ một phần kinh phí để em thực hiện đề tài và tập thể lớp Công Nghệ Sinh học khoá 2014-2018 đã luôn bên cạnh quan tâm và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VII

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNGQUANVỀCÂYBAKÍCH 3

1.1.1 Phân loại khoa học 3

1.1.2 Giá trị dược liệu 3

1.1.3 Phân bố 4

1.1.4 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền và thành phần hóa học của cây Ba kích trong và ngoài nước 4

1.2 CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR TRONG NGHIÊNCỨUĐADẠNGDITRUYỀN 6

1.2.1 Chỉ thị RAPD 6

1.2.2 Kỹ thuật RAPD-SCAR 8

1.2.3 Kỹ thuật ISSR 9

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1.ĐỐITƯỢNGVÀPHẠMVINGHIÊNCỨU 11

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 12

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 12

2.2.1 Phương pháp đánh giá hình thái 12

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 13

2.2.2 Phương pháp điện di trên gel agarose 14

2.2.4 Phương pháp phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD 15

2.2.5 Phân tích sản phẩm phản ứng PCR-RAPD 15

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1.ĐÁNHGIÁHÌNHTHÁI 17

3.2.TÁCHCHIẾTDNATỔNGSỐ 19

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ PCR-RAPD 20

3.4.KẾTQUẢPHÂNTÍCHMỐIQUANHỆDITRUYỀNGIỮACÁCMẪUBA KÍCH 25

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP amplified fragment length polymorphism

AP-PCR arbitrary primed polymerase chain reaction

CAPS cleaved amplified polymorphics sequences

CTAB cetyltrimethyl-ammonium bromide

DAF DNA amplification fingerprinting

DNA deoxyribonucleic acid

dNTP deoxyribonucleoside triphophate

EDTA ethylene diamine tetraacetic acid

ISSR inter-simple sequence repeats

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR polymerase chain reaction

RAPD randomly amplified polymorphic DNA

SRAP sequence related amplified polymorphism

SSR simple sequence repeats

PIC Polymorphic Information Content

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH Danh mục các bảng:

Bảng 2.1 Danh sách địa điểm thu mẫu 12Bảng 2.2 Thành phần đệm chiết qua các lần cải tiến 13Bảng 2.3 Danh mục mồi ngẫu nhiên được sử dụng trong nghiên cứu 15Bảng 3.1 Nồng độ dung dịch dna tổng số tách chiết từ các mẫu nghiên cứu 20Bảng 3.2 Tổng hợp số loại phân đoạn, băng DNA được nhân bản và số phân đoạn, băng DNA đa hình 22Bảng 3.3 sản phẩm đa hình RAPD của mồi OPF-11 nhận được sau khi chạy PCR với DNA tổng số của các mẫu ba kích 24Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền (Nei) giữa các mẫu ba kích 25

Danh mục các hình:

Hình 2.1 Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR 14Hình 3.1 Kết quả đánh giá hình thái giữa các mẫu: lá non có màu tím sẫm (I); lá non có màu xanh (II); lá có hình dạng hơi tròn (III) và lá già có nhiều lông ở mặt dưới (IV) 18Hình 3.2 Hình thái các loại kiểu hình của cây ba kích sử dụng trong nghiên cứu:

lá non có màu tím sẫm (I); lá non có màu xanh (II); lá có hình dạng hơi tròn (III)

và lá già có nhiều lông ở mặt dưới (IV) 18Hình 3.3 DNA tổng số tách chiết từ 11 mẫu ba kích Đường chạy ký hiệu M là DNA ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy 1 đến 11 là dna tổng số của mẫu từ bk1 đến bk11 19

Hình 3.4 Sản phẩm rapd sử dụng mồi OPF-11 Đường chạy ký hiệu M là dna ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy 1 đến 11 là sản phẩm PCR của mẫu

từ BK1 ĐẾN BK11 23Hình 3.5 Sản phẩm RAPD sử dụng mồi OPB-04 Đường chạy ký hiệu M là DNA ladder 1000 bp (Phusabiochem), đường chạy 1 đến 8 là sản phẩm PCR của mẫu

từ BK1 đến BK8 23Hình 3.6 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phần mềm NTSYSPC 2.0 với hệ số là NEI72, phương pháp Clustering SAHN 26

MỞ ĐẦU

Cây Ba kích (Morinda officinalis How.) thuộc họ cà phê (Rubiaseae) là loại

thảo dược quý Ba kích thường mọc trong tự nhiên, mọc dại ở những vùng đồi, núi đồi trung du miền núi phía bắc Việt Nam như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Giang, Quảng Nam

Củ của cây Ba kích được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng, sức dẻo dai và khử phong thấp [22] Dịch chiết từ củ Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ trí não giúp ăn và ngủ ngon [21] Ở Việt Nam, nghiên cứu của Trần Mỹ Tiên và cs (2012) khi thử nghiệm trên chuột, đã chứng minh dịch chiết của rễ cây Ba kích có ảnh hưởng đến tính sinh dục đực [12]

Thực trạng hiện này cho thấy nhu cầu sử dụng rễ Ba kích ngày càng tăng dẫn đến hiện tượng khai thác quá mức làm cho số lượng cây trong tự nhiên giảm nhanh Chính vì vậy Ba kích rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng trong tự nhiên

và đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ [1]

Ở Việt Nam, tỉnh Quảng Nam đã từng xảy ra tình trạng khai thác cạn kiệt nên tỉnh đã bắt đầu đưa loại cây này vào sản xuất từ năm 2006, nhưng nguồn giống vẫn chưa ổn định về tính di truyền, vẫn chưa xác định được quan hệ họ hàng các giống giữa các vùng

Mỗi vùng đều có những điều kiện sinh thái nhất định ảnh hưởng đến quá trình sống cũng như bảo tồn nguồn gen của chúng, qua quá trình chọn lọc tự nhiên

có những giống mang được các đặc tính di truyền quý của địa phương, có những giống lại không đáp ứng được điều đó Ban đầu huyện Tây Giang (Quảng Nam)

là nơi phát hiện và trồng cây Ba kích, sau đó nhân rộng và được trồng ở nhiều khu vực khác: Trà My, Nam Giang, Phước Sơn, … Từ giống Ba kích dại ban đầu, nay nhân rộng và được trồng tại các địa điểm khác nhau tại tỉnh Quảng Nam, Đà Nẵng

Mặt khác, giống Ba kích cũng đang nhập từ các tỉnh phía Bắc vào, đồng thời việc trồng cây Ba kích từ nuôi cây mô cũng đã và đang thực hiện tại Phước Sơn (Quảng Nam) Điều đó dẫn đến nguồn gen cây Ba kích tại Quảng Nam khá phức tạp và không đồng nhất, nguồn giống vẫn chưa ổn định về tính di truyền, vẫn chưa xác định được quan hệ họ hàng các giống giữa các vùng

Ngoài những giống được người dân nhân giống từ tự nhiên bằng phương pháp giâm hom, còn có các giống được nhập từ các địa phương khác Vấn đề này rất khó kiểm soát, gây ảnh hưởng đến sự đồng nhất về chất lượng các sản phẩm

từ cây Ba kích ở địa phương Việc nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích có ý nghĩa trong việc bảo tồn tính đa dạng sinh học và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen quý đó phục vụ cho công tác chọn tạo giống tại địa phương

Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị DNA ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cá thể và quần thể thực vật nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống [11] So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh), thì chỉ thị DNA mang những ưu điểm nổi bật: dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và hiện tượng tương tác gen, có thể xác định được các biến dị DNA trong các giai đoạn sinh trưởng, phát triển và ở các cơ quan khác nhau ở thực vật

Tại khu vực miền Trung – Tây nguyên cho đến nay cũng chưa có nghiên cứu về việc xác định tính đa dạng di tuyền của cây Ba kích bằng chỉ thị phân tử Gần đây, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử, như: RAPD, AFLP, RFLP, SSR, SNP cho phép đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể và các xuất xứ sinh vật một cách nhanh chóng [4]

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây Ba kích tại Quảng Nam-Đà Nẵng bằng chỉ thị phân

tử RAPD”,

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BA KÍCH

1.1.1 Phân loại khoa học

Ba kích có tên khoa học là Morinda officinalis How., thuộc họ Cà phê -

Rubiaceae, tại Việt Nam Ba kích còn có nhiều tên gọi: Dây ruột gà, Ba kích thiên, Liên châu Ba kích, Chẩu phòng xì (Mông), Sáy cáy (Thái), Thau tày cáy (Tày), Chồi hoàng kim (Mường), Chày kiàng đòi (Dao)

Ba kích là cây lâu năm, dạng thân leo cuốn vào giá đỡ Rễ có thịt dày, hình trụ tròn, cong queo, thắt thành từng đoạn như ruột gà, được chế biến sử dụng làm thuốc Thân hình trụ tròn, phân nhánh nhiều Cành non có lông thô màu nâu khi già nhẵn không lông Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, có cuống Lá kim nhỏ hợp thành ống màu xám nâu Phiến lá hình elip thuôn dài, lá non màu tím có lông, lá già màu xanh không lông Cụm hoa ở nách lá hay đầu cành Hoa nhỏ màu trắng ngà Quả khi còn non màu xanh, khi chín màu hồng

1.1.2 Giá trị dược liệu

Theo y học hiện đại Ba kích có tác dụng: Tăng cường sức đề kháng của cơ thể đối với các yếu tố độc hại, chống viêm, điều hoà hoạt động nội tiết Đối với nam giới có hoạt động sinh lý yếu Ba kích có tác dụng làm tang khả năng giao hợp Đối với người già hoặc những bệnh nhân đau mỏi khớp, Ba kích có tác dụng giảm đau rõ rệt sau khi sử dụng Ba kích dài ngày Rễ Ba kích chiết xuất bằng rượu

có tác dụng giảm áp huyết, có tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, tăng cường não [5]

Theo y học cổ truyền, cây Ba kích có tác dụng bổ thận tráng dương, mạng gân cốt, khử phong thấp Từ xa xưa nhân dân ta đã biết sử dung rễ Ba kích trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa bệnh, Ba kích là vị thuốc bổ trí não và tinh khí, dùng trong các bệnh liệt dương, sớm xuất tinh, di mộng tinh, phụ nữ kinh nguyệt không đều, phong thấp, huyết áp cao [2]

1.1.3 Phân bố

Cây Ba kích mọc hoang ở hầu hết các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Bắc Cạn, Lào Cai, Yên Bái, Phú Thọ, Lai Châu, Sơn La, Hoà Bình, Ninh Bình, Thanh Hoá và Nghệ An Ngoài ra còn có ở Trung Quốc, Ấn Độ, Lào

và Triều Tiên Cây thích ứng rộng với điều kiện sinh thái Cây ưa sáng ở giai đoạn trưởng thành, tuy nhiên cây dưới 2 năm tuổi có khả năng chịu bóng Cây tồn tại

và phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 22,5-23,1°C, chịu được nhiệt độ tối thấp tuyệt đối -2,8°C và tối cao tuyệt đối 41,4°C Độ ẩm không khí trung bình từ 82- 89% Lượng mưa bình quân năm từ 1420,7 - 2574,5 mm Ba kích ưa đất feralit

đỏ vàng và đất feralit giàu mùn trên núi, đất thịt ẩm mát Cây sinh trưởng sau 5 đến 7 năm mới thu dược liệu, năng suất bình quân 8-12 kg củ tươi/gốc, càng để lâu năm sản lượng càng cao chất lượng dược liệu càng tốt [13]

1.1.4 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền và thành phần hóa học của cây

Ba kích trong và ngoài nước

a Các nghiên cứu ngoài nước

Ba kích là loài phân bố hẹp trên thế giới nên có ít công trình nghiên cứu về loài cây này, chỉ có một số công trình nghiên cứu điển hình ở Australia và Trung Quốc Các nghiên cứu này tập trung vào các tác dụng dược lý cũng như các thành phần hóa học của loài cây này

Ding và cs (Trung Quốc) đã phân tích đa dạng di truyền cây Ba kích bằng

40 chỉ thị RAPD, trong đó có 14 mồi cho sản phẩm đa hình Qua phân tích kết quả các tác giả đưa ra kết luận có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích (Trung Quốc)

ở mức độ phân tử [16]

b Các nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu của Chu Thị Thu Hà về tính đa dạng di truyền của cây Ba kích

ở tỉnh Quảng Ninh bằng chỉ thị ISSR năm 2015 đã chọn được 6 mồi ISSR để tiến hành phân tích bằng phương pháp PCR-ISSR cho tỉ lệ băng đa hình là 93,2% và

giá trị PIC trung bình là 0,7799 Kết quả cho thấy các mẫu Ba kích được chia thành 2 nhóm với hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0,32 đến 0,88 từ đó khẳng định có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích ở mức độ phân tử [5]

Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Ba kích của Võ Châu Tuấn và cs (2010)

Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng đoạn thân (khoảng 1cm) để tái sinh chồi

in vitro trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,25 mg/L Kinetin Sau đó các

chồi này tiếp tục được nhân nhanh trong các môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng Số lượng chồi đạt nhiều nhất trên môi trường MS có bổ sung 3,5 mg/L BA + 0,2 mg/L IBA là 15 chồi/ mẫu cấy Chồi được đưa vào môi trường

tái sinh rễ tốt nhất là môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/L IBA Cây con in vitro

được đưa ra nhà lưới thu được kết quả đạt 97,9% thích nghi [11]

c Tình trạng khai thác cây Ba kích tại Quảng Nam – Đà Nẵng

Thấy được giá trị dược học, giá trị kinh tế của cây Ba kích vô cùng to lớn, điều đó dẫn đến việc khai thác một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát Chính vì vậy đã làm cho số lượng cây Ba kích ngoài tự nhiên giảm mạnh, tính đa dạng về cây Ba kích giảm nhanh, có nguy cơ tuyệt chủng Ba kích đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ [1] Tình trạng này cũng đã và đang xảy ra tại vùng Quảng Nam-

Đà Nẵng

Sau tình trạng khai thác ồ ạt, tính từ sau năm 2006, tại khu vực Quảng

Nam-Đà Nẵng đã tiến hành trồng cây Ba kích Ban đầu, giống Ba kích được lấy từ khu vực vùng núi xã Lăng (Tây Giang, Quảng Nam) và được trồng nhiều tại đây bằng phương pháp dâm hom Sau đó, Ba kích được trồng sang nhiều khu vực khác: Nam Giang, Đông Giang, Hòa Khánh (Đà Nẵng) … Không những thế, trong những năm gần đây, giống Ba kích đang được nhập từ các khu vực khác hay lấy giống từ công nghệ nuôi cây mô (Phước Hiệp, Phước Sơn, Quảng Nam) Điều đó dẫn đến nguồn gen cây Ba kích tại Quảng Nam khá phức tạp và không đồng nhất, nguồn giống vẫn chưa ổn định về tính di truyền, vẫn chưa xác định được quan hệ

họ hàng các giống giữa các vùng Chất lượng giống không ổn định ảnh hưởng đến quá trình sản xuất

1.2 CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR TRONG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

Chỉ thị phân tử (Molecular marker) hay chỉ thị di truyền (Genetic marker)

là các dấu hiệu, hoặc các đặc trưng có tính phân biệt giữa các cá thể Điểm khác biệt là những chỉ thị này không dựa trên hình thái bên ngoài mà là dựa trên sự khác biệt về trình tự gene của mỗi sinh vật Chỉ thị phân tử thường là các đoạn DNA ngắn đã biết vị trí trên nhiễm sắc thể, và đoạn DNA này liên kết chặt với tính trạng đang khảo sát Liên kết chặt có nghĩa là trong quá trình sinh sản, chỉ thị phân tử đó luôn được di truyền kèm với tính trạng đang khảo sát cho thế hệ con

Theo nguyên tắc của kỹ thuật RAPD, hai cá thể hoàn toàn giống nhau sau khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD ở những điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng

và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể RAPD là công cụ hữu hiệu, đã được ứng dụng rộng rãi

để phân tích đa dạng di truyền cũng như xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau [6], [14]

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, sử dụng một mồi duy nhất, một đoạn oligonucleotide ngẫu nhiên được chọn để khuếch đại vùng gene bên cạnh của hai vị trí gắn mồi có chiều ngược nhau Thông thường, trong phân tích RAPD, mỗi mồi là một đoạn oligonucleotide dài 10 mer với khoảng 60-70% G+C và không tự bắt cặp với nhau, nhiệt độ bắt cặp thấp (37 - 40°C) Mồi bắt cặp với trình tự mà giống hệt hoặc tương đồng cao trên DNA khuôn mẫu mặc dù có một vài điểm không tương đồng, đặc biệt là ở đầu 5’ Sự đa hình được phát hiện

là do sự xuất hiện hay không xuất hiện băng và có thể do cả việc thay đổi trong trình tự bắt cặp của mồi và cả do hiện tượng chèn đoạn/mất đoạn giữa hai vị trí gắn mồi [6], [14]

Hầu như tất cả các marker RAPD là maker trội Nó không có khả năng phân biệt đoạn DNA được khuếch đại từ một locus là đồng hợp (2 bản sao) hay dị hợp (1 bản sao) Hiếm khi có marker RAPD đồng trội nhận biết được kích thước khác nhau của đoạn DNA khuếch đại từ cùng một locus Sự đa hình các đoạn khuếch đại chủ yếu là do thay thế hay mất bazơ trong vị trí gắn mồi, sự chèn làm cho các

vị trí gắn mồi quá xa để mà có thể khuếch đại thành công hay sự thêm/mất bazơ

có thể làm thay đổi kích thước của đoạn được khuếch đại Mặc dù số lượng đoạn khuếch đại không phụ thuộc vào kích thước genome và mức đa bội thể nhưng phản ứng khuếch đại được xác định một phần bởi sự cạnh tranh vị trí gắn mồi trong genome Mồi sẽ bám tốt hơn khi mức độ tương đồng cao hơn [6], [14]

Các kỹ thuật cải tiến từ RAPD như AP-PCR, SCAR, DAF, SRAP, CAPS, RAMPO, và RAHM có thể bù đắp được những yếu điểm của RAPD và có thể

tăng cường sự tiện dụng của kỹ thuật này cho các trường hợp đặc trưng Protocol đơn giản so với các kỹ thuật hiện có [6]

Kỹ thuật RAPD được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu di truyền và xác định quan hệ di truyền ở các loài RAPD đã được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền ở các loài ngũ cốc như ngô, lúa… ở các cây có múi như bưởi, cam, quýt,

đa dạng di truyền ở một số loại đậu, một số cây ăn quả, các loài thủy hải sản…

Valdermar P.Carvalho và cs (2004) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên

cứu quan hệ di truyền giữa 79 giống ngô (Zea mays L.) bản địa và 2 giống ngô lai

hiện đang được người dân Brazil canh tác Qua 32 mồi khuếch đại được 255 băng với 184 (72.2%) băng đa hình và qua phân tích cho thấy sự chỉ số tương đồng là 0.78-0.91 [7]

Việc sử dụng các kỹ thuật ISSR và RAPD để phát hiện đa hình DNA, nhận

dạng kiểu gene và tính đa dạng di truyền của lúa mạch (Barley cultivars) đã biết được nguồn gốc Theo đó, 16 giống lúa mỳ từ các nước khác nhau được xác định

mối quan hệ phát sinh loài, được phân tích bằng 353 marker PCR (125 RAPD và

228 ISSR) [13]

32 mẫu thuộc chi Citrus và 3 mẫu thuộc chi Microcitrus trong bộ sưu tập các giống cây Citrus, Đại học California (Mỹ) đã được Federici và cs (1998) kiểm

tra bằng phân tích RAPD Dữ liệu cho thấy C.maxima cùng nhóm với các loài C

hongheensis và C.latipes Thanh yên (C medica) cùng nhóm với C.indica, chanh

cốm, chanh và các dạng gần gũi Quýt không thực sự thuộc về nhóm trên mà là một loài khác, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy có rất nhiều mẫu đã được xác định loài sai [9]

không thể lặp lại Do đó, những amplicon RAPD được phát triển thành marker SCAR Đối với kỹ thuật này, marker RAPD được giải trình tự và những primer có chiều dài lớn hơn được thiết kế để sử dụng đặc hiệu cho từng locus cụ thể Những mồi SCAR dài hơn (thường 18-24 nucleotide) có nhiệt độ gắn mồi cao hơn nên đặc hiệu và có thể lặp lại SCAR sử dụng hiệu quả cho nghiên cứu lập bản đồ gene (SCAR đồng trội), so sánh bản đồ gene, hay nghiên cứu mối quan hệ tương đồng giữa các loài, kiểu gene và marker hỗ trợ chọn lọc các đặc điểm tốt quan tâm [6],

[14]

Trong các chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở PCR được sử dụng rộng rãi nhất trong các nghiên cứu đa dạng di truyền, SCAR có những ưu điểm như ít nhạy cảm hơn đối với điều kiện của một phản ứng PCR chuẩn do kích thước primer của nó dài hơn nhiều so với RAPD do đó tính đặc hiệu và tính lặp lại cao hơn Hơn nữa, SCAR không yêu cầu hóa chất đồng vị phóng xạ và chỉ phát hiện các locus đơn Marker SCAR đã được sử dụng để nhận dạng loài trong đa dạng loài như ở thực vật, côn trùng, vi sinh vật và động vật [14]

1.2.3 Kỹ thuật ISSR

Chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1994, đây là kĩ thuật dựa trên PCR nhằm khuếch đại đoạn DNA nằm giữa hai vùng vi vệ tinh lặp lại xác định có hướng ngược chiều nhau Kỹ thuật này sử dụng các vùng vi vệ tinh, thường có chiều dài 16-25bp, làm mồi duy nhất trong phản ứng PCR đối với các locus khác nhau trên genome để khuếch đại các đoạn nằm giữa các vi vệ tinh tạo ra các sản phẩm có kích thước khác nhau [2], [14]

Kỹ thuật này có sự kết hợp các ưu điểm của phân tích AFLP, vi vệ tinh và tính phổ biến của RAPD ISSR có độ lặp lại cao, độ tin cậy cao hơn so với RAPD

do sử dụng mồi dài (16-18 nucleotide), nhiệt độ ủ và kéo dài cao hơn (45-60ºC) dẫn đến kết quả chính xác hơn Khoảng 92-95% các băng xác định lặp đi lặp lại khi khuếch đại từ mẫu DNA của cùng một giống và các lần PCR khác nhau khi được xác định bằng điện di polyacrylamide gel ISSR là chỉ thị trội Tuy nhiên,

cũng có trường hợp sự phân ly giống như một chỉ thị đồng trội, vì vậy có thể phân biệt giữa dạng đồng hợp tử và dị hợp tử [14], [17]

Phần 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu lá non sau khi cắt khỏi cây được đựng trong túi polyetylen có gấp mép

giúp dễ bảo quản, di chuyển

Mỗi đối tượng cần lấy từ 10 mẫu lá Khi thu mẫu cần ghi chép đầy đủ thông tin về vị trí lấy mẫu

Các mẫu sau khi lấy có thể bảo quản trong điều kiện thường dưới 1 ngày, bảo quản lạnh (40C) trong thời gian dưới 2 ngày, và ở nhiệt độ -200C

Trong mỗi địa điểm sẽ thu mẫu ở nhiều khu vực khác nhau, trong quá trình thu mẫu sẽ tìm hiểu kỹ nguồn gốc của giống, nơi cung cấp giống, và nơi xuất giống, qua đó mở rộng phạm vi thu mẫu, khảo sát mẫu