Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại bệnh viện bạch mai năm 2017 2018

Có nhiều phương pháp điều trị ung thư phổi như phẫu thuật, hoá trị, xạ trị, điều trị đích; trong đó nhiều nghiên cứu đã chứng minh các thuốc ức chế tyrosine kinase tyrosine kinase inhibi

Trang 1

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN HỮU THẮNG

NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR

HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH

VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

Hà Nội – 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN HỮU THẮNG

NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR

HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH

VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

KHÓA QH.2013.Y

NGƯỜI HƯỚNG DẪN 1: PGS.TS PHẠM CẨM PHƯƠNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN 2: PGS.TS LÊ THỊ LUYẾN

Hà Nội – 2019

Trang 3

LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng tri ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Cẩm Phương và PGS.TS Lê Thị Luyến, là những người thầy, người hướng dẫn khoa học, đã tận tình giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập, trực tiếp hướng dẫn em thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, là những người đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những thầy cô, đồng nghiệp, những người đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận: GS.TS Mai Trọng Khoa, PGS.TS Trần Đình Hà (Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai), TS Nguyễn Thuận Lợi, ThS Nguyễn Tiến Lung, cùng toàn thể các bác sỹ, điều dưỡng, kỹ thuật viên Đơn

vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai đã giúp đỡ em trong quá trình thu thập số liệu phục vụ cho nghiên cứu

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và ủng hộ em trong quá trình học tập

Tuy nhiên vì kiến thức chuyên môn còn hạn chế và bản thân còn thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung của khóa luận không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận sự góp ý để khóa luận này được hoàn thiện hơn

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Nguyễn Hữu Thắng

Trang 4

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu/từ

AJCC American Joint Committee on Cancer (Uỷ ban liên hiệp

Ung thư Hoa Kỳ) ATP Adenosine triphosphate CEA Carcinoembryonic Antigen ctDNA Circulating tumor DNA (DNA khối u trong máu) DNA Deoxyribonucleic acid

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng

trưởng biểu bì) EMT Epithelial-mesenchymal transitions (Chuyển dạng biểu mô-

trung mô) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan thực phẩm và

dược phẩm Hoa Kỳ) kDa KiloDalton

OS Overall survival (Thời gian sống thêm toàn bộ) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) PET-CT Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp phát xạ

positron) PFS Progression-free survival (Thời gian sống bệnh không tiến

triển) PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase

RR Relative risk (Nguy cơ tương đối) SCC Squamos Cell Carcinoma (Ung thư biểu mô vảy) SPECT Single-photon Emission Computed Tomography (Chụp cắt

lớp điện toán bức xạ đơn photon) TKI Tyrosine kinase inhibitor (Ức chế tyrosine kinase) TNM T: tumor; N: lymph node; M: metastasis

UTPKTBN Ung thư phổi không tế bào nhỏ

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

Trang 5

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 –TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ (UTPKTBN) 3

1.1.1 Dịch tễ học 3

1.1.2 Yếu tố nguy cơ 3

1.1.3 Triệu chứng 3

1.1.4 Chẩn đoán 5

1.2 THỤ THỂ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ (EGFR) 8

1.2.1 Cấu trúc và sự hoạt hoá của EGFR 8

1.2.2 Đột biến EGFR 10

1.2.3 Điều trị UTPKTBN bằng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) phân tử nhỏ 12

1.2.4 Sự kháng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) 13

1.2.5 Phương pháp lấy mẫu, xác định đột biến gen EGFR mẫu huyết tương trong UTPKTBN 16

1.2.6 Tình hình nghiên cứu đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân UTPKTBN 21

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn lựa 24

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 24

2.2.2 Cỡ mẫu 24

2.2.3 Các biến số, chỉ số trong nghiên cứu 24

2.2.4 Thời gian nghiên cứu 24

Trang 6

2.2.5 Địa điểm nghiên cứu 25

2.2.6 Các bước thực hiện 25

2.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 26

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 27

3.1.2 Đặc điểm mô bệnh học và giai đoạn bệnh 27

3.2.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 28 3.3 MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG 29

3.3.1 Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân 29

3.3.2 Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học và giai đoạn bệnh 30

3.3.3 Đột biến T790M và một số yếu tố liên quan 31

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN 34

4.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34

4.1.1 Đặc điểm lâm sàng 34

4.1.2 Đặc điểm mô bệnh học – giai đoạn bệnh 35

4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 35 4.3 MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG 36

4.3.1 Mối liên quan giữa tình trạng dột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 36

4.3.2 Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học – giai đoạn bệnh 38

4.3.3 Đột biến T790M và một số yếu tố liên quan 38

Trang 7

KẾT LUẬN 41

KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1

-PHỤ LỤC 1 QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 1

PHỤ LỤC 2 PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 4

PHỤ LỤC 3 DANH SÁCH BỆNH NHÂN 6

Trang 8

-Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc và hoạt động của EGFR 8

Hình 1.2 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 10

Hình 1.3 Các dạng đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng với TKIs 11

Hình 1.4 Phân bố một số cơ chế kháng thuốc ức chế tyrosine kinase thế hệ I,II 14

Hình 1.5 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng real-time PCR 18

Hình 1.6 Biểu đồ chuẩn của phản ứng real-time PCR 19

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 25

Hình 3.1 Đặc điểm giai đoạn bệnh của đối tượng nghiên cứu 28

Hình 3.2 Tỷ lệ các loại đột biến trên exon 18-21 của gen EGFR 29

Hình 3.3 Ví dụ về đột biến kháng thuốc thứ phát T790M 32

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTPKTBN theo AJCC 2010 7

Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu 27

Bảng 3.2 Đặc điểm mô bệnh học của đối tượng nghiên cứu 28

Bảng 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân đột biến EGFR huyết tương 28

Bảng 3.4 Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân 30

Bảng 3.5 Mối liên quan giữa đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học và giai đoạn bệnh 30

Bảng 3.6 Mối liên quan giữa đột biến T790M và đặc điểm bệnh nhân 31

Bảng 3.7 Mối liên quan giữa đột biến T790M với mô bệnh học – giai đoạn bệnh 32

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phế quản phổi nguyên phát là ung thư xuất phát từ niêm mạc phế quản, phế nang Dựa vào mô bệnh học, ung thư phế quản phổi chia thành hai thể bệnh chính: ung thư phổi không tế bào nhỏ và ung thư phổi tế bào nhỏ, trong đó ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 85% Ung thư phế quản phổi chẩn đoán sớm thường khó khăn và tốn kém Phần lớn được chẩn đoán ở giai đoạn muộn Chẩn đoán ung thư phế quản phổi cần phối hợp nhiều phương pháp: Lâm sàng, X – quang, chụp cắt lớp vi tính, nội soi, xét nghiệm tế bào,

mô bệnh học Có nhiều phương pháp điều trị ung thư phổi như phẫu thuật, hoá trị, xạ trị, điều trị đích; trong đó nhiều nghiên cứu đã chứng minh các thuốc ức chế tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor – TKI) có thể giúp trì hoãn bệnh tiến triển và cải thiện chất lượng sống tốt hơn so với hoá trị ở

những bệnh nhân có đột biến EGFR [3]

Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR) là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của ung thư, trong đó có ung thư phổi Đột biến trên vùng tyrosine kinase của EGFR là rất quan trọng cho việc xác định độ nhạy thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA dựa trên mẫu mô ung thư được xem là tiêu

chuẩn vàng trong phát hiện đột biến gen EGFR Tuy nhiên, phương pháp này

không khả thi trong một số trường hợp không đủ điều kiện cho phép sinh thiết, hoặc mẫu sinh thiết quá nhỏ, không đủ để giải trình tự gen, hoặc cần kiểm tra lại bằng mẫu huyết tương khi tín hiệu đột biến thấp Phương pháp phát hiện

đột biến gen EGFR bằng cách sử dụng ctDNA (circulating tumor DNA) có

trong huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (mẫu “sinh thiết lỏng” – Liquid Biopsy) có nhiều ưu điểm vượt trội [23, 30] Điều này cho phép bệnh nhân có thêm cơ hội để làm xét nghiệm chẩn đoán, đồng thời có thể làm xét nghiệm lặp lại nhiều lần để theo dõi điều trị mà không cần can thiệp sâu như sinh thiết Bên cạnh đó, phương pháp này khá đơn giản, dễ thực hiện, giảm được chi phí, thời gian cho bệnh nhân và không gây biến chứng [8]

Như vậy, việc phân tích đánh giá tình trạng đột biến EGFR mẫu huyết

tương rất cần thiết giúp các bác sĩ trong việc điều trị nhằm kéo dài thời gian sống và nâng cao chất lượng sống của bệnh nhân Do đó, đề tài nghiên cứu

Trang 10

“Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân ung thư

phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 – 2018” được thực hiện với mục tiêu sau:

Mô tả được tình trạng đột biến EGFR phát hiện ở mẫu huyết tương và phân tích được một số yếu tố liên quan trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 – 2018

Trang 11

CHƯƠNG 1 –TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ (UTPKTBN)

1.1.1 Dịch tễ học

Ung thư phổi là một trong những loại ung thư phổ biến nhất thế giới trong nhiều thập kỷ qua Theo thống kê của GLOBOCAN năm 2018, trên thế giới có 2,094 triệu trường hợp mới mắc (chiếm 11,6% tổng số bệnh nhân ung thư), trong đó nam giới phổ biến hơn với 1,369 triệu ca mới mắc (chiếm 14,5% tổng số ung thư ở nam giới) Ung thư phổi cũng là nguyên nhân phổ biến gây

tử vong do ung thư trên toàn thế giới, ước tính chiếm khoảng 18,4% các trường hợp tử vong do ung thư hàng năm (1,761 triệu người chết) [56]

Tại Việt Nam, theo thống kê của GLOBOCAN năm 2018, ung thư phổi

là loại ung thư phổ biến thứ hai với 23,7 nghìn trường hợp mới mắc (chiếm 14,4% tổng số bệnh nhân ung thư) trong đó nam giới chiếm 16,7 nghìn ca (chiếm 18,4% tổng số ung thư) Số lượng người chết vì ung thư phổi hằng năm cũng rất cao với 20,7 nghìn người (chiếm 18% tổng số người chết vì ung thư) [56]

1.1.2 Yếu tố nguy cơ

Thuốc lá là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất Gặp hơn 90% trường hợp ung thư phổi ở nam giới có nghiện thuốc lá, khoảng 80% trường hợp mắc ở

nữ giới có liên quan đến thuốc lá Yếu tố môi trường khi tiếp xúc với nhiều khí độc như amiăng, những chất gây ung thư như 3-4 benzopyren, hydrocarbon thơm nhiều vòng hay những chất phóng xạ cũng làm tăng nguy

cơ mắc ung thư phổi Ngoài ra, các yếu tố về di truyền như bệnh u nguyên

bào võng mạc, đột biến gen p53, đột biến gen EGFR cũng liên quan đến bệnh

Trang 12

lẫn máu, điều trị kháng sinh không có kết quả

Ở giai đoạn tiến triển, triệu chứng đa dạng hơn tuỳ theo vị trí u, mức độ lan rộng tổn thương với toàn thân có thể mệt mỏi, gầy sút, sốt Các triệu chứng hô hấp thường gặp như đau ngực dai dẳng, cố định 1 vị trí, khó thở, hoặc có hội chứng trung thất với các triệu chứng như phù áo khoác, khó nuốt hay nuốt đau, khàn tiếng …

Các dấu hiệu do di căn: hạch (thượng đòn, nách), di căn não, gan, xương, phổi đối bên

Các hội chứng cận ung thư: thường gặp trong ung thư phổi không tế bào nhỏ Bao gồm: ngón tay dùi trống, đái tháo nhạt, hội chứng Cushing, tăng Canxi máu, vú to, giọng cao, teo tinh hoàn, hội chứng giả nhược cơ, hội chứng da liễu: viêm da cơ [4]

1.1.3.2 Cận lâm sàng

+ Chẩn đoán hình ảnh:

Chụp X – quang lồng ngực thẳng và nghiêng: phát hiện đám mờ, hình ảnh tràn dịch màng phổi Giúp xác định vị trí, hình thái, kích thước tổn thương

Chụp cắt lớp vi tính: Cho phép đánh giá hình ảnh khối u và hạch trung thất, xác định chính xác vị trí, kích thước và mức độ lan rộng tổn thương ở cả hai phổi

Siêu âm ổ bụng: phát hiện các tổn thương di căn

Chụp cộng hưởng từ sọ não: khi nghi ngờ có di căn não

Xạ hình xương bằng máy SPECT: phát hiện di căn xương từ rất sớm so với chụp X – quang thông thường

Chụp PET/CT: là phương pháp tốt nhất với ung thư phổi trong phát hiện di căn xa ngoài não [4]

+ Nội soi chẩn đoán:

Nội soi phế quản: thường chỉ định trong các trường hợp u trung tâm, giúp xác định tổn thương và sinh thiết làm mô bệnh học

Trang 13

Nội soi màng phổi: chỉ định trong trường hợp theo dõi di căn màng phổi

Nội soi trung thất: chỉ định trong trường hợp có hạch trung thất bất thường, kết hợp làm sinh thiết hạch [3]

+ Mô bệnh học:

Không những cho phép chẩn đoán xác định bệnh mà còn xác định thể

mô bệnh học, độ mô học giúp cho lựa chọn điều trị và tiên lượng bệnh Bệnh phẩm có thể được lấy qua sinh thiết xuyên thành ngực hoặc qua nội soi phế quản, sinh thiết tổn thương di căn (hạch thượng đòn) [3]

Các tiêu chuẩn chẩn đoán và phân loại của các type mô học UTPKTBN theo WHO 2015 bao gồm: ung thư biểu mô vảy, ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tuyến vảy, ung thư biểu mô tế bào lớn, ung thư biểu mô tế bào sáng, ung thư biểu mô tế bào khổng lồ [54]…

+ Các xét nghiệm khác [3]:

Các chất chỉ điểm khối u: Cyfra 21-1, CEA với ung thư biểu mô tuyến; SCC với ung thư biểu mô vảy Tuy nhiên chỉ điểm u trong ung thư phổi ít có giá trị

Xét nghiệm gen: hiện nay, kỹ thuật giải trình tự gen dựa trên bệnh

phẩm mô bệnh học giúp xác định đột biến gen EGFR trong các trường hợp

ung thư biểu mô tuyến giúp chỉ dịnh thuốc điều trị đích

Test chức năng hô hấp: đánh giá chức năng hô hấp trước khi phẫu thuật Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu: giúp đánh giá toàn trạng trước, trong và sau điều trị Ngoài ra các xét nghiệm này còn giúp phát hiện một số hội chứng cận ung thư gặp trong ung thư phổi

1.1.4 Chẩn đoán

1.1.4.1 Chẩn đoán xác định

Chẩn đoán xác định dựa trên lâm sàng (các triệu chứng hô hấp, hội chứng trung thất…), chẩn đoán hình ảnh (X – quang, CT ngực…), kết quả mô bệnh học

Trang 14

1.1.4.2 Chẩn đoán phân biệt [4]

Viểm phổi: chụp X – quang phổi kiểm tra lại sau điều trị kháng sinh 1 tháng

Áp xe phổi: dựa vào hội chứng nhiễm trùng, chụp X – quang: hình hang, đáp ứng với điều trị kháng sinh

Tràn dịch màng phổi: nếu là ung thư phổi thì sau khi chọc hết dịch chụp X – quang lại có hình ảnh khối u

1.1.4.3 Chẩn đoán giai đoạn

Chẩn đoán giai đoạn TNM của UTPKTBN theo AJCC (American Joint Committee on Cancer) năm 2010

Phân loại về u nguyên phát (ký hiệu: T) + Tx: U nguyên phát không thể đánh giá, hoặc có tế bào ác tính trong đờm hay dịch rửa phế quản nhưng không thấy trên hình ảnh hoặc nội soi phế quản + T0: Không có bằng chứng về u nguyên phát

+ Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ

+ T1: Kích thước lớn nhất của khối u ≤ 3cm, được bao quanh bởi nhu mô phổi hoặc lá tạng màng phổi, không có bằng chứng về xâm lấn vượt quá đoạn gần của phế quản thuỳ; gồm T1a (kích thước lớn nhất ≤ 2cm) và T1b (kích thước lớn nhất 2-3 cm)

+ T2: Với 3 < kích thước lớn nhất ≤ 7cm hoặc bất kỳ nhưng xâm lấn phế quản gốc, cách ngã ba khí phế quản ≥ 2cm, xâm lấn lá tạng màng phổi; gây xẹp phổi hoặc viêm phổi tắc nghẽn lan đến rốn phổi nhưng chưa lan toàn bộ phổi; gồm T2a (3 < kích thước lớn nhất ≤ 5cm) và T2b (5 < kích thước lớn nhất ≤ 7cm)

+ T3: Kích thước lớn nhất > 7cm hoặc xâm lấn một trong các thành phần: thành ngực (bao gồm cả khối u rãnh liên thuỳ trên), cơ hoành, thần kinh hoành, màng phổi trung thất, màng ngoài tim hoặc xâm lấn phế quản gốc, cách carina < 2cm nhưng chưa tới carina hoặc gây ra xẹp phổi, viêm phổi do tắc nghẽn trên toàn bộ phổi hoặc có các nốt riêng biệt trên cùng 1 thuỳ phổi

Trang 15

+ T4: Khối u kích thước bất kỳ nhưng xâm lấn: trung thất, tim, mạch máu lớn, khí quản, thần kinh quặt ngược thanh quản, thực quản, thân đốt sống, carina, các nốt khối u khác ở thuỳ phổi khác cùng bên

Phân loại về hạch vùng (ký hiệu : N) + N0: Không có hạch di căn vùng

+ N1: Di căn hạch cạnh phế quản và hoặc hạch trong phổi, hạch rốn phổi cùng bên, bao gồm cả sự xâm lấn trực tiếp

+ N2: Di căn hạch trung thất cùng bên và hạch dưới carina

+ N3: Di căn hạch rốn phổi đối bên, hạch trung thất đối bên, hạch cơ bậc thang cùng hoặc đối bên, hạch thượng đòn

Phân loại về di căn xa (ký hiệu: M) + M0: Không có di căn xa

+ M1: Di căn xa, gồm M1a (có kèm theo các nốt khối u ở phổi đối bên, tràn dịch màng phổi hoặc màng tim ác tính) và M1b (di căn xa)

Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTPKTBN theo AJCC 2010

Giai đoạn IIA

Trang 16

1.2 THỤ THỂ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ (EGFR)

1.2.1 Cấu trúc và sự hoạt hoá của EGFR

Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor receptor – EGFR) là một nhóm protein chức năng thụ thể màng có trọng lượng phân tử 170kDalton (kDa) ở các tế bào có nguồn gốc biểu mô, trung mô và thần kinh, được Carpenter và cộng sự nghiên cứu phát hiện vào năm 1978 [16] Trong gia đình thụ thể yếu tố phát triển biểu bì gồm có bốn thành viên: HER1 (EGFR, ErbB1), HER2 (neu, ErbB2), HER3 (ErbB3) và HER4 (ErbB4) Các protein này đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà các quá trình sinh trưởng, phát triển, trao đổi chất và sinh lý của tế bào [9, 27]

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc và hoạt động của EGFR

(A) Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì(EGFR): Vùng ngoại bào chứa miền tương tác với các yếu tố tăng trưởng, vùng xuyên màng tế bào và vùng nội bào chứa miền tyrosine kinase (B) Hoạt động của EGFR: khi yếu tố tăng trưởng liên kết vào phần ngoại bào của thụ thể EGFR, hai phân tử EGFR kết hợp với nhau (dimer hoá) từ đó hoạt hoá vùng tyrosine kinase tự phosphoryl hoá giúp EGFR kết hợp được với các phân tử tín hiệu ở giai đoạn sau của con đường tín hiệu [23]

Cấu trúc của phân tử EGFR gồm 3 phần: phần liên kết ngoài màng, phần xuyên màng đặc hiệu và phần trong bào tương có hoạt tính tyrosine kinase [9]

Trang 17

+ Phần ngoài màng của EGFR (vùng ngoại bào) có trọng lượng khoảng 100kDa, với hai vùng giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử của EGFR Vùng gắn kết các yếu tố hoạt hoá hay ức chế các thụ thể, để đẫn truyền tín hiệu vào trong tế bào, làm tế bào có thể phát triển bình thường hoặc trở nên ác tính

+ Phần xuyên màng tế bào: có trọng lượng nhỏ 3kDa, tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng

+ Phần trong tế bào (vùng nội bào): có trọng lượng khoảng 60kDa là protein kinase với đuôi tận cùng carboxyl nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hoá của EGFR

Protein EGFR mang hoạt tính tyrosine kinase, là khởi nguồn của con đường tín hiệu tyrosine kinase trong tế bào Hoạt tính tyrosine nội bào của EGFR được hoạt hoá khi EGFR liên kết với các phối tử như EGF hoặc yếu tố chuyển dạng (transforming gowth factor α: TGFα) Hai con đường tín hiệu chính được kích hoạt bởi EGFR là RAS/RAF/MEK/ERK và PI3K/AKT, ngoài ra còn có Src tyrosine kinase, PLCγ, PKC và STAT Ngay sau khi được hoạt hoá, vùng nội bào của EGFR sẽ tự phosphoryl hoá, khởi đầu một dòng thác tín hiệu lan toả khắp tế bào gây kích hoạt: con đường PI3K/AKT (kích thích sự tăng sinh mạch máu, di căn và ức chế quá trình chết theo chương trình), tín hiệu RAS/RAF (kích thích phân bào và các con đường dẫn truyền tín hiệu phiên mã) [1, 9, 27] … Trong các tế bào khoẻ mạnh, con đường tín hiệu nội bào trên được kiểm soát một cách nhịp nhàng và chặt chẽ, đảm bảo

sự phát triển bình thường của tế bào Trong các tế bào ung thư, hoạt tính tyrosine kinase của EGFR bị rối loạn bởi các cơ chế phát sinh ung thư, bao

gồm đột biến EGFR, tăng số lượng bản sao gen EGFR hoặc biểu hiện quá

mức protein EGFR [17] Việc hoạt hoá sai chức năng tyrosine kinase của EGFR làm tăng tỷ lệ phát sinh, tốc độ phát triển, khả năng xâm lấn và di căn của các tế bào ung thư [1]

Trang 18

Hình 1.2 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR

EGFR tiếp nhận tín hiệu từ yếu tố tăng trưởng, truyền qua các con đường JAK/STAT, PI3K/Akt, Ras/raf/MEK/ERK… vào nhân tế bào, kích thích tế bào biệt hoá, tăng sinh, sống sót, tạo u, sinh mạch…[57]

1.2.2 Đột biến EGFR

Gen EGFR, nằm trên cánh ngắn NST số 7, dài 110kb, chia 28 exon và

được xếp vào nhóm gen tiền sinh ung thư (proto-oncogen) [1] Đột biến gen

EGFR xảy ra ở giai đoạn rất sớm và chiếm tỷ lệ cao ở nhóm người không hút

thuốc lá, ở nhóm ung thư biểu mô tuyến so với các phân nhóm mô bệnh học khác của UTPKTBN, ở nữ giới so với nam giới và ở nhóm bệnh nhân Đông Á

so với các chủng tộc khác [45, 48] Tất cả các đột biến gây hoạt hoá EGFR đều thuộc vùng bám adenosine triphosphate (ATP) của thụ thể tyrosine kinase, cũng đồng thời là vị trí tương tác của các loại thuốc ức chế tyrosine kinase của EGFR (EGFR TKIs – EGFR tyrosine kinase inhibitors) [31, 44] Các đột

biến gen EGFR thuộc bốn exon 18-21, mã hoá vùng tyrosine kinase, khiến

cho protein EGFR luôn trong trạng thái hoạt hoá không phụ thuộc vào phối tử,

có tác dụng tăng sự nhạy cảm của khối u hoặc giúp kháng lại các EGFR TKIs

Trang 19

Những đột biến này được chia làm ba nhóm, trong đó, các đột biến làm tăng tính nhạy cảm của khối u với EGFR TKIs chủ yếu thuộc hai nhóm I và II

+ Nhóm I gồm các đột biến xoá đoạn ở exon 19, phổ biến nhất (khoảng 44%)

là kiểu đột biến xoá từ vị trí acid amin vị trí 747-leucine (L), 748-arginine (R), 749-glutamate (E), 750-alanine (A) (đột biến LREA)

+ Nhóm II gồm các đột biến thay thế một nucleotid làm thay đổi aicd amin ở exon 18 và 21 Đột biến điểm thường gặp nhất (khoảng 41%) là đột biến ở exon 21 thay leucine bằng arginine tại codon 858 (đột biến L858R) Một số đột biến khác như đột biến thay thế glycine ở codon 719 thành serine (G719S), thành alanine (G719A) hoặc thành cysteine (G719C) chiếm 4%; một số đột biến vô nghĩa khác chiếm 6%

+ Nhóm III (5%) gồm các đột biến lặp đoạn, thêm đoạn và đột biến điểm tại

exon 20 gen EGFR Exon 20 chứa hầu hết là các đột biến làm cho tế bào ung

thư phổi kháng lại với thuốc điều trị đích như đột biến điểm T790M, V769L, S768I và các đột biến thêm đoạn Tuy nhiên, gần đây các nhà khoa học đã phát hiện ra một ngoại lệ, một đột biến thêm 4 acid amin tại exon 20, đột biến A736_Y764insFQEA, lại làm tăng tính nhạy cảm của tế bào ung thư phổi với thuốc điều trị đích [60]

Hình 1.3 Các dạng đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng với TKIs

Trang 20

Các đột biến gen EGFR trên exon 18-21 mã hoá vùng tyrosine kinase của thụ thể, đồng thời là vị trí tương tác của các loại thuốc TKIs[47]

Cho đến nay, đã có nhiều bằng chứng cho thấy trạng thái cân bằng mở” của hoạt tính tyrosine kinase-EGFR bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi đột biến gen Những phân tích động học đã chứng minh đột biến thuộc hai nhóm I và

“tắt-II làm tăng hệ số phân li Km của ATP với EGFR và giảm hệ số phân li Km của EGFR TKIs so với khi thụ thể ở trạng thái bình thường Những đột biến này khiến EGFR giảm mạnh ái lực với ATP, giúp các thuốc TKI không phải cạnh tranh tại vị trí tương tác với thụ thể, thụ thể trở nên nhạy cảm một cách đặc biệt với các thuốc này [15, 24]

Khoảng 10-60% bệnh nhân UTPKTBN có đột biến ở exon 18-21 của

gen EGFR Các đột biến này tạo ra protein EGFR có ái lực mạnh với thuốc điều trị đích, do đó, bệnh nhân UTPKTBN mang đột biến gen EGFR thường

đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích [35]

1.2.3 Điều trị UTPKTBN bằng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) phân

Các thuốc TKIs có trọng lượng phân tử nhỏ, cạnh tranh với ATP ở vùng tyrosine kinase, làm ức chế mạnh sự phosphoryl hoá nội tế bào của EGFR dẫn đến ức chế quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào Kết quả là ức chế các quá trình: bám dính, xâm lấn, di căn, tăng sinh mạch, tăng sinh tế bào và tăng quá trình chết tế bào theo chương trình và tăng nhạy cảm với hoá trị Các thuốc TKIs được sử dụng gồm Gefitinib (Iressa) và Erlotinib (Tarceva) [5]

Erlotinib là một chất ức chế tyrosine kinase dùng đường uống, với liều 150mg hàng ngày là một tiêu chuẩn được chấp thuận để điều trị cho bệnh nhân UTPKTBN [37] Vai trò của Erlotinib đã được chứng minh trong các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng về điều trị bước 2,3 (sau thất bại với hoá

Trang 21

chất), điều trị duy trì (sau khi điều trị hoá chất ổn định) và điều trị bước 1

trong UTPKTBN giai đoạn tiến triển có đột biến EGFR [1, 39] Tương tự như

thế, Gefitinib hiện được chấp thuận cho việc điều trị bước 1,2 ở những bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến triển hoặc di căn có kết quả xét nghiệm gen

dương tính với đột biến EGFR [39]

Nghiên cứu của Nguyễn Minh Hà và cộng sự về hiệu quả điều trị trúng đích trên bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn muộn có và không có đột biến gen

EGFR cho thấy ở 80 bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB/IV được điều trị

bằng Erlotinib có sự cải thiện có ý nghĩa thống kê ở cả PFS và OS ở nhóm

dương tính với đột biến EGFR Trung vị PFS ở nhóm đột biến EGFR (+) so với nhóm đột biến EGFR (-) lần lượt là 7,5 tháng và 4,25 tháng (p = 0,015) Tương tự, trung vị OS ở nhóm đột biến EGFR (+) so với nhóm đột biến

EGFR (-) lần lượt là 13 tháng và 8 tháng (p = 0,041) [7]

Một số thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên pha III như EURTAC ở Châu

Âu hay thử nghiệm OPTIMAL được thực hiện tại Trung Quốc so sánh việc điều trị bằng Erlotinib so với hoá trị liệu ở những bệnh nhân mắc UTPKTBN

có dương tính với đột biến EGFR, đã cho kết quả khả quan về tỷ lệ đáp ứng

(RR) cũng như thời gian sống thêm bệnh không tiến triển (PFS) [39] Trong nghiên cứu EURTAC đã chứng minh lợi ích của Erlotinib khi kéo dài đáng kể PFS thêm 4,5 tháng so với hoá trị (9,7 tháng so với 5,2 tháng, p < 0,0001) [39, 43] Tương tự, trong nghiên cứu OPTIMAL, PFS ở người sử dụng Erlotinib được kéo dài thêm 8,5 tháng so với hoá trị liệu (13,1 tháng so với 4,6 tháng, p

< 0,0001) [39, 67]

1.2.4 Sự kháng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs)

Mặc dù nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn

muộn mang đột biến gen EGFR làm tăng tính nhạy cảm với các thuốc TKIs

và có tỷ lệ đáp ứng với thuốc TKIs rất cao, trên 60% và kéo dài được thời gian sống bệnh không tiến triển (PFS) trung bình trên 9 tháng [33] Tuy nhiên, dưới áp lực chọn lọc của các tế bào khối u với thuốc, sau khoảng 10-20 tháng điều trị, bệnh tiến triển trở lại ở hầu hết các bệnh nhân có đáp ứng tốt ban đầu, thể hiện tình trạng “trơ” của tế bào khối u với thuốc [32] Y học đã ghi nhận

Trang 22

một số cơ chế gây nên tình trạng kháng thuốc TKIs, các nguyên nhân này được chia làm 3 loại chính: xuất hiện đột biến mới tại gen đích, hoạt hoá con đường tín hiệu mới và chuyển dạng mô bệnh học [58]

Hình 1.4 Phân bố một số cơ chế kháng thuốc ức chế tyrosine kinase thế

hệ I,II [58]

1.2.4.1 Cơ chế kháng thuốc TKIs do xuất hiện đột biến mới tại gen đích

Cơ chế kháng thuốc đầu tiên ở bệnh nhân UTPKTBN được chứng minh

là sự xuất hiện đột biến điểm T790M tại exon 20 gen EGFR Phát hiện này

được công bố bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập của Kobayashi và Pao năm

2005 [26, 36] So sánh với trình tự gen EGFR lành tính, đột biến T790M là

đột biến thứ phát thay thế acid amin Threonine trên phân tử EGFR (được mã hoá bởi codon 790 trên exon 20) bằng Methionine Đây là nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng 50% các trường hợp [19, 46] Chức năng của Threonine 790 như một “người gác cổng” trong phân tử EGFR, một yếu tố quan trọng quyết định tính đặc hiệu của các chất ức chế gắn vào vùng bám ATP của thụ thể tyrosine kinase Sự biến đổi cấu trúc protein EGFR tại vị trí đột biến T790M không tạo ra sự phong toả về vị trí không gian đối với thuốc TKIs mà nó làm hồi sinh ái lực của EGFR với ATP, đối kháng lại cơ chế ức chế kinase theo kiểu cạnh tranh ATP của TKIs [62] Theo đó, các TKIs ức chế thuận nghịch như Erlotinib hoặc Gefitinib có hiệu quả rất giới hạn với thể đột biến T790M

Trang 23

Osimertinib (Tagrisso) là thuốc TKIs mới thuộc thế hệ thứ 3 chống lại đột biến T790M, được FDA chấp thuận vào 11/2015 và ở thời điểm đó chỉ được điều trị bước 2 sau khi bệnh tiến triển với TKIs thế hệ I cho bệnh nhân

UTPKTBN có đột biến EGFR và mang đột biến T790M Sau đó, hiệu quả của

Osimertinib tiếp tục được khẳng định qua nghiên cứu AURA 3 là một nghiên cứu nhãn mở, pha 3 đa trung tâm với trên 400 bệnh nhân UTPKTBN có đột

biến EGFR và mang đột biến T790M sau khi đã tiến triển với TKIs bước 1

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Osimertinib có hiệu quả cao hơn đáng kể so với liệu pháp hoá trị Platinum kết hợp với Pemetrexed ở những bệnh nhân UTPKTBN có đột biến T790M (PFS 10,1 so với 4,4 tháng) [22, 40]

Mới cách đây không lâu vào tháng 4/2018 bằng kết quả nghiên cứu FLAURA thì thuốc TKIs thế hệ 3 này đã được FDA chấp thuận sử dụng cho

bệnh nhân có đột biến EGFR ở exon 19 và 21 (không đề cập đến có hay

không đột biến T790M) Kết quả nghiên cứu FLAURA cho thấy hiệu quả ưu việt, mang đến thời gian sống thêm lâu hơn ở những bệnh nhân sử dụng Osimertinib (PFS ở nhóm bệnh nhân sử dụng Osimertinib là 18,9 tháng so với 10,2 tháng ở những bệnh nhân sử dụng nhóm TKIs thế hệ 1) [49]

Các đột biến điểm thứ hai khác, chẳng hạn như D761Y [13], T854A [14] hoặc L747S [59] cũng kèm theo sự kháng lại các thuốc TKIs mặc dù cơ chế vẫn chưa rõ ràng [58]

1.2.4.2 Cơ chế kháng TKIs bằng cách kích hoạt các con đường thay thế

Các con đường kích hoạt khác hay đường vòng cũng có thể gây ra sự kháng thuốc TKIs Thông qua việc kích hoạt các con đường vòng, các tế bào ung thư có thể tồn tại và sinh sôi nảy nở ngay cả khi bị ức chế bởi con đường điều khiển ban đầu Con đường kích hoạt thay thế phổ biến nhất là sự khuếch đại cMET chiếm 5-10% các trường hợp có khả năng kháng với các thuốc TKIs [19, 61] Khuếch đại cMET có thể kích hoạt tín hiệu đường dẫn truyền PI3K-AKT độc lập với EGFR thông qua việc điều khiển tín hiệu và điều khiển quá trình nhị trùng phân ERBB3 [19] Tuy nhiên, ngưỡng khuếch đại của cMET mà ở đó gây ra sự kháng TKIs còn chưa được làm rõ [20]

Trang 24

Việc kích hoạt các con đường thay thế khác, bao gồm khuếch đại HER2 [52], đột biến PIK3CA [46], đột biến BRAF và tăng biểu hiện của thụ thể tyrosine kinase AXL cũng đã được báo cáo là thúc đẩy khả năng kháng với các thuốc TKIs [65]

1.2.4.3 Cơ chế kháng TKIs bằng việc chuyển dạng mô bệnh học

Khoảng 5% bệnh nhân bị biến đổi từ ung tư biểu mô tuyến thành ung thư phổi tế bào nhỏ sau khi có được sự đề kháng với TKIs [46]; quá trình này được mô tả lần đầu tiên vào năm 2006 ở một phụ nữ 45 tuổi mắc ung thư biểu

mô tuyến có đột biến EGFR và chưa bao giờ hút thuốc [63] Một giả thiết

khác cho quan sát này là bệnh nhân có khối u với mô bệnh học có sự kết hợp của cả UTPKTBN và ung thư phổi tế bào nhỏ, không rõ ràng trên sinh thiết chẩn đoán, và sau đó thành phần ung thư phổi tế bào nhỏ trở nên chiếm ưu thế khi thành phần UTPKTBN được điều trị có đáp ứng bằng TKIs Tuy nhiên, quá trình lâm sàng của các trường hợp được báo cáo thường không phù hợp với giả thuyết này [34]

Ngoài ra còn có sự chuyển dạng biểu mô – trung mô (EMT) thúc đẩy

sự xâm lấn hơn của khối u, di căn và kháng thuốc TKIs [53] EMT đã được báo cáo trong 2 trường hợp (5%) của 37 bệnh nhân [46] Về mặt hình thái, các

tế bào ung thư bị mất các đặc điểm biểu mô và biến đổi thành các tế bào trung

mô [50]

1.2.5 Phương pháp lấy mẫu, xác định đột biến gen EGFR mẫu huyết

tương trong UTPKTBN

1.2.5.1 Vai trò của sinh thiết lỏng trong xác định đột biến EGFR mẫu huyết

tương

Hiện nay kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA dựa trên mẫu mô ung thư

được xem là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện đột biến gen EGFR Tuy nhiên

có một số khó khăn khi xét nghiệm từ mẫu sinh thiết như bệnh nhân già yếu, không đủ sức khoẻ để sinh thiết, vị trí u không thể sinh thiết, bệnh nhân không còn u sau một thời gian điều trị hoặc bệnh nhân không đồng ý sinh thiết Mặt khác, quy trình lấy mẫu sinh thiết khối u có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư, gieo rắc mầm bệnh ung thư vào vị trí khác [42] Vì vậy,

Trang 25

cần phải tìm kiếm một mẫu thay thế khác để phát hiện đột biến EGFR

Huyết tương chứa DNA có nguồn gốc từ tế bào ung thư chết, hoại tử giải phóng các mảnh DNA vào máu gọi là các ctDNA (circulating tumor DNA) Nồng độ ctDNA cao hơn ở những bệnh nhân có ung thư di căn Các DNA này có khả năng đại diện cho toàn bộ bộ gen của khối u [28] Vậy việc phân tích và xét nghiệm ctDNA sẽ giúp tìm ra các đột biến có liên hệ trực tiếp với sự phát triển tình trạng khối u Sinh thiết lỏng là biện pháp cho phép xác định bệnh nhân có khối u có đột biến đặc hiệu theo cách xâm lấn tối thiểu và tốn ít thời gian hơn; ngoài ra sinh thiết lỏng cũng giúp ích trong việc theo dõi tiến triển bệnh và kịp thời đưa ra phương pháp điều trị mới [18]

Cho đến nay, nhiều kỹ thuật đã được thử nghiệm để phát hiện đột biến

EGFR bằng cách sử dụng mẫu huyết tương Và một số nghiên cứu đã chứng

minh rằng các đột biến được phát hiện trong huyết tương rất phù hợp (thường

là 60%-90%) với những đột biến được phát hiện trong mô khối u ở bệnh nhân UTPKTBN [18] Ví dụ trong nghiên cứu ASSESS năm 2016, sự phù hợp tổng thể của tình trạng đột biến là 89% [41]

1.2.5.2 Phương pháp phát hiện đột biến gen EGFR mẫu huyết tương

Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên còn được gọi là PCR thời gian thực, và do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại [11]

Trong real-time PCR, hiển thị cơ bản để người làm thí nghiệm có thể quan sát được trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu đồ khuếch đại (amplification graph) [11]

Trang 26

Hình 1.5 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng real-time PCR

Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt [11]

Real-time PCR có khả năng xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử bằng cách thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng [11] Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn được gọi là đường biểu diễn chuẩn (standard curve) [11]

Trang 27

Hình 1.6 Biểu đồ chuẩn của phản ứng real-time PCR

Biểu đồ chuẩn vẽ lên đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa số lượng bản DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng Trong hình ở trên, E2-E4-E7 là các ống phản ứng chứa các mẫu chuẩn còn B4 là ống phản ứng chứa mẫu thử [11]

Chất huỳnh quang sử dụng trong real-time PCR để xác định các đột

biến EGFR huyết tương là các probe (đoạn dò), đó là những đoạn

oligonucleotides sợi đơn trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích Có nhiều loại probe, và thậm chí cả primers cũng được

sử dụng làm chất phát huỳnh quang cho real-time PCR Đã có 2 kit xét

nghiệm đột biến EGFR được FDA chấp thuận: therascreen EGFR RGQ

Plasma PCR Kit (Quiagen) phát triển bởi Quiagen và AstraZeneca được FDA chấp thuận vào tháng 01/2015 để sử dụng Iressa, kit này sử dụng đầu dò

Beacon [21]; cobas® EGFR Mutation Test v2 (Roche) được FDA chấp thuận

tháng 10/2015, sử dụng đầu dò TaqMan [21]

ddPCR (Droplet digital PCR)

PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) là phản ứng dựa trên sự khuếch đại cô lập của hàng ngàn phân tử DNA riêng lẻ đồng thời, với mỗi phân tử được ngăn cách trong một giọt riêng biệt Sự hiện diện của sản phẩm được khuếch đại trong mỗi giọt được biểu thị bằng tín hiệu huỳnh quang và tỷ lệ các giọt

Trang 28

dương tính có thể cho phép định lượng chính xác các acid nucleic trong một mẫu Các phản ứng PCR thông thường bao gồm những phản ứng khuếch đại của nhiều phân tử DNA trong một ống duy nhất Ngược lại, PCR vi giọt kĩ thuật số phân chia các phân tử DNA riêng lẻ thành nhiều phản ứng song song bằng cách trộn một mẫu DNA với hỗn hợp dầu-nước trong điều kiện thích hợp Điều này tạo ra hàng ngàn giọt khác nhau, trong mỗi giọt có thể không chứa, chứa một hoặc nhiều hơn một phân tử DNA Mỗi giọt là một phản ứng độc lập có thể được khuếch đại đồng thời trong một ống và chỉ những giọt ban đầu chứa ít nhất một phân tử DNA có thể chứa sản phẩm mục tiêu để phát hiện [55]

Chất phát huỳnh quang sử dụng để phát hiện đột biến có thể là các đầu

dò (Taqman) hoặc thuốc nhuộm gắn với dsDNA như EvaGreen [55]

Giải trình tự gen

Phương pháp giải trình tự DNA (phương pháp dideoxy) hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977 Nguyên tắc của phương pháp dideoxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các dNTP là dideoxynucleotide (ddNTP) vào thành phần phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm Do ddNTP bị thiếu nhóm C3’-OH, nên một khi

nó được gắn vào mạch DNA đang tổng hợp, thì quá trình tổng hợp DNA sẽ dừng lại [2]

Phản ứng giải mã trình tự được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt, mỗi ống có DNA khuôn, DNA mồi, enzym DNA polymerase (thường là Taq polymerase), 4 loại dNTP thông thường (một trong những loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp); ngoài ra, từng loại trong 4 loại ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) sẽ được bổ sung lần lượt tương ứng vào mỗi ống nghiệm nêu trên với nồng độ bằng 1/10

so với nồng dộ loại dNTP tương ứng Với thành phần phản ứng như vậy, trong phần lớn trường hợp, dNTP sẽ liên kết vào mạch DNA đang tổng hợp, nhưng ddNTP (ở nồng độ thấp) cũng sẽ liên kết vào một số mạch DNA đang tổng hợp và làm kết thúc quá trình sao chép Do có nhiều phân tử DNA được tổng hợp đồng thời nên quá trình này dẫn đến sự hình thành của một hỗn hợp

Trang 29

nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở đầu 3’ về chiều dài và loại nucleotide kết thúc chuỗi Các sản phẩm này sau đó được phân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự các băng xuất hiện trên bản điện di theo chiều từ cực dương sang cực âm [2]

Phương pháp này giúp xác định các đột biến đã biết và đột biến mới

1.2.6 Tình hình nghiên cứu đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân

UTPKTBN

Trên thế giới

Năm 2009, Bai Hua và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tình

trạng đột biến EGFR trong mẫu huyết tương ở những bệnh nhân UTPKTBN

giai đoạn IIIB-IV sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao performance liquid chromatography, HPLC) Kết quả cho thấy trong 230

(High-bệnh nhân nghiên cứu, phát hiện 81 đột biến EGFR trong 79 mẫu huyết tương

(tỷ lệ 34,3%), bao gồm 56 đột biến xoá đoạn ở exon 19, 25 đột biến ở exon 21,

có 2 mẫu huyết tương có 2 đột biến ở cả exon 19 và 21 [12]

Năm 2012, Zhen Huang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên 882 bệnh nhân có mẫu mô và huyết tương phù hợp để khảo sát tình trạng đột biến

EGFR và sự tương đồng giữa xét nghiệm mẫu mô và huyết tương, sử dụng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Kết quả cho thấy trong 882

bệnh nhân xét nghiệm EGFR huyết tương, phát hiện 270 bệnh nhân (32,1%)

có đột biến, trong đó vị trí exon 19 chiếm 20,3% với 167 bệnh nhân, exon 21 chiếm 15,1% với 124 bệnh nhân, bao gồm 21 bệnh nhân (2,83%) cùng tồn tại

cả hai đột biến exon 19 và 21 [25]

Một nghiên cứu khác của Xiao Zhao và cộng sự năm 2013 nhằm so

sánh tình trạng đột biến EGFR ở mẫu mô và huyết tương của bệnh nhân

UTPKTBN giai đoạn I-IV Kết quả cho thấy trong 111 mẫu huyết tương phát

hiện tỷ lệ đột biến EGFR là 17,1% trong đó 55% là đột biến xoá đoạn trên

exon 19, 45% là đột biến L858R trên exon 21 [66]

Năm 2014, theo nghiên cứu của Xuefei Li và cộng sự nhằm phân tích

và theo dõi tình trạng đột biến EGFR để dự đoán hiệu quả và theo dõi tình

Trang 30

trạng kháng thuốc trong quá trình điều trị bằng TKIs Mẫu huyết tương xét nghiệm sử dụng phương pháp ARMS Kết quả cho thấy trong 141 mẫu huyết

tương nghiên cứu tỷ lệ đột biến EGFR là 25,5% (36 mẫu đột biến), bao gồm

17 mẫu chứa đột biến xoá đoạn trên exon 19, 12 mẫu chứa đột biến L858R trên exon 21, 1 mẫu chứa đột biến T790M, 4 mẫu chứa đột biến kép T790M

và đột biến xoá đoạn trên exon 19, 1 mẫu chứa đột biến kép T790M và đột biến L858R trên exon 21, 1 mẫu chứa đột biến kép xoá đoạn trên exon 19 và đột biến L858R [29]

Năm 2015, Một nghiên cứu nhằm đánh giá tình trạng thực sự của mối

tương quan giữa phát hiện đột biến EGFR mẫu mô và huyết tương được tiến

hành bởi Kai Guo và cộng sự trên 198 bệnh nhân UTPKTBN trong đó giai đoạn I đến giai đoạn IIIA chiếm 92,4% Phương pháp được sử dụng là

Scorpion – ARMS Kết quả cho thấy 34/198 (17,2%) có đột biến EGFR huyết

tương trong đó đột biến xoá đoạn trên exon 19 chiếm 22,5% (23 bệnh nhân), đột biến L858R trên exon 21 chiếm 7% (5 bệnh nhân) và có 2 đột biến kép (xoá đoạn exon 19 + đột biến điểm L858R exon 21; xoá đoạn exon 19 + đột biến điểm L861Q exon 21) [23]

Năm 2016, Takayuki Takahama và cộng sự tiến hành đánh giá tình

trạng đột biến EGFR mẫu huyết tương ở những bệnh nhân UTPKTBN vùng

phía Tây Nhật Bản bằng phương pháp PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) Kết quả trong tổng số 260 bệnh nhân (độ tuổi trung bình 68) phát hiện 120 bệnh nhân có đột biến nhạy với TKIs (46,2%), và 75 bệnh nhân có đột biến kháng thuốc T790M (28,8%) Trong số 120 bệnh nhân đột biến nhạy với TKIs, số lượng bệnh nhân nam so với nữ là 40/80, số người không hút thuốc so với số người hút thuốc là 82/36 (còn 2 người chưa xác định được); trong số 75 bệnh nhân phát hiện đột biến kháng thuốc T790M, số lượng bệnh nhân nam so với

nữ là 27/48, số người không hút thuốc so với người hút thuốc là 52/21 (còn 2 người chưa xác định được) Từ đó đưa ra kết luận rằng việc xét nghiệm đột

biến EGFR trong mẫu huyết tương bằng kỹ thuật ddPCR là một cách tiếp cận

đầy hứa hẹn để phát hiện đột biến gen trong quá trình điều trị bằng thuốc TKIs [51]

Một nghiên cứu của Shirong Zhang và cộng sự năm 2018 đã tiến hành

Trang 31

khảo sát tỷ lệ đột biến EGFR trong mẫu huyết tương của 1001 bệnh nhân giai đoạn III-IV ở 65 bệnh viện tại Trung Quốc Kết quả đột biến EGFR được phát

hiện ở 251 bệnh nhân trong tổng 1001 bệnh nhân (25,1%) trong đó 189 bệnh nhân phát hiện đột biến nhạy thuốc đơn độc (18,9%), 3 bệnh nhân phát hiện đột biến nhạy thuốc kết hợp (0,3%), 28 bệnh nhân có đột biến kháng thuốc (2,8%), 31 bệnh nhân có đột biến kết hợp các đột biến nhạy và kháng thuốc

(3,1%) Kết luận rằng xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương là khả thi và có

thể thay thế khi sinh thiết mô không khả thi [64]

Tại Việt Nam

Năm 2017, Phan Thanh Thăng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

nhằm đánh giá khả năng phát hiện đột biến EGFR trong mẫu huyết tương của

bệnh nhân UTPKTBN so với phương pháp mẫu mô bằng cách sử dụng 42 cặp mẫu máu và mô sinh thiết của 42 bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB-IV tại

bệnh viện Chợ Rẫy Phát hiện đột biến EGFR trong mẫu huyết tương bằng kỹ

thuật Scorpions ARMS (kết hợp giữa công nghệ khuếch đại alen đột biến và công nghệ scorpions sử dụng các cặp mồi thông minh trong phản ứng PCR để phát hiện các đột biến gen khi alen đột biến chiếm tỉ lệ rất nhỏ) Kết quả có 17

trường hợp có đột biến EGFR trong huyết tương (40,5%) và 19 trường hợp có đột biến EGFR mẫu mô (45,2%) Tỷ lệ đột biến trong mẫu huyết tương thấp

hơn so với trong mẫu mô khoảng 5% nhưng không có ý nghĩa thống kê (p >

0,05) Theo giới tính, đột biến EGFR mẫu huyết tương xảy ra với tỷ lệ cao ở

nữ hơn so với nam (p < 0,05) với tỷ lệ ở nữ là 64,3% (9/14), tỷ lệ ở nam là

28,6% (8/28) Xét theo giai đoạn bệnh, đột biến EGFR mẫu huyết tương xảy

ra với tỷ lệ cao hơn ở nhóm thuộc giai đoạn IV so với giai đoạn IIIB (p < 0,05); tỷ lệ đột biến trong mẫu huyết tương của nhóm thuộc giai đoạn IV là 53,6% (15/28), và của nhóm thuộc giai đoạn IIIB là 14,3% (2/14) Không có

sự khác biệt giữa tỷ lệ đột biến EGFR huyết tương giữa nhóm ≤ 60 tuổi so

với > 60 tuổi, giữa nhóm thuộc ung thư biểu mô tuyến so với dạng mô học khác (p > 0,05) [8]

Trang 32

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là 136 bệnh nhân UTPKTBN có chỉ định xét

nghiệm đột biến gen EGFR huyết tương tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung

bướu, Bệnh viện Bạch Mai năm 2017-2018 đáp ứng các tiêu chuẩn chọn lựa

và tiêu chuẩn loại trừ

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn lựa

+ Bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định UTPKTBN dựa vào kết quả mô bệnh học và hoá mô miễn dịch

+ Bệnh nhân có đầy đủ hồ sơ bệnh án bao gồm thông tin hành chính, kết quả

mô bệnh học, giai đoạn bệnh

+ Bệnh nhân được chỉ định xét nghiệm EGFR huyết tương

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

+ Không xác định được đột biến EGFR huyết tương do chất lượng mẫu kém

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu mô tả hồi cứu 2.2.2 Mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu được chọn theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện

2.2.3 Các biến số, chỉ số trong nghiên cứu

+ Thông tin chung của đối tượng nghiên cứu:

- Tuổi, giới, địa chỉ, tiền sử hút thuốc lá, tiền sử điều trị thuốc đích

- Kết quả xét nghiệm mô bệnh học, giai đoạn bệnh

+ Kết quả xét nghiệm đột biến gen EGFR huyết tương:

- Kết quả có hay không có đột biến, loại đột biến, vị trí đột biến

2.2.4 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 5 năm 2017 đến tháng 8 năm 2018

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	0,93 MB