BÁO CÁO NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP TÌM DEMODEX, BÊNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU, CẢI TIẾN KỸ THUẬT, XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP ,TÌM DEMODEX, BÊNH VIỆN DA LIỄU, TRUNG ƯƠNG

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP

TÌM DEMODEX

Người thực hiện:

Chủ nhiệm: TS.Bs Trần Cẩm Vân Thư ký:

Hà Nội, tháng 7 năm 2019

BN : Bệnh nhân

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN 3

1 Khái niệm 3

2 Triệu chứng lâm sàng 3

2.1 Viêm nang lông dạng vẩy phấn (pityriasis folliculitis, pityriasis folliculorum) 3

2.2 Viêm da Demodex giống dạng trứng cá đỏ.(Rosacea –like Demodicidosis) 3

2.3 Viêm da do Demodex dạng trứng cá đỏ thể u hạt (Granulomatous rosacea ) hay còn gọi (demodicidosis gravis ) 3

3 Cận lâm sàng 3

4 Điều trị 3

Chương 2 4

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

2.1 Đối tượng nghiên cứu 4

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 4

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 4

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 4

2.3 Vật liệu, dụng cụ nghiên cứu 4

2.4.1.1 Thiết kế nghiên cứu 5

2.4.1.2 Cỡ mẫu 5

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu cho mục tiêu 2 5

2.4.2.1.Thiết kế nghiên cứu 5

2.4.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 6

2.4.1.3 Phân chia nhóm nghiên cứu 6

2.4.3 Các kỹ thuật nghiên cứu 7

2.5 Các chỉ tiêu nghiên cứu 8

2.5.1 Đặc điểm chung 8

2.5.2 Các chỉ tiêu đánh giá 8

2.6 Các biện pháp hạn chế sai số 9

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 9

2.8 Đạo đức trong nghiên cứu 9

2.9 Hạn chế của đề tài 10

CHƯƠNG 3 11

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 11

3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 11

3.2 Kết quả xét nghiệm của phương pháp SSSB và KOH tiêu chuẩn 12

KẾT LUẬN 14

Bảng 3.2 Phân bố bệnh theo giới 20Bảng 3.3 Phân bố bệnh theo địa dư 21Bảng 3.4 Thời gian trả kết quả xét nghiệm của phương pháp SSSB vàKOH tiêu chuẩn 21Bảng 3 5 Ảnh hưởng khi nhận định hình thái trên kính hiển vi củaphương pháp băng dính và dao cùn 22

Bảng 3.6 Kết quả soi trực tiếp bằng phương pháp SSSB

và KOH tiêu chuẩn 22

Bảng 3.7 Kết quả nhận định số lượng Demodex bằng phương pháp

SSSB và KOH tiêu chuẩn 22

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm da do Demodex (Demodicidosis) là bệnh da mạn tính, ảnh hưởng

chính vùng mặt, gây nên bởi một loại côn trùng chân khớp ký sinh ở nanglông, tuyến bã ở người và súc vật [1] Bệnh xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, tỷ

lệ bệnh khác nhau ở từng khu vực, tuy nhiên bệnh có xu hướng gặp nhiều ở

các nước nhiệt đới Trên thế giới, theo ước tính Demodex ở người chiếm tỉ lệ cao từ 20- 80 % và 100% ở người già [2] Có 2 loài Demodex ngoại ký sinh ở người, đó là D.folliculorum và D.brevis sống ở nang lông, tuyến bã sử dụng chất béo làm nguồn dinh dưỡng [3] D.folliculorum thường sống ở phần phễu của nang lông, trong khi đó D.brevis chui sâu hơn vào tuyến bã và ống bài xuất tuyến bã [4] Demodex có thể tồn tại trên da người khoẻ mạnh mà không có biểu hiện lâm sàng Tỉ lệ Demodex phát hiện trên da người khoẻ mạnh ở độ

tuổi trung niên và người già khoảng 100% và có độ tập trung thấp [5] Tỉ lệ

nhiễm Demodex tăng theo tuổi Demodex ở lứa tuổi đến 20 có khoảng 25%, ở

tuổi đến 50 có khoảng 30% và người trên 90 tuổi gần như 100% nhiễm

Demodex [6]

Để xác định có nhiễm Demodex, hiện nay có nhiều phương pháp như

sinh thiết bề mặt da tiêu chuẩn (standardized skin surface biopsy SSSB); soi trực

tiếp dưới kính hiển vi (direct microscopic examination DME); tìm Demodex spp

ở vẩy da; sinh thiết toàn bộ lớp da; xác định Demodex spp bằng DNA; xác định Demodex spp bằng máy soi da Sinh thiết bề mặt da tiêu chuẩn (SSSB)

và soi trực tiếp bằng kính hiển vi (DME) thường được sử dụng để xác

định mật độ ký sinh trùng Demodex (Dd) Phương pháp SSSB bao gồm nhỏ

một giọt chất kết dính cyanoacrylic trên lam kính, áp bề mặt lam kính mangchất dính lên da, đợi khô và lấy ra sau khoảng 1 phút Trước đó, diện tích bềmặt tiêu chuẩn 1cm 2 được vẽ trên lam kính SSSB là một phương pháp lấy

mẫu không xâm lấn, qua đó có thể thu thập một phần bề mặt của lớp sừng vànang lông Với SSSB, lấy được phần nông lớp sừng của nang lông và

Demodex sống ở đó Ngược lại, soi trực tiếp, không thấy được các nang lông (đặc điểm quan trọng để phát hiện Demodex)

Tuy nhiên, trước đây chưa có nghiên cứu nào so sánh hai phương phápnày với mối liên quan tới lâm sàng và số lượng ký sinh trùng Để phục vụ tốthơn cho công tác chẩn đoán và điều trị bệnh nhân, chúng tôi tiến hành:

“Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật soi trực tiếp Demodex tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương”.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 Khái niệm

Viêm da do Demodex (Demodicidosis) là bệnh da mạn tính, ảnh hưởngchính vùng mặt, gây nên bởi một loại côn trùng chân khớp ký sinh ở nanglông, tuyến bã ở người và súc vật

Có 2 loài Demodex ngoại ký sinh ở người, đó là D.folliculorum vàD.brevis sống ở nang lông, tuyến bã sử dụng chất béo làm nguồn dinh dưỡng.D.folliculorum thường sống ở phần phễu của nang lông, trong khi đó D.brevischui sâu hơn vào tuyến bã và ống bài xuất tuyến bã

2 Đặc điểm Demodex

2.1 Hình thể

Demodex spp là một loại ký sinh trùng thuộc: Ngành (phylum) động

vật chân đốt (Athropoda); Lớp (class) nhện (Aneachnida); Bộ (oder) ve(Ararina); Ho (family) Demodicidae (Demodicidae); Giống (Genus)

Demodex.

Demodex có khoảng 65 loài, Có 2 loài Demodex ký sinh trên người là D.folliculorum và D.brevis Demodex spp ký sinh chủ yếu ở nang lông và

tuyến bã Đặc biệt trên vùng da mặt bao gồm má, mũi, cằm, trán, thái dương,

mí mắt, lông mày, da đầu, cổ, tai Những vùng da dầu khác như kẻ mũi môi,vùng xung mắt, và ít phổ biến vùng trên và giữa ngực và lưng, chúng cũng cóthể tìm thấy ở dương vật, mu sinh dục, mông [7]

D folliculorum khu trú phổ biến ở vùng mặt, trong khi đó D.brevis phổ biến hơn là vùng cổ và ngực Nhiễm D.folliculorum nhiều hơn là D.brevis,

nhưng sau đó lan rộng khắp cơ thể [8]

D.folliculorum trưởng thành có chiều dài 0,3- 0,4 mm và D.brevis có

chiều dài ngắn hơn là 0,15-0,2 mm [9] Hai loài có cấu trúc giống nhau, chỉkhác nhau độ dài của đuôi con cái hơi ngắn hơn và tròn hơn con đực Khôngthể trông thấy chúng bằng mắt thường, nhưng dưới kính kiển vi thì cấu trúccủa chúng được thấy rõ Nó có hình thái bán trong suốt, kéo dài cơ thể baogồm hai đoạn đầu bụng gắn dính khớp nhau Có 4 đôi chân phân đoạn, ngắndính liền với phần đầu của cơ thể Cơ thể được bao phủ bởi các vẩy để chochúng gắn dính vào nang lông và phần miệng giống kim băng để ăn các tếbào da, và các chất dầu nhờn tích tụ trong các nang lông Các sinh vật này dichuyển trên mặt với tốc độ chậm 8-16 mm/giờ chủ yếu vào ban đêm, khi cóánh sáng chúng di chuyển lùi lại nang lông

nang lông Demodex thích sống trong môi trường nóng ẩm và hoạt động mạnh

trong bóng tối

Demodex đực trưởng thành sẽ rời khỏi nang lông đi tìm con cái, trong khi con cái trưởng thành vẫn còn ở trong nang lông, Demodex bò lên từ miệng

nang lông sang nang lông khác, ở nang lông mới sự thụ tinh bắt đầu.Sự thụtinh xảy ra ở miệng nang lông Sau khi thụ tinh, con cái đào hang đến tuyếnbã và đẻ trứng ở đó [1]

3 Triệu chứng lâm sàng

Demodex có thể tồn tại trên da người khoẻ mạnh mà không có biểu

hiện lâm sàng, tuy nhiên sẽ gây bệnh khi chúng tập trung với số lượng lớnhoặc khi miễn suy giảm

Bệnh nhân viêm da do demodex thường đi khám với các triệu chứngnhư: Ngứa kèm theo đỏ da, vẩy da, mụn mủ ở nang lông, sẩn đỏ mụn mủ ở dađầu kèm theo rụng tóc từng đám Nhìn chung,bệnh có ba thể bệnh chính :

- Viêm nang lông dạng vẩy phấn (Pityriasis folliculitis, pityriasisfolliculorum)

- Viêm da Demodex giống dạng trứng cá đỏ (Rosacea like demodicidosis)

- Trứng cá đỏ thể u hạt (Granulomatous rosacea )

2.1 Viêm nang lông dạng vẩy phấn (pityriasis folliculitis, pityriasis folliculorum)

Viêm nang lông dạng vẩy phấn được mô tả đầu tiên bởi Aries năm

1930 xảy ra chủ yếu ở phụ nữ trung niên hoặc già hơn, những người này ít rửamặt, nhưng sử dụng nhiều kem trang điểm và kem tẩy

Biểu hiện bởi đỏ mặt lan toả và có vẩy ở nang lông hoặc da bị xậmmàu, nút sừng nhỏ ở nang lông làm cho da mặt lấm tấm như giấy ráp Cảmgiác chủ quan ngứa và cảm giác nóng bỏng, có cảm giác như kiến bò Cạo da

chứa lượng lớn Demodex spp.

Mô bệnh học: Xâm nhập viêm nhiều tế bào Lympho xung quanh cácmạch máu ở trung bì, không hình thành u hạt

2.2 Viêm da Demodex giống dạng trứng cá đỏ.(Rosacea –like Demodicidosis)

Bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng như sẩn và sẩn mụn mủ, đỏ da, cóvẩy giống như trứng cá nhưng có những đặc điểm riêng

- Bắt đầu đột ngột, tiến triển nhanh

- Có triệu chứng ngứa, rát, cảm giác như kiến bò trong bóng tối

- Đỏ da dai dẳng, nhạy cảm với ánh nắng

- Vẩy da ở nang lông

- Tổn thương là những sẩn mụn nước ( papulovesicle), mụn nước mụn mủ( vesicopustules ), đặc biệt không có nhân (noncomedon)

- Tổn thương không đối xứng, không có biểu hiện giãn mạch, thường có phốihợp viêm bờ mi ( demodectic blepharitis )

- Tiền sử thường dùng thuốc bôi chứa steroid

- Thường gặp trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch

Mô bệnh học: Thấy bạch cầu đơn nhân thâm nhập viêm xung quanhnang lông, đôi khi hình thành u hạt

2.3 Viêm da do Demodex dạng trứng cá đỏ thể u hạt (Granulomatous rosacea ) hay còn gọi (demodicidosis gravis )

Bệnh biểu hiện sẩn đỏ, mụn mủ, abces ăn sâu và ở một bên mặt, tồn tạidai dẳng, không đáp ứng với điều trị thông thường

Thể này thường phối với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (có haykhông có HIV)

Mô bệnh học: Thấy tổ chức u hạt bao gồm tế bào khổng lồ chứa dấu vết

của hiện tượng thực bào Demodex spp, có hoại tử ở trung tâm.

Ngoài ra VDDD có thể kèm theo rụng tóc và viêm bờ mi

- Viêm bờ mi ( blepharitis): Bệnh nhân có thể ngứa, nóng bỏng, đỏ bờ mi,

lông mi rụng, dày mi mắt, nhiều vẩy Thường viêm bờ mi do Demodex kết

hợp với bệnh da ở xung quanh mi mắt

- Rụng tóc: Thấy rụng tóc từng mảng, trên vùng rụng tóc thấy có sẩn đỏ, mụnmủ

3 Cận lâm sàng

Để xác định có nhiễm Demodex spp hay chẩn đoán VDDD có thể dùng

một trong các phương pháp sau:

- Sinh thiết chuẩn trên bề mặt da (standardized skin surface biopsy SSSB)

- Kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi (direct microscopic examination DME)

-Tìm Demodex spp ở vẩy da

- Sinh thiết toàn bộ lớp da

- Xác định Demodex spp bằng DNA.

- Xác định Demodex spp bằng máy soi da.

4.1 Sinh thiết chuẩn trên bề mặt da.

- Phương pháp này đơn giản không xâm lấn phương pháp này lấy lớpsừng và tìm vi sinh vật sống ở đó, bôi 1 giọt cyanoacrylic lên lam 1cm2 sau đó

áp lên bề mặt nang lông vùng da bị tổn thương, lấy lam nhẹ nhàng ra khỏi tổnthương da và làm khô, kiểm tra dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần

Hình 1.1 Sinh thiết bề mặt da tiêu chuẩn

(a) một giọt keo cyanoacrylic lên lam kính dàn ra 1cm2 rồi áp lam lên tổn

thương da (c,d) lấy lam kính nhẹ nhàng để khô.(e) D.Folliculorum ở nang

lông dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần

- Đánh giá kết quả

Nếu ≥ 5 con/cm2: Demodex spp là căn nguyên gây bệnh

Nếu < 5 con/cm2 : Demodex spp không phải căn nguyên gây bệnh.

- Ưu nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm: đọc kết quả nhanh, chính xác, có giá trị so sánh kết quả trước

và sau điều trị [10]

Nhược điểm:

+Đôi khi kết quả xét nghiệm âm tính giả

+ Đòi hỏi kỹ thuật trích thủ bệnh phẩm tốt

+Khó phát hiện được D.brevis vì D.brevis nằm sâu trong tuyến bã và

tuyến meibomian

+ Phải có loại cồn dính đặc biệt để dính 1 phần thượng bì và nang lông

mà không gây thương tổn da [11]

3.2 Kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi

- Lấy chất tiết từ tuyến bã bằng cách bóp chặt da vùng tổn thương muốnlấy bệnh phẩm bằng ngón cái và ngón trỏ, các bệnh phẩm lấy được chuyểnqua lam kính, trộn với 1 giọt glycerin và phủ 1 lá men, kiểm tra dưới kínhhiển vi với độ phóng đại 40

- Đánh giá kết quả

Nếu ≥ 5 con/cm2: Demodex spp là căn nguyên gây bệnh

Nếu < 5 con/cm2 : Demodex spp không phải căn nguyên gây bệnh [11].

Hình 1.2 Soi trực tiếp dưới kính hiển vi chất từ tuyến bã của bệnh

nhân

(a,b) phương pháp lấy mẫu: 1 cm2 da bị tổn thương bóp chặt giữa ngón

cái và ngón trỏ và sau đó dùng đầu cùn lấy chất tiết (c) D.Folliculorum dưới

kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần (không ở trong nang lông)

Phương pháp SSSB mô tả đầu tiên bởi Marks và Dawber vào năm1971[12], SSSB là một phương pháp không xâm lấn đơn giản được sử dụng

để nghiên cứu lớp sừng, các loại bệnh lý trong lớp này là mảng lớn của visinh vật ở lớp sừng Hai mươi hai năm sau vào năm 1993, SSSB 1 cm2 để đo

Demodex spp (Forton và Seys đổi tên nó thành SSSB) được công bố trên hai tạp chí Nghiên cứu Demodex spp với SSSB ở bệnh nhân bệnh trứng cá đỏ và người khỏe mạnh, các tác giả đề xuất 5 Demodex/cm2 như là ngưỡng tối ưu:

để đánh giá kết quả chẩn đoán với độ đặc hiệu cao (98%), kết quả dương tínhgiả (2%), nhưng độ nhạy tương đối thấp (55%) Năm 2005 tiêu chuẩn được

mở rộng ra được sử dụng để chẩn đoán bệnh nhân biểu hiện lâm sàng củaVDDD bằng bởi SSSB Năm 2003, Akilov và cộng sự cũng đã sử dụng

ngưỡng 5 Demodex /cm2 cho kỹ thuật DME trong các nghiên cứu của tác giả

Với SSSB, lấy được phần nông lớp sừng của nang lông và Demodex

sống ở đó Ngược lại DME, không thấy được các nang lông ( đặc điểm quan

trọng để phát hiện Demodex) Tuy nhiên, một số hạn chế của kỹ thuật SSSB

đã được báo cáo trong y văn Forton xác định rằng kỹ thuật SSSB không thích

hợp cho nghiên cứu tỷ lệ Demodex spp, vì SSSB thu thập mẫu da hạn chế cả

về diện tích bề mặt và độ sâu Hơn nữa, kết quả âm tính giả có thể xảy ra ở

những bệnh nhân với Demodex spp cao và ở những bệnh nhân dày sừng hoặc

da dầu SSSB chỉ được sử dụng một lần Kết quả âm tính giả SSSB phụ thuộcđộ dính của D với lam kính Khi lâm sàng điển hình SSSB sẽ được làm lại lầnhai cùng vị trí để xác định chắc chắn [11]

3.3 Tìm Demodex spp ở vẩy da.

- Dùng dao mổ tiệt trùng cạo vẩy da ỏ trên nang lông, cạo hơi sâu hơn

cạo nấm một chút để lấy được bề mặt của lớp sừng và một phần nang lông.

- Soi tìm Demodex spp dưới kính hiển vi Dùng vật kính 10X quan sát sơ bộ về hình thể, đếm số lượng và độ tập trung của Demodex spp Còn vật kính

20X, 40X nhận định rõ hình thể, cấu tạo của từng loại và từng giai đoạn

Hình 1.3 Demodex Folliculorum mite

Hình 1 4 Demodex Brevis mite

Tìm Demodex spp bằng cách cạo chất nhờn trên mặt cho vào KOH hoặc

sinh thiết rồi kiểm tra bằng kính hiển vi.

3.4 Sinh thiết toàn bộ lớp da.

Sinh thiết toàn bộ nang, nhuộm Hematoxilin-Eosine, Soi tìm Demodex spp dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần, tìm thấy Demodex spp ở nang

lông, xâm nhập viêm Lympho bào xung quanh mạch máu và trung bì nông[4] Phương pháp này ít được sử dụng

3.5 Xác định Demodex spp bằng DNA.

Dùng kỹ thuật real-Time PCR để phát DNA Demodex spp, sau đó khuếch đại, giải mã xác định loài Demodex [14].

3.6 Xác định Demodex spp bằng máy soi da.

Xác định Demodex spp bằng máy soi da là phương pháp chẩn đoán hình ảnh

ở thượng bì và trung bì nông không xâm lấn, nó phát hiện hiệu quả Demodex

spp và đo được mật độ của nó [15]