NGHIÊN cứu BIẾN đổi GEN mã hóa ENZYM CHỐNG OXY hóa CYP1A1 và NỒNG độ gốc tự DO ở NAM GIỚI THIỂU TINH NẶNG và vô TINH

Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới...5 Vô sinh nam giới có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, hầu hết đều dẫn đến hậu quả là người nam không có tinh trùng hoặc tinh trùng suy g

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ NGA

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN

MÃ HÓA ENZYM CHỐNG OXY HÓA CYP1A1

VÀ NỒNG ĐỘ GỐC TỰ DO Ở NAM GIỚI THIỂU TINH NẶNG VÀ VÔ TINH

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ NGA

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN

MÃ HÓA ENZYM CHỐNG OXY HÓA CYP1A1

VÀ NỒNG ĐỘ GỐC TỰ DO Ở NAM GIỚI THIỂU TINH NẶNG VÀ VÔ TINH

Chuyên ngành : Y Sinh học- Di truyền

Mã số : 62720301

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Lương Thị Lan Anh PGS.TS Trần Đức Phấn

HÀ NỘI - 2017

AR : Androgen Receptor

AZF : Azoospermia Factor

CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrance Conductance RegulatorFSH : Follice Stimulating Hormone

GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone

RCS : Reactive Clo Species

ROS : Reactive Oxygen Species

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI 1

BÙI THỊ NGA 1

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC 1

HÀ NỘI - 2017 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI 2

BÙI THỊ NGA 2

Mã số : 62720301 2

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC 2

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 2

TS Lương Thị Lan Anh 2

PGS.TS Trần Đức Phấn 2

HÀ NỘI - 2017 2

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam giới 3

1.1.1 Khái niệm vô sinh và vô sinh nam giới 3

1.1.2 Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới 4

1.1.3 Tình hình vô sinh và vô sinh nam ở Việt Nam 5

1.2 Các nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam 5

1.2.1 Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới 5

Vô sinh nam giới có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, hầu hết đều dẫn đến hậu quả là người nam không có tinh trùng hoặc tinh trùng suy giảm các mức độ khác nhau, bất thường về hình thái tinh trùng 5

1.2.1 Nguyên nhân ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng 6

1.2.2 Nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng và tinh dịch 11

1.3 Gốc tự do và stress oxy hóa 12

1.3.3 Vai trò của các gốc kháng oxy hóa trong điều trị vô sinh nam 16

1.3.4 Các phương pháp xác định mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch 18

1.4 Gen chuyển hóa gốc tự do CYP1A1 trong cơ thể 19

1.4 Kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán xác định biến đổi gen 20

1.5.1 Khái niệm PCR 20

1.5.2 Nguyên lý của kỹ thuật PCR 21

1.5.3 Một số phương pháp PCR đặc hiệu 22

1.5.4 Kỹ thuật ARMS-PCR 24

Chương 2 26

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Số bệnh nhân và số mẫu 26

2.3 Quy trình nghiên cứu 27

2.4 Hóa chất và dụng cụ 27

2.5 Phương pháp nghiên cứu 27

2.5.1 Loại hình nghiên cứu 27

2.5.2 Cách tiến hành nghiên cứu 27

2.5.3 Xét nghiệm tinh dịch đồ và mức độ stress oxy hóa bằng kit Oxisperm 28

2.5.4 Tách chiết DNA 28

2.5.5 Nhân đoạn gen sử dụng phương pháp ARMS-PCR 29

2.5.6 Điện di 30

2.5.7 Xử lí số liệu 30

2.6 Các chỉ tiêu nghiên cứu 30

2.7 Đạo đức trong nghiên cứu 31

Chương 3 32

DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Đặc điểm sinh học của đối tượng nghiên cứu 32

3.1.1 Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh và nhóm chứng 32

Nhóm bệnh: 30 bệnh nhân 32

Độ tuổi trung bình của 2 nhóm được thể hiện ở bảng sau: 32

Đặc điểm 32

Nhóm bệnh 32

Nhóm chứng 32

(X ± SD) 32

3.1.2 Đặc điểm nhóm bệnh phân loại theo mật độ tinh trùng 32

Dựa vào mật độ tinh trùng trong tinh dịch, chúng tôi phân loại nhóm bệnh thành: Vô tinh và thiểu tinh nặng 32

Đặc điểm 32

Vô tinh 32

Thiểu tinh nặng 32

Tổng32 Số lượng 32

30 32 Tỉ lệ % 32

100 32 32 3.2 Xác định biến đổi A2455G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật ARMS-PCR 33

3.2.1 Kết quả chạy điện di 33

3.2.2 Xác định biến đổi A2455G của gen CYP1A1 33

Alen 35

Nhóm bệnh 35

(n=30) 35

Nhóm chứng 35

(n=5) 35

P 35

A( A2455G) 35

G(A2455G) 35

3.3 Xác định nồng độ gốc tự do trong tinh dịch và mối liên quan với biến đổi gen CYP1A1 35

Mức I: Nồng độ gốc tự do thấp 35

Mức II: Nồng độ gốc tự do trung bình thấp 35

Mức III: Nồng độ gốc tự do trung bình 35

Mức IV: Nồng độ gốc tự do cao 35

Ta có bảng sau: 35

Mẫu 36 Mức độ gốc tự do trong tinh dịch 36

1 36 2 36 3 36 4 36 … 36 Từ kết quả trên, ta thu được đồ thị thể hiện tỉ lệ các mức gốc tự do dưới đây: 36

36

Bước đầu mô tả mối liên quan giữa nồng độ gốc tự do trong tinh dịch và biến đổi A2455G của gen CYP1A1 36

Theo kết quả biến đổi gen, chúng tôi chia đối tượng nghiên cứu thành hai nhóm: Bình thường (không có biến đổi gen AA), bất thường (dị hợp tử AG hoặc đồng hợp tử GG) 36

Phân bố mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch và biến đổi gen CYP1A1: 36

Bình thường 37

n(%) 37

Bất thường 37

n(%) 37

I 37

II 37

III 37

IV 37

Biến đổi gen CYP1A1 với một số chỉ số tinh dịch đồ 38

So sánh giữa sự biến đổi của gen nghiên cứu CYP1A1 ở nam giới thiểu tinh nặng và vô tinh với tỉ lệ sống, tỉ lệ di động tiến tới, vận tốc trung bình và bất thường hình thái của tinh trùng được thể hiện ở bảng sau: 38

Chương 4 39

DỰ KIẾN BÀN LUẬN 39

Chúng tôi dự kiến bàn luận những vấn đề sau: 39

4.1 Đặc điểm sinh học của nhóm đối tượng nghiên cứu 39

4.2 Đặc điểm biến đổi gen CYP1A1 của nhóm đối tượng nghiên cứu 39

4.3 Xác định nồng độ gốc tự do và bước đầu mô tả mối liên quan với sự biến đổi gen CYP1A1 ở nam giới thiểu tinh nặng và vô tinh 39

Trong 30 mẫu tiến hành đo gốc tự do trong tinh dịch theo protocol của kirt, có… mẫu ở mức độ I, …mẫu ở mức độ II, …mẫu ở mức độ III và … 39

mẫu ở mức độ IV 39

Ở mức stress oxy hóa I, tỉ lệ bất thường gen là… 40

Ở mức stress oxy hóa II, tỉ lệ bất thường gen là… 40

Ở mức stress oxy hóa III, tỉ lệ bất thường gen là… 40

Ở mức stress oxy hóa IV, tỉ lệ bất thường gen là… 40

Mức stress oxy hóa trong tinh dịch với sự biến đổi A2455G của gen mã hóa enzyme chống oxy hóa CYP1A1 có mối liên quan …với p… 40

Mối tương quan giữa một số đặc điểm tinh dịch đồ với mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch40 Có mối tương quan giữa mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch với một số chỉ số tinh dịch đồ: 40

Tỉ lệ sống ( r =…, p <…) 40

Tỉ lệ di động tiến tới ( r =…, p <…) 40

Tốc độ trung bình ( r =…, p <…) 40

Có mối tương quan với bất thường hình thái tinh trùng (r=…, p <…) 40

Mức độ của các mối tương quan 40

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 41

PHỤ LỤC 6

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm nguyên nhân gây vô sinh nam (WHO, 1999) [21] 6

Bảng 1.2 Phân loại gốc tự do [36] 14

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi xác định biến đổi gen CYP1A1 (I462V) 29

Bảng 2.2 Chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR 29

Bảng 3.1 Đặc điểm độ tuổi của nhóm bệnh và nhóm chứng 32

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhóm bệnh phân loại theo mật độ tinh trùng 32

Bảng 3.3 Tỷ lệ biến đổi gen của 2 nhóm nghiên cứu 34

Bảng 3.4 Tỷ lệ kiểu gen A2455G trên gen CYP1A1 34

Bảng 3.5 Tỷ lệ alen của A2455G giữa 2 nhóm 35

Bảng 3.6 Kết quả đo gốc tự do trong tinh dịch 36

Bảng 3.7 Phân bố mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch và biến đổi gen CYP1A1 37

Bảng 3.8 Mối liên quan giữa mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch với biến đổi gen ở nam giới thiểu tinh nặng và vô tinh 37

Bảng 3.9 Mối liên quan giữa biến đổi gen CYP1A1 với một số chỉ số của tinh dịch đồ ở nhóm bệnh 38

Hình 1.1 Ảnh hưởng của stress oxy hóa lên chất lượng và số lượng tinh trùng .16

Hình 1.2 Vai trò của chất kháng oxy hóa 18

Hình 1.3 Vị trí gen CYP1A1 trên NST 15 19

Bảng 1.3 Một số đột biến của CYP1A1 [41] 20

Hình 1.4 Chu trình 3 giai đoạn PCR 22

Hình 1.5 Sơ đồ kỹ thuật ARM -PCR 25

Hình 3.1 Tỷ lệ nhóm bệnh phân loại theo mật độ tinh trùng 32

Hình 3.2 Hình ảnh sau khi chạy điện di trên máy soi tia UV 33

Hình 3.3 Tỷ lệ kiểu gen của A2455G giữa nhóm bệnh và nhóm chứng 35

Hình 3.4 Tỷ lệ giữa các mức độ gốc tự do trong tinh dịch 36

Hình 3.5 Phân bố mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch với sự biến đổi gen của đối tượng nghiên cứu 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học côngnghệ hiện đại, chất lượng cuộc sống của con người ngày càng được nângcao Tuy nhiên, bên cạnh đó, tỉ lệ bệnh tật cũng diễn biến khá phức tạp,xuất hiện nhiều căn bệnh mới gây khó khăn cho chẩn đoán và điều trị.Trong số đó, tình trạng vô sinh đã trở thành một trong những vấn đề sứckhỏe sinh sản gây ảnh hưởng lớn tới cuộc sống hạnh phúc của rất nhiều cặp

vợ chồng Vô sinh (infertility) là hiện tượng mất hay giảm khả năng sinhsản, trong đó nam và nữ đóng vai trò như nhau Theo tổ chức y tế thế giới(WHO), trong số các cặp vợ chồng ở độ tuổi sinh sản gặp vấn đề về việcsinh con thì 30 - 40% do nam giới, 40% do nữ giới, 10% do cả nam và nữ,10% không rõ nguyên nhân [1] Từ đó, người ta có cái nhìn chính xác hơn

về vô sinh nam và vấn đề này cũng được nghiên cứu một cách sâu sắc vàtoàn diện hơn

Vô sinh ở nam giới do nhiều nguyên nhân gây nên Vì vậy, để điềutrị hiệu quả và có thái độ xử lý đúng đắn, chẩn đoán nguyên nhân gây vôsinh và vô sinh nam giới là hết sức cần thiết, đặc biệt phục vụ cho công tác

tư vấn di truyền

Ngày nay, di truyền y học phát triển nhanh, mạnh; có nhiều kỹ thuậtxác định được các nguyên nhân di truyền gây vô sinh mà trước đây đượccho là vô sinh không rõ nguyên nhân, các xét nghiệm này đã và đang gópphần định hướng cho can thiệp và điều trị

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nước trên thế giới bắt đầunghiên cứu ảnh hưởng của stress oxy hóa lên chức năng của cơ thể Stressoxy hóa (oxidative Stress, OS) là hậu quả của sự mất cân bằng giữa sự hìnhthành các gốc tự do có oxy và cơ chế kháng oxy hóa của cơ thể OS được

xem là có liên quan đến nguyên nhân của nhiều bệnh lý ở người như ungthư, xơ vữa động mạch, tiểu đường, tổn thương gan, đục thủy tinh thể, bệnhAlzheimer, bệnh Parkinson và nhiều bệnh khác Nhiều nghiên cứu cũng chỉ

ra rằng stress oxy hóa cũng liên quan phần lớn đến tốc độ của quá trình lãohóa, được định nghĩa là sự tích tụ dần các tổn thương cơ bản Đặc biệt trên

hệ sinh sản nói chung và của nam giới nói riêng, các nhà khoa học đãchứng minh được rằng các chất oxy hóa gây tác động bất lợi trên cả cấutrúc và chức năng của tinh trùng Tuy nhiên ở Việt Nam, đây còn là mộtvấn đề rất mới, chưa có nhiều báo cáo hay nghiên cứu cụ thể Vì vậy, đểtham gia vào công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản của người dân Việt Nam

và góp phần vào việc chẩn đoán nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới,

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu biến đổi gen mã hóa enzym

chống oxy hóa CYP1A1 và nồng độ gốc tự do ở nam giới thiểu tinh

nặng và vô tinh” với các mục tiêu:

1 Mô tả một số biến đổi của gen mã hóa enzym chống oxy hóa CYP1A1 ở nam giới thiểu tinh nặng và vô tinh.

2 Xác định nồng độ gốc tự do trong tinh dịch ở nam giới thiểu tinh nặng và vô tinh.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam giới

1.1.1 Khái niệm vô sinh và vô sinh nam giới

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), vô sinh là tình trạng một cặp vợchồng trong độ tuổi sinh đẻ, có sức khỏe bình thường, mong muốn có connhưng không thể có thai sau 12 tháng có quan hệ tình dục mà không sửdụng biện pháp tránh thai nào[2]

Dựa vào tiền sử đã từng có thai trước đó hay chưa mà vô sinh đượcphân thành hai loại: Vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ phát Vô sinhnguyên phát hay còn gọi là vô sinh I, là trường hợp cặp vợ chồng chưatừng có thai lần nào Vô sinh thứ phát, còn gọi là vô sinh II, là trường hợpcặp vợ chồng đã từng có thai ít nhất một lần nhưng sau đó không thể cóthai lại mặc dù đang chung sống với nhau trên một năm và không sử dụngbất kì biện pháp tránh thai nào

Vô sinh nam là vô sinh mà nguyên nhân do nam giới, người vợ cóthể bình thường hoặc cũng bị vô sinh Vô sinh không rõ nguyên nhân là cáctrường hợp vô sinh mà thăm khám lâm sàng và làm các xét nghiệm kinhđiển ở cả vợ và chồng vẫn không phát hiện được nguyên nhân

Trong vô sinh nam giới, nguyên nhân do bất thường về số lượng tinhtrùng thường hay gặp, bao gồm thiểu tinh (TT) và vô tinh (VT)

Theo WHO, vô tinh (VT) là tình trạng trong tinh dịch không có tinh trùng(azoospermia), thường gặp hơn cả là do tinh hoàn không có khả năng sản xuấttinh trùng Thiểu tinh (TT) là tình trạng mẫu tinh dịch có ít hơn 15 x 106 tinhtrùng/ ml (oligozoospermia) Thiểu tinh nặng (TTN) là những trường hợp tinhdịch có ít hơn 5 x 106 tinh trùng/ ml (severe oligozoospermia) [3], [4], [5]

1.1.2 Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới

Theo ước tính của WHO (1991), trên thế giới có khoảng 12,15% cặp

vợ chồng vô sinh tương đương 50 - 80 triệu người [6] Năm 2013 tỉ lệ vôsinh là 10 - 15% cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản [7]

Ở Australia, theo nghiên cứu của Kildea (2000) tỉ lệ vô sinh chiếm26,3% ở nam giới độ tuổi từ 20 - 45 [8], còn tại Mỹ theo Wysahk (2001) tỉ

lệ này là 17,1%, trong khi ở giai đoạn 2006 - 2010 là 9,4% ở nam giới độtuổi từ 15 - 44 và 12% ở độ tuổi từ 25 - 44 [9]

Theo nghiên cứu của D Stewart Irvine (2002) thì vô sinh là một vấn

đề phổ biến trên thế giới, chiếm 14 - 17% ở các cặp vợ chồng, trong đó vôsinh do nam giới thì khó xác định [10]

Nghiên cứu của Mittal ở Ấn Độ (2004), vô sinh ảnh hưởng tới 10 20% cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ [11]

-Theo AliH (2005) ở Ả Rập có khoảng 10 - 15% cặp vợ chồng vôsinh, trong đó nguyên nhân do nam giới chiếm 50% [12]

Năm 2009, nghiên cứu của Ceylan tại Thổ Nhĩ Kì cho thấy có 10 20% cặp vợ chồng bị vô sinh trong đó vô sinh nam chiếm 50% [13]

-Takahaski và cộng sự (1990) nghiên cứu trên 173 mẫu tinh dịch củacác đối tượng nam giới vô sinh tại Nhật Bản cho thấy có 35,8% VT, 19,6 %

có lượng tinh trùng giảm trầm trọng, 9,8% giảm vừa và 34,7% có tinh dịch

đồ bình thường [14] Theo Aribarg (1995), vô sinh ở Thái Lan chiếm 12%các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ

Nhìn chung, theo các tác giả thì ở tùy từng nước trên thế giới tỉ lệ vôsinh thay đổi từ 10 - 20%, trong đó nguyên nhân vô sinh do nam hay nữ làtương đương nhau, tỉ lệ này có xu hướng ngày càng tăng

1.1.3 Tình hình vô sinh và vô sinh nam ở Việt Nam

Ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về vô sinh cho thấy tỉ lệ

vô sinh có xu hướng tăng Điều tra dân số năm 1980, tỉ lệ này chỉ ở mức 7 10%, đến năm 1982, tỉ lệ vô sinh tăng lên đến 13% [15]

-Theo Phan Văn Quyền (2000) tỉ lệ vô sinh là 10 - 15% [16] -Theo báocáo của Trần Thị Phương Mai (2001), vô sinh do nữ chiếm khoảng 30 - 40%các trường hợp, vô sinh nam chiếm tỉ lệ gần tương đương là 30% Khoảng20% các trường hợp tìm thấy nguyên nhân vô sinh ở cả hai vợ chồng Cònlại, vô sinh không rõ nguyên nhân chiếm tỉ lệ khá lớn là 20% [17]

Trần Thị Trung Chiến và cộng sự (2002) đã công bố tỉ lệ vô sinhtrong độ tuổi sinh đẻ chiếm 5% trong đó nguyên nhân do nam giới chiếm40,8% [18] Báo cáo của Nguyễn Viết Tiến tại Hội thảo quốc tế “Cập nhật

về hỗ trợ sinh sản” (2013) tại Hà Nội nghiên cứu trên 14.396 cặp vợ chồngtrong độ tuổi sinh đẻ, tuổi từ 15 - 49, tại 8 tỉnh đại diện cho 8 vùng sinhthái của cả nước cho thấy tỉ lệ vô sinh chung trên phạm vi toàn quốc là7,7%, trong đó vô sinh do nam giới chiếm 25 - 40%, do nữ giới là 40%,còn lại là do cả hai vợ chồng và chưa rõ nguyên nhân [19]

Nhìn chung, theo thống kê của các tác giả nghiên cứu ở Việt Nam vàtrên thế giới đều cho rằng nguyên nhân vô sinh do nam giới chiếm tỉ lệ gầnbằng với vô sinh do nữ giới Với các số liệu nên trên, rõ ràng vô sinh nóichung và vô sinh nam giới nói riêng đang trở thành một vấn đề đáng ngạicủa y học và xã hội Việt Nam

1.2 Các nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam

1.2.1 Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới

Vô sinh nam giới có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, hầu hết đềudẫn đến hậu quả là người nam không có tinh trùng hoặc tinh trùng suy giảmcác mức độ khác nhau, bất thường về hình thái tinh trùng

Theo de Kretser (1997), nguyên nhân của vô sinh nam giới có thểchia thành ba nhóm: trước tinh hoàn, tại tinh hoàn và sau tinh hoàn

 Trước tinh hoàn: Do thiểu năng tuyến sinh dục, do rối loạn cươngdương hoặc không xuất tinh được

 Tại tinh hoàn: Do bất thường nhiễm sắc thể (NST), tinh hoàn ẩn, donhiễm trùng, do các tác nhân kháng tinh trùng, do miễn dịch

 Sau tinh hoàn: Do tắc nghẽn, do tinh trùng giảm vận động, do chứcnăng tuyến phụ

Năm 1999, WHO đã đưa ra một bảng phân loại các nguyên nhân gây

vô sinh ở nam giới một cách có hệ thống [20]

Bảng 1.1 Các nhóm nguyên nhân gây vô sinh nam (WHO, 1999) [21]

Rối loạn về tình dục và phóng tinh Nhiễm trùng tuyến sinh dục phụMiễn dịch Tinh trùng ít

Bất thường tinh dịch Nội tiết

Bệnh lý toàn thân Tinh trùng ít

Dị tật bẩm sinh Tinh trùng dị dạng

Tổn thương tinh hoàn mắc phải Tinh trùng di động yếu

Giãn tĩnh mạch tinh VT do tắc nghẽn

Nguyên nhân do khám và điều trị VT không rõ nguyên nhân

Cách phân loại trên giúp tiêu chuẩn hóa việc chẩn đoán các nguyênnhân gây vô sinh ở nam giới đồng thời để so sánh các nghiên cứu với nhau.Tuy nhiên, để có cái nhìn khái quát nhất về các nguyên nhân gây vô sinh ởnam giới, người ta thường phân loại thành vô sinh do số lượng và chấtlượng tinh trùng

1.2.1 Nguyên nhân ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng

Có thể nói cho đến nay, phương pháp cơ bản và hàng đầu để chẩnđoán vô sinh nam giới thường dựa trên kết quả tinh dịch đồ theo chuẩn củaWHO, hiện đang được áp dụng ở hầu hết các cơ sở xét nghiệm tinh dịch

trên thế giới Theo Trần Đức Phấn (2010) trong số các cặp vợ chồng vôsinh có tới 44% kết quả tinh dịch đồ bất thường [22].

Tiêu chuẩn tinh dịch đồ WHO 2010: [23]

Lê Hoàng Anh (2010) đã khảo sát tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO

2010 cho thấy tỉ lệ những người nam vô sinh không có tinh trùng (KCTT)

là 6% [24] Có nhiều nguyên nhân gây ra tình trạng KCTT hoặc ít tinhtrùng (ITT) bao gồm các nguyên nhân di truyền và không di truyền

1.2.1.1 Các nguyên nhân không do di truyền

Các yếu tố gây rối loạn nội tiết hay ảnh hưởng đến quá trình sinhtinh, cương dương, phóng tinh đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh.Các bệnh tật thuộc nhóm này gồm:

• Các bệnh ảnh hưởng vùng dưới đồi, vùng tuyến yên như phẫu thuậtvùng tuyến yên, tia xạ, nhồi máu (hội chứng Sheehan, đột quỵ tuyếnyên), bệnh tự miễn, chấn thương sọ não, dị dạng như hội chứng hốyên rỗng, thiểu sản tuyến yên, và các nhiễm khuẩn hệ thần kinh:apxe, viêm màng não, viêm não, lao

• Giãn tĩnh mạch thừng tinh (Varicocele): Là hiện tượng dòng máutĩnh mạch thừng tinh bị nghẽn tắc làm tăng nhiệt độ gây giảm sốlượng và giảm chất lượng tinh trùng

• Lỗ đái lệch thấp (Hypospadias) là một rối loạn trong đó niệu đạo sẽ

mở ra ở vị trí mặt dưới của dương vật hoặc ở gốc dương vật, tầngsinh môn chứ không phải đầu dương vật, khiến tinh trùng xuất rakhó đi vào lỗ cổ tử cung

• Nhiễm trùng: Một số bệnh nhiễm trùng như quai bị có thể gây viêmteo tinh hoàn, sốt trên 38,5oC có thể ức chế quá trình sinh tinh trongthời gian 6 tháng (WHO, 1987) [25]

• Viêm tuyến tiền liệt, viêm ống dẫn tinh, viêm niệu đạo, viêm baoquy đầu, viêm mào tinh hoàn, phẫu thuật, chấn thương có thể gây

ra sẹo ngăn chặn quá trình xuất tinh

• Sử dụng một số thuốc điều trị bệnh nội khoa như: Nội tiết tố(corticoid, androgens), cimetidin, sulphasalazine, spironolactone,nitrofurantoin, niridazone, colchichine… đều trực tiếp hoặc gián tiếpảnh hưởng đến quá trình sinh tinh

• Các nguyên nhân khác: Một số bệnh toàn thân ảnh hưởng đến nộitiết như bệnh ác tính, tim mạch, đái tháo đường, suy gan, suy thận…tiếp xúc với hoá chất hay bức xạ, hút thuốc lá, nghiện các chất như:

ma tuý, rượu…, kháng thể kháng tinh trùng, chấn thương tinh hoàn,thoát vị bẹn, tinh hoàn lạc chỗ…

1.2.1.2 Các nguyên nhân do di truyền

 Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ tế bào:

Một số bất thường di truyền nói chung và bất thường NST nói riênggây suy giảm quá trình sinh tinh, hậu quả là làm suy giảm khả năng sinhsản của nam giới Kết quả của một số nghiên cứu cho thấy, ở các bệnhnhân nam vô sinh, tỉ lệ bất thường NST thường cao gấp 6 lần và bấtthường NST giới tính cao gấp 15 lần so với cộng đồng [16]

• Bất thường NST giới tính thường gặp:

Hội chứng Klinefelter: Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng các

trường hợp bất thường NST giới tính như hội chứng Klinefelter (47,XXY,

48,XXXY) hay rối loạn cấu trúc NST giới tính có thể gây tình trạng KCTT[26] Theo Trần Quán Anh (2002), hội chứng Klinefelter (47,XXY) chiếm1% các thể vô sinh, 13 - 20% các trường hợp KCTT [27]

Hội chứng nam 47,XYY chiếm tỉ lệ 1/500 đến 1/1000 trẻ sơ sinhnam được sinh ra [28] Ở những người mắc hội chứng này, cơ thể không cóbiểu hiện hình thái gì đặc biệt, thường cao lớn, nội tiết không thay đổikhác thường, nhiều trường hợp tính tình hung hăng, thiếu tự chủ Tuynhiên, những người nam 47,XYY có thể biểu hiện sinh dục kém phát triển,tinh hoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp

Hội chứng nam 46,XX (male 46,XX): Hội chứng nam 46, XXthường là kết quả của sự trao đổi chéo không cân giữa nhánh ngắn củaNST X và NST Y, dẫn đến sự chuyển vị vật liệu di truyền của NST Y sangNST X, trong đó có chứa gen xác định giới tính nam (SRY) Do gen SRYvẫn tồn tại nên kiểu hình vẫn là nam, tuy nhiên không có sự hiện diện củatoàn bộ vùng đặc hiệu nam trên NST Y (MSY: Male specific region Y) Do

đó, nam 46,XX chắc chắn không có sự sinh tinh nên một khi làm karyotypxác định là nam 46,XX thì việc phẫu thuật tìm tinh trùng trong tinh hoàn

để hỗ trợ sinh sản là vô ích [29]

• Bất thường NST thường:

Bên cạnh những bất thường về NST giới tính, những bất thường củaNST thường cũng có thể gây nên tình trạng vô sinh Bất thường NSTthường chiếm tỉ lệ 1 - 2% các trường hợp vô sinh nam Cơ chế do sự mấtcân bằng trong bộ NST gây trở ngại cho việc bắt cặp NST trong quá trìnhgiảm phân, do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh Thường gặp các dạngđột biến số lượng NST như hội chứng Down và các loại đột biến cấu trúcNST như mất đoạn, chuyển đoạn tương hỗ, đảo đoạn quanh tâm và ngoàitâm [30]

Hội chứng Prader - Willi: là một rối loạn di truyền hiếm gặp do độtbiến mất đoạn nhánh dài gần tâm NST số 15 vùng băng q12 với biểu hiệnbéo phì, thiểu năng trí tuệ và suy sinh dục, những người này thường vô sinh.

• Các rối loạn di truyền khác gây thiếu GnRH hoặc gonadotropin: Những rối loạn nguyên phát của sự chế tiết và điều hòa của haihormon sinh dục LH và FSH từ tuyến yên do đột biến các gen thụ thể LHnằm trên nhánh dài của NST số 9 (9q) và FSH nằm trên nhánh ngắn NST

số 2 (2p21)

 Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ phân tử:

• Với sự phát triển không ngừng của các kỹ thuật di truyền, một số tácgiả đã chỉ rõ được một số gen liên quan đến quá trình sinh sản, cácgen này nằm ở đoạn xa nhánh dài NST Y (Yq11.23), nhóm gen nàyđược gọi là DAZ (deleted in Azoospermia) Khi phân tích DNA củanhững người nam vô sinh thấy có 8% trường hợp có mất đoạn ở nơi

có các gen DAZ, những người bình thường về tinh dịch không cócác bất thường này [31]

• Các nhà khoa học đã phát hiện mối liên quan chặt chẽ giữa KCTThoặc ITT với sự mất đoạn nhỏ xảy ra trên nhánh dài NST Y (Yq) làvùng AZF (azoospermic factor) Bốn vùng AZF lần lượt là AZFa,AZFb, AZFd, AZFc [32]

• Xơ nang (Cystic Fibrosis) là một bệnh do đột biến gen CFTR trên

NST số 7 Nam giới bị bệnh này thường không có ống dẫn tinh hoặcống dẫn tinh bị tắc dẫn đến KCTT trong tinh dịch mặc dù tinh hoànvẫn sản xuất được tinh trùng

• Hội chứng Kallmann: Gen LAL - 1 nằm trên nhánh ngắn NST X bịđột biến dẫn đến sự thiếu hụt LH, FSH, gây giảm sản xuất tinhtrùng, suy chức năng tuyến sinh dục, giảm sự sinh tinh tại tinh hoàn.Những bệnh nhân này biểu hiện mất khứu giác và suy sinh dục dosuy hạ đồi

• Hội chứng kháng Androgen: Gen AR (gen thụ thể của androgen)

nằm trên nhánh dài của NST X bị đột biến dẫn đến mất một phầnhoặc hoàn toàn thụ thể androgen Người đột biến kháng androgenhoàn toàn có kiểu hình nữ, bộ NST 46,XY, tinh hoàn nằm trong ổbụng hay trong ống bẹn sâu, không có tử cung, buồng trứng, âm đạo,hoặc âm đạo cụt, vô sinh

1.2.2 Nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng và tinh dịch

Bên cạnh số lượng, chất lượng tinh trùng cũng như tinh dịch ảnhhưởng đáng kể đến khả năng sinh sản ở nam giới Một tỉ lệ không nhỏ namgiới có mật độ tinh trùng bình thường, vẫn gặp khó khăn trong việc có con

1.2.3.1 Nguyên nhân từ plasma tinh

Plasma tinh có thành phần rất phức tạp, gồm nhiều hợp chất hữu cơ

và vô cơ như: nước, muối, fructose, kẽm, acid citric và một số chất khác[33] Sự mất cân bằng hay thiếu hụt các thành phần trong plasma tinh cũngảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng và độ di động của tinh trùng mặc dù

số lượng tinh trùng vẫn bình thường

1.2.2.1 Nguyên nhân từ tinh trùng

Hình thái tinh trùng: Nguyễn Xuân Bái (2002) tiến hành nghiên cứutinh dịch của 1000 cặp vợ chồng vô sinh tại bộ môn Mô Phôi, trường Đạihọc Y Hà Nội Kết quả cho thấy tỉ lệ có tinh dịch đồ bất thường chiếm60% Bất thường về độ di động tinh trùng chiếm tỉ lệ cao nhất 28,7%, tiếpđến là mật độ tinh trùng 25,4%, hình thái tinh trùng 19,6% [34]

Chức năng tinh trùng: Đứt gãy DNA tinh trùng gây ra một tỉ lệkhông nhỏ các trường hợp vô sinh Chỉ số để đánh giá mức độ đứt gãy củaDNA tinh trùng - DNA Fragmentation Index (DFI) càng lớn thì mức độ đứtgãy DNA càng cao Nam giới vô sinh có tinh dịch đồ bất thường có tỉ lệđứt gãy DNA tinh trùng cao hơn nam giới vô sinh có tinh dịch đồ bình

thường Tỉ lệ nam giới có tinh dịch đồ bình thường có DFI ở mức > 30%vẫn chiếm tỉ lệ cao (41%) [35].

Stress oxy hóa là một trong những tác nhân quan trọng tác động lên

sự hình thành và phát triển của tinh trùng, gây nên ảnh hưởng cả về hìnhthái lẫn chức năng của tinh trùng Giống như nhiều loại tế bào sống hiếukhí khác, tinh trùng liên tục tiếp xúc với môi trường cân bằng liên quanđến oxy Oxy cần để tế bào tồn tại và gốc tự do có oxy ở nồng độ sinh lí làrất cần thiết để duy trì chức năng bình thường của tế bào Ngược lại, nếucác sản phẩm phụ của oxy như ROS (Reactive Oxygen Species) tăng caolại là nguy cơ gây ảnh hưởng đến chức năng và sự tồn tại của tế bào

1.3 Gốc tự do và stress oxy hóa

1.3.1 Khái niệm và phân loại gốc tự do

Gốc tự do là những tiểu phân hóa học (phân tử, mảnh phân tử,nguyên tử, ion) có electron độc thân (e- hóa trị) và có thể tồn tại độc lập

Ví dụ: Gốc hydroxyl, superoxide, hydrosuperoxide, lipoperoxyl, alkoxyl…Trong cơ thể, gốc tự do hình thành qua 3 con đường chủ yếu:

 Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể tạo ra những dạng oxy hoạtđộng đầu tiên

 Quá trình peroxyd hóa lipid

 Các phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể

Như vậy, bản chất gốc tự do là một nguyên tử hoặc nhóm các nguyên

tử còn ít nhất một electron chưa được ghép, chính vì thế nó luôn có xuhướng ổn định bản thân bằng cách “đánh cắp” điện tử từ phân tử khác, làmcho phân tử đó mất ổn định và trở thành một gốc tự do mới Cứ như thếhiện tượng này tạo ra một phản ứng dây chuyền sản sinh gốc tự do trong cơthể, hậu quả có thể làm phá vỡ toàn bộ tế bào

Các gốc tự do là sản phẩm phụ của các phản ứng hóa học trong cơthể, ví dụ như quá trình trao đổi chất Các nguồn tạo gốc tự do được tìm

thấy trong thực phẩm như thức ăn chiên, rượu, khói thuốc lá, thuốc trừ sâu,chất gây ô nhiễm không khí…

Tác hại của gốc tự do:

Trong cơ thể, tất cả các phân tử sinh học đều có khả năng bị gốc tự

do tấn công làm biến đổi cấu trúc và chức năng, trong đó phân tử lipid là dễ

bị nhất Vị trí tấn công thường gặp là lipid màng tế bào, thành phần quantrọng nhất và cũng dễ tổn thương nhất Quá trình biến đổi này chính là sựperoxyd hóa lipid (POL) sinh ra các chất mới L•, LOO•… Bản thân các gốcLOO• có thể chuyển dịch điện tử tạo ra các peroxide nội và phân hủy thànhnhững mảnh có số cacbon ngắn hơn, ở dạng andehyd độc hại như:hydroxynonenal, malonyldiandehyd, hoặc etan, pentan… Từ đó gây tiêuhủy màng tế bào, tạo ra các sản phẩm andehyd độc hại Quá trình này gắnliền với tổn thương ở mô trong các bệnh (như tổn thương gan do CCl4, xơvữa động mạch, tổn thương ở các khối u ác tính…)

Các DNA cũng bị các gốc có tính oxy hóa mạnh tấn công, khi gốcnày hình thành ở gần sát phân tử DNA Những nucleobase tìm thấy ở trongnước tiểu của người là bằng chứng có sự tấn công liên tục của các gốc tự

do và phân tử DNA Dù được sửa chữa với hiệu quả rất cao, một số tổnthương này vẫn có thể được tích tụ lại, sau một thời gian lượng tích tụ đủ

sẽ dẫn tới đột biến và từ đó sinh ra ung thư

Vai trò của gốc tự do:

Mặc dù gây nhiều tác hại cho cơ thể, gốc tự do ở nồng độ thích hợpvẫn đóng vai trò nhất định

Trong hóa học các gốc tự do tham gia vào các phản ứng phân hủy,tổng hợp hóa học… thực chất là quá trình bẻ gãy các liên kết, tạo gốc tự

do, để hình thành liên kết mới, chất mới

Trong sinh học gốc tự do có vai trò quan trọng Chúng tham gia vàoquá trình đồng hóa, dị hóa, ly giải các chất Các gốc tự do là thành phần

không thể thiếu của việc sản xuất năng lượng ATP Ngoài ra gốc tự do còntham gia bảo vệ cơ thể thông qua việc tiêu hủy virus, vi khuẩn, kí sinhtrùng, các tế bào già, tế bào hỏng và tế bào ung thư.

Hydrogen peroxideHypobromous acidOzone

Oxy đơn bộiCác peroxide lipidCác sản phẩm của phản ứngMaillard

Các dạng nitơ

hoạt động

Nitrie oxide Nitrogen dioxide

Nitrous acidNitrousyl cationNitroxyl anionDinitrogen tetroxideDinitrogen trioxidePeroxynitrite

Peroxynitrous acidAlkyl peroxynitritesNitryl chloride

1.3.2 Stress oxy hóa và sự ảnh hưởng lên hệ sinh sản nam

1.3.2.1 Stress oxy hóa

Cơ thể bình thường khỏe mạnh luôn tồn tại sự cân bằng giữa quátrình sinh gốc tự do có oxy và cơ chế kháng oxy hóa của cơ thể Khi sự cânbằng này bị phá vỡ thì gây ra hiện tượng stress oxy hóa Tình trạng này dẫnđến một loạt các căn bệnh mạn tính và ung thư

1.3.2.2 Ảnh hưởng của stress oxy hóa lên hệ sinh sản nam

Trong các nguyên nhân vô sinh nam, stress oxy hóa được xem là mộttrong những tác nhân quan trọng và được nghiên cứu rất nhiều trong nhữngnăm gần đây Giống như nhiều loại tế bào sống hiếu khí khác, tinh trùngliên tục tiếp xúc với môi trường cân bằng liên quan đến oxy Oxy rất cầnthiết để tế bào tồn tại và gốc tự do có oxy ở nồng độ sinh lí là rất cần thiết

để duy trì chức năng bình thường của tế bào Ngược lại, nếu các sản phẩmphụ của oxy như ROS tăng cao lại là nguy cơ gây ảnh hưởng đến chứcnăng và sự tồn tại của tế bào ROS thường tồn tại dưới các dạng gốc tự donhư: Ion hydroxyl, superoxide, hydrogen peroxide, peroxyl radical vàhypochlorite ion

Vai trò của gốc tự do lên chức năng sinh sản của nam giới: ROS

có vai trò trong nhiều hiện tượng quan trọng để giúp tinh trùng có khả năngthụ tinh với noãn như: Phản ứng cực đầu, tăng di động, khả năng hóa,tương tác giữa tinh trùng và noãn Bản thân các thành phần tinh dịch người

là một nguồn tạo các gốc tự do quan trọng ảnh hưởng đến tinh trùng Bạchcầu và chính tinh trùng, đặc biệt là các tinh trùng non và tinh trùng dị dạng,

là những tế bào đóng vai trò quan trong việc hình thành gốc tự do

Năng lượng cho việc di chuyển của tinh trùng được tạo ra từ ty thểcủa tinh trùng Nếu chức năng của ty thể bị rối loạn, có thể làm gia tăng sảnxuất gốc tự do trong tinh dịch Bạch cầu trong tinh dịch cũng là tác nhântạo ra gốc tự do quan trọng Sự xuất hiện của bạch cầu trong tinh dịch mặc

dù rất ít cũng có thể làm suy giảm chức năng tinh trùng

Ảnh hưởng của stress oxy hóa lên tinh trùng: Stress oxy hóa ảnh

hưởng lên tinh trùng theo hai cơ chế Một là gây tổn thương màng tinhtrùng, do đó làm giảm khả năng di động và khả năng thụ tinh của tinhtrùng Hai là gây tổn thương DNA của tinh trùng dẫn đến giảm khả năngthụ tinh và ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi sau thụ tinh Do đó, gốc tự

do có thể làm giảm khả năng sinh sản của nam giới, ảnh hưởng xấu đến sựphát triển của phôi và thai nhi sau này

Giãn tĩnh mạch thừng tinh (GTMTT) có thể liên quan đến khoảng15% các trường hợp vô sinh Ở các trường hợp GTMTT, người ta thấyROS tăng cao trong huyết thanh, trong tinh hoàn và tinh dịch Đây có thể lànguyên nhân gây rối loạn chức năng tinh trùng của GTMTT Một nghiêncứu đã tìm thấy mối liên hệ giữa nồng độ ROS và GTMTT Các chất khángoxy hóa cũng giảm trong GTMTT Ngoài ra, người ta thấy rằng sau khiphẫu thuật GTMTT cũng làm cải thiện các hoạt động kháng oxy hóa và cóthể giúp cải thiện chất lượng tinh trùng [37]

Hình 1.1 Ảnh hưởng của stress oxy hóa lên chất lượng và số lượng tinh trùng 1.3.3 Vai trò của các gốc kháng oxy hóa trong điều trị vô sinh nam

Việc sử dụng các chất kháng oxy hóa (antioxidant) trong điều trị vôsinh nam nhằm làm giảm tác động của OS lên tinh trùng được nghiên cứurất nhiều trong những năm gần đây

Chất kháng oxy hóa, hay còn gọi là “chất thải gốc tự do”, là các hợpchất làm giảm sự hình thành các gốc tự do hoặc phản ứng và trung hòa chúng

Chúng hoạt động bằng cách nhường một điện tử cho gốc tự do trước khi nó

có thể oxy hóa các tế bào khác Một khi các electron của gốc tự do được ghépnối, gốc tự do được ổn định và trở thành không độc đối với cơ thể

Các chất kháng oxy hóa có thể có tác động làm sạch và loại trừ tácđộng của các gốc tự do thông qua việc ức chế sự hình thành và đối khángvới các tác động của gốc tự do Việc sử dụng antioxidant có thể có tác dụngcải thiện các chỉ số tinh trùng, giảm ROS, giảm tổn thương tinh trùng, tăngkhả năng có thai khi điều trị vô sinh nam

Ross và cộng sự (2010) phân tích kết quả của 17 nghiên cứu ngẫunhiên có nhóm chứng, trên tổng cộng 1665 bệnh nhân, đánh giá hiệu quảcủa antioxidant Kết quả cho thấy 14/17 nghiên cứu chứng minh có sự cảithiện về chất lượng tinh trùng và tỉ lệ có thai khi sử dụng antioxidant [38]

Gharagozloo và Aitken (2011) phân tích kết quả của 20 nghiên cứuđánh giá hiệu quả của antioxidant Tổng cộng 19/20 nghiên cứu cho kết quảantioxidant giúp giảm nồng độ ROS, giảm tổn thương DNA tinh trùng, cảithiện chất lượng tinh trùng đặc biệt khả năng di động [39]

Các antioxidant được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu baogồm: vitamin C, vitamin E, kẽm, selenium, acid folic, carnitine,astaxanthin, N-acetyl cysteine Các antioxidant được sử dụng đơn lẻ hoặcphối hợp với các phác đồ khác nhau, thời gian điều trị khác nhau

Hình 1.2 Vai trò của chất kháng oxy hóa 1.3.4 Các phương pháp xác định mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch

Hiện nay có 2 phương pháp chủ yếu để xác định mức stress oxy hóatrong tinh dịch:

Đo nồng độ ROS:

Đo nồng độ ROS đã trở thành một xét nghiệm hữu ích trong việcđánh giá ban đầu cũng như theo dõi mức độ hiếm muộn ở nam giới.Phương pháp gián tiếp được dùng phổ biến hiện nay là phương pháp đohuỳnh quang, sử dụng đầu dò luminol hay lugigen Ưu điểm của nó là cóthể định lượng được toàn bộ hàm lượng ROS trong điều kiện sinh học Tuynhiên hạn chế của phương pháp là không đánh giá được chính xác mức độstress oxy hóa trong tinh dịch

Xác định mức độ stress oxy hóa trong tinh dịch bằng kít Oxisperm:

Nguyên lí của phương pháp dựa trên phản ứng của nitro bluetetrazolium (NBT) trong gel-phản ứng (RG) của kít với anion superoxidetrong tinh dịch tạo tinh thể màu xanh không tan trong nước Sản phẩm củaphản ứng này gắn trên màng tinh trùng và có thể dễ dàng quan sát đượcdưới kính hiển vi quang học Những tinh thể này có thể tăng bắt màu tronggel-phản ứng từ màu vàng tới những màu xanh tím khác nhau, có thể dễ

dàng đánh giá bằng mắt thông qua sử dụng bảng màu

1.4 Gen chuyển hóa gốc tự do CYP1A1 trong cơ thể

Gen này mã hóa 1 enzym là thành viên của họ các enzym CYP450.Gen nằm trên nhánh dài của NST số 15 gồm 6069 cặp base, tại vùng 2băng 4 băng phụ 1 (15q24.1) Gen mã hóa enzym cytochrome P450 làmonooxygenase, trong microsom của gan, enzym này liên quan đến conđường vận chuyển điện tử NADPH Nó oxy hóa các hợp chất bao gồmsteroid, các acid béo, và các dị nguyên từ ngoài cơ thể [40]

Hình 1.3 Vị trí gen CYP1A1 trên NST 15

Bảng 1.3 Một số đột biến của CYP1A1 [41]

CYP1A1*2A và CYP1A1*2B T3801C

Đột biến hay gặp trong nhóm CYP1A1*2B là sự thay đổi nucleotid ở

vị trí A2455G gây biến đổi axit amin Ile462Val tại exon 7 có liên quan tới

vô sinh nam

Trong nghiên cứu của mình, Fritsche E và cộng sự (1998) đã chỉ rarằng một đột biến xảy ra ở exon 7 gây ra sự trao đổi Isoleucin - Valin gâyảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa gốc tự do, tỉ lệ cá nhân bị mắc vô sinhtrong nhóm mang đột biến này cao hơn so với nhóm chứng [42] Aydos S.E

và cộng sự (2009) cũng đã chỉ ra rằng đột biến này gắn với GSTM1 kiểu genrỗng làm tăng nguy cơ vô sinh lên 6.9 lần so với nhóm chứng [43]

1.4 Kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán xác định biến đổi gen

1.5.1 Khái niệm PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) - phản ứng khuếch đại chuỗi gen,

là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng hàng ngày để thu một lượnglớn các bản sao chép của một đoạn DNA trong ống nghiệm PCR được coinhư một máy “photocopy”

Năm 1971, Khorana và cộng sự đã mô tả phương pháp tiếp cậnkhuếch đại một vùng trong chuỗi đôi DNA sử dụng hai cặp mồi được thiết

kế để đầu 3’ của chúng hướng về nhau (Kleppe và CS, 1971) Tuy nhiên,hướng tiếp cận như vậy đã không thành công đến tận 12 năm sau đó, vào