NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO THÂN CÂY AN XOA

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH, CHỐNG OXI HÓA, CỦA CAO THÂN CÂY AN XOA

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

NGUYỄN VĂN THỦY

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO THÂN

CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Tp HCM – 2018

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

NGUYỄN VĂN THỦY

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO THÂN

CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)

Chuyên nghành: Sản xuất và phát triển thuốc

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học: ThS Phan Thị Thanh Thủy

Tp HCM – 2018

Trang 3

Lời cam đoan Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học

Nguyễn Văn Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS Phan Thị Thanh Thủy Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận

là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Văn Thủy

Trang 4

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Lời cảm ơn

LỜI CẢM ƠN

Đề tài được hoàn thành tại bộ môn Hóa dược, trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của thầy cô và bạn bè

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc của mình tới ThS Phan Thị Thanh Thủy, người đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn bộ môn Hóa dược, bộ môn Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Dược - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bài báo cáo này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả

Nguyễn Văn Thủy

Trang 5

i

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 CHI HELICTERES VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHÚNG 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Helicteres 2

1.1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Helicteres 2

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA 13

1.2.1 Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật 13

1.2.2 Đặc điểm thực vật 13

1.2.3 Công dụng chữa bệnh 14

1.2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.2.5 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 15

1.3 CHẤT CHỐNG OXI HÓA 15

1.3.1 Vai trò của chất chống oxi hóa 15

1.3.2 Các chất chống oxi hóa thường gặp 16

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA 18

1.4.1 Phương pháp DPPH 18

1.4.2 Phương pháp FRAP 18

1.4.3 Phương pháp MDA 19

1.4.4 Phương pháp ABTS 19

1.4.5 Phương pháp tổng năng lực khử 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.2 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Dụng cụ, hóa chất 20

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Xác định độ ẩm bột dược liệu 21

2.3.2 Phương pháp xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật 21

Trang 6

ii

2.3.3 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn 23

2.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng phenolic tổng 25

2.3.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 27

2.3.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 30

3.1 CHỈ TIÊU BỘT DƯỢC LIỆU 30

3.1.1 Mất khối lượng do sấy khô 30

3.1.2 Độ ẩm bột dược liệu 30

3.2 SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 30

3.3 CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU VÀ THU CAO PHÂN ĐOẠN 32

3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG PHENOLIC TỔNG 33

3.5 KẾT QUẢ SẮC KÝ LỚP MỎNG CÁC CAO PHÂN ĐOẠN 36

3.6 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA 37

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 KẾT LUẬN 45

4.1.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu 45

4.1.2 Quy trình chiết xuất và thu cao 45

4.1.3 Định lượng phenolic tổng bằng phương pháp Folin – Ciocalteu 45

4.1.4 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của cao trên mô hình DPPH 45

4.2 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 7

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

IC Inhibitory concentration Nồng độ ức chế

Lu1 Human lung carcinoma Dòng tế bào ung thư phổi LNCaP Hormone-dependent human prostate carcinoma Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt MDA Malonyl dialdehyd

Trang 8

ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các hợp chất sesquiterpenoid quinone phân lập từ chi Helicteres 3

Hình 1.2 Các hợp chất naphthoquinone được phân lập từ chi Helicteres 4

Hình 1.3 Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Helicteres 5

Hình 1.4 Các hợp chất alkaloid được phân lập từ chi Helicteres 6

Hình 1.5 Các hợp chất lignan được phân lập từ chi Helicteres 8

Hình 1.6 Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Helicteres 10

Hình 1.7 Các hợp chất cucurbitacin được phân lập từ chi Helicteres 11

Hình 1.8 Các hợp chất khác được phân lập từ chi Helicteres 12

Hình 1.9 Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) 13

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của Vitamin C 16

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của Vitamin E 17

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất để thực hiện sơ bộ thành phần hóa học 22

Hình 2.2 Quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ thân An xoa 24

Hình 2.3 Nguyên tắc phản ứng của phương pháp DPPH 27

Hình 3.1 Kết quả chiết cao tổng và thu cao phân đoạn từ thân An xoa 33

Hình 3.2 Đường chuẩn acid gallic 34

Hình 3.3 Biểu đồ hàm lượng phenolic tổng trong cao tổng và cao phân đoạn 35

Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng cao tổng và các cao phân đoạn 36

Hình 3.5 Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của cao tổng Ethanol 96% 39

Hình 3.6 Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của cao phân đoạn Chloroform 39

Hình 3.7 Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của cao phân đoạn Ethyl acetat 40

Hình 3.8 Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của cao phân đoạn nước 41

Hình 3.9 Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của Vitamin C 42

Hình 3.10 Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của cao tổng và các cao phân đoạn so với Vitamin C 43

Trang 9

iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các hợp chất sesquiterpenoid quinone phân lập từ chi Helicteres 2

Bảng 1.2 Các hợp chất naphthoquinone được phân lập từ chi Helicteres 3

Bảng 1.3 Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Helicteres 4

Bảng 1.4 Các hợp chất alkaloid được phân lập từ chi Helicteres 6

Bảng 1.5: Các hợp chất lignan được phân lập từ chi Helicteres 7

Bảng 1.6: Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Helicteres 8

Bảng 1.7 Các hợp chất cucurbitacin được phân lập từ chi Helicteres 10

Bảng 1.8 Các hợp chất khác được phân lập từ chi Helicteres 11

Bảng 1.9 Khả năng gây độc tế bào của các lignan trong thân cây An xoa 14

Bảng 2.1 Các phản ứng đặc trưng để xác định các nhóm hợp chất 22

Bảng 2.2 Nồng độ cao đem định lượng 25

Bảng 2.3 Quy trình xây dựng đường chuẩn acid gallic 26

Bảng 2.4 Dãy nồng độ pha dung dịch thử gốc 28

Bảng 2.5 Quy trình thử hoạt tính dọn gốc tự do DPPH 29

Bảng 3.1 Kết quả giảm khối lượng do sấy khô 30

Bảng 3.2 Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu 30

Bảng 3.3 Kết quả sơ bộ thành phần hóa thực vật 31

Bảng 3.4 Kết quả chiết cao toàn phần 32

Bảng 3.5 Kết quả chiết cao phân đoạn 32

Bảng 3.6 Tương quan giữa hàm lượng acid gallic và giá trị OD760 nm 33

Bảng 3.7 Hàm lượng phenolic tổng trong cao tổng và cao phân đoạn 34

Bảng 3.8 Thông số thử hoạt tính dọn gốc tự do DPPH trên cao tổng 38

Bảng 3.9 Thông số thử hoạt tính dọn gốc tự do DPPH trên cao Chloroform 39

Bảng 3.10 Thông số thử hoạt tính dọn gốc tự do DPPH trên cao Ethyl acetat 40

Bảng 3.11 Thông số thử hoạt tính dọn gốc tự do DPPH trên cao nước 41

Bảng 3.12 Thông số thử hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của Vitamin C 42

Bảng 3.13 Giá trị IC50 của các mẫu thử 43

Trang 10

Tóm tắt Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - Năm học 2013 – 2018 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO THÂN CÂY AN XOA

(Helicteres hirsuta Lour.)

Tác giả: Nguyễn Văn Thủy Hướng dẫn khoa học: ThS Phan Thị Thanh Thủy

Mở đầu

Những năm gần đây, cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) nổi lên như một thần dược trị

ung thư, được người dân ở Bình Phước sử dụng để điều trị ung thư gan Tuy nhiên hiện nay ở

Việt Nam và trên thế giới vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài cây này Vì vậy nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết

từ thân An xoa, từ đó đưa ra những luận cứ khoa học góp phần giải thích một số tác dụng chữa bệnh cũng như làm tiền đề cho những nghiên cứu sau này

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thân của cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) được thu thập tại

thị trấn Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước

Tiến hành sơ bộ thành phần hóa thực vật dựa trên các phản ứng định tính đặc trưng và thiết lập quy trình chiết cao theo phương pháp ngâm lạnh Cao chiết từ thân cây được sử dụng để khảo sát hoạt tính chống oxi hóa dựa trên hai mô hình: định lượng phenolic tổng bằng phương pháp Folin-Ciocalteu và thử hoạt tính chống oxi hóa trên mô hình DPPH

Kết quả

Trong thân An xoa chứa khá đa dạng các nhóm hợp chất tự nhiên, nhất là flavonoid và

polyphenol Hàm lượng phenolic tổng cao nhất trong trong phân đoạn Ethyl acetat (143,83 μgGAE/mg) tiếp theo là cao tổng Ethanol 96% (51,22 μgGAE/mg), cao phân đoạn Chloroform (47,58 μgGAE/mg) và cao nước (37,67 μgGAE/mg) Hoạt tính chống oxi hóa cao nhất trong phân đoạn Ethyl acetat (IC50 = 20,78 μg/ml) tiếp theo là cao tổng Ethanol 96% (IC50 = 60,85 µg/ml), cao phân đoạn Chloroform (IC50 = 74,56 µg/ml) và cao nước (IC50 = 101,16 µg/ml)

Trang 11

Final essay for the degree of BS Pharm Abstract

Nguyen Van Thuy

Final essay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 - 2018

STUDY ON THE ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE EXTRACTS OF

HELICTERES HIRSUTA LOUR

Nguyen Van Thuy Supervisor: MPharm Phan Thi Thanh Thuy Introduction

In recent years, Helicteres hirsuta L known as a magic drug can cure cancers and used to

treat liver cancer by people in Binh Phuoc province In Vietnam and around the word, however, there is not many study on it’s biological activity Thus, the study carried out to

evaluate the antioxidant activity of extracts of Helicteres hirsuta L for providing scientific

arguments, explaining some of the therapeutic effects and serving as the basis for further studies

Materials and methods

Research subject is the trunk of Helicteres hirsuta L.) harvested in Loc Ninh Town,

Binh Phuoc province

Carry out the preliminary determination of plant chemical compositions based on specific qualitative reactions, and set up the process of cold-soaking extraction Extracts of the plant used to evaluate the antioxidant activity based on the two models: total phenolic content by Folin-Ciocalteu method and Antioxidant activity by DPPH assay

Results

Helicteres hirsuta L contains a variety of natural compounds, especially flavonoid and

polyphenol In the Ethyl acetate fraction, the total phenolic content is highest (143,83 μgGAE /mg), and then 96% total Ethanol extract (51,22 μgGAE/mg), Chloroform fraction extract (47,58 μgGAE/mg), and aqueous extract (37,67 μgGAE/mg) The antioxidant activity is highest in the Ethyl acetate fraction (IC50 = 20,78 μg/ml), followed by 96% total Ethanol extract (IC50 = 60,85 µg/ml), Chloroform fraction extract (IC50 = 74,56 µg/ml) and aqueous extract (IC50 = 101,16 µg/ml)

Trang 12

Folin-1

Đặt vấn đề Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Không chỉ các nước phương Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu Mặc dù công nghệ tổng hợp Hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ tạo ra nhiều loại thuốc khác nhau sử dụng trong công tác phòng và chữa bệnh nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều, song đóng góp của những Dược phẩm có nguồn gốc thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học khi mà xu hướng quay về với những Dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên đang được người bệnh ưu tiên hơn do những lợi ích lâu dài và hiệu quả mà nó mang lại

Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) đã được sử dụng từ lâu trong Y học cổ

truyền Việt Nam để điều trị bệnh như: Thân dùng làm thuốc chữa ung nhọt, giải độc gan; rễ dùng làm dịu đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm và làm thuốc tiêu độc Đặc biệt gần đây, thân của cây An xoa còn được người dân ở thị trấn Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước sử dụng để điều trị ung thư gan

Hiện nay việc sử dụng cây An xoa để điều trị bệnh chủ yếu chỉ dựa trên kinh nghiệm dân gian Tuy rằng trên thế giới đã có một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây An xoa nhưng ở Việt Nam thì những công trình nghiên cứu về loài cây này còn rất ít Hơn nữa, những hiểu biết về hoạt tính sinh học của cây chưa được công bố một cách đầy đủ, đặc biệt là hoạt tính chống oxi hóa và khả năng chống tế bào ung thư

Với những lý do trên, cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) được chọn làm

đối tượng cho đề tài nghiên cứu này với tên đề tài là: “Nghiên cứu hoạt tính chống

oxi hóa của cao thân cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)”, với mục đích tìm hiểu về thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn cao chiết từ thân cây An xoa trồng tại Bình Phước, từ đó cung cấp những dữ liệu khoa học cụ thể để giải thích một số tác dụng chữa bệnh, làm tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về loài cây này cũng như định hướng sử dụng làm nguyên liệu sản xuất Dược phẩm và thực phẩm chức năng

Trang 13

2

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CHI HELICTERES VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHÚNG

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Helicteres

Họ Trôm (Sterculiaceae) là một họ thực vật trong bộ Bông (Malvales) với khoảng 70 chi với hơn 1500 loài cây thân gỗ và cây bụi, phân đó chủ yếu ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt, đặc biệt là ở châu Á, châu Phi và châu Úc [5]

Chi Helicteres là một chi trong họ Trôm (Sterculiaceae), phân bố chủ yếu ở

vùng Trung Mỹ, Đông Nam Á, Đông Á và Ấn Độ Theo phân loại thực vật học, chi

Helicteres bao gồm 134 loài, trong số này chỉ có 35 loài được chấp nhận tên [27]

Ở Việt Nam hiện có 6 loài thuộc chi Helicteres đã được xác định gồm:

- Cây tổ kén tròn – Helicteres isora L

- Cây tổ kén đực – Helicteres angustifolia L

- Cây tổ kén cái (An xoa) – Helicteres hirsuta L

- Cây tổ kén hoa trắng – Helicteres viscida Blume

- Cây tổ kén không lông – Helicteres glabriuscula Wall

- Cây tổ kén lá mác - Helicteres lanceolata A.DC

1.1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Helicteres

H angustifolia

Trang 14

3

1 2

3 4

Hình 1.1 Các hợp chất sesquiterpenoid quinone phân lập từ chi Helicteres

 Các hợp chất naphthoquinone

Từ rễ của loài Helicteres angustifolia các nhà nghiên cứu đã phân lập được 2

hợp chất naphthoquinone mới, chúng đều có cấu trúc khung 3,5,6-trimethylnaphtho(2,3-b)furan-4,9-dione [24]

2,3-dihydro-8-hydroxy-Bảng 1.2 Các hợp chất naphthoquinone được phân lập từ chi Helicteres

5

6

Helicquinone Helicquinone methyl ether

H angustifolia

Trang 15

4

9 8-O-β-D-glucuronyl-hypolaetin 4'-methyl ether H angustifolia

10 Isoscutellarein 4'-methyl ether 8-O-β-D-glucuronide H isora

11 Isoscutellarein 4'-methyl ether 8-O-β-D-glucuronide

13 Isoscutellarein 8-O-β-D-glucuronide 2'',4''-disulfate H isora

14 Isoscutellarein 4'-methyl ether 8-O-β-D-glucuronide

2''-sulfate

H isora

Trang 16

5

7 R1=R4=OH; R2=R6=R7=H; R3=R5=OCH3

8 R1=R3=R5=OH; R2=R4=R6=H; R7=O-Glucoside

9 R1=R3=R6=OH; R2=R7=H; R5=OCH3; R4=O-Glucuronic Acid

10 R1=R3=OH; R2=R6=R7=H; R5=OCH3; R4=O-Glucuronic Acid

Trang 17

6

Trang 18

7

Bảng 1.5: Các hợp chất lignan được phân lập từ chi Helicteres

25 (±)-trans-dihydrodiconiferyl alcohol H hirsuta

Trang 19

8

28 Hình 1.5 Các hợp chất lignan được phân lập từ chi Helicteres

 Các hợp chất triterpenoid

Theo các tài liệu đã công bố, tổng cộng có 15 hợp chất triterpenoid trong chi

Helicteres được phân lập từ loài H angustifolia và H hirsuta [2], [7], [9], [17]

Bảng 1.6: Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Helicteres

29 3β-acetoxy-27-(trans-cinnamoyloxy)lup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester H angustifolia

30 3β-acetoxy-27-[(4-hydroxybenzoyl)oxy]lup-20(29)-en-28-oic acid H angustifolia

31 3β-acetoxy-27-[(4-hydroxybenzoyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid methyl ester H angustifolia

32 3β-acetoxy-27-(benzoyloxy)olean-12-en-28-oic acid methyl ester H angustifolia

33 Cylicodiscic acid (= 3β,27-dihydroxylup-20(29)-en-28-oic acid) H angustifolia

34 3β-O-(trans-coumaroyl)betulinic acid H angustifolia

35 Pyracrenic acid (=3β-O-(trans-caffeoyl)betulinic acid H angustifolia

36 3β-O-(trans-feruloyl)betulinic acid H angustifolia

Trang 20

9

41 3β-hydroxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid H angustifolia

Trang 21

10

45 Cucurbitacin G 2-O-β-D-glucopyranoside H angustifolia

Trang 22

11

Hình 1.7 Các hợp chất cucurbitacin được phân lập từ chi Helicteres

 Các hợp chất khác

Ngoài ra, các nhà nghiên cứu còn phân lập được một số hợp chất steroid,

coumarin, pregnane và phenyl propanoid từ loài H angustifolia và H hirsuta [2],

Trang 23

12

Theo các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Helicteres trong các loài

đã được công bố về thành phần hóa học (H angustifolia, H isora, H hirsuta) đã

phân lập được 53 hợp chất, cho thấy sự có mặt rất đa dạng của các lớp chất trong tự

nhiên (11 nhóm hợp chất), gồm: 4 sesquiterpenoid quinone, 2 naphthoquinone, 3

alkaloid, 15 triterpenoid, 9 lignan, 10 flavonoid, 4 cucurbitacin, 1 coumarin, 1 pregnane, 2 phenyl propanoid và 2 steroid

Trang 24

13

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA

1.2.1 Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật

Tên khoa học: Helicteres hirsuta Lour

Tên Việt Nam: An xoa, tổ kén cái, dó lông

Đặc điểm hình thái: Cây bụi cao 1-3m; nhánh hình trụ, có lông Lá hình trái

xoan dài 5-17cm, rộng 2,5-7,5cm, gốc cụt hay hình tim, đầu nhọn thành mũi nhọn, mép có răng không đều, mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao; cuống lá dài 0,8-4cm; lá kèm hình dải, có lông, dễ rụng Cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá Hoa màu hồng hay đỏ; cuống hoa có khớp và có lá bắc dễ rụng; đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5 răng; cánh hoa 5; cuống bộ nhị có vân đỏ; nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị; bầu có nhiều gợn, chứa 25-30 màu trong mỗi lá noãn Quả nang hình trụ nhọn; hạt nhiều, hình lăng trụ [1]

Hình 1.9 Cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)

Bộ phận dùng: Thân, rễ và lá - Radix et Folium Helicteres hirsuta

Trang 25

14

Sinh thái: Mọc phổ biến trong rừng thưa, ven rừng, trên các bãi hoang, đồi cỏ

ở độ cao từ thấp lên đến 1500m Ra hoa kết quả gần như quanh năm

Phân bố: Khắp nơi, từ Bắc vào Nam Còn có ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc,

Lào, Camphuchia, Thái Lan, Malayxia, Indonesia, Philippines

1.2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về cây An xoa (Helicteres

hirsuta Lour.) Một trong số ít những nghiên cứu được công bố là công trình do

nhóm nghiên cứu người Mỹ, William P Jones và các đồng sự thực hiện năm 2006 Công trình nghiên cứu đã công bố 6 hợp chất được phân lập từ thân của cây An xoa,

đó là: (±)-pinoresinol, (±)-medioresinol, boehmenan, (±)-syringaresinol,

(-)-boehmenan H và (±)-trans-dihydrodiconiferyl alcohol Cả 6 hợp chất này đều có

hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư phổi (Lu1), ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP)

và ung thư vú ở người (MCF-7), trong đó (±)-pinoresinol có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất là hợp chất tiềm năng cho các nghiên cứu về thuốc kháng ung thư sau này [12]

Bảng 1.9 Khả năng gây độc tế bào của các lignan trong thân cây An xoa

Trang 26

15

1.2.5 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Phạm Hồng Ngọc Thùy và các cộng sự (2017) đã khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng phenolic, flavonoid và hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính chống oxi hóa được khảo sát trên 3 mô hình DPPH, ABTS và FRAP Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện chiết tối ưu bao gồm: chiết ở nhiệt độ 60oC trong 35 phút với tỷ lệ nguyên liệu là 1:100 (g/ml) Methanol 40% thu được hàm lượng phenolic và flavonoid tổng cộng cao nhất Để tối ưu hóa thời gian và giảm thiểu lượng dung môi sử dụng nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát bằng phương pháp chiết với sự hỗ trợ của siêu âm nhờ đó đã giảm thời gian chiết xuống còn 25 phút với tỷ lệ nguyên liệu là 3:100 (g/ml) Methanol 40% Phương pháp sấy khô ở 80oC

là phương pháp tốt nhất để duy trì hoạt tính chống oxi hóa Cũng trong năm này nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành khảo sát trên HPLC và xác định được sự có mặt của 19 hợp chất trong lá và 17 hợp chất trong thân cây An xoa [18], [19], [20] Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Duyên và Lê Thanh Phước tại trường Đại học

Cần Thơ (2016) Từ cao chiết thân, lá và hoa của cây An Xoa (Helicteres hirsuta

L.) thu tại Hòn Sơn thuộc xã Lại Sơn, huyện Kiên Hải, tỉnh Kiên Giang Nghiên cứu đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan) đối với bốn phân đoạn cao khác nhau: Petroleum ether (PE), Dichloromethane (DC), Ethyl acetate (EA), Methanol (MeOH) Kết quả có hai cao có biểu hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2 là cao PE và cao DC Từ cao DC đã cô lập được 4 hợp chất: stigmasterol, lupeol, apigenin và tiliroside Cấu trúc hóa học các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) kết hợp với

so sánh tài liệu tham khảo đã công bố [2]

1.3 CHẤT CHỐNG OXI HÓA

1.3.1 Vai trò của chất chống oxi hóa

Chất chống oxi hóa là những chất làm vô hiệu hóa tác động của gốc tự do Cụ thể hơn, các chất chống oxi hóa có electron dư thừa để cung cấp cho gốc tự do, chất chống oxi hóa chuyển những electron thừa của chúng cho những gốc tự do biến chúng thành những phân tử cân bằng, làm mất đi tính thiếu ổn định và dễ gây phản

Trang 27

16

ứng hóa học với những phân tử khác, nhờ vậy làm vô hiệu hóa tác hại của gốc tự

do

Chất chống oxi hóa ức chế quá trình oxi hóa, thậm chí ở nồng độ tương đối nhỏ và do đó có vai trò sinh lý khác nhau trong cơ thể Thành phần chống oxi hoá trong các loài thực vật có vai trò sàng lọc gốc tự do và giúp chuyển đổi các gốc tự

do Một loạt các chất chống oxi hóa sàng lọc gốc tự do được tìm thấy trong các nguồn thực phẩm như trái cây, rau và trà,…

1.3.2 Các chất chống oxi hóa thường gặp

 Vitamin C (acid ascorbic)

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của Vitamin C

Vitamin C hay acid ascorbic là một dẫn xuất của đường hexose với 6 carbon

và không thể tổng hợp ở bộ linh trưởng Nguồn thực phẩm chứa nhiều Vitamin C bao gồm các loại trái cây, đặc biệt là nho, họ cam chanh, các loại rau… Do cấu trúc vòng đối xứng, nên Vitamin C có thể tồn tại ở bốn cấu trúc lập thể, nhưng chỉ có L-ascorbic acid là có hoạt tính sinh học Vitamin C đại diện cho hàng rào chống oxi hoá trong máu, có khả năng phản ứng với hầu hết các loại oxi và có thể làm ngưng các chuỗi phản ứng của gốc tự do Chức năng chủ yếu của vitamin C là sự sản xuất collagen, một protein chính của cơ thể Đặc biệt, vitamin C giúp nối kết một phần của phân tử amino acid proline để hình thành hydroxyproline Kết quả là, sự cấu trúc nên collagen rất ổn định vitamin C còn hết sức cần thiết cho sự lành vết thương, sự mạnh khỏe của nướu răng, và ngăn ngừa các mảng bầm ở da Thêm vào

đó, vitamin C còn có chức năng miễn dịch, tham gia sản xuất một số chất dẫn

Trang 28

17

truyền thần kinh và hormon, tổng hợp carnitine, hấp thụ và sử dụng các yếu tố dinh dưỡng khác [22]

δ-tocotrienol, R 1 =R 2 =R 3 =H

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của Vitamin E

Vitamin E là hợp chất hoà tan chủ yếu trong lipid, lần đầu được phát hiện vào năm 1936 Trong thực phẩm, các nguồn phổ biến nhất chứa vitamin E là các loại dầu thực vật như cọ dầu, hướng dương, ngô, đậu tương, ô liu và mầm lúa mì Các nguồn khác có hạt ngũ cốc, cá, bơ lạc, các loại rau lá xanh Vitamin E có 8 hình thức trong tự nhiên, có thể chia thành hai dòng hợp chất là tocopherol và tocotrienol (gọi chung là tocol) Trong 8 hình thức của Vitamin E, chỉ có α-tocopherol được chuyên chở trong máu và được xem là một hình thức hoạt động Việc rối loạn nghiêm trọng chức năng tuyến tuỵ và mật hoặc sự kém hấp thu lipid có thể là do ảnh hưởng đến sự hấp thụ Vitamin E Khi ở trong máu, Vitamin E gắn kết huyết tương mang protein, vận chuyển đến gan, đưa vào lipoprotein, đặc biệt là nơi nồng

độ lipoprotein thấp và được bài tiết vào máu [22]

 Các hợp chất polyphenol

Polyphenol là những hợp chất chuyển hoá thứ cấp và thường liên quan đến bảo vệ chống lại bức xạ tia cực tím hoặc sự tấn công của các mầm bệnh Trong thực vật, Polyphenol góp phần tạo nên sự cay đắng, chát, màu sắc, hương vị, mùi và chất chống oxi hoá ổn định Đến cuối thế kỉ 20, các nghiên cứu về dịch tễ học và phân

Trang 29

18

tích tổng hợp đã cho rằng việc sử dụng lâu dài chế độ ăn có chứa Polyphenol sẽ cung cấp một số chất chống lại ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, loãng xương và bệnh thoái hoá thần kinh

Có hơn 8000 hợp chất Polyphenol khác nhau đã được tìm thấy trong các loài thực vật khác nhau Tất cả các hợp chất phenolic đều được sinh ra từ chất trung gian phổ biến phenylalanine, hoặc từ một tiền thân như acid shikimic Chủ yếu xảy ra ở hình thức liên hợp với một hoặc nhiều bã đường liên kết với các nhóm hydroxyl Sự liên kết với các hợp chất khác, như cacboxylic và axit hữu cơ, các amin, lipid và liên kết với phenol khác cũng phổ biến Polyphenol có thể được phân loại thành các nhóm khác nhau theo chức năng của vòng phenol Các nhóm chính của Polyphenol bao gồm: acid phenolic, flavonoid, stilbene và lignan [21]

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA

1.4.1 Phương pháp DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch Methanol bão hoà Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường

độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dung dịch mẫu thử so với đối chứng khi đọc trên máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 517 nm [6]

1.4.2 Phương pháp FRAP

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hoá trong việc khử phức Fe3+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+ - TPTZ (màu xanh) trong môi trường acid Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy trong nguyên liệu Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng

593 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene) Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxi hóa, các chất chống oxi hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ Kết quả tính toán là mmol Fe2+/g chất khô Do đó, khi kết quả tính toán ra lớn thì

Trang 30

19

chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử

có thể nhường điện tử là cao Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxi hóa có thể khử nhiều phức Fe3+ - TPTZ cùng lúc Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP [4]

1.4.3 Phương pháp MDA

Xác định khả năng ức chế peroxi hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxi hóa lipid màng tế bào MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm [23]

1.4.4 Phương pháp ABTS

Thử nghiệm đánh giá khả năng ngăn chặn sự tạo thành sản phẩm oxi hóa có màu (734 nm) của muối ABTS [2,2’-azisbonis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) diammonium] của các chất thử nghiệm Mức độ làm giảm cường độ hấp thu ở

734 nm nói lên khả năng chống oxi hóa của chất thử nghiệm [14]

1.4.5 Phương pháp tổng năng lực khử (reducing power)

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hoá trong việc khử phức K3[Fe(CN)6] thành phức

K4[Fe(CN)6], phức này tác dụng với FeCl3 thành KFe[Fe(CN)6] Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxi hóa có trong nguyên liệu Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 690 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch acid ascorbic [4]

Trang 31

20

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học

Kết quả và biện luận

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu để nghiên cứu là thân cây An xoa được thu thập vào tháng 6 năm

2018 tại thị trấn Lộc Ninh, tỉnh Bình Phước Mẫu thực vật gồm lá, hoa, quả và thân cây An xoa được đối chiếu với tài liệu của TS Võ Văn Chi [1] Kết quả nhận định

đây chính là cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) thuộc họ Trôm (Sterculiaceae)

Mẫu thân cây tươi sau khi sơ chế được sấy ở nhiệt độ 80oC tới khi độ ẩm dưới 10% Mẫu khô sau đó được xay nhỏ cho phù hợp với yêu cầu của từng thí nghiệm

và được bảo quản trong dụng cụ thích hợp

2.2 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

- Hóa chất: Acid acetic, Na2CO3, NH4OH, FeCl3, HCl, H2SO4, KOH, Mg

- Các thuốc thử: Fehling, Mayer, Hager, Dragendorff, Bouchardat, Bertrand, Folin-Ciocalteu, DPPH

- Chất chuẩn: Vitamin C (99,7%), Acid gallic (98%)

- Bản mỏng tráng sẵn (Silicagel- Merck)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy siêu âm Hwashin Technology Power sonic 410 (Hàn Quốc)

- Đèn UV Spectroline Model CM-10A (Mỹ)

- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Tủ lạnh ALASKA

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Máy cô quay chân không IKA RV 10

- Máy đo quang phổ SHIMADZU – JAPAN Model 1800

- Tủ hút khí độc

Trang 32

21

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xác định độ ẩm bột dược liệu

- Cân trọng lượng bì

- Cân chính xác vào bì khoảng 2g mẫu

- Sấy mẫu ở áp suất thường ở 105oC trong 4 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm và đem cân trọng lượng sau khi sấy Ghi lại lượng cân

- Tiếp tục sấy mẫu ở áp suất thường, 105oC trong 2 giờ, để vào bình hút ẩm chờ nguội và cân lại trọng lượng sau khi sấy Lặp lại nhiều lần, mỗi lần sấy 2 giờ, cho đến khi khối lượng không thay đổi

- Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức sau:

𝑋 =𝑎 − (𝑏 − 𝑐)

X: độ ẩm mẫu thử (%)

a: Khối lượng ban đầu của mẫu thử (g)

b: Khối lượng của mẫu + bì sau cùng (g)

c: Khối lượng bì (g)

2.3.2 Phương pháp xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật

 Sơ đồ chiết xuất

Dựa vào độ hòa tan của các nhóm hợp chất trong dược liệu để tách chúng bằng những dung môi có độ phân cực tăng dần từ: kém phân cực, phân cực trung bình, phân cực mạnh bằng cách chiết lần lượt với các dung môi: Diethyl eter, Ethanol 96% và nước (hình 2.1) [3]

Trang 33

22

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất để thực hiện sơ bộ thành phần hóa học

chất Thuốc thử/cách phát hiện Phản ứng dương tính

Acid béo Nhỏ dung dịch lên giấy Vết trong mờ

dương đậm

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	1,99 MB