Nghiên cứu được thực hiện nhằm nâng cao hiệu quả xử lý mẫu và phân tích dư lượng kháng sinh Florfenicol trong cá Rô phi bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC, UVVis). Phương pháp được phát triển dựa trên việc lựa chọn dung môi chiết; hoàn thiện quy trình xử lý mẫu và xác định đường chuẩn của Florfenicol trong mẫu máu, gan, thân, thịt cá Rô phi; lựa chọn tỷ lệ thành phần pha động và các điều kiện sắc ký khác. Kết quả cho thấy sử dụng dung môi chiết là Ethylacetate; chiết rung siêu âm; pha động là Acetonitrilenước ở tỷ lệ 7525 (VV);... có thể cho độ thu hồi 87,9299,91%, độ chụm 1,69¬5,83%, giới hạn phát hiện 0,00420,0076 µgg, thời gian lưu tương đối ngắn và trạng thái sắc ký đồ khá lý tưởng.
Trang 1TỐI ƯU HÓA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH FLORFENICOL TRONG CÁ RÔ PHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẰNG CAO
Bùi Thị Dịu 1 và Lê Huy Tuấn1*
lehuytuan@hdu.edu.vn,
Ngày nhận bài báo: 16/10/2017 - Ngày nhận bài phản biện: 03/11/2017
Ngày bài báo được chấp nhận đăng: 26/11/2017
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm nâng cao hiệu quả xử lý mẫu và phân tích dư lượng kháng sinh Florfenicol trong cá Rô phi bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC, UV-Vis) Phương pháp được phát triển dựa trên việc lựa chọn dung môi chiết; hoàn thiện quy trình xử lý mẫu và xác định đường chuẩn của Florfenicol trong mẫu máu, gan, thân, thịt cá Rô phi; lựa chọn tỷ lệ thành phần pha động và các điều kiện sắc ký khác Kết quả cho thấy sử dụng dung môi chiết là Ethylacetate; chiết rung siêu âm; pha động là Acetonitrile/nước ở tỷ lệ 75/25 (V/V); có thể cho độ thu hồi 87,92-99,91%, độ chụm 1,69-5,83%, giới hạn phát hiện 0,0042-0,0076 µg/g, thời gian lưu tương đối ngắn và trạng thái sắc ký đồ khá lý tưởng.
Từ khoá: Florfenicol, kháng sinh, cá Rô phi, sắc ký lỏng hiệu năng cao
ABSTRACT Optimization of methods for analysis of florfenicol antibiotic residues in Tilapia by using
high-performance liquid chromatography method
The study was carried out to improve the efficiency of sample handling and Florfenicol residue analysis in Mozambique tilapia by using liquid chromatography method (HPLC–Vis) The method was developed by selecting the solvent extraction, completing sample handling process and determining Florfenicol Calibration curve in Mozambique tilapia’s blood, live, body and flesh; selecting component ratio at mobile phase and other chromatographic conditions The results were evaluated by the recovery, limit of detection, trueness, robustness and Chromatogram state.
Keywords: Florfenicol, antibiotics, Tilapia, HPLC
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm qua, cùng với sự phát triển không ngừng về diện tích và sản lượng, nghề nuôi trồng thủy sản cũng đang đứng trước những thách thức không nhỏ từ vấn đề dịch bệnh Đây cũng chính là một trong những nguyên nhân dẫn đến việc thuốc kháng sinh ngày càng được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản
Trước đây, thuốc kháng sinh Chloramphenicol được người nuôi sử dụng nhiều trong việc điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cơ thể động vật thủy sản, nhưng loại kháng sinh này đã bị cấm sử dụng vì dư lượng của nó có thể gây ra hiện tượng thoái hóa tủy xương ở người Dẫn xuất Florinated của kháng sinh này đã được thay thế bằng Florfenicol (FF) và nhanh chóng được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi và thủy sản Mặc dù có tính an toàn cao hơn nhưng Florfenicol vẫn nằm trong danh mục thuốc kháng sinh hạn chế sử dụng (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2009), mức giới hạn tối đa của Florfenicol trong sản phẩm thuỷ sản xuất vào thị trường EU là 1.000 ppb và Canada là 800 ppb
Để phân tích lượng tồn dư của Florfenicol trong cơ thể động vật có các phương pháp được đề xuất, như: Sắc ký lỏng (Phạm Kim Đăng và ctv, 2014; Hayes, 2005; Kowalski và ctv, 2005; Guo
và ctv, 2008; Sorensen và Elbaek, 2004; Sun và ctv, 2009a; Xie và ctv, 2010); Sắc ký khí (Pfenning
và ctv, 2000; Zhang và ctv, 2006), ELISA (Sun và ctv, 2009b) Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp hiện nay đang được sử dụng khá rộng rãi cả trong nước và quốc tế Phương pháp này có thể cho khoảng tuyến tính khá rộng, hiệu suất phân ly, độ chọn lọc, độ ổn định tương đối cao
Hiện nay, có khá nhiều nghiên cứu sử dụng HPLC để phân tích dư lượng Florfenicol được công bố, tuy nhiên có rất ít các báo cáo về phương pháp phân tích loại kháng sinh này trong cơ thể cá Rô phi, đặc biệt là phương pháp xử lý mẫu và phân tích đối với từng cơ quan nội tạng cụ thể Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng và tối ưu hóa hiệu quả xử lý mẫu và phân tích dư lượng kháng sinh Florfenicol trong các mẫu gan, thận, máu và cơ thịt của cá Rô phi bằng phương pháp sắc ký lỏng (HPLC, UV-Vis) Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung vào hệ
1
Đại học Hồng Đức
* Tác giả để liên hệ: Ths Lê Huy Tuấn, Giảng viên bộ môn Khoa học Vật nuôi, Khoa Nông Lâm Ngư Nghiệp, Đại học Hồng
Đức Địa chỉ: 565 Quang Trung, Đông Vệ, Tp Thanh Hóa Điện thoại: 0902.172.789 E-mail: lehuytuan@hdu.edu.vn
Trang 2thống các phương pháp phân tích Florfenicol trên động vật nói chung và trên cá Rô phi nói riêng
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu
Kháng sinh chuẩn Florfenicol do hãng Sigma cung cấp Nước cất hai lần được làm sạch và loại ion qua hệ thống Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) Toàn bộ các dung dịch chuẩn bị cho chạy sắc ký đều được lọc qua màng lọc nilon 0,45µm trước khi đưa vào cột
Hệ thống sắc ký lỏng cao năng HPLC, UV-Vis Shimadzu và cột sắc ký: SHIMAZDU: Shim-pack VP-ODS 150L4.6
Chất chuẩn Florfenicol được pha trong methanol ở nồng độ 1µg/ml và bảo quản trong tủ lạnh ở 0 - 40
C Dung dịch nghiên cứu pha loãng từ dung dịch gốc (1µg/ml) bằng nước cất
Cá Rô phi đen (oreochromis mossambicus) được chọn làm thí nghiệm, có khối lượng 200±30g.
Cá được nuôi tạm dưỡng 10 ngày trong bể composite (25℃, ph 7,5±0,5 do 6±0,5mg/l) Các mẫu máu, gan, thận và thịt của cá được lấy để phân tích Máu (lấy từ tĩnh mạch) được cho vào ống li tâm 5ml có chứa 100µl chất chống đông, ly tâm 10000r/min, lấy phần huyết tương phía trên, bảo quản ở -20℃ Mẫu gan, thận và thịt được bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ -20℃
Mẫu huyết tương chờ giải đông tự nhiên Thêm 1g Na2SO4 khan và 2mL Ethyl acetate, rung vortex 30s, đặt vào bể rung siêu âm 10 phút (tần số siêu âm 40 kHz, công suất 500W), li tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy phần dung dịch phía trên Chiết lặp lại lần nữa với 3ml ethyl acetate Gộp dung dịch từ hai lần chiết và thổi cạn bằng khí N2 ở 40℃ Sau đó thêm 1ml dung dịch pha động, 1ml n-Hecxen, rung vortex 1 phút, li tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy tầng dung dịch phía trên Tiếp tục tẩy mỡ một lần nữa với 1ml n-Hecxen Bơm dung dịch thu được vào bình đựng mẫu sắc ký thông qua đầu lọc 0,22µm
Mẫu phẩm gan, thận, thịt chờ giải đông tự nhiên Lấy 0,3g thận (1g gan, 3g thịt) vào ống li tâm Nghiền mịn bằng máy đồng hóa mẫu Sau đó thêm Na2SO4 khan, Ethyl acetate và thực hiện các bước tương tự xử lý mẫu máu (không sử dụng thao tác rung siêu âm cho các loại mẫu phẩm này để tránh hiện tượng tạo váng huyền phù)
2.2 Xây dựng đường chuẩn
a Xây dựng đường chuẩn của chất chuẩn: Lần lượt lấy Florfenicol tiêu chuẩn ở các nồng độ 10; 5;
2; 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/mL để trực tiếp phân tích bằng HPLC Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Dựa vào nồng độ và diện tích peak trung bình tương ứng để xác định phương trình tuyến tính và hệ
số xác định (R2
)
b Xây dựng đường chuẩn trên mẫu phẩm: Lấy mẫu trắng của 1ml máu (0,3g thận, 1g gan hoặc 3g
thịt) lần lượt cho 0.5ml dung dịch Florfenicol ở các nồng độ 10; 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/mL
Áp dụng các bước xử lý mẫu như mô tả ở mục 2.5 Lúc này được chuỗi nồng độ lần lượt là 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 µg/mL Tiến hành phân tích HPLC Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Dựa vào nồng độ và diện tích peak trung bình tương ứng để xác định phương trình tuyến tính và hệ số xác định (R2
)
2.3 Xác định độ thu hồi và độ chuẩn
a Xác định độ thu hồi: lấy 0.5ml dung dịch Florfenicol chuẩn ở các nồng độ 0,5; 2; 10 µg/mL cho
vào các mẫu trắng để tiến hành chiết tách và phân tích theo các bước trên Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Dựa vào nồng độ ban đầu, đường chuẩn tương ứng và nồng độ sau khi phân tích, xác định
độ thu hồi dựa vào công thức sau:
Độ thu hồi (H%) = 100%
b Xác định chính xác: độ chính xác của phương pháp được xác định thông qua độ chụm Lấy 0,5 ml
dung dịch Florfenicol chuẩn ở các nồng độ 0,5; 2; 10 µg/mL cho vào các mẫu trắng để tiến hành chiết tách và phân tích theo các bước trên Tiến hành thí nghiệm trong 3 ngày liên tiếp Mỗi ngày làm thí nghiệm lặp lại 5 lần
Trang 32.4 Xác định giới hạn phát hiện (LOD)
Phân tích mẫu thêm chuẩn với nồng độ thấp nhất (0,05µg/ml đối với mẫu máu và 0,05 µg/g đối với gan, thận, thịt), lặp lại 10 lần, tính độ lệch chuẩn SD Giới hạn phát hiện của phương pháp được tính theo công thức: LOD = 3SD
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Lựa chọn dung môi chiết
Florfenicol có thể dễ hàng hòa tan trong các dung môi hữu cơ như: Acetonitrile, Acetone, Ethylacetate Vì vậy các dung môi này cũng thường được sử dụng trong các phương pháp chiết tách các chất thuộc nhóm Phenicol (Feng và ctv, 2006; Peng, 2010; Zhu và ctv, 2006) Kết quả khảo sát hiệu quả chiết Florfenicol của Acetonitrile, Ethylacetate, Acetone trong mẫu gan cá lần lượt cho hệ số thu hồi là: 86,13; 95,54; 91,72% Acetonitrile cho hệ số thu hồi tương đối thấp, khi phân tích HPLC thấy xuất hiện khá nhiều peak tạp, Florfenicol thường không có sự tách biệt hoàn toàn với các tạp chất
Trong khi đó, dung môi chiết là Ethylacetate và Acetone lại cho hệ số thu hồi khá cao, đường nền của sắc ký đồ HPLC khá ổn định Tuy nhiên, do Ethylacetate cho hiệu quả chiết cao hơn, dễ dàng được thổi khô bằng khí N2 và tính an toàn cao hơn nên thí nghiệm này đã sử dụng Ethylacetate làm dung môi chiết cho quá trình xử lý mẫu
3.2 Lựa chọn pha động và tỷ lệ các thành phần
Khảo sát hai loại dung môi thường được sử dụng làm pha động trong kỹ thuật sắc ký lỏng
là Methanol và Acetonitrile, kết quả cho thấy: dụng pha động là Acetonitrile cho độ nhạy cao hơn, lượng dùng cần ít hơn Methanol
Trong cùng điều kiện sắc ký, ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần pha động Acetonitrile/Nước (V/V) đến thời gian lưu được thể biện trong Bảng 1 Kết quả cho thấy khi dùng pha động Acetonitrile/nước ở tỷ lệ 75/25 (V/V), thời gian lưu tương đối ngắn, Acetonitrile tách khỏi các tạp chất, đường nền khá ổn định Nếu hạ thấp tỷ lệ Acetonitrile trong pha động sẽ làm kéo dài thời gian lưu Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ Acetonitrile thì thời gian lưu cũng có sự thay đổi nhưng không
rỏ ràng Vì vậy, thí nghiệm này đã lấy tỷ lệ pha động là Acetonitrile/Nước = 75/25 (V/V)
Bảng 1 Ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần pha động đến thời gian lưu
Acetonitrile/nước（V/V） 50/50 60/40 65/35 70/30 75/25 80/20 85/15
Thời gian lưu（min） 16,88 16,03 13,15 11,73 10,85 10,73 10,92
3.3 Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký: VP-ODS C18（250 mm4,6 mm, 5 µm）
- Bước sóng tử ngoại: Tiến hành khảo sát quang phổ trong dải 200-300 nm, Florfenicol cho mức hấp thụ cao nhất tại bước sóng 225 nm
- Pha động: Acetonitrile/ nước = 25/75
- Lưu tốc dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: 35℃
- Lượng nhập mẫu: 20 µL
- Thời gian vận hành: 12 phút
3.4 Trạng thái sắc ký đồ
a, b, c, d, e, f (hình 1) lần lượt là sắc ký đồ của chất chuẩn, mẫu trắng của máu, mẫu máu, gan, thận, và thịt thêm chuẩn.
Trang 40.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275 Detector A:224nm
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min 0
25 50 75 100 125
150Detector A:224nm
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min
0
50
100
150
200
250
300
mV
Detector A:224nm
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min 0
50 100 150 200 250 300 350 mV Detector A:224nm
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
mV
Detector A:224nm
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min 0
50 100 150 200 250
300Detector A:224nm
Hình 1 Sắc ký đồ của Florfenicol
a Florfenicol chuẩn 2µg/mL; b Mẫu trắng của máu; c Máu thêm chuẩn 2µg/mL; d Gan thêm chuẩn 2µg/g.; e.
Thận thêm chuẩn 2µg/g và f Thịt thêm chuẩn 2µg/g
3.5 Đường chuẩn
a Đường chuẩn của chất chuẩn
Phân tích HPLC đối Florfenicol tiêu chuẩn ở các nồng độ 10; 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/mL cho kết quả như hình 2 Phương trình tương quan tuyến tính của Florfenicol là Y1= 45857X1 -63,55; mức độ tương quan rất chặt (R2
=1)
Hình 2 Đường chuẩn của Florfenicol tiêu chuẩn
b Đường chuẩn Florfenicol của máu, gan, thận và thịt
Tiến hành xây dựng đường chuẩn của Florfenicol trong các loại mẫu phẩm như mô tả ở phần 2.2b Kết quả như hình 3, trong đó a, b, c, d lần lượt là đường chuẩn của Florfenicol trong máu, gan, thận và thịt Phương trình tuyến tính và hệ số xác định lần lượt là:
ab
c d
ef
Trang 5Trong máu (Y2)：Y 2 = 44758X 2 + 3175，R² = 0,9996
Trong gan (Y3)：Y 3 = 44287X 3 + 3306，R² = 0,9992
Trong thận (Y4)：Y 4 = 42876X 4 + 2564，R² = 0,9997
Trong thịt (Y5)：Y 5 = 43265X 5 + 2599，R² = 0,9998
(Y là diện tích peak, X là nồng độ Florfenicol )
Hình 3 Đường chuẩn của Florfenicol trong máu, gan, thận và thịt
3.6 Hệ số thu hồi và độ chụm
Kết quả xác định hệ số thu hồi và độ chính xác được thể hiện trong bảng 2 Hệ số thu hồi khá cao (trên 94%); RSD% trung bình tương đối thấp (3,34 ̵ 4,24%)
Bảng 2 Hệ số thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối
Mẫu máu thêm chuẩn
Mẫu gan thêm chuẩn
Mẫu thận thêm chuẩn
Mẫu thịt thêm chuẩn
Nồng độ thêm chuẩn (µg/g)
Nồng độ thực tế (µg/g)**
Hệ số thu hồi (%)**
Hệ số thu hồi trung bình (%) 95,70 94,79 94,84 95,09
RSD*(%)**
3.7 Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD)
Giới hạn phát hiện Florfenicol trong các mẫu máu, gan, thận và thịt lần lượt là 0,0066 µg/ml, 0,0072 µg/g, 0,0039 µg/g, 0,0051 µg/g (Bảng 3)
Bảng 3 Giới hạn phát hiện của phương pháp
Trang 6Mẫu Nồng độ phân tích SD LOD
Máu(µg/ml) 0,0435 0,0461 0,0476 0,0450 0,0430 0,0466 0,0491 0,0022 0,0066 Gan (µg/g) 0,0471 0,0461 0,0435 0,0496 0,0445 0,0466 0,0501 0,0024 0,0072 Thận (µg/g) 0,0486 0,0471 0,0491 0,0450 0,0471 0,0476 0,0481 0,0013 0,0039 Thịt (µg/g) 0,0440 0,0461 0,0471 0,0445 0,0476 0,0491 0,0466 0,0017 0,0051
4 KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu ban đầu về kỹ thuật sắc ký lỏng cao năng để phát hiện tồn dư florfenicol sản phẩm cá Rô phi đã cho thấy với các điều kiện tối ưu có thể đáp ứng được các yêu cầu theo quyết định 2002/657/CE của ủy ban Châu Âu và Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8374:2010 Độ thu hồi đạt được tương đối cao (87,9299,91%), độ chụm (1,69-5,83%), giới hạn phát hiện (0,0042-0,0076 µg/g) Phương pháp này có thể ứng dụng để phân tích Florfenicol tồn dư trong cá Rô phi Nghiên cứu có thể tiếp tục mở rộng trên các nền mẫu của gia súc, gia cầm và một số loài thủy sản khác
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2009), Thông tư số 15/2009/TT-BNN, Ban hành danh mục thuốc, hoá chất, kháng
sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng
2 Phạm Kim Đăng, Vũ Thị Ngân và Phạm Hồng Ngân (2014), Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh Chloramphenicol
(CAP), Florphenicol (FF), Thiamphenicol (TAP) trong một số sản phẩm động vật bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
(LC-MS/MS), Tạp chí Khoa học và Phát triển, 12(2): 165-176.
3 Feng Jingbin, Li Liudong and Jia Xiaoping (2006), Pharmarcokinetics of Florfenicol in Tilapina, South China Fisheries
Science, 2(5): 2529.
4 Hayes J.M (2005), Determination of florfenicol in fish feed by liquid chromatography, JAOAC Internat, 88(6): 177583.
5 Kowalski P., Chmielewska A and Konieczna L (2005), Comparative evaluation between capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography for the analysis of florfenicol in plasma, Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 39:
980989.
6 Guo Xia, Zhang Suxia and Jian Cheng (2008), Determination of Florfenicol and Florfenicol Amine Residues in Shrimp Muscle High Performance Liquid Chromatography Chinese Journal of Veterinary Drug, 42(7)：1216.
7 Peng Zhangxiao (2010), The Pharmacokinetics and Toxicology of Ivermectin in Crucian Shanghai Ocean University.
8 Pfenning A P., Rupp H S and Roybal J E (2000), Simultaneous determinati on of residues of chloramphenicol, florfenicol ,
florfenicol amine, and thiamphenicol in shrimp tissue by gaschromat ography with electron capturedetection, JAOAC
Internat, 83(1): 2530.
9 Sorensen L.K., Elbaek T H (2004), Simultaneous determination of trimethoprim, sulfadiazine, florfenicol and oxolinic acid in surface water by liquid chromatography tandem mass spectrometry, Chromatographia, 60: 285291.
10 Sun Faliang, Diao Youxiang and Sun Ning (2009a), Establishment and Application of Detecting the Residues of Florfenicol
in Chicken Muscle by Indirec comptivive Enzyme – Linked Immunosorbent Assay Chinese Scientia Agricultura Sinica.
2009, 42(5): 181519.
11 Sun Lei, Zhang Li and Wang Shu huai (2009b), Determination of Chloramphenicol, Thiamphenicol, Florfenicol and
Florfenicol Amine Residues in Animal Derived Food by PULC-MS/MS, Chinese Journal of Veterinary Drug, 43(3) : 4045.
12 TCVN 8374:2010 Thủy sản và sản phẩm thủy sản – Xác định hàm lượng Florfenicol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC).
13 Xie Kaizhou, Yao Yilin and Xu Dong (2010), Simultaneous determination of reidues of florfenicol and the matabotite
florfenicol amine in hen egg by HPLC with fluorescence detection, Chinese Journal Vaterinary Madicine, 30(4): 489492.
14 Zhang S., Li J and Sun E (2006), Simultaneous determination of florfenicol and florfenieol amine in fish, simhrp, and swinemuscle by gas chromatograph y with a microcell electron capturede tector, JAOAC Internat, 89(5): 143541.
15 Zhu Limin, Yang Xianle and Lin Qicun (2006), The residues and pharmacokintics of florphenicol in Trionyx sinnensis following intramascular injection and oral administration, Journal of fisheries of China, 30(4): 515519.