Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh nguyên phát

Tôi xin cam đoan đề tài: “Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh nguyên phát” là do tự bản thân

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Bác sĩ, tôi

xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS BSNT Vũ Thị Huyền giảng viên bộmôn Y sinh học - Di truyền, trường đại học Y Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn tôi

từ khi bắt đầu đến khi kết thúc quá trình nghiên cứu và làm khóa luận, đóng gópcho tôi những ý kiến quý báu hoàn thành bản khóa luận này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên bộmôn đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để tôihoàn thành khóa luận này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, ban Giám hiệu, phòng Quản lý đạihọc và bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường đại học Y Hà Nội đã tạo mọiđiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian hoàn thành nghiên cứu

Tôi cũng xin cám ơn hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp đã đóng gópnhững ý kiến quý báu để tôi hoàn thiện bản khóa luận

Nhân dịp này, tôi kính trọng tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha, mẹ tôi đãdành tất cả điều kiện để tôi được học tập, phấn đấu và trưởng thành trongcuộc sống và sự nghiệp

Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã dành cho tôi nhiều sự động viên và đóng góp

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Tạ Tiên Sinh

Tôi xin cam đoan đề tài: “Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh nguyên phát” là do tự bản thân tôi thực hiện Tất cả những

số liệu do chính tôi thu thập, kết quả trong luận văn này trung thực và chưa có

ai công bố trong bất kỳ một nghiên cứu nào khác

Tôi xin đảm bảo tính khách quan, trung thực của các số liệu và kết quả

xử lý số liệu trong nghiên cứu này

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Tạ Tiên Sinh

ADN Acid Deoxyribonucleic

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Vô sinh 3

1.1.1 Khái niệm vô sinh và lịch sử các nghiên cứu về vô sinh 3

1.1.2 Nguyên nhân vô sinh nam giới 4

1.2 Xenobiotic 6

1.2.1 Khái niệm xenobiotic và ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể 6

1.2.2 Quá trình biến đổi chung của xenobiotic 8

1.2.3 Gen chuyển hóa xenobiotic 11

1.3 PCR 17

1.3.1 Khái niệm và lịch sử phát triển của kỹ thuật PCR 17

1.3.2 Nguyên lý kỹ thuật PCR 18

1.3.3 Một số phương pháp PCR đặc hiệu 19

1.3.4 Phương pháp di truyền phân tử - kỹ thuật ARMS - PCR 21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 25

2.1.3 Số bệnh nhân và số mẫu 25

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2 Đạo đức trong nghiên cứu 29

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Đặc điểm tuổi của đối tượng nghiên cứu 30

3.2 Kết quả tách chiết và đo độ tinh sạch ADN 30

3.3 Kết quả phương pháp ARMS - PCR 31

3.3.2 Kết quả nghiên cứu đột biến CYP1A1 A2455G sử dụng kỹ thuật

ARMS - PCR 323.3.3 Kết quả nghiên cứu đột biến GSTP1 C341T sử dụng kỹ thuật

ARMS - PCR 333.3.4 Kết quả nghiên cứu đột biến GSTP1 G313A sử dụng kỹ thuật

ARMS - PCR 343.3.5 Kết quả nghiên cứu đột biến NAT2 C481T sử dụng kỹ thuật

ARMS - PCR 343.3.6 Kết quả nghiên cứu đột biến NAT2 G590A sử dụng kỹ thuật

ARMS - PCR 353.3.7 Kết quả nghiên cứu đột biến CYP1A1 A2455G, GSTP1 G313A,

GSTP1 C341T, NAT2 C481T, NAT2 G590A của nhóm bệnh 36Chương 4: BÀN LUẬN 384.1 Đặc điểm sinh học của nhóm đối tượng nghiên cứu 384.2 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi ở các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 394.2.1 Tách chiết ADN 404.2.2 Tiến hành PCR theo phương pháp ARMS và điện di đọc kết quả 41KẾT LUẬN 47KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 48TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Một số đột biến của CYP1A1 13Bảng 1.2 Một số đột biến của GSTP1 15Bảng 1.3 Một số đột biến của NAT2 17Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi của các polymorphism CYP1A1 (Ile462Val),

NAT2 (Leu161Leu), GSTP1(Ile105Val và Ala114Val) 28Bảng 2.2 Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR 28Bảng 3.1 Đặc điểm độ tuổi của đối tượng nghiên cứu và nhóm chứng 30Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ tinh sạch ADN theo phương pháp Phenol/

Chloroform 30Bảng 3.3 Kết quả đo nồng độ tinh sạch ADN theo phương pháp ADN-

express 31Bảng 3.4 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen CYP1A1

A2455G sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 32Bảng 3.5 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen GSTP1

C341T sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 33Bảng 3.6 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen GSTP1

G313A sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 34Bảng 3.7 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen NAT2

C481T sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 34Bảng 3.8 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen NAT2

G590A sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 35Bảng 3.9 Kết quả nghiên cứu đột biến gen CYP1A1 A2455G, GSTP1 G313A,

GSTP1 C341T, NAT2 C481T, NAT2 G590A của nhóm bệnh 36Bảng 4.1 So sánh một số ưu nhược điểm hai phương pháp tách ADN 41Bảng 4.2 Thành phần 1 mẫu PCR theo khuyến nghị của nhà sản xuất 41

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa xenobiotic 10

Hình 1.2 Vị trí gen CYP1A1 trên NST 15 12

Hình 1.3 Vị trí gen GSTP1 trên NST 11 14

Hình 1.4 Vị trí gen NAT2 trên NST 8 16

Hình 1.5 Chu trình 3 giai đoạn PCR 19

Hình 1.6 Sơ đồ kỹ thuật ARMS - PCR 22

Hình 1.7 Mẫu kết quả chạy điện di kỹ thuật ARMS - PCR 22

Hình 3.1 Kết quả chạy điện di GSTP1 Ile105Val sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh hiện nay là một vấn đề cần được quan tâm nhiều hơn tại ViệtNam cũng như trên thế giới Vô sinh không chỉ ảnh hưởng tới chất lượngcuộc sống mà còn làm tăng tần suất của những cuộc ly hôn Hiện nay vô sinhkhông còn là vấn đề riêng của nữ giới Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO),trong các cặp vợ chồng ở độ tuổi sinh sản gặp vấn đề về sinh con thì 30 - 40%

do nam giới và 10% là do cả 2 giới, 40% do nữ giới và khoảng 10% không rõnguyên nhân [1] Tại các nước Tây Âu, tỷ lệ vô sinh dẫn đến ly hôn chiếm15%, trong đó nguyên nhân do nam giới chiếm hơn 50% Từ đó vô sinh nam

đã được nghiên cứu một cách sâu sắc và toàn diện hơn

Cơ thể chúng ta là một hệ thống mở luôn tiếp nhận các chất từ môitrường tự nhiên: thức ăn, thuốc, hóa chất,… Xenobiotic là các chất hóa học lạđối với cơ thể, nó có thể có những ảnh hưởng tốt đối với cơ thể trong quátrình chống lại các tác nhân lạ (ứng dụng của thuốc trong điều trị các bệnh lýnội ngoại khoa) song bên cạnh đó nó cũng có những tác dụng không tốt cho

cơ thể (hóa chất độc hại, thuốc lá, rượu,…), trong đó có rất nhiều chất có khảnăng gây vô sinh Nhiệm vụ của cơ thể là chuyển hóa các chất độc hại và đàothải chúng, giúp cơ thể có được sự cân bằng trong các hoạt động sống và sinhsản Trong quá trình chuyển hóa xenobiotic, CYP1A1 là gen có vai trò thenchốt, tham gia mã hóa enzym liên quan đến biến đổi nhóm hoạt tính củaxenobiotic trong giai đoạn I của chu trình; GSTP1 và NAT2 là hai gen giữ vaitrò mã hóa hai enzym tham gia biến đổi xenobiotic giai đoạn II, biến đổithành các chất dễ dàng thải trừ ra ngoài môi trường Vì vậy việc nghiên cứuảnh hưởng của đột biến những gen này gây nên vô sinh ở nam giới cũng đãđược tiến hành trên nhiều quốc gia Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện chưa có mộtcông trình nghiên cứu nào

PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử giúp chẩn đoán nhanh và rất hữu hiệuđối với các bệnh phân tử Việc thực hiện kỹ thuật ARMS - PCR trong việcnghiên cứu các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 để xác định các biến đổi của cácgen đó ở nam giới vô sinh chưa có một nghiên cứu nào được tiến hành tại ViệtNam Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:

“Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh nguyên phát”

Đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu sau:

1 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật ARMS - PCR để xác định những biến đổi

ở các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 ở nam giới vô sinh nguyên phát.

2 Mô tả một số biến đổi của các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 ở nam giới vô sinh nguyên phát.

Chương 1TỔNG QUAN

Vô sinh được phân thành hai nhóm: vô sinh nguyên phát và vô sinh thứphát Vô sinh nguyên phát là khi người nam hay nữ này chưa từng có con lầnnào Vô sinh thứ phát là trong tiền sử của người nam hoặc nữ này đã từng có con

ít nhất một lần nhưng sau đó không thể có con dù quan hệ tình dục bình thườngtrong vòng 12 tháng mà không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào

Vô sinh nam là vô sinh mà nguyên nhân không có con bắt nguồn từngười nam giới, do chức năng sinh sản của người nam giới không được đảmbảo như người bình thường, cần có sự can thiệp của y tế

1.1.1.2 Lịch sử nghiên cứu về vô sinh

Theo ước tính của WHO (1991), trên thế giới có khoảng 12,15% cặp vợchồng vô sinh tương đương 50 - 80 triệu người [3]

Năm 2003, nghiên cứu của Krauz và cộng sự cũng kết luận nguyên nhângây vô sinh nam giới khoảng 50%, trong đó khoảng 40 - 50% những nam giớinày có bất thường về số lượng và chất lượng tinh trùng [4]

Tại Ả Rập, năm 2006, Ali Hellani tiến hành nghiên cứu và cũng chorằng, khoảng 10 - 15% cặp vợ chồng vô sinh, trong đó nguyên nhân do namgiới chiếm 50% [5]

Tại Singapore năm 2009, Poongothai J và cộng sự tiến hành nghiên cứucũng cho rằng khoảng 15% cặp vợ chồng vô sinh, trong đó nguyên nhân donam giới chiếm 50% [6].

Đến năm 2010, WHO công bố số liệu mới, cho rằng 8 - 10% cặp vợchồng vô sinh trong đó 35% do vợ, 30% do chồng, 25% do cả hai, 10% chưa

rõ nguyên nhân [7]

Như vậy, theo các nghiên cứu trên, tỷ lệ các cặp vợ chồng vô sinh chiếm

từ 10 - 20%, trong đó nguyên nhân do nam giới chiếm khoảng 50%

Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam

Theo Ngô Gia Hy (2000), trong các cặp vợ chồng vô sinh, nguyên nhân

do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cả hai chiếm tỷ lệ 10% [8].Theo Trần Thị Trung Chiến và cộng sự (2002), tỷ lệ vô sinh chiếm 5%,trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [9]

Theo Trần Quán Anh (2009) tỷ lệ vô sinh chiếm 15%, và tỉ lệ này đang

có chiều hướng tăng mạnh Trong đó vô sinh nam chiếm trên 50% [10]

Theo Trần Đức Phấn (2010) trong số các cặp vợ chồng vô sinh có 44%

có tinh dịch đồ bất thường [11]

Báo cáo của Nguyễn Viết Tiến tại Hội thảo quốc tế “Cập nhật về hỗ trợsinh sản” (2013) tại Hà Nội cho thấy tỷ lệ vô sinh ở Việt Nam là 7,7% Trong

đó nguyên nhân do nam giới chiếm 25 - 40% [12]

Như vậy, tại Việt Nam, tỷ lệ vô sinh khác nhau giữa các nghiên cứu,song đều chỉ ra rằng nguyên nhân bắt nguồn từ nam giới khoảng 40 - 50%

1.1.2 Nguyên nhân vô sinh nam giới

Vô sinh nam do nhiều nguyên nhân gây nên, trong đó có hai nhómnguyên nhân chính là nhóm nguyên nhân do di truyền và nhóm nguyên nhânkhông phải do di truyền

1.1.2.1 Nhóm nguyên nhân do di truyền

Bao gồm những nguyên nhân bất thường trong NST gây mất chức năngsinh sản có từ thời kì bào thai NST bị đột biến có thể là NST thường hoặcNST giới tính Một số bệnh lý thường gặp trong nhóm nguyên nhân này:

- Hội chứng Klinefelter: một người đàn ông có hai NST X và một NST

Y thay vì một NST X và một NST Y (47,XXY) Đây là nguyên nhân hàngđầu gây vô sinh ở nam giới, chiếm tỷ lệ từ 1/500 đến 1/1000 trẻ trai được sinh

ra [13] Điều này gây ra sự phát triển bất thường của tinh hoàn, dẫn đếntestosteron thấp hoặc không có, từ đó gây bất thường tới sự sản sinh tinhtrùng, dẫn đến giảm cả số lượng và chất lượng tinh trùng

- Hội chứng Down: trẻ mới sinh có bộ NST 46,XY,+21, hay còn gọi làtrisomy 21 Trẻ mắc hội chứng Down thường có những bất thường về thể chất

và tâm thần, trong đó thường không có khả năng sinh sản [14]

- Đột biến gen trên NST X: Gen AR là gen thụ thể của androgen, thuộcnhánh dài NST X Nếu gen này bị đột biến sẽ dẫn đến mất một phần hay toàn

bộ thụ thể androgen gây hội chứng kháng androgen trên lâm sàng, gây ảnhhưởng tới việc sản xuất tinh trùng nhưng không gây dị tật bộ phận sinh dục,

từ đó ảnh hưởng trực tiếp tới chức năng sinh sản của nam giới [15]

- Đột biến gen trên NST Y: AZF là một đoạn ở nhánh dài của NST Y(Yq11) Người có đột biến gen này thường có số lượng tinh trùng bị giảm nặnghoặc không tạo được tinh trùng, chính là nguyên nhân gây vô sinh [16]

- Đột biến gen trên NST thường: Gen UBE2I được tìm thấy trên nhánhngắn NST số 16 Nam giới bị đột biến gen này ảnh hưởng tới chức năng củathụ thể androgen, làm giảm sự sản sinh tinh trùng và gây nên vô sinh [17].Gen CFTR được tìm thấy trên nhánh dài của NST số 7 Nam giới bị bệnh này

sẽ không có ống dẫn tinh hoặc tắc ống dẫn tinh, dẫn đến không có tinh trùngtrong tinh dịch [18]

- Sự đứt gãy ADN ở tinh trùng: Những tinh trùng bị đứt gãy ADN dẫn tớichất lượng tinh trùng giảm sút, giảm khả năng thụ tinh, tăng nguy cơ sẩy thai.

1.1.2.2 Nhóm nguyên nhân không phải do di truyền

Một số nguyên nhân trong nhóm này như các yếu tố sinh hóa, nội tiết tố,

và các yếu tố môi trường

+ Các yếu tố sinh hóa: quá trình sản xuất tinh trùng cần một số nguyênliệu như kẽm, fructose, acid citric, ion calci… Fructose là nguồn dinh dưỡng

và năng lượng chính của tinh trùng Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự suygiảm nồng độ fructose trong tinh dịch có liên quan đáng kể tới các bất thường

về số lượng, cấu trúc và chức năng tinh trùng [19]

+ Nội tiết tố: nội tiết tố ảnh hưởng tới quá trình sản xuất tinh trùng gồm

3 chất chủ yếu FSH, LH và testosteron Sự điều hòa 3 chất này đảm bảo choquá trình sản xuất tinh trùng diễn ra bình thường Khi có bất thường trong hệtrục dưới đồi - tuyến yên - tinh hoàn gây nên sự bất thường trong nồng độ 3chất này, từ đó làm rối loạn quá trình sản xuất tinh trùng [20]

+ Các yếu tố môi trường: hóa chất độc hại, các chất kích thích, nhiệt độkhông thích hợp, kim loại nặng… không chỉ ảnh hưởng tới chuyển hóa vậtchất và năng lượng nói chung mà còn là nguyên nhân gây suy giảm sản xuấttinh trùng cả về số lượng và chất lượng [21]

1.2 Xenobiotic

1.2.1 Khái niệm xenobiotic và ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể

1.2.1.1 Khái niệm

Xenobiotic là những chất hóa học lạ so với cơ thể sinh vật, là những chất

mà cơ thể sinh vật không tự sản xuất ra Các chất này gồm: chất có nguồn gốcthực vật, dược phẩm, thuốc trừ sâu, mỹ phẩm, hương liệu, nước hoa, phụ giathực phẩm, hóa chất công nghiệp và chất gây ô nhiễm môi trường [22]…

Khi xenobiotic xâm nhập vào cơ thể con người, nó sẽ được chuyển hóa

và đào thải ra ngoài Nếu quá trình chuyển hóa đó diễn ra không theo đúngtrình tự của cơ thể (do đột biến các gen mã hóa enzym tham gia chuyển hóaxenobiotic), xenobiotic sẽ là các chất độc và sinh ra các gốc tự do, các gốc tự

do đó sẽ tích tụ lại và tiếp tục gây nên các đột biến khác của cơ thể hoặc ảnhhưởng trực tiếp tới chức năng cơ quan, qua đó gây nên bệnh tật

1.2.1.2 Ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể

+ Dioxin: Đây là một chất được xếp vào loại cực độc Việc đốt cháy túinilon từ các hoạt động của con người là một trong các nguồn phát sinh chủyếu của dioxin Đây là chất ít tan trong nước, tồn tại trong đất, qua đó xâmnhiễm qua con đường thực phẩm, vào thực vật, tôm cá, rau quả và cuối cùngđược con người hấp thu Ngoài ra, dioxin cũng có thể gây ngộ độc trực tiếpqua hô hấp, qua da do tiếp xúc hoặc qua nước uống Nếu liều lượng cao,dioxin có thể gây độc cấp tính, nếu liều lượng thấp có thể gây độc mạn tính vàung thư, ảnh hưởng tới chức năng của hệ nội tiết và sinh sản [21]

+ Thuốc lá: Các chất độc từ thuốc lá không chỉ ảnh hưởng đến người hút

mà còn gây nguy hại với những người vô tình hít phải khói thuốc, nhất là phụ

nữ và trẻ em Thành phần khói thuốc lá rất phức tạp, có tới hơn 4000 hợp chấttrong đó 200 loại hóa chất có hại cho sức khỏe và 40 chất có thể gây ung thư(benzopyren, các nitrosamin) Việc hút thuốc làm giảm đáng kể nồng độ củanội tiết tố và các thông số tinh dịch, đó là khuyến cáo cho rằng những ngườiđàn ông đang điều trị vô sinh nên ngừng hút thuốc để tăng cơ hội có con [23].+ Rượu: Quá trình chuyển hóa của rượu trong cơ thể sinh ra acetaldehyd.Đây là chất gây biến dị tế bào sinh dưỡng và tế bào sinh dục Sau thời giannghiện rượu mãn tính, nồng độ acetaldehyd trong máu cao sẽ làm tăng nguy

cơ gây ung thư gan và các tổ chức khác trong cơ thể bởi khả năng làm độtbiến ADN Việc sử dụng rượu mãn tính là một nguyên nhân gây giảm số lượng

và chất lượng tinh trùng [24]

+ Thuốc trừ sâu: thuốc trừ sâu (hay thuốc bảo vệ thực vật) là loại hóachất con người sản xuất ra để trừ sâu bệnh và cỏ dại cho cây trồng Một sốchất như DDT (hydrocarbon clo hữu cơ) gây ảnh hưởng tới cơ thể sinh vậtbằng cách phá vỡ sự cân bằng Natri/Kali của các sợi thần kinh, khiến các dâythần kinh hoạt động truyền tải liên tục, gây ảnh hưởng tới chức năng thầnkinh Các chất thuộc nhóm carbamat hoạt động gây ức chế enzymacetylcholinesterase khiến acetylcholin hoạt động liên tục mà không bị phânhủy và gây ra các bệnh yếu hoặc liệt Nhóm hóa chất diệt cỏ acid benzoic lại

có chức năng tương tự như các hormon tăng trưởng khiến tế bào phân chiakhông bình thường, gây ra các đột biến Nhóm người tiếp xúc thường xuyênvới các hóa chất diệt cỏ có nguy cơ bị đột biến và vô sinh cao [25]

+ Dược phẩm: dược phẩm là những chất được chế tạo mà khi được hít,tiêm, uống, bôi… sẽ được hấp thu vào cơ thể và gây thay đổi sinh lý học Một

số chức năng của dược phẩm như các chất hướng thần (nicotin, cafein…) ảnhhưởng đến chức năng hệ thần kinh trung ương, làm thay đổi nhận thức, tâm

lý, ý thức; các kháng sinh (penicillin, chloramphenicol…) khi được hấp thu sẽ cótác dụng giúp cơ thể chống lại các sinh vật xâm nhập vào cơ thể; các hóa chấtchống ung thư (cisplastin, 5-fluo-uracin…) xâm nhập vào các tế bào ung thư vàtiêu diệt Bên cạnh tác dụng trợ giúp cơ thể chống lại bệnh tật, dược phẩm còngây ra các tác dụng không mong muốn ảnh hưởng không tốt tới cơ thể như phụthuộc (hay nghiện) thuốc (các thuốc giảm đau nhóm opioid: morphin và các dẫnxuất), giảm tác dụng dược lý (các kháng sinh)… và đặc biệt các thuốc nhóm hóachất chống ung thư có thể ảnh hưởng tới chức năng sinh sản [26]

1.2.2 Quá trình biến đổi chung của xenobiotic

1.2.2.1 Hấp thu

Xenobiotic xâm nhập cơ thể qua đường tiêu hóa, hô hấp, da-niêm mạc,tiêm truyền, trong đó đường tiêu hóa là chủ yếu

Quá trình hấp thu phụ thuộc vào cấu trúc của tổ chức, pH môi trường nơixenobiotic xâm nhập, cấu tạo của xenobiotic…

Cơ chế hấp thu chủ yếu theo qui luật vật lý, vận chuyển theo gradient(bậc thang) nồng độ, từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp

Đối với thuốc: Khả năng hấp thu được đặc trưng bởi đại lượng sinh khảdụng Đó là tỷ lệ thuốc xâm nhập hệ tuần hoàn so với lượng đưa vào.

1.2.2.2 Phân bố

Sau khi xâm nhập cơ thể, xenobiotic được phân bố ở các tổ chức khácnhau, tùy thuộc tính chất hóa học, tính tan của mỗi chất Các chất ít tan trongnước, ưa lipid như chloroform, hexobarbital sẽ phân bố nhiều vào mô mỡ, cơquan nhiều lipid như tổ chức thần kinh

Trong huyết tương, 1 phần xenobiotic gắn với protein huyết tương (chủyếu là với albumin) Đặc điểm của sự gắn xenobiotic với protein:

+ Chất nào càng ít tan trong nước thì gắn với protein huyết tương càngnhiều

+ Có sự cân bằng động giữa phần tự do và phần gắn với protein

Xenobiotic + Protein huyết tương  Xenobiotic-protein

Quá trình chuyển hóa thường gồm 2 giai đoạn (phase):

RH + O2 + NADPH+ H+ ROH + NADP+ + H2O

Các enzym tham gia phản ứng giai đoạn I rất đa dạng và phong phú Baogồm hệ thống enzym oxidase, reductase, và hydrolysis, trong đó hệ thốngcytochrom P450 monooxygenase (CYP450) giữ vai trò oxidase cácxenobiotic CYP1A1 là một gen mã hóa enzym trong họ CYP450

+ Giai đoạn II:

Trong các phản ứng tiếp theo giai đoạn II, các chất chuyển hóa otic được chia thành các nhóm: glutathion (GSH), sulfat, glycin, hoặc acidglucuronic Các loại phản ứng liên hợp xảy ra bao gồm carboxyl (-COOH), hydroxyl (-OH), amino (-NH2) và nhóm sulfhydryl (-SH) Sản phẩmcủa các phản ứng liên hợp ít phân cực hơn so với ban đầu, không giống nhưphản ứng giai đoạn I thường tạo ra các chất hoạt động hóa học Việc bổ sungcác nhóm anion lớn (như GSH) giải độc các ion phản ứng và sản sinh ra nhiềuchất chuyển hóa phân cực mà không thể khuếch tán qua màng, và có thể phảithông qua cơ chế vận chuyển tích cực.

xenobi-Những phản ứng này được xúc tác bởi một nhóm lớn các transferaseđặc trưng, mà khi kết hợp có thể chuyển hóa gần như bất kỳ hợp chất kỵnước nào [27] Một trong các emzym quan trọng nhất của nhóm này làglutathione S-transferase (GST, GSTP1 là một gen mã hóa enzym trong họGST) và N-acetyltransferase 2 (NAT2)

1.2.2.4 Thải trừ

Sau khi phản ứng giai đoạn II, các hợp chất xenobiotic có thể đượcchuyển hóa hơn nữa Một ví dụ phổ biến là việc xử lý hợp chất glutathion đểacetylcystein (acid mercapturic) liên hợp [28]

Con đường thải trừ chủ yếu của cơ thể là qua nước tiểu, còn lại một phầnqua phân, mồ hôi, hơi thở…

Đa số các xenobiotic sau khi được chuyển thành các dẫn xuất tan trongnước, được đào thải ra nước tiểu Một số chất có phân tử lượng lớn, ít tantrong nước, được gan đào thải qua mật, xuống ruột rồi ra ngoài theo phân

Sự thải trừ được đặc trưng bởi đại lượng “thời gian bán thải” (T1/2) làthời gian để thải một nửa lượng chất so với ban đầu

Mức độ thải trừ phụ thuộc nhiều vào chức năng thận Khi thận suy, làmgiảm thải trừ, tăng độc tính

1.2.3 Gen chuyển hóa xenobiotic

1.2.3.1 CYP1A1

Gen CYP1A1 mã hóa 1 enzym là thành viên của họ các enzym CYP450.CYP450 là monooxygenase, thường thấy trong microsom của gan, enzym nàyliên quan đến con đường vận chuyển điện tử NADPH Gen CYP1A1 nằm trênnhánh dài của NST số 15 gồm 6069 cặp base, tại vùng 2 băng 4 băng phụ 1(15q24.1) Chức năng của CYP450 trong chuyển hóa oxy hóa các hợp chấtbao gồm steroid, các acid béo, và xenobiotic [29]

Nguồn: http://www.genecards.org/

Hình 1.2 Vị trí gen CYP1A1 trên NST 15

Bảng 1.1 Một số đột biến của CYP1A1

ra sự biến đổi acid amin Isoleucin thành Valin ở vị trí 462 trên exon 7 [30].

Trong nghiên cứu của mình, Fritsche E và cộng sự (1998) đã chỉ rarằng một đột biến xảy ra ở exon 7 gây ra sự biến đổi acid amin Ile thành Valgây ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa xenobiotic, tỷ lệ bị mắc vô sinhtrong nhóm mang đột biến này cao hơn so với nhóm chứng (OR = 2,4;95%CI = 0,83 - 6,95) [31] Aydos S.E và cộng sự (2009) cũng đã chỉ rarằng đột biến này gắn với đột biến gen GSTM1 làm tăng nguy cơ vô sinh lên6,9 lần so với nhóm chứng (95%CI = 2,29 - 19,3) [32]

Luo H và cộng sự (2014) đã chứng minh được rằng đột biến genCYP1A1 làm tăng nguy cơ vô sinh nam [33]

1.2.3.2 GSTs và GSTP1

Glutathione S-transferases (GSTs), gồm các enzym tham gia vào giaiđoạn II của quá trình chuyển hóa xenobiotic, xúc tác cho sự liên hợpglutathion (GSH) với mục đích giải độc Các GSTs bao gồm ba họ: cáccytosolic, mitochondrial, ADN microsomal - còn gọi là MAPEG-protein [34].Các thành viên của GSTs cực kỳ đa dạng trong chuỗi acid amin, và một phầnlớn các chức năng không rõ [35]

GSTP1 (Glutathion S transferase pi 1) là 1 gen thành viên của họ GSTs.Gen nằm trên nhánh dài của NST số 11 gồm 3066 cặp base, tại vùng 1 băng 3băng phụ 3 (11q13.3) GSTP1 mã hóa enzym đóng vai trò quan trọng trong giảiđộc bằng xúc tác cho sự tiếp hợp của nhiều hợp chất kỵ nước và lực điện tử vớiglutathion, tham gia hoạt động trong quá trình chuyển hóa xenobiotic [36]

AGLUTATHIONE S - TRANSFERASE, TYPE

GLUTATHIONE S - TRANSFERASE, TYPE

C

GSTP1, Ile105Val vàAla114Val

Nguồn: Ali – Osman et al (1997)

Theo nghiên cứu của Ali - Osman và cộng sự (1997), các đột biếnthường gặp của GSTP1 xảy ra tại hai vị trí là G313A trên exon 5 (đột biếnthay đổi acid amin Isoleucin thành Valin) và C341T trên exon 6 (đột biếnthay đổi acid amin Alalin thành Valin) Và theo nhóm đột biến như vậy sẽ có

3 type tương ứng: type A - đột biến tại vị trí C341T; type B - đột biến tại vị tríG313A; và type C - đột biến tại cả hai vị trí G313A và C341T [37]

Yarosh S.L và cộng sự (2015) đã khẳng định sự đa hình trong genGSTM1, GSTT1 và GSTP1 (G313A) làm tăng nguy cơ vô sinh nam lên 1,5 lần(95%CI = 1,02 - 2,20; p = 0,04), nguy cơ này tăng lên bởi hút thuốc lá [38].Khi tiến hành nghiên cứu đa hình trong nhóm gen GSTs, Xiong D.K vàcộng sự (2015) kết luận sự đa hình trong các đột biến GSTP1 vị trí G313Alàm phát triển các yếu tố nguy cơ vô sinh nam ở nam giới Tứ Xuyên, TâyNam Trung Quốc (OR = 1,53; 95%CI = 1,11 - 2,11; p = 0.009) [39]

1.2.3.3 NAT và NAT2

Các gen nhóm NAT (N-acetyltransferase) gồm có NAT1 và NAT2, mãhóa enzym có chức năng acetyl trong quá trình chuyển hóa các xenobiotic.NAT2 mã hóa enzym có hoạt động acetyl hóa cao Các N-acetyltransferasestham gia vào giai đoạn II của quá trình chuyển hóa xenobiotic, mà hoạt độngcủa nó là acetyl sulfamethazine (kháng sinh), song với acid amino benzoic thìkhông chuyển hóa được tất cả [40]

NAT2: Gen NAT2 nằm trên nhánh ngắn của NST số 8 gồm 9974 cặpbase, tại vùng 2 băng 2 (8p22) Gen này mã hóa enzym có chức năng acetylhoá xenobiotic tham gia cùng với các glutathione S-transferase trong chuyểnhóa xenobiotic ở giai đoạn II [41].

Nguồn: http://www.genecards.org/

Hình 1.4 Vị trí gen NAT2 trên NST 8 Bảng 1.3 Một số đột biến của NAT2

Acetyl hóa chậm NAT2, Arg197Gln

Nguồn: Cascorbi I et al (1996), Delomenie C et al (1996), Magalon H et al (2008)

Theo Cascorbi I (1996), Delomenie C (1996), Magalon H (2008) đãcùng chỉ ra rằng vai trò của NAT2 là tham gia acetyl hóa các xenobiotic trong giaiđoạn II của quá trình chuyển hóa, và các đột biến hay gặp ở gen này đều làm choquá trình acetyl hóa bị chậm lại, do đó gây nên sự tích tụ các chất độc hại trong cơthể là nguyên nhân sinh ra một số bệnh di truyền trong đó có vô sinh [42],[43],[44]

Một đột biến điển hình hay gặp của NAT2 xảy ra tại vị trí G590A gâythay đổi acid amin trong quá trình dịch mã Arg197Gln được Yarosh và cộng

sự (2014) nghiên cứu, đột biến gây ra tính nhạy cảm đến vô sinh nam, vànguy cơ này được tăng cường ở nhóm có sự tiếp xúc với các chất oxy hóanhư: khói thuốc lá (OR = 1,71; 95%CI = 1,02 - 2,87; p = 0,042), lạm dụngrượu (OR = 2,14; 95%CI = 1,08 - 4,27; p = 0,029), lượng thức ăn ít chất xơ(OR = 1,68; 95%CI = 1,01 - 2,79, p = 0,04) [45]

1.3 PCR

1.3.1 Khái niệm và lịch sử phát triển của kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction được dịch là chuỗitrùng hợp hay phản ứng khuếch đại chuỗi gen PCR là một kỹ thuật nhằmkhuếch đại một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật như E.Coli haynấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ

nhiều mục đích khác nhau, như xác định bệnh di truyền, nhận dạng, chẩnđoán các bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống [46].

+ Giai đoạn 2 - Gắn mồi: hạ nhiệt độ xuống 52oC Ở nhiệt độ này haiđoạn mồi (Forward primer và Reverse premer) sẽ cặp đôi với hai sợi ADNtheo hướng 5’-3’ Giai đoạn này thường từ 30 giây đến 1 phút

+ Giai đoạn 3 - Tổng hợp ADN: nâng nhiệt độ lên 72oC Ở nhiệt độ nàyADN Taq polymerase hoạt động để kéo dài các mạch ADN Nguyên liệu ởđây là 4 loại nucleotid A, T, G, C (dNTP) Thời gian tùy thuộc vào độ dài củatrình tự ADN, thường từ 30 giây đến nhiều phút

+ Cứ sau mỗi chu kì gồm ba giai đoạn như trên, một ADN khuôn nhânthành hai Sau 30 chu kì thì từ một phân tử ADN khuôn ban đầu có thể tạo ra

số lượng ADN gấp 230 lần

Toàn bộ quá trình trên được thực hiện nhờ máy luân nhiệt tự động

thường được dùng để tạo ra thư viện cADN (complementary ADN) lớn từmột lượng rất nhỏ mARN, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đahình dựa vào trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mật

độ phân tử gen Ngoài ra, RT - PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa làchúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh virus ARN

+ Real time PCR: là một phương pháp khuếch đại gen và đọc kết quảđược thực hiện trong một ống hay một giếng mẫu Phương pháp này đòi hỏiphải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị phát huỳnh quang từ mộtgiếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép xử lý kết quả, xácđịnh độ biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.+ Multiplex PCR: là kỹ thuật PCR sử dụng các phản ứng chuỗipolymerase để khuếch đại một số trình tự ADN khác nhau cùng một lúc (nhưnếu thực hiện nhiều phản ứng PCR riêng biệt trong cùng một phản ứng) Quátrình này khuếch đại ADN trong các mẫu sử dụng nhiều mồi và một ADNpolymerase nhiệt độ trung gian trong một chu trình nhiệt Thiết kế mồi cho tất

cả các cặp mồi đã được tối ưu hóa để tất cả các cặp mồi có thể làm việc ởcùng nhiệt độ ủ trong PCR

+ Nested PCR: là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặpmồi của PCR được dùng để khuếch đại đoạn ADN Phản ứng Nested PCRphải được thực hiện hai lần Lần đầu phản ứng được thực hiện trong 15 đến

30 chu kỳ, với cặp mồi thứ nhất, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạngen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần một Sản phẩmPCR lần một sau đó sẽ làm mẫu cho lần hai, cặp mồi thứ hai sẽ bắt cặp phíatrong sản phẩm của PCR lần một, và khuếch đại đoạn gen cần xác định

+ RFLP - PCR (Restriction Fragment Length Polymorphisms - PCR):

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân

đoạn ADN dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE).Khi ủ ADN với enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp và ở pH, nhiệt độthích hợp sẽ tạo ra những phân đoạn ADN với kích thước khác nhau, từ đólập nên các bản đồ gen Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên 80đến nay.

1.3.4 Phương pháp di truyền phân tử - kỹ thuật ARMS - PCR

ARMS - PCR (amplification refractory mutation system - PCR): là kỹthuật để phát hiện các đột biến điểm được biết đến và mô tả lần đầu tiên bởiNewton C.R [47]

1.3.4.1 Khái niệm về kỹ thuật ARMS - PCR

Kỹ thuật ARMS - PCR dựa trên nguyên tắc của alen mồi cụ thể của quátrình PCR, tức là một mồi cụ thể sẽ chỉ cho phép quá trình khuếch đại diễn rakhi nó được bắt cặp đặc hiệu với alen đột biến

1.3.4.2 Nguyên lý kỹ thuật ARMS - PCR

ARMS - PCR là kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến Nguyên lýcủa kỹ thuật là dựa vào đặc tính của Taq ADN polymerase chỉ khuếch đạihoàn chỉnh 1 phân tử ADN một khi đầu 3’ của mồi và sợi khuôn bổ sung hoàntoàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn, phản ứng bị

ức chế hoàn toàn

Nguồn: http://cf.eqascheme.org/info/public/cf/assayarms.xhtml

Hình 1.6 Sơ đồ kỹ thuật ARMS - PCR

Sau khi tiến hành kỹ thuật ARMS - PCR, sản phẩm thu được tiếp tục được tiến hành chạy điện di và so sánh kết quả với mẫu

Nguồn: http://www.lytech.ru

Hình 1.7 Mẫu kết quả chạy điện di kỹ thuật ARMS - PCR

Kết quả hình ảnh điện di cho thấy nếu vạch sáng xuất hiện ở cả mồi bìnhthường (Normal) và mồi đột biến (Permutation) thì kết quả dị hợp tử đột biến,nếu kết quả xuất hiện vạch sáng chỉ ở mồi đột biến thì kết quả là đồng hợp tửđột biến, nếu kết quả vạch sáng chỉ ở mồi bình thường thì kết quả là không cóđột biến Đối với những kết quả cho không phù hợp về độ sáng của vạch (kếtquả số 4 trên mẫu permutation) hay không cho kết quả (kết quả số 5) chúng tacần kiểm tra lại nồng độ ADN và các bước trong quy trình kỹ thuật và thựchiện lại đối với những mẫu này.

1.3.4.3 Một số nghiên cứu áp dụng kỹ thuật ARMS - PCR trong chẩn đoán các đột biến nucleotid đặc hiệu

ARMS - PCR là một kỹ thuật PCR hiện đại Kỹ thuật này có tính chấtđặc hiệu cho các đột biến xảy ra trên một nucleotid và là một kỹ thuật được ápdụng rộng rãi trong các nghiên cứu trên thế giới

Laczmanski L và cộng sự (2013) sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR nhưmột thử nghiệm kiểm định sự chính xác của kỹ thuật minisequensing trongnghiên cứu đột biến yếu tố V (G1691A) liên quan tới quá trình đông máu và

sự phát triển bệnh thrombophilia [48]

Interferon gamma (IFN-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thông) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thôngqua receptor của nó và đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của bệnh viêmnhư viêm nha chu mãn tính Nghiên cứu về mối liên quan giữa đột biến của genIFN-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thông (A874T) và các đột biến của gen IFN-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thôngR1 (A611G, T189G, C95T),Heidari Z và cộng sự (2015) đã sử dụng thành công kỹ thuật ARMS - PCR vàđánh giá được sự liên quan của đột biến IFN-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thông đối với sự phát triển bệnh viêmnha chu mãn tính cũng như khẳng định các đột biến trên INF-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thôngR1 không liênquan tới bệnh này [49]

Khosravi A và cộng sự (2016) trong nghiên cứu phát hiện các đột biếncủa gen α-Globin trong dân tỉnh Khuzestan Province, Iran liên quan tới sự

phát triển bệnh α-Thalassemia đã sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR và thấyđược 11 đột biến hay gặp của gen này trên tổng số hơn 50 đột biến điểm đãđược phát hiện trên thế giới [50].

Việc ứng dụng kỹ thuật ARMS - PCR trong thực nghiệm cũng như trênnghiên cứu trên thế giới đã được biết đến từ lâu, nhưng hiện tại ở Việt Namcòn hạn chế và chưa có đề tài nghiên cứu nào sử dụng kỹ thuật ARMS - PCRtrong chẩn đoán vô sinh nam để phát hiện các đột biến CYP1A1, NAT2,GSTP1 Vì vậy chúng tôi tiến hành kỹ thuật này trong nghiên cứu của mình

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là những bệnh nhân nam được chẩn đoán vô sinh I đãđược xét nghiệm tinh dịch đồ tại Bộ môn Y sinh học - Di truyền, ĐH Y Hà Nội

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu

Đối với nhóm bệnh:

+ Nam giới trong độ tuổi sinh sản

+ Nam giới vô sinh không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng (<15 triệu)(WHO – 2010)

Đối với nhóm so sánh:

+ Nam giới trong độ tuổi sinh sản

+ Có ít nhất một con

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

+ Nam giới bị các bệnh ung thư

+ Nam giới vô sinh đã được xác định nguyên nhân: Mất đoạn nhỏ trênNST Y, nhiễm sắc đồ bất thường, tắc nghẽn đường sinh dục, giãn tĩnh mạchthừng tinh

+ Nam giới đang mắc các bệnh cấp tính, bị tâm thần

2.1.3 Số bệnh nhân và số mẫu

Vì là nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình nên chúng tôi lấy nhóm nghiêncứu là 10 và nhóm so sánh là 10