NGHIÊN cứu TÍNH đa HÌNH THÁI đơn c677t GEN MTHFR ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP THỂ BIỆT hóa

Tình hình nghiên cứu về đa hình thái đơn C677T gen MTHFR trên bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa...3 1.2... Để giúp chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh,giúp cho quá trình điều trị bệ

NGUYỄN HOÀNG YẾN

NGHI£N CøU TÝNH §A H×NH TH¸I §¥N C677T GEN MTHFR ë BÖNH NH¢N UNG TH¦ TUYÕN

GI¸P THÓ BIÖT HãA

Chuyên ngành : Tai Mũi Họng

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Quang Trung

HÀ NỘI – 2017

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quang Trung, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn cao học Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm làm việc giúp tôi hoàn thành nghiên cứu này Trong quá trình nghiên cứu và học tập, tôi luôn nhận được những lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy

để có thể thực hiện tốt nghiên cứu của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Huy Bình, phó trưởng bộ môn Sinh

lý – Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học, đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn.

Tôi xin cảm ơn Ths Vũ Trung Lương, phó trưởng khoa Tai Mũi Họng – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thu thập bệnh nhân và mẫu bệnh phẩm nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, đặc biệt là GS.TS Mai Trọng Khoa và PGS.TS Trần Đình Hà, TS Phạm Cẩm Phương đã tạo điều kiện hết mức cho tôi được tiến hành nghiên cứu tại Đơn vị Gen trị liệu - Bệnh viện Bạch Mai.

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Đơn vị Gen trị liệu, đặc biệt là TS Nguyễn Thuận Lợi, những người đã chỉ dẫn, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động viên tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Hà Nội, ngày 22 tháng 11 năm 2017

Học viên

Nguyễn Hoàng Yến

Tôi là Nguyễn Hoàng Yến, học viên Cao Học khóa 24, chuyên ngành

Tai – Mũi – Họng , Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan:

1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

của TS Nguyễn Quang Trung

2 Công trình này không trùng lặp với bất cứ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơinghiên cứu cho phép lấy số liệu và xác nhận

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội,ngày 22 tháng 11 năm 2017

Người viết cam đoan

Nguyễn Hoàng Yến

(American Joint Committee on Cancer).

ARMS Amplification refractory mutation system

F/Rm Forward primer/ Reverse mutation primer

F/Rw Forward primer/ Reverse wild type primer

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

MAPK Mitogen – Activated Protein Kinase

MTHFR Methylene tetrahydrofolate reductase

mTOR Mammalian Target of Rapamycin

PI3K Phosphotidylinositol - 3 Kinase

TMH Tai mũi họng

(International Union Against Cancer)

UTBMTG Ung thư biểu mô tuyến giáp

UTTG Ung thư tuyến giáp

SNP Sigle nucleotide polymorphism

5,10-MTHF 5,10- Methylene tetra hydrofolate

5-MTHF 5-Methyl tetra hydrofolate

Nguyễn Hoàng Yến 3

CHỮ VIẾT TẮT 4

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình nghiên cứu về đa hình thái đơn C677T gen MTHFR trên bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa 3

1.2 Bệnh học ung thư tuyến giáp 5

1.2.1 Dịch tễ học và yếu tố nguy cơ 5

1.2.2 Lâm sàng 7

1.2.3 Mô bệnh học 7

1.2.4 Phân loại giai đoạn ung thư tuyến giáp thể biệt hóa 8

1.3 Gen MTHFR 13

1.3.1 Tổng quan về gen MTHFR 13

1.3.2 Đa hình gen MTHFR 14

1.3.3 C677T (C677T-Ala222Val) và chức năng sinh hóa MTHFR 16

1.4 Các phương pháp phân tích đa hình gen MTHFR 17

1.4.1 Kỹ thuật PCR 18

1.4.2 Kỹ thuật ARMS - PCR 20

1.4.3 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 22

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 23

2.1.3 Cỡ mẫu nghiên cứu 23

2.3.1 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2017 đến tháng 10/2017 23

2.3.2 Địa điểm nghiên cứu 23

2.4 Thiết kế nghiên cứu 24

2.5 Công cụ và phương pháp thu thập số liệu 25

2.6 Các bước tiến hành 25

2.6.1 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng 25

2.6.2 Đánh giá giai đoạn bệnh 26

2.6.3 Xét nghiệm đa hình thái đơn C677T gen MTHFR 26

2.7 Phân tích và xử lý số liệu 29

2.8 Đạo đức nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3 29

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 30

3.1.1 Đặc điểm của nhóm bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa 30

3.2 Kết quả xác định đa hình thái đơn C677T gen MTHFR 33

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA 33

3.2.2 Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp 33

3.2.3 Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp 34

3.2.4 Kết quả xác định kiểu gen và tần số alen 35

3.3 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với một số đặc điểm của nhóm ung thư tuyến giáp 38

3.4 Mối tương quan giữa đa hình đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với giai đoạn bệnh 41

3.4.1 Mối liên quan giữa đa hình đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với khối u 41

3.4.3 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với giai đoạn

bệnh 43

3.4.4 Mối liên quan giữa đa hình đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với đột biến gen V600E 44

Nhận xét: 44 Kết quả bảng cho thấy không có mối liên quan nào giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR và đột biến V600 E (p>0,05) 44

Chương 446 BÀN LUẬN 46

4.1 Bàn luận về đặc điểm đối tượng nghiên cứu 46

4.1.1 Tuổi 46

4.1.2 Giới 48

4.1.3 Các yếu tố nguy cơ 48

4.1.4 Chỉ số khối cơ thể (BMI) 49

4.1.5 Lý do khám bệnh 50

4.1.6 Mô bệnh học 50

4.2 Bàn luận về xác định đa hình thái đơn C677T gen MTHFR bằng kĩ thuật ARMS PCR 50

4.2.1 Kết quả tách chiết DNA 50

4.2.2 Phân tích đa hình thái đơn C677T gen MTHFR bằng phương pháp ARMS-PCR và giải trình tự gen 52

4.2.3 Sự phân bố kiểu gen và tần số alen của đa hình thái đơn C677T gen MTHFR ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa ở Việt Nam 53

4.3 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với yếu tố nguy cơ và giai đoạn bệnh của ung thư tuyến giáp 55

4.3.3 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với đột biến BRAV V600E 57

4.4 Điểm mạnh và điểm yếu của nghiên cứu 58

KẾT LUẬN 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC

Nguyễn Hoàng Yến 3

CHỮ VIẾT TẮT 4

Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTTG thể biệt hóa theo AJCC 9

Bảng 1.2 Vị trí và các kiểu đột biến gen MTHFR 14

Bảng 1.3 Bảng phân bố tần số đột biến gen MTHFR trên thế giới 16

Bảng 2.1 Trình tự chuỗi DNA mồi 28

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 28

30 31 Bảng 3.1 Đặc điểm về yếu tố nguy cơ của nhóm UTTG (N=70) 31

Yếu tố nguy cơ 31

n 31 % 31 Tiền sử chiếu tia xạ vùng đầu cổ 31

0 31 0 31 Sống trong vùng có bướu cổ địa phương lưu hành 31

0 31 0 31 Tiền sử mắc các bệnh lý tuyến giáp 31

2 31 11,42 31 Không mắc bệnh gì 31

68 31

8,57 31

Nhận xét: Có 62 bệnh nhân không tiền sử bệnh 31

Có 2 bệnh nhân có tiền sử bệnh lý TG, trong đó có 1 bệnh nhân có tiền sử

Basedow, 1 bệnh nhân có nhân TG 31

Có 6 bệnh nhân có tiền sử gia đình có người bị UTTG 31Bảng 3.2 Đặc điểm về BMI của đối tượng nghiên cứu (N = 70) 31

Mô bệnh học 32

(N=70) 38Bảng 3.9 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với giới

của nhóm UTTG (N= 70) 39Bảng 3.10 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với yếu

tố nguy cơ của nhóm UTTG (N= 70) 39Yếu tố nguy cơ 39

CC 39

CT 39

TT 39

Tiền sử chiếu tia xạ vùng đầu cổ 40p>0.05 40

Sống trong vùng có bướu cổ địa phương lưu hành 40Tiền sử mắc các bệnh lý tuyến giáp 40Không mắc bệnh gì 40

N 40

Nhận xét: 40

Có 8 bệnh nhân có tiền sử bệnh lý TG, trong đó có 2 bệnh nhân mang kiểu

gen CC, 6 bệnh nhân có kiểu gen CT, không bệnh nhân nào mang kiểu gen TT 40Bảng 3.11 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với tiền

sử gia đình của nhóm UTTG (N= 70) 40Tiền sử gia đình 40

6 bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc ung thư tuyến giáp, trong đó có

1 bệnh nhân mang kiểu gen CC, 2 bệnh nhân có kiểu gen CT, 3 bệnh nhân mang kiểu gen TT 41Bảng 3.12 Mối liên quan giữa đa hình thái đơn C677T gen MTHFR với chỉ

số khối của nhóm UTTG (N= 70) 41

0 41

N 41

Bảng 3.14 Mối liên quan giữa đa hình đa hình thái đơn C677T gen MTHFR

với hạch bạch huyết vùng ở nhóm UTTG (N= 70) 42

Bảng 3.16 Mối liên quan giữa đa hình đa hình thái đơn C677T gen MTHFR

với đột biến gen V600E ở UTTG 44

Nguyễn Hoàng Yến 3

CHỮ VIẾT TẮT 4

Hình 1.1: Con đường tín hiệu liên quan đến thụ thể tyrosine kinase 11

của yếu tố tăng trưởng [20] 11

Hình 1.2 Con đường p53 có liên quan đến p21 12

Hình 1.3 Vị trí gen MTHFR 13

Hình 1.4 Chuyển hóa của MTHFR 14

Hình 3.1 Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp ARMS – PCR (Mẫu 28, 29, 31: xuất hiện cả 2 băng F/Rw và F/Rm có dạng dị hợp tử CT Mẫu 30: chỉ xuất hiện ở 1 băng F/Rm có dạng đồng hợp tử TT) 34

Hình 3.2 Kết quả giải trình tự gen (Mẫu 1: Tại vị trí khoanh tròn chỉ có duy nhất một đỉnh chỉ thị loại nucleotide C - tương ứng kiểu gen CC; Mẫu 2 - 4: Tại vị trí khoanh tròn xuất hiện hai đỉnh tại cùng 1 vị trí, do một nửa alen mang nucleotide C, một nửa alen mang nucleotide T - tương ứng kiểu gen CT) 35

Biểu đồ 1.1 Số bệnh nhân UTTG điều trị tại BV Bạch Mai (năm 2012 –

2016) 6Biểu đồ 3.1 Đặc điểm tuổi của nhóm UTTG (N= 70) 30Biểu đồ 3.2 Đặc điểm về giới của nhóm UTTG (N = 70) 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư biểu mô tuyến giáp (UTBMTG) là u ác tính của tế bào biểu

mô nang giáp, là loại phổ biến nhất của hệ nội tiết (90%) [1] UTBMTGchiếm 1% các loại ung thư nói chung [2], (UTTG) là bệnh thường gặp ở mọilứa tuổi Hai nhóm gặp nhiều nhất là 7 - 20 và 40 - 65 tuổi, trong đó nữnhiều hơn nam Trên thế giới tỷ lệ mắc UTTG khoảng 0,5-10/100.000 dân,

tỷ lệ này tùy thuộc vào vùng miền và quốc gia [3] Tại Việt Nam, riêng ở HàNội tỷ lệ UTTG chiếm 2%, nữ giới 3,6%, nam giới 0,8% với tỷ lệ là 4,5/1[4] Theo phân loại của Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ, UTBMTG gồm: thể biệthóa (thể nhú, thể nang, thể tủy) và thể không biệt hóa, trong đó UTBMTG

thể nhú là thể hay gặp nhất, chiếm tỷ lệ khoảng 75%

Trong những năm gần đây, tỷ lệ phát hiện bệnh UTTG ở nước ta ngàycàng nhiều Bệnh nhân đa phần ở lứa tuổi lao động, gây ảnh hưởng lớn tớichất lượng cuộc sống, kinh tế Qua theo dõi chúng tôi thấy, chỉ có một số ítdân số tiếp xúc với bức xạ phát triển bệnh UTTG Ngoài ra, các yếu tố ditruyền cũng đóng vai trò quan trọng trong bệnh lý UTTG Các nghiên cứu gầnđây chứng minh nồng độ folate máu thấp có liên quan đến UTTG Folate làmột acid amin, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợpdeoxynucleoside, nó cung cấp nhóm providemethyl và tham gia vào quá trìnhmethyl hóa trong tế bào [5] Nồng độ folate thấp sẽ không thể kết hợp uraciltrong quá trình tổng hợp DNA, dẫn đến nhiễm sắc thể bị tổn thương, làm giảm

sự chính xác của quá trình sửa chữa DNA và quá trình methyl DNA [6].Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) tham gia vào sự trao đổi củaacid folic, nó xúc tác sự hình thành của 5 methylentetrahydrofolate từ 5, 10-methylentetrahydrofolate (chất xúc tác cho sự chuyển homocysteine thànhmethionine) [7] Có khoảng 50 kiểu đột biến gen MTHFR đã được tìm thấy

trong đó hay gặp là C677T gen MTHFR Sự thay đổi ở vị trí nucleotid số

677 trong gen MTHFR (C677T), C biến đổi thành T gây thay thế acid aminvaline thành alanine, liên quan với giảm hoạt động của enzym và giảmfolate, tăng homocysteine máu Hiện nay tại Việt Nam chưa có công trìnhnào nghiên cứu về vấn đề này Để giúp chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh,giúp cho quá trình điều trị bệnh hiệu quả, nhanh chóng, từ sự trải nghiệmthực tế trong quá trình phát hiện và điều trị tại cơ sở y tế trong thời gian qua,

chúng tôi tiến hành tìm hiểu đề tài: “Nghiên cứu tính đa hình thái đơn

C677T gen MTHFR ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa” với

mục tiêu sau:

Đánh giá nguy cơ của đa hình thái đơn C677T gen MTHFR ở

các bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nghiên cứu về đa hình thái đơn C677T gen MTHFR trên bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa.

Báo cáo đầu tiên đánh giá vai trò của đa hình thái đơn C677T genMTHFR với nguy cơ ung thư tuyến giáp đã được tiến hành bởi Siraj và cộng

sự (2008) [7], nghiên cứu này gợi ý rằng đa hình thái đơn C677T genMTHFR không làm tăng nguy cơ ung thư tuyến giáp

Fard – Esfahani và cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu trên 154bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa và 198 người khỏe mạnh Nghiêncứu đã chỉ ra rằng những người mang kiểu gen 677CT MTHFR và gen 677TTMTHFR có nguy cơ mắc bệnh ung thư tuyến giáp thể biệt hóa cao gấp 2,08lần người mang kiểu gen 677CC MTHFR (95%, CI: 0,82 – 5,25) Ngoài ra,phân tích đa biến thể hiện nguy cơ ung thư tuyến giáp tăng gấp 2,38 lần giữanhững người mang kiểu gen đồng hợp tử lặn 677TT với người mang kiểu gen677CC và 677CT (95%, CI: 0,97 – 5,82) [8]

Ozdemir và cộng sự (2012) nghiên cứu 60 đối tượng UTTG thể biệthóa và 50 đối tượng thuộc nhóm chứng chỉ ra nguy cơ mắc UTTG ở ngườimang gen 677TT MTHFR cao gấp 1,92 lần so với nhóm chứng (OR: 1,92,95% CI: 1,03 – 3,58) Trong khi đó những bệnh nhân UTTG mang alen 1298A>C có nguy cơ ngang nhóm chứng Nguy cơ ở những người mang gen đồnghợp tử 1298 CC (CC vs AA hoặc AC) không tăng một cách có ý nghĩa thống

kê (OR: 1,30, 95% CI: 0,73 – 2,29) [9]

Yang Y.- M và cộng sự (2014) nghiên cứu trên 360 đối tượng UTTG

và 900 đối tượng thuộc nhóm chứng đã chỉ ra sự tương quan giữa đa hình

C667T gen MTHFR và nguy cơ ung thư tuyến giáp Người mang alen T cónguy cơ UTTG cao gấp 2,06 lần so với những người mang alen C (OR = 2,06,95% CI = 1,97 – 3,77, p = 0,04) Theo như tỷ lệ UTTG đã được nghiên cứu,kiểu gen TT hoặc CT có hơn gấp đôi nguy cơ so với kiểu gen CC (OR = 2,22,95% CI = 0,87 – 5,65, p = 0.09) [10].

Chen Y, Wang B, Wang YG (2014) đã tiến hành phân tích dữ liệu tổnghợp gồm 2421 đối tượng gồm bệnh nhân có bệnh tuyến giáp và bệnh nhânung thư tuyến giáp Nghiên cứu này đã đã chỉ ra rằng đa hình C677T genMTHFR không làm tăng nguy cơ mắc bệnh tuyến giáp (T so với C: OR =1,09, 95% CI = 0,94 –1,26, p = 0,25; TT so với CC: OR: 1,04, 95%CI = 0,75– 1,42, p =0,831; TT so với CC + TT: OR = 1,13, 95% CI 0,86 – 1,50, p =0,37; 95% CI 0,88 – 1,68, p = 0,24) Đồng thời cho thấy các cá nhân mangalen T làm tăng nguy cơ ung thư tuyến giáp ở người da trắng lên 1,3 lần sovới các cá nhân mang alen C (OR = 1,3; 95% CI = 1,03 – 1,65; p = 0,03).Người mang gen đồng hợp tử TT làm tăng nguy cơ ung thư tuyến giáp lên2.06 lần so với người mang gen dị đồng hợp tử CC (OR = 2,50; 95% CI =1,04 – 4,10; p = 0,04) [11]

Zara-LopesT và cộng sự (2016) nghiên cứu 344 phụ nữ trong đó có

200 bệnh nhân (100 ung thư tuyến giáp và ung thư vú 100) và 144 phụ nữkhỏe mạnh không có tiền sử của bệnh ung thư Nghiên cứu này cho thấynhững người mang gen đồng hợp tử lặn 677TT MTHFR có nguy cơ mắcung thư tuyến giáp cao 2,5 lần (OR = 2,50; 95% CI = 1,15 – 5,46; p=0,02) và nguy cơ ung thư vú cao 2,53 lần (OR = 2,53; 95% CI = 1,08 –

5,93; p = 0,03) [12]

Tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về đa hình thái đơn C677Tgen MTHFR trên bệnh nhân ung thư tuyến giáp thể biệt hóa

1.2 Bệnh học ung thư tuyến giáp.

Ung thư biểu mô tuyến giáp là u ác tính của tế bào biểu mô nang giáp.Theo phân loại của Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ, UTBMTG gồm: thể biệt hóa

(thể nhú, thể nang, thể tủy) và thể không biệt hóa

Ung thư tuyến giáp thể nhú phát triển từ tế bào nang giáp, là thể hay

gặp nhất, chiếm tỷ lệ khoảng 75% Bệnh thường gặp ở những người dưới 40

tuổi, chủ yếu là nữ giới, tiến triển tương đối chậm, có thể khu trú trong nhiềunăm, tiên lượng tốt, tỷ lệ sống trên 20 năm khoảng 90% Ung thư tuyến giápthể nhú thường di căn hạch vùng hơn là di căn xa

Ung thư tuyến giáp thể nang ít gặp hơn, chiếm khoảng 15% Bệnhthường gặp ở những người có tuổi, chủ yếu là nữ giới, có tỷ lệ cao ở nhữngvùng thiếu hụt iot, có khả năng xâm lấn các tổ chức xung quanh cao Ung thưtuyến giáp thể nang có thể di căn sớm vào phổi, xương

Ung thư tuyến giáp thể tủy phát triển từ tế bào cạnh nang, chiếm tỷ lệ

khoảng 5%, có tính chất gia đình, đều do đột biến các vùng khác nhau củagen tiền ung thư RET Bệnh có tiên lượng kém hơn thể nhú và thể nang

Ung thư tuyến giáp thể không biệt hóa rất hiếm gặp, có tiên lượng xấu,tiến triển nhanh

1.2.1 Dịch tễ học và yếu tố nguy cơ

Ung thư tuyến giáp là loại bệnh lý ung thư tiến triển thầm lặng Bệnh gặpchủ yếu ở lứa tuổi lao động, thường được phát hiện ở giai đoạn muộn và dicăn Theo Hiệp hội ung thư Mỹ (American Cancer Society, năm 2014) có khoảng62.980 trường hợp ung thư tuyến giáp mới mắc (trong đó 47.790 nữ và 15.190nam), trong khi năm 2009 mới chỉ có khoảng 37.000 trường hợp Ung thư tuyếngiáp gặp ở mọi lứa tuổi, thường ở những người trẻ hơn là những người lớn tuổi,với hai đỉnh cao là 7 – 20 tuổi và 40 – 65 tuổi, ở nữ giới nhiều hơn nam với tỷ lệ

½ Theo GLOBOCON 2012 ghi nhận có khoảng 2.400 ca ung thư tuyến giáp mới

ở Việt Nam nhưng thực tế con số này có lẽ còn lớn hơn Tại bệnh viện Bạch Mai,

số trường hợp ung thư tuyến giáp đến khám và điều trị ngày càng tăng trongnhững năm gần đây

Biểu đồ 1.1 Số bệnh nhân UTTG điều trị tại BV Bạch Mai (năm 2012 –

tỷ lệ mắc cao từ 10 đến 25 năm kể sau khi tiếp xúc [13] Ung thư tuyến giápcũng liên quan đến yếu tố gia đình, đặc biệt là ung thư thể tủy ở người trẻ cóliên quan đến tân sinh đa nội tiết type II (MEN – Multiple – EndocrineNeoplasia) Ngoài ra người ta còn tìm thấy một số tố nguy cơ có liên quan

đến ung thư tuyến giáp như tuổi, giới tính, tiền sử mắc các bệnh tuyến giápmãn tính, sống trong vùng có hàm lượng iot cao trong lương thực, thực phẩm.Gần đây, nhờ kỹ thuật sinh học phân tử phát triển, người ta biết đến một sốbiến đổi về gen gây ung thư tuyến giáp

1.2.2 Lâm sàng

Ung thư tuyến giáp là loại ung thư tiến triển thầm lặng và có tuổi thọ kéodài trên 10 năm, hay gặp ở phụ nữ, tuổi từ 40 – 65

− Khối u tuyến giáp [14], [15], [16], [17], [18]

• Trong giai sớm, dấu hiệu thường nghèo nàn, ít có giá trị Đa số bệnhnhân phát hiện bệnh khi khám sức khỏe định kỳ, tự sờ thấy u, hoặc thấy khốisưng phồng vùng cổ

• Giai đoạn muộn, khối u lớn xâm lấn rộng bệnh nhân xuất hiện các

triệu chứng: nuốt vướng, nuốt nghẹn, khàn tiếng, khó thở

• Đặc điểm u tuyến giáp: U có thể ở một thuỳ, eo hoặc cả hai thuỳ TG,

có thể biểu hiện một hay nhiều nhân với đặc điểm u cứng, bờ rõ, bề mặt nhẵnhay gồ ghề, có thể di động hoặc cố định

− Hạch cổ:

• Hạch cổ: đa số hạch cùng bên (có thể hạch cổ đối bên hoặc hai bên)

• Với đặc điểm hạch thường cứng, to chậm, không đau Hạch di độngđược khi còn nhỏ chưa xâm lấn rộng, dính và hạn chế di động khi hạch to

• Một số trường hợp có hạch trước khi tìm thấy u nguyên phát

− Di căn:

Hay gặp nhất là xương và phổi Di căn xương với tính chất tiêu hủy gâyđau hoặc gãy xương tự nhiên Di căn phổi thường âm thầm, kiểu hạt kê hơn làdạng nốt Di căn tại các vị trí não, gan, buồng trứng ít gặp hơn, chỉ gặp ở bệnhnhân có ung thư tuyến giáp thể tủy

1.2.3 Mô bệnh học

Trong các phương pháp chẩn đoán ung thư tuyến giáp, chẩn đoán môbệnh học luôn là tiêu chuẩn vàng Việc định thể mô bệnh học rất quan trọng

trong chẩn đoán xác định, chọn lựa phương pháp điều trị và tiên lượng bệnh Hiện nay phân loại mô bệnh học thường phân loại theo AJCC (AmericanJoint Committee on Cancer) Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ

Ung thư thể biệt hóa bao gồm: thể nhú, thể nang và thể tủy

Ung thư thể không biệt hoá

1.2.4 Phân loại giai đoạn ung thư tuyến giáp thể biệt hóa

Giai đoạn bệnh được coi là yếu tố tiên lượng có giá trị nhất trong UTTGthể biệt hóa và nó là cơ sở cho việc lựa chọn phương pháp điều trị Trong đólâm sàng, cận lâm sàng (siêu âm vùng cổ, mô bệnh học) là cơ sở xác định giaiđoạn bệnh Hiện nay, hệ thống phân loại TNM là tiêu chuẩn quốc tế cho giaiđoạn UTTG Hệ thống phân loại TNM bởi Hiệp hội ung thư Hoa kỳ năm 2010được đánh giá dựa trên kích thước và mức độ xâm lấn của khối u (T- tumor),tình trạng di căn hạch bạch huyết (N – nudole) và di căn xa (M – metastase)

1.2.4.1 Phân loại TNM theo AJCC 2010 [19].

- T (tumor): khối u nguyên phát

+ Tx: u nguyên phát không xác định được

+ To: không có bằng chứng của khối u nguyên phát

+ T1: u có đường kính < 2cm, giới hạn trong TG

o T1a: u có đường kính < 1cm

o T1b: u có đường kính từ 1 - 2cm

+ T2: u có đường kính 2 - 4cm, giới hạn trong TG

+ T3: u lớn có đường kính > 4cm, vẫn nằm trong giới hạn của TG hoặc

u kích thước bất kỳ có vi xâm lấn ra ngoài TG ( như xâm lấn cơ ức giáp hoặc

hoặc các mạch máu trung thất.

- M (metastase): di căn xa

+ Mo: không có di căn xa

+ M1: có di căn xa

1.2.4.2 Phân loại giai đoạn bệnh theo AJCC 2010 (American Joint Committee on Cancer) [19]

Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTTG thể biệt hóa theo AJCC

Ung thư biểu mô thể nhú hoặc thể nang Giai đoạn Bệnh nhân < 45 tuổi Bệnh nhân > 45 tuổi

T bất kỳ, N1, Mo

T bất kỳ, N bất kỳ, M1

1.2.4.3 Một số khía cạnh sinh học phân tử trong ung thư tuyến giáp

UTTG là kết quả của nhiều quá trình biến đổi từ tế bào biểu mô tuyếnbình thường dẫn đến loạn sản, ung thư biểu mô tại chỗ, cuối cùng thành ungthư xâm nhập Trong những năm gần đây, những tiến bộ về kỹ thuật sinh họcphân tử đã phát hiện hầu hết các biến đổi quan trọng về gen trong việc hìnhthành ung thư Đó là sự tăng sinh quá mức bình thường của các gen tiền ungthư (Proto – oncogene) và đột biến bất hoạt của các gen ức chế khối u (Tumorsuppressor genes) trong cơ chế bệnh sinh UTTG Các gen này kiểm soát quátrình sinh sản, biệt hóa và quá trình chết theo chương trình của tế bào(Apoptosis)

Biến đổi di truyền quan trọng trong bệnh UTTG là đột biến gen EGFR,gây rối loạn trong con đường dẫn truyền tín hiệu thông qua thụ thể yếu tố pháttriển biểu mô EGFR Trong tế bào ung thư, hoạt tính tyrosine kinase của EGFR

bị rối loạn bởi đột biến gen EGFR, tăng số lượng bản sao gen EGFR hoặc biểuhiện quá mức protein EGFR Bên cạnh đó, protein BRAF với hoạt tínhserine/threonine kinase tiếp nối con đường tín hiệu của KRAS trong tế bào Sựphosphoryl hóa BRAF hoạt hóa các gen MEK1 và MEK2 thúc đẩy phân bào vàlàm tăng khả năng sống sót của tế bào ung thư [20]

Hình 1.1: Con đường tín hiệu liên quan đến thụ thể tyrosine kinase

của yếu tố tăng trưởng [20]

Sau khi yếu tố tăng trưởng liên kết với thụ thể tương ứng, protein RASđược hoạt hóa và truyền tín hiệu qua các con đường khác nhau: Qua RAF,MAPK để kiểm soát sự tăng sinh và biệt hóa trong các loại tế bào khác nhau;Qua PI3K, Akt, mTOR giúp tế bào duy trì khả năng sống sót, không qua chếttheo chương trình

Bất thường di truyền học trong UTTG, còn có thể kể đến là họ gen sinhkhối u RAS (H – ras, K – ras, N – ras) Các gen này mã hóa cho một loạiprotein nằm ở mặt trong của màng TB, có hoạt tính GTPase tham gia con

đường dẫn truyền tín hiệu nội bào Những nghiên cứu cho thấy sự khuếch đạigen RAS sẽ thúc đẩy sự tiến triển của khối u tuyến giáp, đặc biệt thường gặptrong ung thư biểu mô tuyến dạng nang ở vùng thiếu iod.

Protein p53 là protein kiềm chế khối u tiêu biểu nhất, tên gọi p53 xuấtphát từ mô tả đầu tiên về protein này với khối lượng 53kDa Protein p53 làmột yếu tố phiên mã có khả năng đáp ứng với nhiều rối loạn của tế bào nhưđứt gãy DNA, thiếu oxy máu, thay đổi sự kết dính của tế bào Sự hoạt hóap53 khiến tế bào ngừng tăng trưởng, thúc đẩy sửa chữa DNA, kích thích tếbào chết theo chương trình Protein p53 hoạt động làm kích thích quá trình

phiên mã để tạo nên p21 Đột biến gen TP53 làm tế bào mất khả năng kiểm

soát sự tăng trưởng của tế bào Các kết quả nghiên cứu tổng hợp của Hội Hệ

gen Ung thư Quốc tế cho thấy gen TP53 là gen thường xuyên đột biến nhất

(trên 50%) trong các dạng ung thư ở người

Hình 1.2 Con đường p53 có liên quan đến p21

Trong con đường này, p53 hoạt hóa quá trình sản xuất p21 Sự có mặtp21 ức chế sự hình thành phức hệ cyclin/CDK (như cyclin D1/CDK4, cyclinE/CDK2), do đó ức chế sự giải phóng yếu tố E2F, làm ngừng chu trình tế bào,khiến tế bào không thể phân chia

Ngoài đột biến gen EGFR, KRAS và BRAF, các bất thường về ditruyền khác có thể làm thay đổi liệu trình điều trị bệnh UTTG còn có phứchợp chuyển vị liên quan đến hoạt tính tyrosie kinase của thụ thể ALK, vốnnhạy cảm với các tác nhân ức chế ALK, phức hợp chuyển vị RET/ PTC ởnhiễm sắc thể 10, đột biến MEK và sự khuếch đại gen MET.

1.3 Gen MTHFR

1.3.1 Tổng quan về gen MTHFR

MTHFR là một gen qui định protein enzym Các bệnh liên quan đếnMTHFR bao gồm: bệnh tim mạch, dị tật ống thần kinh, bệnh tâm thần, ungthư vú, ung thư máu và ung thư tuyến giáp Hoạt động của gen liên quan đếnnồng độ homocysteine máu, đặc biệt là nồng độ folate huyết thanh

MTHFR có khối lượng phân tử 150 kDa bao gồm 656 aa Gen MTHFRnằm trên nhánh ngắn p của NST số 1 (1p36.3) Gen MTHFR bắt đầu từ cặpbase 1944 và kết thúc ở cặp base 27374, tổng cộng có 25431 cặp base, baogồm 11 exons và 11 introns [22] Gen MTHFR còn được biết đến với các têngọi khác như: 5,10 - methylene tetrahydrofolate reductase, methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR_HUMAN

Hình 1.3 Vị trí gen MTHFR

Enzyme Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR; EC 1.5.1.20)được quy định bởi gen MTHFR, là một trong những enzyme quan trọng nhấtchu trình chuyển hóa folate Enzyme MTHFR liên quan tới việc chuyển 5,10 -methylene tetrahydrofolate (CH2THF) thành 5 - methyl tetrahydorfolate

(CH3THF), con đường này xúc tác việc loại bỏ gốc methyl của homocysteine

để tạo thành methionine Sau đó, cơ thể sử dụng methionine để tạo ra protein

và các sản phẩm quan trọng khác Ngoài ra, nó cũng ảnh hưởng tới gốcmethyl của acid nucleic, các hoormon, các chất dẫn truyền thần kinh, cũngnhư việc tổng hơp purin và pyrimidine

Hình 1.4 Chuyển hóa của MTHFR

1.3.2 Đa hình gen MTHFR

Có khoảng 50 kiểu đa hình gen MTHFR đã được tìm thấy trong đó haikiểu đa hình MTHFR hay gặp đó là MTHFR C677T và MTHFR A1298C, cảhai đều làm giảm hoạt tính của MTHFR và dẫn tới giảm folate máu Trongnghiên cứu này chúng tôi chỉ quan tâm tới đa hình C677T gen MTHFR, C biếnđổi thành T ở vị trí nucleotid số 677 làm biến đổi valine thành alanine

Bảng 1.2 Vị trí và các kiểu đột biến gen MTHFR

(Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6561/table/A52375)

IVS2+533G→A n/a(intronic) Intron 2 Rosenberg N et al

IVS6+31T→C n/a (intronic) Intron 6 Goyette P et al

IVS10+262C→G n/a (intronic) Intron 10 Linnebank M et al

Tần số của alen T là thay đổi đáng kể tùy theo từng chủng tộc và địa lý.Tần số cao nhất (> 20%) được tìm thấy ở nhưng người gốc Tây Ban Nha,Colombia, và Amerindians ở Brazil; ngược lại, ở quần thể người da đen, ít cókiểu gen đột biến hơn Trong số các quần thể da trắng ở châu Âu, Bắc Mỹ và

Úc, tần số dao động từ 8 % đến 20% [31]

Bảng 1.3 Bảng phân bố tần số đột biến gen MTHFR trên thế giới

677T (%)

Tác giả 677CC

1.3.3 C677T (C677T-Ala222Val) và chức năng sinh hóa MTHFR.

Biến đổi trên gen MTHFR tại vị trí C677T, dẫn đến sự thay đổi Alaninthành Valin Đa hình thái đơn C677T gen MTHFR làm giảm hoạt tính củaenzyme MTHFR Với những người mang kiểu gen đồng hợp tử lặn TT khiếnenzyme methylene tetrahydrofolate reductase giảm hoạt tính còn 30% và kiểugen dị hợp tử CT thì enzym giảm hoạt tính còn 60 - 70% so với kiểu gen CC[36], [37] Methylene tetrahydrofolate reductase là một enzyme chủ chốttrong quá trình trao đổi chất folate MTHFR đóng vai trò quan trọng trong ảnhhưởng đến việc phát sinh ung thư thông qua hai con đường chuyển hóa folate.Một là ảnh hưởng đến mức độ methyl hóa phụ thuộc vào S-adenosyl-methionine (SAM) Việc giảm hoạt tính của MTHFR có thể làm giảm sựmethyl hóa homocysteine thành methionine dẫn đến việc thay đổi nồng độSAM từ đó là giảm mức độ methyl hóa DNA Mặt khác, đa hình gen MTHFRlàm giảm hoạt tính của enzyme này làm cho cơ thể bị thiếu hụt 5,10-MTHF,

đây là chất cần thiết cho quá trình tổng hợp thymidylate có thể dẫn đến saihỏng trong việc kết hợp uracil vào DNA, từ đó dẫn đến ngưng trễ quá trìnhsửa chữa DNA đồng thời gia tăng tần số đứt gãy và phá huỷ nhiễm sắc thể.Các khối u ác tính có nguồn gốc từ các mô nhanh chóng tăng sinh, chúng cónhu cầu tổng hợp DNA cao hơn, nên nhạy cảm hơn với sự thiếu hụt chấtfolate và sự suy giảm DNA Các đa hình gen làm giảm hoạt động MTHFR đãđược tìm thấy có liên quan đến giảm nguy cơ bệnh bạch cầu, u lymphoma vàung thư đại trực tràng [38], [39]

Trong chu trình chuyển hóa của MTHFR, folate đóng vai trò là chấtcung cấp nhóm methyl trong quá trình mythylation của DNA Đa hình genMTHFR làm giảm hoạt độ enzyme này và là nguyên nhân thiếu hụt folate.Một khi folate không được cung cấp đủ thì uracil sẽ được thay thế thyminetrong quá trình tổng hợp DNA [40] Kết quả là dẫn đến sự phá vỡ DNA và

sự bất ổn định hệ gen Đây chính là nguyên nhân của nhiều bệnh lý ác tính,ung thư…

Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về mối tương quan giữa đa hìnhgen MTHFR trong một số bệnh ung thư vú, tiền liệt tuyến, đại trực tràng TạiViệt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về đa hình kiểu gen MTHFR trongbệnh lý tuyến giáp và đặc biệt là ung thư tuyến giáp thể biệt hóa

1.4 Các phương pháp phân tích đa hình gen MTHFR

Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật

để xác định kiểu gen Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiêncứu như kỹ thuật ARMS - PCR (amplification refractory mutation system -PCR: Hệ thống khuếch đại đột biến chịu nhiệt), ASP - PCR (Allelen specific -PCR: Phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu alen), real - time multiplex PCR,Sequencing (giải trình tự gen trực tiếp) Trong đó, ARMS - PCR là phương

pháp có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản và giá thành rẻ, được áp dụng rộng rãitrong các labo sinh học phân tử ở Việt Nam Bởi vậy, trong phạm vi của đềtài, tôi xin trình bày những nét chính của kỹ thuật ARMS - PCR, là kỹ thuậtliên quan đến việc xác định kiểu gen MTHFR trong nghiên cứu này Ngoài ra

độ tin cậy của kỹ thuật này được kiểm chứng bằng giải trình tự gen Về cơbản, kỹ thuật ARMS - PCR được tiến hành dựa trên cơ sở khuếch đại đoạngen nghi ngờ mang đột biến bằng kỹ thuật PCR

1.4.1 Kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karry Millus đưa

ra vào năm 1985 và được Saiki hoàn thiện vào năm 1988, kể từ đó tạo nênmột tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới PCR làphương pháp vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao

từ một trình tự DNA đích dựa trên hoạt động của enzyme polymerase.Phương pháp PCR được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịchphản ứng (gọi là PCR mix), có thể tích vào khoảng 10 µl - 50 µl với các thànhphần chủ yếu là: (1) enzyme polymerase chịu nhiệt, thường dùng Taqpolymerase, có hoạt tính tối đa ở 72oC và bền với nhiệt độ; (2) 4 loạideoxyribonucleotide (dNTP) là adenine, guanine, thymine và cytosine (dATP,dGTP, dTTP, dCTP); (3) DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bảntrong ống phản ứng; (4) các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạnoligonucleotide có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide có trình tự bổ sungmột cách đặc hiệu với trình tự của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản; (5)ion Magie (Mg2+) trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp; (6) dung dịch đệmTris - KCl để làm dung môi cho phản ứng Khi ống nghiệm phản ứng nàyđược cho vào buồng ủ nhiệt của máy luân nhiệt (máy PCR), chương trìnhnhiệt độ trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt thay đổi theo chu

kỳ, nhờ vậy mà phản ứng PCR sẽ xảy ra

Về nguyên tắc, phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau,mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

• Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation): Đầu tiên nhiệt độ sẽ

được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bịmất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn

• Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ đến 55oC

- 65oC, là nhiệt độ thích hợp để các các đoạn mồi tìm đến và bắt cặp bổ sungvào hai đầu của đoạn DNA đích

• Giai đoạn 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ

được tăng lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzyme Taqpolymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’của sợi DNA đích Từ đó bắt nguồn cho sự tổng hợp mạch bổ sung

Sau mỗi chu kỳ, các chuỗi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng đểlàm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi, có chiều dài bằngkhoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm đượcxác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNAban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôilượng mẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đã nhân bảnđược thành 2n bản sao Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách ra khi điện di,phát hiện được sau khi nhuộm và để tạo dòng hoặc giải trình tự Trong quá trìnhthực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng nhưng lượngmồi và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) tự do giảm, enzym DNApolymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP vàenzym để đảm bảo phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất

1.4.2 Kỹ thuật ARMS - PCR

ARMS là một ứng dụng của PCR trong đó DNA được khuếch đại bằngcác alen mồi tương ứng đặc hiệu Trong PCR, sự không bắt cặp ở đầu 3’ củamồi có thể làm giảm đáng kể quá trình khuếch đại ARMS - PCR là phươngpháp rất hữu ích cho việc xác định các đột biến điểm Nó cũng là phươngpháp quan trọng để xác định sự thay đổi trong DNA là đồng hợp hay dị hợp

Dị hợp tử hoặc đồng hợp tử được phân biệt bằng cách sử dụng ARMS mồicho alen đột biến (reverse mutation primer) và alen bình thường (reverse wildtype primer) Các phản ứng cho alen đột biến và các alen bình thường đượcthực hiện trong các ống riêng biệt Trong phương pháp này ống 1 chúng tôi sửdụng cặp mồi F (forward primer) và Rw (reverse wild type primer), ống 2 sửdụng cặp mồi F và Rm (reverse mutation primer)

Như vậy với cách thức thực hiện như trên chúng tôi nhận thấy rằng: Sựxuất hiện của sản phẩm đặc hiệu ở cả hai ống là kiểu gen dị hợp tử, nếu chỉxuất hiện ở ống thứ 1 là đồng hợp tử bình thường, nếu chỉ xuất hiện ở ống thứ

2 là đồng hợp tử đột biến

1.4.3 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp

Có nhiều phương pháp giải trình tự gen, bao gồm: giải trình tự genbằng phương pháp hóa học, phương pháp enzym và bằng máy tự động.Phương pháp hóa học để xác định trình tự DNA được Maxam và Gilbert pháthiện năm 1977, nhưng trên thực tế phương pháp này không dễ để thực hiện, vì

nó đòi hỏi phải xác định nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm Chính vì sựphức tạp này nên hiện nay phương pháp hóa học ít được sử dụng, thay vào đócác nhà khoa học dùng phương pháp enzym với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.Phương pháp enzym cũng được phát hiện vào năm 1977, ngày càng đượchoàn thiện và sử dụng dễ dàng tại các phòng thí nghiệm Các phòng thínghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp enzym,

nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng máy tự động chứ không dùng kỹthuật xạ kí tự ghi như trước đây Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụngphương pháp giải trình tự bằng máy tự động ABI PRISM 3730xl GeneticAnalyzer của Applied Biosystems, USA để kiểm định lại độ chính xác củaphương pháp ARMS PCR.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu gồm hai nhóm: Nhóm bệnh là những bệnh nhânđược chẩn đoán xác định là UTTG thể biệt hóa (thể nhú, thể nang và thể tủy),

và nhóm chứng: là những người không có khối u tuyến giáp đến khám tạikhoa Tai Mũi Họng BV Bạch Mai từ tháng 3/2017 đến tháng 10/2017

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

2.1.1.1 Nhóm bệnh:

- Chọn đối tượng được chẩn đoán xác định là UTTG thể biệt hóa: dựavào kết quả mô bệnh học tại khoa Tai Mũi Họng BV Bạch Mai trong giaiđoạn 3/2017 – 10/2017

- Được lấy máu và làm xét nghiệm gen

- Không bị các bệnh mãn tính gây ảnh hưởng đến kết quả của đa hìnhthái đơn C677T gen MTHFR: Tăng huyết áp, tiểu đường, rối loạn mỡ máu,bệnh lý tim mạch, thần kinh

- Không bị bệnh ung thư ở các cơ quan, bộ phận khác kèm theo

- Bệnh nhân và gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.1.2 Nhóm chứng:

- Chọn đối tượng không có khối u tuyến giáp đến khám tại khoa TaiMũi Họng BV Bạch Mai trong giai đoạn 3/2017 – 10/2017

- Được lấy máu và làm xét nghiệm gen

- Không bị các bệnh mãn tính gây ảnh hưởng đến kết quả của đa hìnhthái đơn C677T gen MTHFR: Tăng huyết áp, tiểu đường, rối loạn mỡ máu,bệnh lý tim mạch, thần kinh

- Không bị bệnh ung thư ở các cơ quan, bộ phận khác kèm theo

- Bệnh nhân và gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu