Nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất gây độc tế bào ung thư từ loài san hô mềm menella woodin ở vùng biển cô tô

Trong hơn 30 năm qua, các nghiên cứu về các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ sinh vật biển đã được nghiên cứu rộng rãi, đã tìm ra rất nhiều hợp chất có cấu trúc và hoạt tính sinh học.. Do

Trang 2

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Châu Ngọc Điệp

NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM CÁC HOẠT CHẤT GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯU TỪ LOÀI SAN HÔ MỀM

MENELLA WOODIN Ở VÙNG BIỂN CÔ TÔ

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9420116

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 TS Nguyễn Hoài Nam

Viện Hóa sinh biển

2 PGS.TS Đỗ Thị Thảo

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2019

Trang 3

Lời cảm ơn

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Hoài Nam và PGS.TS Đỗ Thị Thảo là hai thầy đã hướng dẫn tận tình, chu đáo, chia sẻ những kinh nghiệm quí báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam và Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Phân Viện Viễn đông Liên Xô, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Liên Bang Nga đã tạo điều kiện cho tôi làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và học tập trong phòng thí nghiệm

để thực hiện tốt luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể Phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, đã giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Tôi xin cảm ơn GS.TS Valentin A Stonik và các cộng sự Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại Viện

Tôi xin cảm ơn GS.TS Đỗ Công Thung và các cán bộ kiêm thợ lặn Viện Tài nguyên và Môi trường biển, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thu mẫu ngoài biển

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cơ sở đào tạọ Viện Công nghệ sinh học và ThS Bùi Thị Hải Hà cán bộ phụ trách đào tạo đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập ở đây

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2019

Tác giả NCS Châu Ngọc Điệp

Trang 4

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện, một số kết quả có được cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một số kết quả lần đầu tiên được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2019

Tác giả

NCS Châu Ngọc Điệp

Trang 5

MỤC LỤC

Lời cảm ơn……… i

Lời cam đoan……… ii

MỤC LỤC……… iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT……… vii

DANH MỤC CÁC BẢNG……… x

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Đặc điểm chung về san hô mềm 4

1.1.1 Đặc điểm sinh học của san hô mềm 4

1.1.2 Đặc điểm sinh sản 6

1.1.3 Đặc điểm phân bố 7

1.2 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của giống Menela 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về một số loài san hô mềm ở Việt Nam 17

1.3 Giới thiệu về loài san hô mềm Menella woodin 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết 22

2.2.2 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học 25

2.2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 27

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

3.1 Thu mẫu, xử lý mẫu, tạo dịch chiết 31

3.2 Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư của mẫu dịch chiết thô 33

3.3 Phân lập các hợp chất từ loài Menella woodin 33

Trang 6

3.4 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 37

3.4.1 Hợp chất MW1 (Menellsteroid E): 1β,3β,5α,11β tetrahydroxycholestan-6-one (chất mới) 37

3.4.2 Hợp chất MW2 (Menellsteroid F): Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β- tetraol (chất mới) 38

3.4.3 Hợp chất MW3 (Menellsteroid G): 24-methylcholest-24(28)-ene-3β, 5α,6β,11β-tetraol (chất mới) 39

3.4.4 Hợp chất MW4 (Menellsteroid H): 24-Norcholest-22(E)-ene 3β,5α,6β,11β-tetraol (chất mới) 40

3.4.5 Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol 41

3.4.6 Hợp chất MW6: Menellsteroid B 41

3.4.7 Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22 diene-3β,5α,6β,9-tetraol 42

3.4.8 Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7- trien-12,8-olide (chất mới) 42

3.4.9 Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide (chất mới) 43

3.4.10 Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới) 44

3.4.11 Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới) 45

3.4.12 Hợp chất MW12: Menverin A 46

3.4.13 Hợp chất MW13: Menverin B 46

3.4.14 Hợp chất MW14: Menverin C 46

3.4.15 Hợp chất MW15: Menverin F 47

3.4.16 Hợp chất MW16: Menelloide B 47

3.4.17 Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol 48

3.5 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được 48

3.6 Xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS 49

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51

Trang 7

4.1 Hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết thô 51

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc 51

4.2.1 Hợp chất MW1: Menellateroid E (1β,3β,5α,11β tetrahydroxycholestan-6-one) (chất mới) 51

4.2.2 Hợp chất MW2: Menellsteroid F (Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất mới) 53

4.2.3 Hợp chất MW3: Menellsteroid G (24-methylcholest-24 (28)-ene- 3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất mới) 54

4.2.4 Hợp chất MW4: Menellsteroid H (24-Norcholest-22(E)-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất mới) 55

4.2.5 Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol 56

4.2.6 Hợp chất MW6: Menellsteroid B (cholest-22-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol) 58

4.2.7 Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene- 3β,5α,6β, 9-tetraol 59

4.2.8 Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7- trien-12,8-olide (chất mới) 61

4.2.9 Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3, 5,7-trien-12,8-olide (chất mới) 64

4.2.10 Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới) 67

4.2.11 Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới) 69

4.2.12 Hợp chất MW12: Menverin A 71

4.2.13 Hợp chất MW13: Menverin B 72

4.2.14 Hợp chất MW14: Menverin C 73

4.2.15 Hợp chất MW15: Menverin F 74

4.2.16 Hợp chất MW16: Menelloide B 76

4.2.17 Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol 77

4.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất phân lập đƣợc 80

4.4 Hoạt tính ức chế sản sinh ROS 80

Trang 8

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 83

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89

PHỤ LỤC

Trang 9

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

H-1H COSY Correlation Spectroscopy

Phổ tương tác hai chiều

Trang 10

Phổ khối phân giải cao ion hóa

phun mù điện tử

IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

Hz

KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô

LNCaP

Human prostate adenocarcinoma Ung thư tiền liệt tuyến

LU-1

Human bronchogenic

MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú

Trang 11

UV Ultraviolet Spectroscopy Phổ tử ngoại

Trang 12

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các loại thuốc điều trị ung thư đã được FDA chứng nhận thương

mại có nguồn gốc từ sinh vật biển 16

Bảng 1.2. Một số hợp chất tiềm năng cho trị liệu ung thư từ san hô mềm 16

Bảng 3.1. Kết quả xác định giá trị IC50 của mẫu MW 33

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất MW1 37

Bảng 3.10. Kết quả xác định giá trị IC50 của các hợp chất được lựa chọn 49 Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất MW5 57

Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất MW6 58

Trang 13

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sơ đồ phả hệ của giống Menella 5

Hình 1.2 Các dạng tập đoàn san hô mềm chủ yếu 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của các hợp chất (1-8) 8

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của các hợp chất (24), (25) và (26) 10

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (27), (28), (29), (30), (31), (32) 11

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của các hợp chất (33), (34), (35), (36), (37), (38) và (39) 11

Hình 1.11 Cấu trúc hợp chất cholest-1β,3β,5α,6β-tetrol (80) 15

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học của các hợp chất (93-100) phân lập từ loài Cladiella sp. 18

Hình 1.13. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Lobophytum sp và loài Lobophytum leavigatum 18

Hình 1.14. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Sinularia leptoclados 19

Hình 1.15. Cấu trúc vi xương của loài Menella woodin 21

Hình 2.1. Mẫu san hô mềm Menella woodin thu thập ở quần đảo Cô Tô 22

Hình 2.2. Sơ đồ tạo dịch chiết thô và dịch chiết phân đoạn 24

Hình 3.1. Sơ đồ đồ phân bố san hô mềm ở quần đảo Cô Tô 31

Hình 3.2. Sơ đồ phân bố san hô mềm theo độ sâu tại cồn ngầm Bắc Hồng Vàn và dải đá ngầm Vàn Chảy ở Cô Tô 32

Hình 3.3. Mô tả loài Menella woodin 32

Hình 3.4. Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu san hô mềm Menella woodin 34

Hình 3.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn H3 35

Trang 14

Hình 3.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn H4 36

Hình 3.7. Mức độ biểu hiện của ROS trong đại thực bào được kích thích bởi LPS 50

Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất MW1 52

Hình 4.2. Các tương tác COSY (▬), HMBC ( ) và NOE ( ) chính của hợp chất MW1 52

Hình 4.4 Các tương tác COSY (─), HMBC ( ) và NOE ( ) chính của hợp chất MW2 54

Hình 4.6. Một số tương tác HMBC của hợp chất MW3 55

Hình 4.8. Một số tương tác HMBC của hợp chất MW4 56

Hình 4.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất MW6 58

Hình 4.13. Các tương tác COSY (─), HMBC ( ) và NOE ( ) chính của hợp chất MW8 62

Hình 4.14. Phổ ECD thực tế của MW8 và tính toán lý thuyết của các dạng đồng phân 63

Hình 4.16 Các tương tác COSY (─), HMBC ( ) và NOE ( ) chính của hợp chất MW9 65

Hình 4.17. Phổ ECD thực tế của MW9 và tính toán lý thuyết của các dạng đồng phân 66

Hình 4.19. Các tương tác HMBC ( ) và NOE ( ) chính của MW10 68

Hình 4.20. Phổ CD của hợp chất MW10 69

Trang 15

Hình 4.22. Các tương tác COSY (─), HMBC ( ) và NOE ( ) chính của hợp chất MW11 70

Hình 4.26. Các tương tác HMBC chính của hợp chất MW14 73

Hình 4.33. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được từ loài Menella woodin 79

Trang 16

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một trong những căn bệnh nguy hiểm nhất trên toàn thế giới và là nguyên nhân phổ biển gây tử vong đứng thứ 2 sau tim mạch Nó được định nghĩa là một nhóm bệnh đặc trưng bởi sự phát triển không kiểm soát và lây lan của các tế bào bất thường Theo báo cáo của Hiệp hội ung thư Hoa kỳ có khoảng 1,7 triệu ca ung thư mới được chuẩn đoán năm 2016, trong đó có khoảng 600.000 người Mỹ chết vì ung thư Theo báo cáo mới nhất của Viện nghiên cứu phòng chống ung thư Việt Nam, mỗi năm số bệnh nhân mới mắc ung thư ở Việt Nam là 150.000 người, trong đó có 75.000 người tử vong, con số này có xu hướng tăng trong những năm tiếp theo Bởi vậy việc tìm kiếm thuốc đặc trị cũng như thuốc hỗ trợ điều trị và các tác nhân dự phòng hóa học là hết sức cần thiết và cấp bách

Các hợp chất tự nhiên đã được chứng minh là một nguồn nguyên liệu vô cùng tuyệt vời cho sự khám phá và phát triển các loại thuốc mới Từ dịch chiết của các loại vi sinh vật, thực vật và sinh vật biển, các nhà khoa học đã tìm thấy rất nhiều đặc tính dược lý quý giá Nhiều trong số đó đã được thử nghiệm lâm sàng trong điều trị các bệnh ở người và có thể phân loại thành nhóm các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp toàn phần sử dụng trong thử nghiệm lâm sàng hoặc nghiên cứu các đặc tính dược lý mới Từ năm 1981 đến năm 2014, có tới 73% thuốc chống ung thư có mặt trên thị trường hiện nay có nguồn gốc thiên nhiên hoặc được tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc của hợp chất tự nhiên Từ năm 1940 đến 2014 đã có 246 loại thuốc chống ung thư đã được phê duyệt và trong số này có

207 loại được thiết kế dựa trên những dạng có cấu trúc phân tử nhỏ, loại trừ các thuốc có kích thước phân tử lớn và vacxin Hơn nữa 77,3% (160 trong 207) những loại thuốc chống ung thư này có nguồn gốc từ tự nhiên, cho thấy rằng các hợp chất

tự nhiên là nguồn nguyên liệu đóng góp chính cho nghiên cứu các loại thuốc chống ung thư Ưu điểm của các hợp chất tự nhiên biển so với những phân tử tổng hợp là chúng được hình thành bên trong hệ thống sống và tạo ra phục vụ mục đích sinh tồn, bảo vệ cơ thể và lợi thế cạnh tranh trong hệ sinh thái của chúng, do đó các hợp chất này thể hiện hoạt tính dược lý thú vị Hơn nữa, các hợp chất này có cấu trúc

Trang 17

hóa học rất độc đáo trong hầu hết các loại sinh vật biển, điều này cho thấy điều kiện sống khắc nghiệt trong môi trường biển có thể đã tạo nên những hợp chất này Cho tới nay, đã có gần 25.000 hợp chất đã được phân lập từ sinh vật biển và công bố khoa học, trong đó có hơn 10.000 có hoạt tính sinh học, các hoạt chất này có nguồn gốc từ hải miên, da gai, san hô mềm, động vật thân mềm Do vậy, sàng lọc tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng diệt tế bào ung thư là bước đi đầu tiên nhưng là bắt buộc đối với quá trình phát triển thuốc mới Thông qua các bước sàng lọc hoạt tính sinh học có thể chọn ra những đối tượng có triển vọng để nghiên cứu tiếp theo (chiết

tách hoạt chất, nghiên cứu cấu trúc, các nghiên cứu in vitro, các nghiên cứu về độ

an toàn, cơ chế tác dụng dược lý…) lựa chọn được dược liệu và hoạt chất sạch cho những nghiên cứu lâm sàng sâu hơn, toàn diện hơn

Trong hơn 30 năm qua, các nghiên cứu về các hợp chất chuyển hóa thứ cấp

từ sinh vật biển đã được nghiên cứu rộng rãi, đã tìm ra rất nhiều hợp chất có cấu trúc và hoạt tính sinh học Cho đến nay đã có rất nhiều thuốc mới điều trị ung thư có nguồn gốc sinh vật biển đã được FDA Hoa Kỳ chứng nhận và bán trên thị trường do các hãng lớn trên thế giới cung cấp như thuốc điều trị ung thư có tên thương mại như Prialt®

(Ziconotide), Halaven® (Eribulin mesylate), Yondelis® (Trabectedin) Đại dương là nơi sinh sống của 34 trong 36 ngành sinh vật trên trái đất với hơn 300.000 loài động thực vật đã được biết đến Đây chính là nguồn cung cấp vô

số các sản phẩm tự nhiên quý giá từ các loài sinh vật biển như rong biển, ruột khoang, rêu biển, thân mềm, da gai và từ các loài vi khuẩn biển Việt Nam nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km2 vùng biển Với bờ biển dài trên 3.260 km từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 trong số 157 quốc gia ven biển, các quốc đảo và các lãnh thổ trên thế giới Kết quả thống kê đến nay đã thông báo có trên 12.000 loài động thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có rất nhiều loài có độc tố hoặc có hoạt tính sinh học tốt Do vậy, hướng nghiên cứu các công nghệ chiết xuất, phân lập các hoạt chất theo định hướng hoạt tính sinh học từ các nguồn dược liệu biển có trữ lượng lớn như rong biển, hải sâm, san hô mềm được quan tâm đặc biệt Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy, vùng biển nước ta là một trong số

Trang 18

các vùng biển có hệ đa dạng sinh học phong phú nhất Đồng thời, san hô mềm có sự phân bố rất dồi dào và đa dạng, tuy nhiên cho tới nay, ở nước ta các công trình nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ các loài san hô mềm vẫn còn ở mức độ khiêm tốn

Do đó, chúng tôi quyết định lựa chọn đề tài trong khuôn khổ luận án Tiến sỹ:

“Nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất gây độc tế bào ung thƣ từ loài san hô mềm

Menella woodin ở vùng biển Cô Tô”

Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài luận án gồm:

- Đánh giá một số hoạt tính sinh học của dịch chiết tổng nhằm định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

- Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính gây độc tế bào

ung thư của một số hợp chất sạch phân lập được từ loài san hô mềm Menella

woodin thu thập ở vùng biển Cô Tô - Quảng Ninh

Trang 19

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung về san hô mềm

1.1.1 Đặc điểm sinh học của san hô mềm

Vị trí phân loại bộ san hô mềm (Alcyonacea) trong hệ thống phân loại

San hô mềm thuộc giới động vật (Animalia), ngành ruột khoang (Cnidaria - Coenlenterata), lớp san hô (Anthozoa), phân lớp san hô tám ngăn (Octocorallia),

bộ Alcyonacea Bộ san hô mềm Alcyonacea có 34 họ, 307 giống, khoảng 3000 loài được mô tả, phân bố ở khắp các vùng biển trên thế giới, trong đó có 23 họ phân bố

ở vùng nước nhiệt đới (Fabricius K, 2001)

San hô mềm nằm trong lớp Anthozoa và được chia thành ba phân lớp, tùy theo số xúc tu (tua cảm) hoặc những đường đối xứng, và một loạt các bộ tương ứng với kiểu xương ngoài, loại tế bào châm và phân tích di truyền ti thể Phân lớp san hô

với 8 xúc tu được gọi là san hô tám ngăn (Octocorallia) bao gồm các bộ san hô mềm (Alcyonacea) phân bố phổ biến ở vùng biển Thái Bình Dương - Ấn Độ Dương, bộ san hô lam (Helioporacea), bộ san hô lông chim (Pennatulacea) (Hình

1.1) (Tursch B, 1976)

Những loài có nhiều số xúc tu lớn hơn 8 và là bội của 6 được gọi là phân lớp

san hô sáu ngăn (Hexacorallia), nhóm này bao gồm các loài san hô đá (san hô tạo rạn) (Scleractinia), và phân lớp hải quỳ (Ceriantharia) Giống Menella nằm trong

họ Plexauridae Giống Menella gồm 26 loài phân bố tập trung ở vùng biển Ấn Độ

Dương, Thái Bình Dương (Williams GC, 1992)

Cấu trúc tập đoàn san hô mềm: Tập đoàn san hô mềm: khởi đầu cá thể đầu

tiên mọc nhiều nhánh rỗng, trên đó hình thành các cá thể mới Tiếp theo tầng keo ở nách của các nhánh phát triển mạnh, liên kết cá thể con và cá thể mẹ thành một khối, trong khi hệ thống ống nối các khoang vị được hình thành cùng với sự liên kết các vi xương tạo thành một hệ thống chung của tập đoàn (Trần Thái Bái, 2004) Lớp ngoài của tập đoàn là các polip và lớp mô bảo vệ, lớp bên trong chứa các mô,

Trang 20

khoang dạ dày, kênh nội bào, vi xương San hô mềm có có cấu tạo đơn giản, chúng liên kết các cá thể (polip) với nhau thành dạng tập đoàn

Hình 1.1 Sơ đồ phả hệ của giống Menella

Trang 21

hô rất mềm Vì vậy chúng được gọi là san hô mềm khác hẳn với san hô cứng có bộ xương đá vôi cứng và vững chắc (Fabricius K, 2001)

Cấu tạo của một polip bao gồm một rãnh hầu, 1 vành với 8 tua miệng dạng lông chim và 8 vách ngăn tạo thành 8 khoang vị ứng với 8 tua miệng phía ngoài Ngăn cạnh rãnh hầu gọi là ngăn định hướng Hai gờ cơ của vách ngăn giới hạn ngăn này xếp hướng vào nhau ở mặt trong của ngăn Các gờ cơ ở trên vách ngăn còn lại được xếp theo hai hướng ngược nhau kể từ ngăn định hướng, theo kiểu đuổi nhau từ vách ngăn này sang vách ngăn tiếp theo Số lượng tua miệng và vách ngăn không thay đổi trong quá trình sinh trưởng (Trần Thái Bái, 2004)

Hình 1.2 Các dạng tập đoàn san hô mềm chủ yếu

A: dạng phiến bám; B: dạng phễu; C: dạng cây; D: dạng bụi

(Nguồn: Đậu Văn Thảo, 2014)

Hình thái tập đoàn: Trong khi hình thái của polip là khá đồng nhất ở các

loài trong san hô mềm thì hình thái của tập đoàn lại rất đa dạng, ngay kể cả trong một loài cũng có những sai khác tùy thuộc vào môi trường mà loài đó sinh sống Các hình dạng có thể chia thành các nhóm chính sau: dạng khảm nạm, dạng màng, dạng phiến gấp, dạng phễu, dạng khối, phân thùy, dạng ngón, dạng cây, dạng quạt, dạng bụi và trong thực tế có những dạng tập đoàn với hình dạng chuyển tiếp giữa các dạng trên (Hình 1.2)

1.1.2 Đặc điểm sinh sản

Sinh sản hữu tính: Phần lớn san hô mềm, cơ quan sinh sản đực và cái là

riêng biệt ở tập đoàn Tuy nhiên, có vài loài san hô mềm, như loài Heteroxenia và

Xenia là lưỡng tính, trong cơ thể trưởng thành chứa cả cơ quan sinh sản đực và cái

Trang 22

San hô mềm sinh sản hữu tính theo ba hình thức: phát tán trứng và tinh trùng, ấu trùng san hô nở bên trong, ấu trùng nở bên ngoài (Fabricius K, 2001)

Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính tính thường chiếm ưu thế ở san hô mềm

Nó là quá trình phân chia, phân tách từ tập đoàn ban đầu hình thành tập đoàn mới

Một số tập đoàn san hô mềm bố mẹ phát triển theo kiểu thân bò tách dần so với vị trí ban đầu, khi chúng gắn vào nền đáy xa tập đoàn bố mẹ, chúng nhanh chóng phát triển và tái tạo thành tập đoàn độc lập có kích thước tương tự như tập đoàn san hô ban đầu (Fabricius K, 2001)

1.1.3 Đặc điểm phân bố

Các rạn san hô Việt Nam nằm trên vùng nước trong, nông, độ sâu tới 20 m, mặc dù không có các rạn san hô cực lớn nhưng các rạn san hô Việt Nam có đặc tính đa dạng cao, phong phú và có đặc tính khu vực về sinh thái rõ rệt, điều này chỉ

ra sự tồn tại của các phần dị dưỡng bên trong của các loài Vùng biển có độ đục cao, tầm nhìn tới 2 m độ sâu, rất ít loài san hô mềm và tảo cộng sinh, vùng này có

sự phân bố số ít của tập đoàn Briareum và Sinularia Ở vùng biển có độ trong từ 2

- 5 m, có sự phân bố của các loài Clavularia, Briareum, Sinularia, Sarcophyton và

Klyxum Vùng biển có độ trong 5 - 8m nước là vùng có mức độ phong phú san hô

mềm cao nhất (Fabricus KE, 2000)

1.2 Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào

ung thƣ của giống Menella

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

San hô mềm là một trong những động vật biển không xương sống quan trọng, đã là tâm điểm chú ý của các nhà hóa học trong những thập kỷ qua Một số lượng lớn các nghiên cứu công bố về các chất chuyển hóa thứ cấp đã phân lập được

từ các loài san hô mềm bao gồm sesquiterpenoid, diterpenoid, steroid và các glycoside, alkaloid và những hợp chất khác (Berrue F, 2009; Blunt JW, 2008; 2009; Zhang W, 2003) Nhiều trong số các hợp chất này thể hiện hoạt tính sinh học như chống ung thư, kháng khuẩn, sốt rét, hoạt tính chống bám dính (Chai XY, 2012; Zhang W, 2003)

Trang 23

Giống Menella (họ Plexauridae) được cho là một trong những giống san hô

mềm phổ biến ở khu vực Biển Đông Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học về các loài san hô mềm từ giống Menella, kết quả tìm thấy

nhiều hợp chất dạng guaiane sesquiterpenoids (Chai XY, 2010; Kao SY, 2011a; Kao SY, 2011b; 2011c; Li L, 2008; Sung PJ, 2012; Zhang W, 2004), polyhydroxylated steroid (Chai XY, 2011; Chai XY, 2010; Zhang W, 2006b), briarane diterpenoids (Chai XY, 2011; Chai XY, 2010) và một số hợp chất khác thuộc giống này (Deng SZ, 1997)

1.2.1.1 Lớp chất sesquiterpenoid

Năm 2004, Zhang và cộng sự công bố 04 hợp chất dạng guaiane lactone là

menverin A (1), menverin B (2), menverin C (3) và menverin D (4) từ loài Menella

verrucosa (Brundin) (Zhang W, 2004) Đây cũng là kết quả phân lập đầu tiên từ loài

san hô mềm này tại thời điểm đó Tất cả các hợp chất đều có dạng liên hợp methyl-substituted, α, β-unsaturated, γ-lactone moiety, C(8)=C(9) liên hợp với γ-lactone moiety, một nhóm exocyclic methylene ở vị trí C(4) Tiếp đó, năm 2008, Liang Li và các tác giả đã phân lập được 04 hợp chất sesquiterpenoid dạng guaiane

α-lactone là 1-epimenverin B (5), menverin F (6), 1-deoxymenverin F (7) và menverin

G (8) từ loài san hô mềm Menella sp thu thập từ vịnh Lingshui, tỉnh Hainan, Trung

Quốc Các hợp chất phân lập đều có dạng liên hợp α-methyl-substituted, α, unsaturated, γ-lactone moiety, γ-lactone moiety, một nhóm exocyclic methylene ở

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của các hợp chất (1 – 8)

(Nguồn: Zhang W, 2004; Li L, 2008)

Trang 24

Năm 2011, từ các phân đoạn dịch chiết của loài Menella sp thu thập ở vùng

biển phía Nam Đài Loan đã phân lập được 08 hợp chất sesquiterpenoids bao gồm (–

)-hydroxylindestrenolide (9), gồm (+)-hydroxylindestrenolide (10) (Kao SY, 2011a), menelloides A–E (11-15) (Kao SY, 2011b; 2011c; Lee CH, 2012), (+) chloranthalactone B (16) (Kao SY, 2011b) và hợp chất seco-germacrane anhydride (17) (Sung PJ, 2012)

Cũng từ loài Menella sp., năm 2013, Guo Z và cộng sự đã phân lập và xác

định cấu trúc của bốn hợp chất sesquiterpenoid là subergorgic acid (18), subergorgic acid methyl ester (19), 2β-hydroxyl subergorgic acid methyl ester (20)

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của các hợp chất (9 - 17)

(Nguồn: Kao SY, 2011a; Kao SY, 2011b; Kao SY, 2011c; Lee CH, 2012;

Sung PJ, 2012)

Năm 2014, hợp chất menecubebane A (22) cũng được phân lập từ loài từ loài

Menella kanisa Grassoff thu thập tại Hainan, Trung Quốc (Chen M, 2014) Tiếp tục

nghiên cứu trên loài này, năm 2016, Qi Peng và cộng sự đã phân lập thêm 01 hợp

chất dạng sesquiterpenoids là menecubebane B (23) từ loài Menella sp thu thập tại

vùng đảo Leizhou, Trung Quốc (Peng Q, 2016)

Trang 25

(18) R=OH

(19) R=OCH3

(Nguồn: Guo Z, 2013; Chen M, 2014; Peng Q, 2016)

1.2.1.2 Lớp chất steroid

Năm 1997, hợp chất 3β-hydroxy-5α-pregnane-20-one (24) dạng steroid đầu

tiên phân lập từ loài san hô mềm Menella spinifera Kukenthal thu thập tại vùng biển

phía Nam Trung Quốc (Deng SZ, 1997) Tiếp đó, năm 2006, nhóm nghiên cứu của Zhang W và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất dạng polyoxygenated steroid là

menellsteroid A (25) và menellsteroid B (26) (Zhang W, 2006b) từ loài Menella

verrucosa Brundin

(26) R = b Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của các hợp chất (24), (25) và (26)

(Nguồn: Zhang W, 2006) Năm 2010, khảo sát thành phần hóa học trên loài Menella sp thu thập tại đảo

Meishan, tỉnh Hainan, Trung Quốc, Chai XY và các tác giả đã phân lập và xác định

cấu trúc hóa học được một tetrahydroxysteroid là menellsteroid C (27), một hợp

chất tự nhiên lần đầu tiên được phân lập 1β,3β,5α-trihy droxy-cholestan-6-one,

menellsteroid D (28) và 04 hợp chất dạng steroid cholestan-3β,5α,6β-triol (29), cholestan-1β,3β,5α,6β-tetrol (30), nephalsterol (31), cholestan-3β-5-en-6-one (32)

và hợp chất menellsteroid A (26) cũng được tìm thấy ở loài san hô mềm này (Chai

XY, 2010)

Trang 26

(27) R = α-OH (28) R= β-OH

(29) R= H (30) R = β-OH

(31) (32) Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của các hợp chất (27), (28), (29), (30), (31) và (32)

(Nguồn: Chai XY, 2010)

(Nguồn: Chai XY, 2011)

Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học trên loài Menella sp đã phân lập

được 07 hợp chất dạng pregnane steroid, 3α-hydroxy-5β-pregnan-20-one (33), hydroxy-5α-pregnan-20-one (34), 3β-hydroxy-pregnan-5-en-20-one (35), 5β- pregnan-3,20-dione (36), 5α-pregnan-3,20-dione (37), pregnan-4-en-3,20-dione (38)

3β-và pregnan-1,4-dien-3,20-one (39), trong đó hợp chất steroid (39) lần đầu tiên được

phân lập và báo cáo dữ liệu phổ NMR (Chai XY, 2011)

Trang 27

Tây, Trung Quốc Wang và các tác giả đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học, kết quả phân lập được 27 hợp chất dạng polyhydrosterol trong đó có 14 chất mới và

13 chất đã biết cấu trúc, cụ thể 14 chất mới là (23E)-25

hydroperoxycholest-23-ene-3β,5α,6β-triol (40); Cholest-24-ene-1β,3β,5α,6β-tetrol (41); 24(28) en-6-one (42); (22E)-3β,5α-dihydroxy-24-norcholest-22-en-6-one (43);

3β,5α-dihydroxyergost-(24S,22E) 3β,5α dihydroxyergost-22-en-6-one (44); (24R,22E)-3β,5α

dihydroxyergost-22-en-6 one (45); 1β,3β-dihydroxycholestan-6-one (46); 1β,3β,5α-trihydroxycholest 22-en-6-one (47); 1β,3β,5α-trihydroxycholest-24-en-6-

Trang 28

(22E)-one (48); 1β,3β,5α trihydroxyergost-24(28)-en-6-(22E)-one (49); trihydroxy-24-norcholest-22 en-6-one (50); (22E)-3β,5α,6β-trihydroxycholest-22-

(22E)-1β,3β,5α-en-1-one (51); 3β,5α,6β trihydroxycholest-24-en-1-one (52); trihydroxyergost-24(28)-en-1-one (53) và 13 chất đã biết cấu trúc (54-66) đã được

3β,5α,6β-phân lập từ các loài khác, tuy nhiên đây là những hợp chất polyhydrosterol lần đầu

tiên được phân lập từ loài Menella kanisa (Wang P, 2013)

1.2.1.3 Một số chất khác

Từ năm 1993-1997, nghiên cứu thành phần hóa học trên loài san hô mềm

Menella spinifera Kukenthal thu thập tại vùng biển phía Nam Trung Quốc, kết quả

đã phân lập được 06 hợp chất đã biết bao gồm batyl alcohol (67) (Deng SZ, 1997;

Deng SZ, 1993), picolinic acid N-methyl betaine (68) (Deng SZ, 1993; Li F, 1996),

n-hexadecanol (69), 9H-purin-6-amino-N-9-dimethyl (70) và thymidine (71) (Deng

SZ, 1997) Năm 2010, từ loài Menella sp thu thập tại đảo Meishan, tỉnh Hainan,

Trung Quốc, ngoài việc phân lập được các hợp chất steroid, nhóm tác giả còn phân

lập và xác định được một số hợp chất khác như menellin A (72) (Chai XY, 2010)

Hai hợp chất diterpenoids lần đầu tiên được phân lập từ loài Menella sp là

junceellolides B (73) (Chai XY, 2010), junceellolides D (74)

(Nguồn: Deng SZ, 1997; Chai XY, 2010; Gao C, 2014) Năm 2014, từ loài Menella kanisa phân lập 4 hợp chất dạng diketopiperazine

(75-78), trong đó menazepine A (75) là hợp chất mới và 3 hợp chất đã biết là xyclo

Trang 29

(4 hydroxyprolylleucyl) (76), xyclo (Pro-Leu) (77) và xyclo (4

hydroxyprolylphenylalanyl) (78) (Gao C, 2014) Mới đây, năm 2018, một hợp chất

mới là dẫn chất của naphthalene (79) được phân lập từ loài Menella kanisa (Yang

H, 2018)

1.2.1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Năm 2011, từ phân đoạn dịch chiết của loài san hô mềm Menella verrucosa

(Brundin) phân lập được hợp chất sesquiterpenoids là (-)-hydroxylindestrenolide (9) (Kao SY, 2011a), hợp chất (9) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào

ung thư ở người HL-60 và K562 với giá trị IC50 tương ứng là 15,6 µg/ml và 38,7 µg/ml, trên dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến ở người DU-145 ở mức yếu với giá trị IC50 > 40 µg/ml

Năm 2014, hợp chất menecubebane A (20) (Chen M, 2014) từ loài Menella

kanisa Grassoff và hợp chất dạng sesquiterpenoids (21) (Peng Q, 2016) từ loài Menella sp cũng được phân lập Cả 2 hợp chất (20) và (21) đều thể hiện hoạt tính

gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư thực quản Eca9706 và tế bào ung thư tử

cung HeLa ở người Trong đó hợp chất (21) thể hiện hoạt tính mạnh hơn trên cả 2

dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 tương tứng là 20,8 µM (Eca9706) và 30,6 µM

(HeLa) Hợp chất (20) thể hiện hoạt tính yếu hơn trên cả 2 dòng tế bào này Tuy

nhiên, những hợp chất này vẫn chưa có những công trình nghiên cứu đánh giá sâu hơn về mặt cơ chế tác động trên các dòng tế bào ung thư

1.2.1.5 Cơ chế tác động sinh học của một số chất có cấu trúc hóa học tương tự các chất phân lập từ giống Menella

Các hợp chất phân lập từ san hô mềm có nhiều hoạt tính sinh học, có tiềm năng trong việc phát triển thuốc mới từ tự nhiên trong hỗ trợ điều trị ung thư, tuy

nhiên cơ chế tác dụng của các dịch chiết và chất tinh khiết từ giống Menella vẫn

chưa được nghiên cứu nhiều, một số hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự được phân lập từ các loài san hô mềm khác đã được nghiên cứu cơ chế tác dụng gây độc

tế bào trên một số dòng tế bào ung thư người Trong số đó, steroid là một trong những lớp chất chuyển hóa thứ cấp đại diện phân lập từ các loài san hô mềm (Blunt

Trang 30

JW, 2012; Zhang W, 2006a) Những hợp chất này đã có những công bố khoa học chỉ ra rằng chúng có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng viêm, gây độc tế bào Đặc biệt, nhóm hợp chất này luôn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trong

điều kiện thử nghiệm in vitro trong những nghiên cứu trước đó, ức chế sự phát triển

của một loạt các dòng tế bào ung thư người ở nồng độ khác nhau bao gồm tế bào ung thư mũi họng (KB), tế bào khối u ác tính (Mel-28), ung thư phổi (A549 và NCI); ung thư đại tràng (HT-29), ung thư biểu mô gan người (HepG2 và Hep3B); ung thư vú (MCF-7 và MDA-MB-231); ung thư bạch cầu P-388 (Blunt JW, 2012; Zhang W, 2006a)

Một trong số 19 hợp chất polyhydroxysterol từ loài san hô mềm thuộc giống

Muriceopsis thu thập ở vùng biển Quảng Tây, Trung Quốc thể hiện hoạt tính rất tốt

trên 2 dòng tế bào ung thư phổi (A549) với giá trị IC50 = 4,2 ± 1,5 và u xương ác tính (MG63) với giá trị IC50 = 4,3 ± 1,3 là hợp chất cholest-1β,3β,5α,6β-tetrol (80),

đặc biệt hợp chất này thể hiện hoạt tính tương tự như chất đối chứng dương adriamycin (IC50 = 2,8 µM đối với A549 và IC50 = 3,4 µM đối với MG63) Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử ức chế tăng sinh, ức chế phát triển cho thấy, hợp chất này có thể gây ra apoptosis trên dòng tế bào ung thư phổi (A549) (Liu TF, 2013)

Trang 31

Bảng 1.1 Các loại thuốc điều trị ung thư đã được FDA chứng nhận thương

mại có nguồn gốc từ sinh vật biển

mại

Năm chứng nhận

Điều trị

Cytarabine Nucleoside Cytosar-U® FDA 1969 Chống ung thư Ziconotide Peptide Prialt® FDA 2004 Chống ung thư Trabectedin Tetrahydrois

oquinoline alkaloid

Yondelis® EMEA 2007 Chống ung thư

Eribulin

mesylate

Macrocylic keton

Halaven® FDA 2010 Chống ung thư

Brentuximab

vedotin

Antibody drug conjugate

Adcetris® FDA 2011 Chống ung thư

di căn chuột, tế bào ung thư

vú MDAMB-231 di căn cao,

tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3 ở người

Pachycladins

A, D

Cladiella pachyclados

Ức chế di căn tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3

Sinulariolide Cembranoid

diterpene

Sinularia flexibili

Ức chế dự di cư và xâm lấn của tế bào ung thư biểu mô gan người HA22T

Sinuleptolide Cembranoid

diterpene

Sinularia leptoclados

Ức chế tăng sinh tế bào ung thư nướu răng miệng Ca99-2 (apotosis)

Sinulodurin

A, B

Diterpenoid Sinularia dura Ức chế dự xâm lấn của tế

bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3M-CT+ di căn ở mức cao

(Nguồn: Chang YT, 2016; Mudit M, 2016; Rocha J, 2011; Wu YJ, 2015)

Trang 32

Trong hơn 30 năm qua, kết quả đã có rất nhiều nghiên cứu về sinh vật biển, phát hiện được nhiều hợp chất thứ cấp có cấu trúc và hoạt tính sinh học cao Cho tới nay, đã có 5 loại thuốc được đưa vào thương mại hóa (Bảng 1.1) và chúng đều có nguồn gốc từ sinh vật biển (Kondracki B, 2014; Newman DJ, 2016), phát hiện từ hải miên, ốc biển, nhuyễn thể, rong biển đỏ (Mudit M, 2016)

Hiện có khoảng 20 hợp chất chọn lọc từ sinh vật biển vẫn đang trong quá trình nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng ở pha I, II hoặc III (Bảng 1.2) (Chang YT, 2016; Mudit M, 2016; Gerwick WH, 2012; Kondracki B, 2014; Rocha J, 2011; Wu

YJ, 2015) Điều này cho thấy nghiên cứu phát triển các thuốc hỗ trợ điều trị ung thư

có nguồn gốc từ sinh vật biển là vô cùng tiềm năng và hứa hẹn nhiều kết quả tốt

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về một số loài san hô mềm ở Việt Nam

Trong hơn 10 năm trở lại đây, ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên

cứu về san hô mềm, chủ yếu tập trung vào các loài thuộc giống Cladiella,

Lobophytum, Sanularia, Sarcophyton nhưng chưa có công trình nào nghiên cứu trên

giống Menella Cụ thể ở một số công trình sau :

Năm 2007, Châu Văn Minh cùng các công sự đã nghiên cứu thành phần hóa

học của loài san hô mềm Cladiella sp tại Việt Nam và kết quả đã phân lập được 8

hợp chất (93-100) Hợp chất (93) chỉ có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng KB

với IC50 = 4,43 µg/ml, (94) và (95) thể hiện hoạt tính trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm, 95 thể hiện hoạt tính trên 2 dòng tế bào KB và Hep-G2 với giá trị IC50 =

3,37 và 4,72 µg/ml Một điều đáng chú ý là hợp chất (94) là một hợp chất mới, thể

hiện hoạt tính gây độc trên cả 3 dòng tế bào thử nghiệm và được phân lập với hàm

lượng tương đối cao từ loài san hô mềm Cladiella sp (Chau VM, 2007)

Năm 2010, Nguyễn Hữu Tùng và đồng tác giả cũng đã phân lập được các cembranoit (1S,2S,3E,7E,11E)-3,7,11,15-cembratetraen-17,2-olide (101),

lobohedleolide (102) và lobocrassolide (103) từ loài san hô mềm Lobophytum sp

Ba hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư người được thử nghiệm là A-549 (ung thư phổi) và HT-29 (ung thư ruột) với giá trị

IC50 từ 1,8 đến 42,6 µM (Nguyen HT, 2010)

Trang 33

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học của các hợp chất 93-100 phân lập từ loài Cladiella sp

Hình 1.13 Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Lobophytum sp và

loài Lobophytum leavigatum (Nguồn: Nguyen HT, 2010; Tran HQ, 2011)

Trang 34

Một nghiên cứu khác, từ dịch chiết MeOH trên loài san hô mềm Lobophytum

leavigatum, Trần Hồng Quang và đồng tác giả đã phân lập được 6 hợp chất

(104-109) trong đó có 1 hợp chất mới lobophytosterol (104) Đánh giá hoạt tính cho thấy

hợp chất (104) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên 3 dòng tế bào ung thư

được thử nghiệm là A549 (phổi), HCT-116 (ruột) và HL-60 (máu) với giá trị IC50

tương ứng là 4,5; 3,2 và 5,6 µM Kết quả nghiên cứu tiếp theo cho thấy hoạt tính

của hợp chất (104) có thể do cơ chế kích thích apoptosis của các tế bào trên (Tran

Gần đây năm 2017, Ninh Thị Ngọc và đồng tác giả thuộc Viện Hóa sinh biển –

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập và xác định cấu trúc

hóa học được 15 hợp chất steroid (110-124) trong đó có 2 chất mới là leptosteroid

(110) và 5,6β-epoxygorgosterol (117) từ loài san hô mềm Sinularia leptoclados thu

thập ở vùng biển Việt Nam Đánh giá tác dụng gây độc tế bào của chúng đối với

Trang 35

tám dòng tế bào ung thư ở người cho thấy đối với hợp chất eptosteroid (110) thể

hiện độc tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư gan (HepG2, IC50 = 21,13

± 0,07 µM) và ung thư đại trực tràng (SW480, IC50 = 28,65 ± 1,53µM) Còn đối với

ergost-5-en-3β, 7β-diol (117) ức chế dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp tính (HL-60,

IC50 = 20,53 ± 2,26 µM ) và SW480 (IC50 = 26,61 ± 1,59µM) Ngoài ra, hợp chất

3β, 7β-dihydroxyergosta-5,24 (28)-diene (121) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

đáng kể trên tất cả các dòng tế bào được thử nghiệm với các giá trị IC50 dao động từ 13,45 ± 1,81 đến 29,01 ± 3,21µM (Ninh TN, 2017)

Tóm lại, có thể nhận thấy rằng các loài san hô mềm là nguồn dược liệu dồi dào, đa dạng và đáng quý bởi chúng chứa rất nhiều hợp chất thể hiện hoạt tính như tác dụng gây độc tế bào, hoạt tính chống ung thư và kháng viêm v.v Tuy nhiên, việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài san hô mềm

ở nước ta vẫn còn hạn chế, mới chỉ thấy tập trung vào một số loài thuộc giống

Lobophytum, Sinularia và Sarcophyton Do đó, việc nghiên cứu hoá học và hoạt

tính gây độc tế bào ung thư của loài san hô mềm Menella woodin thuộc giống

Menella thu thập ở vùng biển Đông Bắc Việt Nam không chỉ làm sáng tỏ thêm

thành phần hoá học của các loài này, mà còn tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học đáng quý góp phần vào việc tìm kiếm các dược chất có giá trị, đặc biệt là

có khả năng ứng dụng cao trong việc điều trị các bệnh như ung thư, kháng viêm, tiểu đường v.v từ nguồn dược liệu biển

1.3 Giới thiệu về loài san hô mềm Menella woodin

Hệ thống phân loại: Ngành: Cnidaria, Lớp: Anthozoa, Bộ: Alcyonacea, Họ:

Pleuxauridae, Giống: Menella, Loài: Menella woodin Grasshoff, 1999

Khu vực phân bố: Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Biển Đông, Vịnh Bắc

Bộ Tại vùng biển quần đảo Cô Tô, theo các nghiên cứu trước đây của WWF (1994)

và đợt khảo sát năm 2014

Mô tả: Tập đoàn dạng cây bụi, cao tới 80 cm, với các cành dài, mọc lên trên

phân nhánh gần gốc, tạo thành bụi, đường kính nhánh từ 3 - 4 mm Polip phân bố trên thân và nhánh

Trang 36

Vi xương ở lớp bề mặt thân và nhánh có nhiều dạng không đều, dạng có lá phần đầu, ở mép thuôn mịn Vi xương của các lớp bên trong có các dạng không đều vài trong số chúng có từ ba, bốn hoặc năm tia Mỗi đế xúc tu có từ ba đến bốn vi xương nằm ngang và bốn đến sáu vi xương nằm dọc Vi xương có chiều dài 0,01-0,05 mm Có màu đỏ tươi, tua không màu (Grasshoff M, 1999)

Hình 1.15 Cấu trúc vi xương của loài Menella woodin

(Nguồn: Grasshoff M, 1999)

Cho tới thời điểm năm 2019, dựa trên những tài liệu thu thập trên thế giới thì chúng tôi vẫn chưa tìm thêm được những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt

tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài san hô mềm Menella woodin

Do vậy, đây có thể coi là cơ sở để chúng tôi tiến hành lựa chọn mẫu và tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ loài này tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu tiếp theo trên loài san hô mềm này

Trang 37

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu san hô mềm Menella woodin Grasshoff 1999 thuộc họ Plexauridae và

mẫu được thu thập tại quần đảo Cô Tô, Quảng Ninh khu vực Bắc Hồng Vàn, Nam Hồng Vàn và Vàn Chảy vào tháng 4 năm 2014

Mẫu san hô mềm được GS TS Đỗ Công Thung và các cộng sự, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học (Hình 2.1)

Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Mẫu san hô mềm Menella woodin Grasshoff 1999 thu thập ở vùng biển

quần đảo Cô Tô, 04/2014

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết

Trang 38

bằng cách để trên bệ rửa thí nghiệm, cho nước sạch chảy đều trên bề mặt của mẫu nghiên cứu, các lớp đá bao quang mẫu san hô mềm được tan từ từ để lộ phần thân của mẫu san hô mềm Mẫu được ngâm trong nước lạnh trong thời gian từ 2-3 tiếng nhằm loại bỏ từ từ hàm lượng muối vô cơ

- Sau khi mẫu san hô mềm đã được rã đông, loại bỏ các phần túi nylon và

các thành phần sinh vật biển khác bám trên bề mặt của mẫu san hô mềm Lưu lại tiêu bản mẫu, để mẫu sinh vật biển lên mặt bàn thí nghiệm và chụp ảnh để lưu phần mẫu trước khi xử lý

- Sau khi mẫu san hô mềm đã được loại bỏ các thành phần nilon và các

thành phần khác, mẫu được để trên túi lưới ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô hết bề mặt của phần thân mẫu san hô mềm Mẫu được cân để thu được khối lượng thực tế trước khi tiến hành xử lý

- Mẫu được cắt nhỏ thành từ phiến, chiều rộng và dài của phiến tùy

theo độ cứng của mẫu san hô mềm Các phiến càng mỏng thì khả năng làm khô mẫu

và say mẫu càng thuận lợi

- Sấy và làm khô các mẫu san hô mềm Các mẫu san hô mềm sau khi đã

được cắt thành các phiến nhỏ được chuyển vào túi lưới và tiến hành làm khô sơ bộ bằng phương pháp sấy khô trên thiết bị tủ sấy chân không hoặc phơi dưới điều kiện ánh sáng mặt trời (có tránh tia tử ngoại) Trong quá trình sấy mẫu này, khối lượng mẫu san hô mềm giảm xuống rất nhanh

- Làm khô mẫu trên thiết bị đông khô

- Nghiền mẫu thành bột mịn bằng thiết bị nghiền mẫu

2.2.1.2 Phương pháp chiết mẫu

Phương pháp chiết mẫu thực hiện tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Hình 2.2)

- Chuẩn bị mẫu thử: Từ mẫu tươi san hô mềm Menella woodin (ký hiệu MW)

(5 kg mẫu tươi) đã tiến hành xử lý mẫu tươi, được làm khô, tạo bột mịn và loại cơ

bản thành phần muối vô cơ thu được 1kg bột khô mẫu san hô mềm

Trang 39

Hình 2.2 Sơ đồ tạo dịch chiết thô và dịch chiết phân đoạn

- Toàn bộ mẫy bột khô được ngâm chiết ba lần với MeOH ở nhiệt độ phòng

- Toàn bộ bình dịch chiết được lắc đều cho dung môi thấm đều trên bột san

hô mềm và để lắng qua đêm

- Lọc mẫu, phần dịch lọc được cất loại dung môi trên thiết bị cất loại dung môi áp suất giảm thu được dịch chiết thô

- Sử dụng sắc ký bảng mỏng TLC và hệ dung môi CHCl3: MeOH với tỷ lệ thích hợp để đánh giá các mẫu thô thu được

- Cân một lượng nhỏ cỡ 100 mg cho 02 mẫu cặn chiết thô san hô mềm, 01 lọ mẫu thử cho việc thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào, 01 lọ để lưu mẫu dịch chiết phục vụ công tác thử nghiệm các hoạt tính khác sau này

- Lượng dịch chiết thô còn lại pha loãng bằng nước rồi chiết phân bố lại lần

lượt với các dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate Các cặn chiết được làm

khô và cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được các cặn chiết tương ứng là

Bột khô san hô mềm (1kg)

- Lọc, cất loại dung môi

- Thu hồi dung môi, chiết lặp lại

- Cân tổng lượng dịch chiết

- Lấy lượng mẫu nhỏ 100 mg cho vào 2 lọ

Mẫu thử nghiệm hoạt

tính gây độc tế bào

Mẫu lưu trữ phục vụ các nghiên cứu tiếp theo về hoạt tính sinh

Trang 40

cặn chiết n-hexane, cặn chiết dichloroform, cặn chiết ethyl acetate và cặn chiết

nước

2.2.2 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học

2.2.2.1 Phương pháp phân lập chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng

tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ

từ đến khi hiện màu

Sắc ký lớp mỏng điều chế: Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản

mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp

Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha

thường, pha đảo và Sephadex LH-20 Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063

mm (240-430 mesh) Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.)

Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Hệ thống bao gồm Detector UV-vis

bước sóng từ 200-900 nm, bộ lấy mẫu tự đồng (fraction collector) kèm theo với các dãy ống nghiệm kích thước thay đổi tùy theo lượng mẫu, hệ thống bơm (pump) với khả năng điều chỉnh áp từ 1 đến 10 bar, tốc độ dòng từ 1 ml/phút đến 200 ml/phút; Cột tách SNAP loại C8, C18 với dung lượng từ 100 g đến 450g mẫu đầu vào tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Preparative HPLC-Agilent 1100 series): Bao

gồm: Bơm dung môi điều chế (G1310A - Isocratic pump); Bơm mẫu bằng tay (G1328A - Manual injector); Buồng ổn nhiệt và quản lý cột (Thermostatted Column Compartment - G1316A); Detector (G1362A - differential refractometer); Cột điều chế pha thường (Ultraphere-Si Backman, 4.6 x 250 mm, 5µm); Cột điều chế pha

Định dạng
Số trang	177
Dung lượng	11,1 MB