Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol a alisol b23 acetat trong dược liệu trạch tả ( alisma plantago aquatica) trồng tại việt nam

AB23 đã được chứng minh có tác dụng lợi tiểu, chống viêm gan nhiễm mỡ không do rượu, giảm ung thư buồng trứng, chống dị ứng… Alisol A ngoài hướng tác dụng chủ yếu trên tế bào viêm gan cò

Trang 1

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐỖ THỊ THU TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH

VÀ ĐỊNH LƯỢNG ALISOL A & ALISOL

B 23 – ACETAT TRONG DƯỢC LIỆU

TRẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica)

TRỒNG TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội 2018

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐỖ THỊ THU TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH

VÀ ĐỊNH LƯỢNG ALISOL A & ALISOL

B 23 – ACETAT TRONG DƯỢC LIỆU

TRẠCH TẢ (Alisma plantago – aquatica)

TRỒNG TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn: 1 TS Nguyễn Thị Phương

2 Ths Nguyễn Thúc Thu Hương

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Thị Phương (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) và Ths Nguyễn Thúc

Thu Hương (Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược,

ĐHQGHN) là những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đưa ra những ý kiến quý báu để em hoàn thiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và PGS.TS

Phương Thiện Thương đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để

em hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích –

Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân và anh Lê

Ngọc Duy – là những người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong suốt

quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dược đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường

Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Đỗ Thị Thu Trang

Trang 4

MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.) 2

1.1.1 Tên khoa học 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.3 Bộ phận dùng 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Một số tác dụng dược lý 7

1.2 Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat 9

1.2.1 Tổng quan về alisol A 9

1.2.2 Tổng quan về alisol B 23 – acetat 11

1.3 Một số nghiên cứu định tính, định lượng AA và AB23 trong Trạch tả 13

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới 13

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước 14

1.3.3 Tiêu chuẩn về dược liệu Trạch tả trong một số Dược điển 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Hóa chất và dung môi 17

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng 17

2.2.2 Định lượng AA bằng HPLC 17

2.2.3 Phân tích mẫu thực 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng 18

Trang 5

2.3.3 Phân tích mẫu thực 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Định tính AA và AB23 bằng TLC 23

3.1.1 Định tính AB23 23

3.1.2 Định tính AA 24

3.1.3 Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng 25

3.2 Định lượng AA bằng HPLC 27

3.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 27

3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 28

3.2.4 Thẩm định phương pháp định lượng 30

3.3 Ứng dụng phương pháp 35

3.4 Bàn luận 35

3.4.1 Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Trạch tả ở Việt Nam 35 3.4.2 Xây dựng phương pháp định tính 36

3.4.4 Phương pháp định lượng 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 6

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết

AB23 Alisol B 23 - acetate Alisol B 23 - acetat

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà Hóa phân tích

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Limid of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limid of Qualification Giới hạn định lượng

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

Trang 7

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định

2 Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển

4 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết 28

5 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 29

6 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết 29

7 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống 31

8 Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích

pic của AA

32

9 Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại 33

10 Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 34

11 Bảng 3.8 Kết quả định lượng AA trên một số mẫu

Trạch tả

35

Trang 8

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Trạch tả 2

2 Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả 3

3 Hình 1.3 Công thức một số triterpenoid trong thân

7 Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23 11

8 Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại

Viện Dược liệu

14 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn 30

15 Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của

16 Hình 3.8 Sắc ký đồ nền mẫu thử tại LOD 32

Trang 9

Nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong Trạch tả là các hợp chất

triterpenoids, trong đó có alisol A và alisol B 23 - acetat AB23 đã được chứng minh có tác dụng lợi tiểu, chống viêm gan nhiễm mỡ không do rượu, giảm ung thư buồng trứng, chống dị ứng… Alisol A ngoài hướng tác dụng chủ yếu trên tế bào viêm gan còn có tác dụng khác như kháng khuẩn, tăng cường miễn dịch…

Ở Việt Nam, việc đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả thường được

sử dụng theo Dược điển Việt Nam IV, tuy nhiên các tiêu chuẩn còn hạn chế, chưa đáp ứng được yêu cầu đánh giá nên chất lượng dược liệu Trạch tả trên thị trường chưa được đảm bảo Các nghiên cứu về phân tích thành phần hóa học trên thế giới hầu hết đều sử dụng alisol B 23 - acetat làm tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả Tuy nhiên, ngoài alisol B 23 - acetat thì alisol

A cũng chiếm hàm lượng lớn, có nhiều tác dụng quý với tiềm năng nghiên cứu, phát triển để ứng dụng trong điều trị Vì vậy, alisol A cũng là một thành phần quan trọng, có thể sử dụng làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả

Từ những thực tiễn trên, nhằm xây dựng một phương pháp đánh giá

chất lượng dược liệu Trạch tả, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng

phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23 - acetat

trong dược liệu Trạch tả (Alisma plantago – aquatica) trồng tại Việt

Nam” với mục tiêu:

- Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23 – acetat trong dược liệu Trạch tả trồng tại Việt Nam

- Áp dụng phương pháp phân tích trên một số mẫu Trạch tả

Trang 10

Cụm hoa mọc trên một cán thẳng dài có khi đến 1m thành chùy có nhiều vòng hoa xếp thành tầng nhỏ dần về phía ngọn, mỗi tầng phân nhánh thành những chùy nhỏ; hoa lưỡng tính, màu trắng hay hồng, đài có 3 răng màu lục, tồn tại đến khi thành quả; tràng hoa 3 cánh có 1 cựa màu vàng nhạt rất mỏng và rụng sớm; nhị 6 – 9, dẹt, bầu nhiều ô xếp thành một vòng, mỗi ô

có một noãn, vòi nhụy mảnh dễ rụng

Quả bế dẹp, dạng màng, có đài tồn tại

Mùa hoa quả: tháng 10 – 12

Chi Alisma L có khoảng 10 loài, phân bố rải rác từ vùng nhiệt đới đến vùng cận nhiệt đới và ôn đới ẩm Trạch tả có nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam Hiện đã biết có hai loài được dùng làm thuốc là Trạch

tả (A plantago – aquatica L.) và loài A canaliculatum Ở Việt Nam, Trạch tả

chỉ thấy trồng ở các tỉnh như Thái Bình, Hà Nam, Hải Dương, Hưng Yên [4]

Trang 11

1.1.3 Bộ phận dùng

Dược liệu Trạch tả là thân rễ của cây Trạch tả: Thân rễ thu hoạch vào tháng 4-5 khi cây chuyển sang màu vàng Loại bỏ rễ con, cạo vỏ ngoài và rửa sạch, phơi hay sấy khô

Khi dùng, ủ thân rễ cho mềm, thái lát, phơi khô (dùng sống) hoặc tẩm muối (100 g Trạch tả với 2 g muối ăn hòa trong 60 ml nước), sao vàng [4]

Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả [56]

1.1.4 Thành phần hóa học

Ở Trạch tả, thân rễ là bộ phận truyền thống được sử dụng trong Y học

cổ truyền nên hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào các thành phần hóa học ở thân rễ

Theo các nghiên cứu đã được công bố trước đây, các terpenoid được coi là thành phần chính trong Trạch tả [17] Với hợp chất đặc trưng là triterpenoid protostane (alisol A – F và dẫn xuất) và sesquiterpenoid guaiane (alismol, alismoxide, orientalols A – F và orientalols sulfat) Ngoài ra, Trạch

tả cũng chứa một lượng nhỏ diterpenoid, flavonoid, alkaloid, asparagine, phytosterol, acid béo và nhựa

Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học trong thân rễ Trạch tả còn ít Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc

ký kết hợp đã phân lập được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca - 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester, AA, AA

24 – acetat và alisol G [2]

Trang 12

1.1.4.1 Các triterpenoid

Các triterpenoid được coi là thành phần chính có hoạt tính sinh học trong

rễ Trạch tả Đến nay, 55 triterpenoid đã được phân lập và xác định cấu trúc

Ngay từ năm 1968, Murata và cộng sự đã phân lập được AA (1), alisol

A 24 – acetat (2), alisol B (3), AB23 (4) và alisol E (5) từ thân rễ Trạch tả [30] Sau đó, 4 hợp chất đã biết và hợp chất mới là alisol C 23 – acetat (6) được tách ra từ chiết xuất methanol của thân rễ [31] Alisol O (7) và alisol P

(8) được phân lập năm 2008 [53] Gần đây, năm 2012 Jin và cộng sự đã phân

lập được một triterpenoid mới là alisol Q 23 – acetat (9) [18]

(6) alisol C 23 – acetat O H OH H O OAc

Trang 13

Cho đến nay, mới chỉ có 3 diterpenoid được phân lập và xác định Năm

1994, kaurane-2,12-dione (10) được phân lập từ thân rễ Trạch tả bởi

Nakajima và cộng sự [32] Sau đó, Peng và cộng sự phân lập được hai

diterpenoid mới là oriediterpenol (11) và oriediterpenoside (12) từ thân rễ

Alismol (13) và alismoxide (14) thuộc nhóm guaiane là các

sequiterpenoid đầu tiên được phân lập, bởi Yoshiteru và cộng sự (1983) [33]

Hai germaraerane sequiterpenes (germaraerane C (15) và germaraerane D

(16)) và dẫn chất của alismol (orientalol A (17), B, C và sulfoorientalol A, B (18), C, D) [45] [46] Năm 1994, Nakajima và cộng sự đã phân lập được hai

sesquiterpenes là 10-O-methyl-alismoxit (19) và eudesma-4(14)-en-1,6-diol

(20) trong Trạch tả đã qua chế biến [32] Năm 2001, orientalol E (21) thuộc

nhóm oplopanane được phân lập bởi Peng và cộng sự [34]

Trang 14

Năm 1993, Tomoda và cộng sự phân lập được alisman PIIIF thuộc dẫn chất polysaccharides [39] Sau đó, 2 polysacchrides khác được phân lập là alisman PII và alisman SI [37,40]

Ngoài ra, trong Trạch tả còn xác định được một số chất khác như:

Trang 15

1.1.5 Một số tác dụng dƣợc lý

 Lợi tiểu

Trạch tả đã được sử dụng lâu đời trong Y học cổ truyền Trung Hoa với mục đích điều trị thiểu niệu Nghiên cứu trên chuột cho thấy dịch chiết EtOH Trạch tả và alisol A 24-acetat ở liều 20 mg/kg làm tăng đáng kể lượng nước tiểu nhưng thấp hơn hydroclothiazid [40,41] Nghiên cứu trên chuột Sprague-Dawley cho thấy dịch chiết ethanol Trạch tả có tác dụng lợi tiểu ở liều thấp (2,5 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg) nhưng ở liều cao (20, 40 và 80 mg/kg) lại làm giảm đáng kể lượng nước tiểu [9]

Tương tự, khi khảo sát với các dịch chiết khác, cho thấy: Dịch chiết

n-butanol (12,5; 25 và 50 mg/kg) và ethyl acetat (100; 400 mg/kg) làm tăng

lượng nước tiểu Dịch chiết n-butanol (75; 100 mg/kg) và ethyl acetat (800

mg/kg) làm giảm lượng nước tiểu [7]

Điều đó cho thấy tác động sinh học trên thận của các dịch chiết Trạch

tả ở các hàm lượng khác nhau là khác nhau, nên liều lượng sử dụng cần được chú ý nhiều hơn trong các ứng dụng lâm sàng

Gần đây, nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2017) nhằm đánh giá tính tương thích giữa năm triterpen chính trong Trạch tả với tác dụng lợi tiểu Kết quả cho thấy tỷ lệ thành phần thích hợp nhất trong hoạt động lợi tiểu là: AB23 : alisol B : alisol A 24-acetate : AA : alisol C 23-acetate (7.2: 0.6: 2.8: 3.0:

6.4) [52]

 Hạ Lipid máu

Từ năm 1970, các thí nghiệm trên chuột Sprague-Dawley cho thấy tác dụng hạ lipid máu khi dùng alisol A 24-acetat liều 425 mg/kg [16] Nghiên cứu gần đây trên chuột tăng lipid máu cho thấy Trạch tả liều 2,26 g/kg/ngày làm giảm nồng độ cholesterol và triglyceride trong huyết thanh và gan, nhưng làm tăng nồng độ HDL huyết thanh Từ đó, người ta cho rằng Trạch tả làm giảm sự tổng hợp cholesterol ở gan thay vì làm tăng quá trình chuyển hóa cholesterol [10]

Một nghiên cứu khác trên chuột gây đột biến gen apoE và làm tăng sự biểu hiện heparan sulfate proteoglycan ở gan cho thấy Trạch tả và simvastatin

Trang 16

ở liều 10 lần so với liều sử dụng trên người có ý nghĩa điều trị với chứng xơ vữa động mạch, khi làm giảm đồng thời cholesterol toàn phần và LDL [35]

Nhìn chung, Trạch tả có thể làm giảm cholesterol trên chuột để dự phòng tăng lipid máu Tuy nhiên các nghiên cứu còn hạn chế để ứng dụng trong điều trị lâm sàng

 Hạ đường huyết

Từ lâu đời, Trạch tả đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị tiểu đường Nghiên cứu cho thấy các triterpenes loại protostane có hoạt tính hạ đường huyết thông qua cơ chế ức chế hoạt động α-glucosidase và thúc đẩy sự hấp thu glucose, mà không làm tăng adipogenesis như thiazolidinediones [23] Tuy nhiên, các thử nghiệm mới được thực hiện

trên in vitro và cần được nghiên cứu sâu hơn trên cơ thể người để ứng dụng

trong lâm sàng

 Ức chế hình thành sỏi thận

Tác dụng ức chế sự hình thành sỏi thận đã được chứng minh bằng các nghiên cứu dược lý hiện đại trên chuột Nghiên cứu cho thấy khi cho một nhóm chuột được điều trị trong 4 tuần với 0,5 mL/kg triterpenoids thì hàm lượng canxi trong mô thận, lượng canxi bài tiết trong nước tiểu 24h, creatinin huyết thanh và nồng độ ure trong máu giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng [6,29] Nghiên cứu bởi Cao và cộng sự cũng cho thấy, khi sử dụng 1 mL/ngày các thành phần có hoạt tính của Trạch tả trong 28 ngày có thể làm giảm sự hình thành canxi oxalate

ở thận [5]

 Tăng cường miễn dịch

Tác động của Trạch tả trên hệ miễn dịch đã được đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997 Nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol Trạch tả liều 50 mg/kg, 200 mg/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có hiện tượng arthus Những kết quả chỉ ra rằng dịch chiết Trạch tả có ảnh hưởng trên các phản ứng dị ứng khác nhau, đặc biệt là dị ứng loại III [20]

Nghiên cứu bởi Lee và cộng sự (2012) cho thấy dịch chiết EtOH 70% của Trạch tả ức chế đáng kể 5 – lipoxygenase, chất xúc tác quá trình sản xuất leukotriene từ bạch cầu ưa base ở chuột và sự giải phóng β-hexosaminidase

Trang 17

bởi các tế bào kháng nguyên RBL-2H3 Nó cũng làm suy yếu phản ứng quá mẫn muộn ở chuột [21]

 Chống viêm

Hoạt động chống viêm của Trạch tả mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây Khi cho chuột uống dịch chiết Trạch tả liều 0,3 g/kg hoặc 1,2 g/kg trong 14 ngày, sau đó gây tồn thương phổi bằng cách tiêm lipopolysaccharide (0,01 g/kg) Nhận thấy có sự cải thiện tổn thương phổi cấp đáng kể do tác động ức chế sự xâm nhập của bạch cầu trung tính, ức chế sự biểu hiện gen COX – 2, IL – 1B [14] Nghiên cứu khác bởi Kim và cộng sự (2013) cũng cho kết quả, chiết xuất Trạch tả giúp tăng tỷ lệ sống sót ở chuột ngay cả với liều độc lipopolysaccharide [19]

 Chống khối u

Trong nghiên cứu của Fong và cộng sự (2007) cho thấy tác dụng ức chế hiệp đồng tăng lên khi kết hợp dịch chiết Trạch tả 25 mg/mL với thuốc chống ung thư: actinomycin D, puromycin, paclitaxel, vinblastine và doxorubicin, trên quá trình biểu hiện P-glycoprotein [12] AB23 được coi như ứng cử viên tiềm năng cho việc đảo ngược hiện tượng đa kháng thuốc trên bệnh nhân ung thư [41]

1.2 Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat

1.2.1 Tổng quan về alisol A

1.2.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của AA

Công thức phân tử: C30H50O5Tên khoa học (IUPAC): (5R, 8S, 9S,10S, 11S, 14R) – 11 – hydroxy – 4,4,8,10,14 – pentamethyl – 17 – [(2R, 4S, 5R) – 4,5,6 – trihydroxy – 6 –

Trang 18

methylheptan – 2 – yl] – 1,2,5,6,7,9,11,12,15,16 – decahydrocyclopentan [a] phenathren – 3 – one

Tên thông thường: alisol A Tính chất: - Dạng bột, màu trắng, không mùi, nóng chảy ở 90 - 910C

- Trọng lượng phân tử: 490,725 g/mol

1.2.1.2 Tác dụng dược lý

 Chống virus viêm gan B

Nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh rằng những thay đổi đơn giản trong cấu trúc gốc AA có thể tạo ra một số dẫn xuất tiềm năng chống lại HBV 40 dẫn xuất của AA được tổng hợp và khảo sát trong ảnh hưởng chống virus viêm gan B in vitro Và thu được 14 chất tiềm năng [50] Hợp chất 6a cho hoạt tính cao chống lại sự biểu hiện của kháng nguyên HBV bề mặt (IC50= 0,024 mM), kháng nguyên HBV e (IC50=0,028 mM) (SIHBsAg >108, SIHBeAg > 93) [49]

Thử nghiệm khác trên 32 dẫn xuất tetra-acyl hóa của AA cho thấy các hợp chất A1, A23, A24 có hoạt tính cao chống lại sự tiết kháng nguyên bề mặt HBV với giá trị IC50 tương ứng là 0,0048, 0,0044, 0,014 mM, kháng nguyên HBV e với giá trị IC50 tương ứng 0,011, 0,012, 0,018 mM; SIHBsAg

> 333, SIHBeAg > 145; SIHBsAg = 209, SIHBeAg = 77; SIHBsAg > 200, SIHBeAg > 156 Nghiên cứu bổ sung trên chuột cho thấy hợp chất A1 có lợi ích về dược động học (t1/2=1,63h) (F=40,9%) [51]

Trang 19

Nghiên cứu gần đây bởi Ma và cộng sự (2016) cho thấy AA có hoạt

tính kháng khuẩn chống lại các chủng Gram dương Bacillus subtilis và

Staphylococcus aureus với giá trị MIC là 12,5-100mg/mL [25]

 Tăng cường miễn dịch

Nghiên cứu đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997 cho thấy AA hàm lượng 0,05mmol/kg, 0,2mmol/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có hiện tượng arthus [20]

1.2.2 Tổng quan về alisol B 23 – acetat

1.2.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23

Công thức phân tử: C32H50O5Tên khoa học (IUPAC): [(1S,3R)-1-[(2R)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-3-[(5R,8S,9S,10S,11S,14R)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo-

1,2,5,6,7,9,11,12,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]

acetate

Tên thông thường: alisol B 23 - acetat Tính chất: Dạng bột, màu trắng Trọng lượng phân tử: 514,747 g/mol

Trang 20

Một nghiên cứu khác chứng minh tác dụng bảo vệ của AB23 chống lại độc tính gan và ứ mật gây ra bởi 17α-ethinylestradiol (EE) AB23 làm giảm tổng hợp acid mật thông qua việc ức chế biểu hiện gen Cyp7a1 và Cyp8b1, làm tăng chuyển hóa acid mật qua việc kích thích biểu hiện gen Sult2a1 [26] AB23 cũng giúp tăng sinh tế bào gan, có tiềm năng trở thành lựa chọn điều trị mới ở những bệnh nhân cắt gan [27], kháng virus viêm gan B [17]

 Kháng tế bào ung thƣ buồng trứng

Năm 2016, Zhang và cộng sự đã tiến hành xét nghiệm MTT cùng với việc phân tích chu trình tế bào để đánh giá khả năng tồn tại của tế bào ung thư buồng trứng sau khi điều trị với AB23 Kết quả cho thấy AB23 ức chế đáng

kể biểu hiện của cả ba dòng tế bào ung thư buồng trứng, giảm mức độ biểu hiện của các protein CDK4, CDK6 và cyclin D, ngăn chặn chu trình tế bào ở pha G1 AB23 ức chế quá trình tăng sinh, di căn và xâm lấn của các tế bào ung thư buồng trứng [48]

 Các tác dụng khác:

Ngoài ra, AB23 còn có tác dụng kháng khuẩn [18], chống dị ứng [21],

ức chế miễn dịch [47], ức chế quá trình kháng thuốc qua trung gian glycoprotein [41]…

Trang 21

P-Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định lượng AA và AB23 trong

Trạch tả

24-acetate và AB23

- Dung môi chiết: MeOH

- Phương pháp chiết: Siêu âm

- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 × 250mm; 5µm ) + Pha động: ACN:W (65:35)

+ Bước sóng phát hiện: 210 nm và 254 nm + Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

+ Nhiệt độ cột: 35OC

+ Thể tích tiêm mẫu: 10µL

và AB23

- Dung môi chiết: ACN

+ Bước sóng phát hiện: 208 nm + Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút + Nhiệt độ cột: 25OC

+ Bước sóng phát hiện: 215 nm + Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

Trang 22

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu Trạch tả còn rất ít

Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc

ký kết hợp đã phân lập và xác định được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca - 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester,

AA, AA 24 – acetat và alisol G [2]

1.3.3 Tiêu chuẩn về dược liệu Trạch tả trong một số Dược điển

Hiện nay, đã có nhiều quốc gia đưa chuyên luận dược liệu Trạch tả vào

quy định trong Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam…

Dược điển Trung Quốc (2015) quy định sử dụng HPLC để định lượng

AB23 trong thân rễ Trạch tả Quy trình xử lý mẫu như sau: 0,5 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 25 ml ACN trong 30 phút Hệ dung môi pha động

sử dụng là ACN:W (73:27, v/v), detector UV ở bước sóng 208nm, cột C18

Dược điển Trung Quốc quy định, mẫu thử phải có chứa ít nhất 0,050% AB23 tính theo mẫu khô kiệt [9]

Dược điển Hồng Kông cũng sử dụng HPLC để định lượng alisol B

monoacetate: 1 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 20 mL MeOH trong

30 phút Detector UV ở bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút Pha động được lựa chọn là ACN:W với chương trình rửa giải:

Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển Hồng Kông

Dược điển Hồng Kông cũng quy định, mẫu phải có chứa ít nhất 0,082% alisol B monoacetat [38]

Trang 23

Trong chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV), chưa có quy định về chỉ tiêu định lượng hoạt chất chính, chỉ có các quy định về các tiêu chí thông thường:

độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid Vì vậy, chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV) chưa đánh giá chính xác được chất lượng dược liệu Trạch tả Việt Nam cũng như mẫu nhập khẩu

Trang 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Trạch tả được thu hái tại Ninh Bình và lưu trữ tại Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu từ tháng 3/2018 Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành thu thập các mẫu dược liệu Trạch tả tại một số cơ sở trên thị trường Hà Nội để tiến hành áp dụng phương pháp đã xây dựng

Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại Viện Dược liệu

Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả

2 M2 Nguyễn Thị Ban 32 Lãn Ông

3 M3 Nguyễn Thị Sáu 54 Lãn Ông

Trang 25

2.1.2 Hóa chất và dung môi

Chất chuẩn AA do hãng Biopurify Phytochemicals Ltd cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%

Chất chuẩn AB23 do hãng Sigma – Aldrich cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%

Các dung môi hóa chất dùng cho phân tích HPLC đều đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết của hãng Merck

Các dung môi hóa chất dùng cho xử lý mẫu đều đạt chuẩn tinh khiết phân tích

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Cân phân tích (Sartorius, BP-221S)

Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M)

Tủ sấy (Memmert, ULM 500)

Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45)

Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (Vilber lourmat,

CN-15-LC)

Máy chấm sắc ký (CAMAG Linomat 5)

Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Shimadzu): Bơm 20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-

LC-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A Shimadzu

Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

Trang 26

+ Dung môi chiết + Tỷ lệ dung môi chiết

+ Thời gian chiết

2.2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích

- Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu âm với

30 ml MeOH trong 30 phút, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, cô cạn dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, thu được dịch dùng để chấm sắc

ký lớp mỏng [38]

Dung dịch đối chiếu:

- Cân khoảng 1 mg chuẩn AA, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH

- Cân khoảng 1 mg chuẩn AB23, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH

Trang 27

+ Định tính AA:

Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1)

Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)

Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1) + Định tính AB23:

Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)

Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)

Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)

- Thuốc thử: acid sulfuric 10% trong ethanol

2.3.2 Định lƣợng AA bằng HPLC

2.3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử:

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu Trạch tả cho

vào ống ly tâm 50 ml, thêm chính xác khoảng 25 ml EtOH Đem siêu âm trong 30 phút Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm

Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc AA bằng cách cân chính

xác khoảng 5 mg chuẩn AA, hòa tan trong chính xác khoảng 5 ml MeOH được dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn trung gian có khoảng nồng độ thích hợp

2.3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trình rửa giải với pha động gồm ACN (kênh A) phối hợp với H2O (kênh B) theo các tỷ

lệ khác nhau

Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR) của AA, độ phân giải (RS) và hệ số kéo đuôi của pic (AS) RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; tR của các chất phân tích không quá dài nhưng phải đảm bảo tách xa nhau

2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

- Khảo sát dung môi chiết: Khảo sát các dung môi chiết là EtOH, hỗn hợp MeOH : H2O với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi cho hiệu suất chiết cao nhất

Trang 28

- Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết: Từ dung môi chiết phù hợp, tiến hành chiết với các thể tích dung môi khác nhau để lựa chọn được thể tích chiết tối ưu

- Khảo sát thời gian chiết: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút, 90 phút

2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích

 Tính chọn lọc:

Tính chọn lọc: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân

tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn và mẫu phân tích thêm chuẩn Pic của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn với các pic tạp

Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng với chương trình đã lựa chọn Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích pic

Thời gian lưu AA của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng phải tương đương nhau Pic AA trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu

 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ thống phân tích còn cho tín hiệu, có ý nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3

Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong

mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả

Trang 29

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở

đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích

Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát

sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất)

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại

lượng đo được và nồng độ các chất phân tích

Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R2

Theo đó 0,99 ≤ R2≤ 1

Tính thích hợp hệ thống:

Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn

hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích pic của AA có RSD ≤ 2%

 Độ lặp lại (độ chụm):

Độ lặp lại (độ chụm): Là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của

các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)

Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, theo AOAC yêu cầu RSD ≤ 3,7 đối với chất phân tích có hàm lượng trong mẫu ≥ 0,1%

Trang 30

̅: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

: Số lần thử nghiệm

 Độ đúng:

Độ đúng: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình

của các kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận đúng

Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được

so với giá trị lý thuyết

Thêm vào mẫu Trạch tả đã được xác định hàm lượng AA một lượng chính xác chất chuẩn (2 mức thêm chuẩn) sao cho tổng nồng độ của AA trong mẫu thêm chuẩn nằm ở ba mức thấp, trung bình và cao trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Độ thu hồi được tính theo công thức:

R(%) = .100%

Trong đó:

R: Độ thu hồi (%)

Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (µg/mL)

Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/mL)

Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (µg/mL)

Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng trong khoảng 0,1 – 1% là 95 – 105% [3]

2.3.3 Phân tích mẫu thực

Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để xác định hàm lượng AA trong mẫu Trạch tả

Trang 31

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Định tính AA và AB23 bằng TLC

 Chuẩn bị mẫu: mẫu thử và mẫu đối chiếu được chuẩn bị như mục

2.3.1

Ký hiệu: T: Mẫu thử

C: Mẫu đối chiếu AA

C’: Mẫu đối chiếu AB23

 Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl dung dịch thử, dung

dịch đối chiếu Sau khi triển khai, để khô bản mỏng ngoài không khí rồi phun dung dịch thuốc thử, sấy bản mỏng ở 105 oC trong vòng 5 phút Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử

3.1.1 Định tính AB23

 Khảo sát hệ dung môi pha động:

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động:

Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)

Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)

Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)

Kết quả: Sắc ký đồ định tính AB23 trong Trạch tả được trình bày như

hình 3.1

Hình 3.1 Khảo sát định tính AB23

Trang 32

Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366

Quan sát dưới ánh sáng thường

Nhận xét: Kết quả định tính TLC cho thấy với 3 hệ dung môi khảo sát chất AB23 cho vết có giá trị Rf nằm trong khoảng 0,16 – 0,6 Tuy nhiên không thấy vết AB23 tương ứng (cùng giá trị Rf và cùng mầu sắc với vết AB23 chuẩn) xuất hiện trong mẫu thử Điều này chứng tỏ các mẫu Trạch tả nghiên cứu không có thành phần AB23 Chúng tôi lựa chọn hệ dung môi A để định tính thành phần AB23 trong các mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường

3.1.2 Định tính AA

 Khảo sát hệ dung môi pha động:

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động:

Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1)

Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)

Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1)

Kết quả: Sắc ký đồ định tính AA trong Trạch tả được trình bày như

hình 3.2

Hình 3.2 Khảo sát định tính AA

Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366

Quan sát dưới ánh sáng thường

Trang 33

Nhận xét: Trong các hệ dung môi khảo sát, nhận thấy hệ dung môi B cho Rf của AA trong khoảng 0,4; vết tách biệt khỏi các vết khác Vì vậy

chúng tôi chọn hệ dung môi pha động hexan: aceton (1,5:1) (v/v) để triển khai

sắc ký

 Kết luận:

Sau quá trình khảo sát và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đã xây dựng được phương pháp định tính AB23 và AA bằng sắc ký lớp mỏng theo các điều kiện dưới đây:

- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)

- Dung dịch chuẩn: Cân khoảng 1 mg chất chuẩn AB23, AA tương ứng hòa tan trong khoảng 2 ml methanol

- Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu

âm với 30 ml MeOH trong 30 phút, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, cô cạn dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, thu được dịch dùng để chấm sắc ký lớp mỏng

- Dung môi khai triển:

 Định tính AB23: petroleum ete : ethyl acetat (8:9) (v/v)

 Định tính AA: hexan: aceton (1,5:1) (v/v)

- Cách tiến hành: Đưa lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch thử và 5

μl dung dịch chất đối chiếu Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí ở nhiệt độ phòng và phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol Sấy bản mỏng ở 105 oC trong vài phút Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 và ánh sáng thường

Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với vết đạt được trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu

3.1.3 Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng

Chúng tôi đã tiến hành định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường theo phương pháp đã xây dựng trong mục 3.1.1 và

3.1.2 và thu được kết quả trong hình 3.3 và 3.4

Trang 34

Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính AA trên một số mẫu Trạch tả

Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính AB23 trên một số mẫu Trạch tả

Ký hiệu:

Quan sát dưới đèn UV 366 Quan sát dưới ánh sáng thường

- M1 – M7: Các mẫu thử dược liệu Trạch tả, lần lượt từ M1 – M7

- C: Mẫu chất đối chiếu AB23

- C’: Mẫu chất đối chiếu AA

Nhận xét: Trên sắc ký đồ của các mẫu M1 – M7 có vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AA Trong khi đó, không thấy xuất hiện vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AB23 Như vậy, có thể tạm kết

Trang 35

3.2 Định lƣợng AA bằng HPLC

Từ kết quả thu được trong mục 3.1.3 Nhận thấy có thể lựa chọn alisol

A làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả Từ đó, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng alisol A trong dược liệu Trạch tả

3.2.1 Lựa chọn pha tĩnh

Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây [22,54,55] để định lượng AA trong Trạch tả, cột C18 thường được sử dung Để phù hợp với điều kiện thí nghiệm hiện có chúng tôi sử dụng cột Eclipse XDB-C18 (4,6mm x 250nm, 5µm)

3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thử được chuẩn bị như mục 2.3.2.1

Tiến hành khảo sát pha động là hệ dung môi ACN : H2O và thay đổi tỷ

lệ giữa 2 thành phần theo 3 chương trình dung môi:

- Chương trình dung môi 1: ACN : H2O (80:20)

- Chương trình dung môi 2: ACN : H2O (70:30)

- Chương trình dung môi 3: ACN : H2O (60:40) Kết quả thu được trong hình 3.5

Định dạng
Số trang	71
Dung lượng	2,05 MB