Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia a bằng kỹ thuật microsatellite DNA

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng nhữngtiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rấtnhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thườn

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A

BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A

BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA

Chuyên ngành: Hóa sinh

Tôi là Bùi Thị Minh Phượng, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học

Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa Thầy GS.TS Tạ Thành Văn và Cô PGS.TS Trần Vân Khánh

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơinghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này./

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

NGƯỜI VIẾT CAM ĐOAN

Bùi Thị Minh Phượng

BMD Becker Muscular Dystrophy

FISH Fluorescent In Situ Hybridization

ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection

MLPA Multiplex Ligation Probe Amplification

PGD Preimplantation Genetic Diagnosis

RT – RCR Reverse Transcription PCR

CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

dự trao giải thưởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn vàhiệu quả mà phương pháp này mang lại [2] Phương pháp này đã mang lạiniềm vui, niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuynhiên không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh được những đứa conmong muốn bằng phương pháp này Tỷ lệ thành công của phương pháp này chỉđạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia [3] Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sựthành công của phương pháp này như: tuổi bố mẹ, tình trạng sức khỏe, tinhthần tâm lý, chất lượng tinh trùng và trứng… và đặc biệt chất lượng phôi saukhi thụ tinh Các phôi có thể bất thường nhiễm sắc thể (NST) thường hay NSTgiới tính đều làm giảm khả năng mang thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung,

có thể gây sảy thai hoặc sinh ra những đứa con không khỏe mạnh [4], [5], [6],[7] Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứa con không khỏe mạnh và làm tăng tỷ

lệ thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm, thời gian gần đâycác nhà khoa học đã áp dụng quy trình sàng lọc phôi “Pre-Implantion GeneticDiagnosis, PGD” còn gọi là “chẩn đoán di truyền trước làm tổ” nhằm có đượcnhững phôi tốt nhất cho quá trình chuyển phôi [8],[9],[10]

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng nhữngtiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rấtnhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thường trên NST, cả các đột biếngen quan trọng gây ung thư đều có thể được sàng lọc bằng kỹ thuật PGD [11],[12],[13],[14-15] Trong số đó, bệnh hemophilia A (bệnh ưa chảy máu) là loạibệnh có tỷ lệ mắc cao, bệnh cảnh lâm sàng nặng nề và thường gây ra nhữngsang chấn lớn về tâm lý cho gia đình và cho người bệnh Vì vậy vấn đề đặt ra

là chúng ta phải làm sao giúp cho các cặp vợ chồng mang gen bệnhhemophilia A sinh được những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh

Hemophilia A là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năngcủa các yếu tố đông máu VIII [16],[17] Hemophilia A là bệnh di truyền alenlặn trên NST X không có alen trên NST Y, nên người mẹ mang gen bệnh sẽ ditruyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng [18] Theo thống kê của tổchức hemophilia A thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnhhemophilia A và chỉ có khoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu [19] Tại ViệtNam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000người mang gen bệnh hemophilia A [20] Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảymáu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảymáu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ biểu hiệntrên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong huyết tương

Việc tầm soát trước sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quantrọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh Việc xác địnhđột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩn đoántrước sinh bệnh hemophilia A đã được nghiên cứu khá nhiều ở Việt Nam.Việcquản lý bệnh nhân và người mang gen của bệnh lý này là tiền đề vững chắc đểtriển khai thành công quy trình chẩn đoán trước làm tổ trong sàng lọc phôi.Phương pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho người mẹ khimang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khichẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng manggen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh ở cộng đồng Cùng với sự phát triểncủa sinh học phân tử phát hiện các đột biến gây bệnh hemophilia A, kỹ thuậtmicrosatellite DNA là kỹ thuật sử dụng các primer gắn huỳnh quang đểkhuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn (short tandem repeat-STR) và phân tíchkích thước của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen

để xác định các alen đột biến Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là dễ dàng pháthiện alen đột biến mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽgiảm được chi phí cho gia đình bệnh nhân Hiện nay kỹ thuật này còn khámới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền Xuất

phát từ thực tế đó đề tài: “Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA”

được đưa vào nghiên cứu với mục tiêu:

1 Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.

2 Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A

1.1.1 Định nghĩa

Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thườngchức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương - thiếu hụt yếu tố VIIIgây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, thiếu hụtyếu tố XI gây bệnh hemophilia C Bệnh hemophilia A là bệnh rối loạn đôngmáu di truyền hay gặp nhất [21-22]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu

Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kết với giới tính được pháthiện từ những năm 80 của thế kỷ 19 Vào thời điểm này, các nhà khoa họcnhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh chocon trai nhưng truyền gen bệnh cho con gái và người con gái này có thểtruyền gen bệnh cho con trai mình Bệnh hemophilia A còn được biết đến nhưcăn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang gen bệnhnày và truyền nó cho nhiều thế hệ sau

1.1.3 Dịch tễ bệnh học

Theo thống kê của tổ chức hemophilia thế giới (WFH), hiện nay cókhoảng 500.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có khoảng 1/3 đượcchẩn đoán [23] Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A gần giống nhau ở các vùng địa

lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000dân.Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000 ÷ 1/5.000 trẻ trai [24] TạiViệt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000 bệnhnhân hemophilia Số liệu điều tra những năm 1994 ÷ 1996 về tình hình bệnhhemophilia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là

25 ÷ 60/1.000.000 dân Tại mít tinh hưởng ứng ngày hemophilia thế giới 4-2016), hội rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máuTrung ương đã công bố có 6000 người bị bệnh chảy máu di truyền [25].

(17-1.1.4 Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A

1.1.4.1 Đặc điểm chảy máu trong bệnh hemophilia A

Bệnh đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảymáu Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết Xuất huyết có thể tự nhiênhoặc sau chấn thương nhẹ Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu dưới da,

tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp

Chảy máu khớp thường gặp nhất ở bệnh nhân hemophilia A Đây là loạichảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp[26] Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương Nếu điềutrị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sưng và việc điều trị

bị kéo dài tới vài ngày Trẻ lớn có thể nhận biết được chảy máu khớp trước khiđau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp Điều trị sớm

sẽ dự phòng được tình trạng đau mạn tính và biến dạng khớp

Hình 1.1 Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A

(Nguồn: http://hemoviet.org.vn)

Chảy máu trong cơ bao gồm 10-25% các trường hợp xuất huyết nặngtrong hemoglobin Huyết khối cơ được coi là nguyên nhân chính gây ra tìnhtrạng khuyết tật trong chứng chảy máu Chảy máu trong cơ cũng thường gặp

và xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương Những cơ hay bị chảy máu là:

cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vàingày Một dấu hiệu quan trọng và kín đáo trong chảy máu cơ là cảm giácđau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì Nếu không được điều trị sớm cơ sẽ bị pháhuỷ và có thể gây liệt [23 ]

Hình 1.2 Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A

(Nguồn: http://hemoviet.org.vn)

Ngoài ra bệnh nhân có thể bị chảy máu não, chảy máu ở các vị trí khácnhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da cóthể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị Chảy máu miệng,lợi và mũi cũng hay gặp Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu

1.1.4.2 Các xét nghiệm cận lâm sàng để chẩn đoán bệnh

Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân hemophilia A:

- Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài…

+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm hoặc không có.

+ Yếu tố Von - Willebrand trong máu bình thường.

+ Số lượng tiểu cầu trong máu bình thường.

1.1.4.3 Chẩn đoán bệnh

Chẩn đoán xác định [ 21 ]

- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu

- Dựa vào tiền sử gia đình

- Dựa vào xét nghiệm máu:

+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (Prothrombin Time: thời gianprothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated PartialThromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài

> 1,5 giá trị bình thường

+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%

+ Yếu tố Von Willebrand bình thường

+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.

Chẩn đoán mức độ bệnh

Mức độ

Nồng độ yếu tố VIII (%) (hoạt tính (UI/ml))

Biểu hiện chảy máu

Nặng

(Chiếm 70%) <1% (<0,01)

Chảy máu tự nhiên không liênquan đến chấn thương, thườngchảy máu ở khớp và cơ

Trung bình

(Chiếm 15%) 1-5% (0,01-0,05)

Chảy máu tự nhiên hoặc liênquan đến chấn thương nhỏ.Chảy máu nặng sau chấnthương, phẫu thuật

Đây là một bệnh di truyền liên kết với giới tính: Ở nam chỉ có một NST

giới tính X nên nếu NST giới tính X mang gen bệnh thì lượng yếu tố VIII tạo

ra không đủ và người đó bị bệnh hemophilia A [27] Đối với nữ giới nhờ cóhai NST giới tính X nên nếu một NST giới tính X mang gen bệnh thì gen bìnhthường trên NST còn lại vẫn tổng hợp yếu tố VIII bình thường Người phụ nữkhông bị bệnh nhưng mang một gen bị bệnh sẽ truyền cho con trai và ngườicon trai sẽ bị bệnh, nếu truyền cho con gái thì người con gái sẽ trở thànhngười mang gen bệnh

Hình 1.3 Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau

1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh(XHXh) và 100% con trai bình thường (XHY)

2/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thường: trong một gia đình có bố bìnhthường (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (người truyền bệnh) thì 50% số congái sẽ là người mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thường (XX), 50%con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thường (XHY)

3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (XhXh) đồnghợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50% contrai bình thường (XHY) Như vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen

bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi mang

dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XHXh)

4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc

từ người mẹ: thường chiếm khoảng 1/3 các trường hợp hemophilia A Tỉ lệ độtbiến gây bệnh hemophilia xẩy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trongmột thế hệ [31] Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam caohơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ Gần đây, người ta đã chứngminh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến Đột biến đảođoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bàomầm sinh dục nữ Hiện tượng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thểthứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phânbào giảm nhiễm ở nam

1.2.2 Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A

Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho thấy những hiểubiết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein FVIII, mở đường chocác nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophilia A và các dạng đột biến genF8 gây bệnh

Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồngyếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca2+ và phospholipidtiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thànhthrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từfibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu tốthành mạch Việc thiếu hụt hoặc bất thường chức năng yếu tố VIII làm ngừngtrệ dòng thác đông máu theo con đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máukéo dài, không cầm ở bệnh nhân hemophilia A

Hình 1.4 Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương 1.2.2.1 Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII

Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính

X, là một trong những gen lớn nhất của người, có kích thước 186 Kb gồm 26exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62bp đến 262bp và 2 exon lớn nhất làexon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), mã hóa 9 Kb mRNA Người đột biếngen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá trìnhđông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A [28]

Hình 1.5 Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X

(Nguồn: www.hemophilia.com)

Gen mã hóa yếu tố VIII có chuỗi nặng với đầu cuối là N, gồm cácdomain A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A3-C1-C2 vàvùng B Khi thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin vàthreonin Vùng B không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trìnhdịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII.

1.2.2.2 Protein yếu tố VIII

Hình 1.6 Cấu trúc gen và protein FVIII [29]

Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3-Cl-C2,gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước 200 kD, chuỗi nhẹ

là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD Cấu trúc của phức hợp này được giữ

ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ nước với yếu tố vonWillebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tố VIII) và Ca2+.Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các vùng A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là

C, gồm các vùng A3-C1-C2 Vùng B được mã hóa bởi một exon lớn và không

có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết Khi thủy phân hoàn toàn domain

B tạo thành asparagin, serin và threonin Vùng B không cần cho chức năngcủa yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng củayếu tố VIII

Hình 1.7 Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng

(Nguồn w.w.w nature.com/revieus/genetics) Vùng A (A1, A2, A3) là nơi bám của các ion Ca 2+ , Cu 2+ và các yếu tố IX, X trong quá trình đông máu Vùng C (C1, C2) là vị trí bám cho yếu tố vWF, X

và của các phân tử phospholipid một khi FVIII được hoạt hóa Vùng B chứa

vị trí cắt của thrombin đã được loại bỏ trong phân tử FVIII trong quá trình

hoạt hóa FVIII

1.2.2.3 Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A

Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Nghiên cứucủa Oldenburg và cộng sự đã chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thếnucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%)tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và intron 22(36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 – 15% Tùythuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặngnhẹ khác nhau nhau [16 ]

Đột biến điểm

Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen Nghiêncứu của Shima và cộng sự chỉ ra rằng đột biến thay thế Arginin thànhHistidin tại vị trí 372 gây biến đổi vị trí cắt của thrombin và làm quá trìnhhoạt hóa yếu tố VIII bị rối loạn, hoạt tính yếu tố VIII giảm mạnh còn 3 ÷ 5%[30 ] Năm 2000, Jacquemin và cộng sự đã chứng minh đột biến thay thếSerin thành Tyrosin tại vị trí 2119 (vùng C2) làm giảm đột ngột khả năngtương tác giữa yếu tố VIII và yếu tố vWF, dạng đột biến này thường gặp ởthể nhẹ và trung bình [31 ]

Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hưởng tới acidamin arginin, phần lớn các bệnh nhân mang đột biến này đều ở thể nặng [16-19]

Đột biến đảo đoạn

Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trìnhhoạt hóa yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chính gây

ra các dạng đột biến đảo đoạn ở bệnh nhân hemophilia A thể nặng [32]

Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn50% các thể bệnh nặng Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu múttelomere, nhiễm sắc thể X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tựtương đồng đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1).Quá trình tái tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùngint22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26)cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tố VIII [32]

Đột biến mất đoạn và thêm đoạn của gen yếu tố VIII

Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng

Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen Cơ chế phân tử của dạng đột biếnnày đã được kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tượng lặp lại Alu[17] Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tượng Alu làm đứt gãy gen F8 và gây

bệnh hemophilia A thể nặng Xóa đoạn và thêm đoạn nhỏ cũng thường thấytrong hemophilia A thể nặng, trong đó thay đổi 1-55 nucleotid Phổ biến nhất

là xóa hoặc thêm nucleotid Adenin vào exon 14, thường xảy ra trong vùng từc.3637 đến c.4379 [33]

1.3 NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A

Hemophilia A là bệnh rối loạn di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắcthể giới tính X, gây nên do đột biến yếu tố VIII Việc chẩn đoán người lànhmang gen bệnh là rất quan trọng để ngằn ngừa sự ra đời của những đứa trẻ bịbệnh hemophilia A [34]

1.3.1 Đặc điểm chung người mang gen bệnh

Người lành mang gen bệnh là người mang một nhiễm sắc thể X có độtbiến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình thường Biểu hiện lâm sàng có thểnặng hoặc nhẹ

Người lành mang gen bệnh có triệu chứng như một người bị hemophilia Athể nhẹ Những người mang gen bệnh hemophilia A có hoạt tính yếu tố VIIIhuyết tương thấp hơn bình thường, tuy nhiên cũng có những người mang genbệnh có hoạt tính yếu tố VIII rất thấp dưới 4% gây chảy máu như thể nặng.Khoảng 20% người lành mang gen bệnh biểu hiện triệu chứng chảy máu vớicác mức độ khác nhau, bao gồm cả những người có hoạt tính yếu tố VIIIhuyết tương trong giới hạn bình thường (40 đến 60%) [35]

1.3.2 Cơ chế di truyền của người mang gen bệnh hemophilia A

Nếu người mẹ mang gen bệnh kết hôn với một người bố bình thườngthì xác suất mỗi lần sinh con của họ là: 25% con trai bình thường, 25% contrai bị bệnh, 25% con gái bình thường, 25% con gái mang gen bệnh

Hình 1.8 Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường

Nếu một người bố bị bệnh hemophilia A kết hôn với người mẹ bìnhthường thì có khả năng sinh 100% con gái mang gen bệnh hemophilia A,100% con trai bình thường

Hình 1.9 Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh

Tất cả những người phụ nữ mang gen và những người có khả năng manggen bệnh đều cần làm xét nghiệm tình trạng mang gen

1.3.3 Triệu chứng của người mang gen

- Chảy máu sản, phụ khoa:

+ Kinh nguyệt kéo dài (hơn bảy ngày), rong kinh là một trong nhữngtriệu chứng phụ khoa phổ biến nhất Có thể nặng nề với số lượng máu mấttrong khoảng thời gian dài Theo thống kê, có đến 1/3 số phụ nữ bỏ lỡ đáng

kể thời gian học hoặc làm việc do rong kinh Đó cũng có thể là nguyên nhâncủa tình trạng thiếu sắt, thiếu máu và làm giảm chất lượng cuộc sống ở phụ nữmang gen bệnh Chảy máu nặng trong kỳ kinh nguyệt đầu tiên của một ngườilành mang gen bệnh có thể dẫn đến phải nhập viện [35]

+ Chảy máu bất thường âm đạo (băng huyết)

Băng huyết liên quan đến chảy máu bất thường xảy ra ngoài chu kỳkinh nguyệt bình thường Chảy máu bất thường xảy ra đôi khi trong khoảngthời gian giữa phần cuối của một chu kỳ kinh nguyệt với kỳ kinh bắt đầu tiếptheo Nếu chảy máu nặng nề cần nghỉ ngơi tại chỗ hoặc nhập viện để theo dõi

+ Chảy máu ổ bụng (hemoperitoneum)

Máu có thể chảy vào các mô xương chậu và dây chằng, đôi khi vào ổbụng và vùng chậu, gọi là chảy máu ổ bụng, là một cấp cứu ngoại khoa có thể

đe dọa đến tính mạng

+ Chảy máu sau khi sinh:

Người mang gen bệnh hemophilia A có nguy cơ bị xuất huyết trong thai

kỳ Tuy nhiên, trong thực tế, do ảnh hưởng của hormon làm tăng hoạt tính yếutố VIII trong huyết tương nên nguy cơ này giảm xuống

- Các chảy máu khác:

 Dễ bầm tím

 Chảy máu kéo dài từ vết thương nhỏ

 Chảy máu cam

 Chảy máu kéo dài sau khi nhổ răng

 Chảy máu nặng sau khi chấn thương hoặc phẫu thuật

Chảy máu khớp và cơ bắp không phải là triệu chứng hay gặp ở nhữngngười mang bệnh hemophilia A trừ trường hợp hoạt tính yếu tố VIII huyết tươngrất thấp (dưới 4%) Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nguy cơ chảy máu kéo dài(nhiều hơn năm phút) từ vết thương nhỏ hoặc sau khi phẫu thuật ở người manggen bệnh hemophilia A có triệu chứng có thể cao gấp đôi so với những ngườimang gen bệnh không biểu hiện triệu chứng trong cùng một gia đình

1.3.4 Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh

Người phụ nữ mang gen bệnh ngoài việc sinh ra những đứa trẻ bị bệnh

và những đứa con mang gen bệnh, những đứa con mang gen bệnh này lại cókhả năng sinh ra những đứa con bị bệnh Vì vậy, nếu không quản lý hay pháthiện được những người phụ nữ mang gen bệnh thì thế hệ tiếp theo sẽ gia tăng

tỷ lệ những đứa con mang bệnh và mang gen bệnh Vì vậy, việc xác định sớmnhững người phụ nữ mang gen bệnh sẽ giúp cho họ có định hướng, chủ độngtrong việc kết hôn và sinh ra những đứa con khỏe mạnh

1.3.4.1 Định lượng các yếu tố đông máu

Người phụ nữ mang gen thường có yếu tố VIII thấp hơn người phụ nữbình thường, một số người cũng có biểu hiện chảy máu lâu cầm như ngườibệnh hemophilla A thể nhẹ Sử dụng nồng độ yếu tố VIII phát hiện người lànhmang gen đúng được 70-90% theo Nguyễn Anh Trí viện huyết học truyềnmáu Trung ương [36]

1.3.4.2 Phát hiện người lành mang gen bệnh dựa vào phân tích phả hệ

Phả hệ là sơ đồ di truyền của một gia đình Để xây dựng phả hệ cần phải

có tối thiểu 3 thế hệ gần nhất cần phải khai thác kỹ tiền sử bản thân bệnh nhân vàcác thành viên của gia đình bệnh nhân

Phân tích phả hệ sẽ phát hiện được quy luật di truyền của bệnhHemophilia A Trong bệnh lý hemophilia A, gen đột biến gây bệnh nằm trênnhiễm sắc thể X, không alen có trên nhiễm sắc thể Y, nên theo quy luật ditruyền menden, sơ đồ phả hệ có thể phát hiện nam giới bị bệnh, nam giới bìnhthường, nữ giới mang gen và nữ giới bình thường

Nếu một người mẹ mang gen bệnh lấy một người bố bình thường thìxác suất sinh con của họ là: 25% con gái mang gen bệnh, 25% con gái bìnhthường, 25% con trai bị bệnh, 25% con trai bình thường

Hình 1.10 Sơ đồ phả hệ của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường

Nếu một người mẹ mang gen bệnh kết hôn với người bố bị bệnh thì xácsuất sinh con của họ: 25% con gái bị bệnh, 25% con gái mang gen bệnh, 25%con trai bị bệnh, 25% con trai bình thường.

Hình 1.11 Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh [23]

Theo những phân tích di truyền phả hệ thì:

Một người phụ nữ mang gen khi chắc chắn thỏa mãn một trong bốnđiều kiện sau:

Có ít nhất hai con trai bị bệnh, là con của bệnh nhân hemophilia A; Cómột con trai bị bệnh có ít nhất một người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh; Cómột con trai bị bệnh và trong gia đình họ mẹ có ít nhất một người được chẩnđoán là mang gen bệnh

Một người có khả năng mang gen bệnh khi thỏa mãn một trong ba điềukiện sau: Có một con trai bị bệnh và trong gia đình không có ai bị bệnh cũngnhư mang gen bệnh; có ít nhất một người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh vàkhông có con trai bị bệnh, là con của một người mang gen bệnh [37]

Trong những gia đình có người con trai mắc bệnh hemophilia A, người

ta thường lập phả hệ để xác định tình trang mang gen của người mẹ Tuynhiên, phương pháp này cung cấp rất ít thông tin về tình trạng mang gen củangười phụ nữ nên cần phải có số lượng gia đình lớn để có thể tính toán [38]

1.3.4.3 Phát hiện người lành mang gen bệnh dựa vào phân tích gen

Phân tích trực tiếp

Việc phân tích gen của bệnh nhân hemophilia A có thể phát hiện đượcđột biến trên gen F8 Để chẩn đoán một người phụ nữ mang gen bệnh haykhông người ta thường dựa vào việc phân tích đột biến trên của người phụ nữ

ấy có cùng kiểu đột biến với bệnh nhân hemophilia A hay không? Quy trìnhchung cho các kỹ thuật phân tích đột biến trực tiếp bắt đầu từ việc lấy máutĩnh mạch của bệnh nhân, tách chiết DNA và thực hiện các kỹ thuật sinh họcphân tử để xác định loại đột biến: đột biến điểm, đảo đoạn, mất đoạn… Sau

đó sẽ dựa vào đột biến đó xác định được đột biến trên người mang gen

Việc phát hiện đột biến trực tiếp chủ yếu dựa vào kỹ thuật PCR và giảitrình tự gen Với những kỹ thuật này có thể phát hiện 89,3% đột biến và vẫn

bỏ xót những đột biến chưa phát hiện được [39] Tuy nhiên, do gen F8 có kíchthước và trọng lượng phân tử lớn và sự đa dạng về kiểu đột biến nên phươngpháp phân tích trực tiếp đòi hỏi phải có kỹ thuật cao có độ chính xác cao, vàchi phí đắt

* Phát hiện đột biến điểm bằng kỹ thuật giải trình tự gen

Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụngdideoxynucleotid (ddNTP) do Sanger và CS phát minh Với các máy thế hệsau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loạiddNTP Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ốngnghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng, không phải trên 4 hàng khác nhaunhư trước đây Đối với phương pháp giải trình tự tự động, hệ thống điện dithường sử dụng là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua,phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnhquang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phântích Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó

biết được trình tự của DNA đích Phương pháp này giúp xác định các đột biếnđiểm của gen dystrophin như đột biến điểm, đột biến xoá đoạn….và là mộttiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện các đột biến gen F8.

*Phát hiện đột biến đảo đoạn gen F8

a/ Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22

Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn45% các thể bệnh nặng [17] Inversion- PCR (I-PCR) là kỹ thuật chính được

sử dụng để phát hiện đột biến đảo đoạn này Phương pháp được miêu tả bởiRosetti và cộng sự năm 2005 [40] Quy trình gồm 3 bước: (1) Cắt bằngenzym BclI,(2) Nối bằng T4 ligate, (3) Khuếch đại bằng phản ứng MultiplexPCR Phương pháp I-PCR có ưu điểm là dễ tiến hành Enzym BclI tác dụngrất đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym có tính đặc hiệu cao Sản phẩm PCRđược khuếch đại dễ dàng trong thời gian khoảng 30 phút do các đoạn DNA cókích thước ngắn (487 và 559 bp) Như vậy xét nghiệm phân tích gen đượctiến hành nhanh chóng, kết quả thu được có độ tin cậy cao, dễ thực hiện

b Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1

Hiện tượng tái tổ hợp cũng diễn ra tương tự giữa int1h1 (nằm trong intron 1) có kích thước 900 bp và vùng trình tự tương đồng int1h2 cách gen

F8 một đoạn 140 kb về phía đầu mút telomere gây nên dạng đột biến đảođoạn intron 1 xuất hiện ở 5% các thể bệnh nặng [21]

Phương pháp xác định đảo đoạn intron 1 được mô tả bởi Bagnal và cộng

sự năm 2002 [41]:

+ Thiết kế hai phản ứng Multiplex PCR có thể phát hiện được các bệnhnhân bị đột biến Phản ứng 1 có chứa các cặp mồi đặc hiệu cho int1h1 cộng vớimột mồi đặc hiệu cho chuỗi int1h2; phản ứng 2 chứa cặp mồi đặc hiệu choint1h2 cộng với một mồi đặc hiệu cho int1h1 Dựa vào kích thước khác nhau củacác đoạn DNA sau khi điện di để phát hiện đột biến Trường hợp không có đột

biến đảo đoạn intron 1, phản ứng 1 chỉ có mồi int1h1 bắt cặp cho kích thước

1908 bp Ở phản ứng 2 chỉ có mồi đặc hiệu cho int1h2 bắt cặp cho kích thước

1191 bp Nếu đột biến xảy ra, mồi int1h1 bắt cặp với int1h2 ở cả hai phản ứng sẽcho các kích thước 1323 bp và 1776 pb tương ứng ở phản ứng 1 và phản ứng 2

*Phát hiện đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8

Trong những năm gần đây, MLPA (Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán độtbiến mất đoạn, lặp đoạn gen F8 Kỹ thuật MLPA (khuếch đại đa đoạn dò)được mô tả lần đầu vào năm 2002 bởi Schouten J.P và CS, đây là phiên bảnmới của phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA đích được khuếch đại chỉbằng 1 cặp mồi [42]

- Kỹ thuật MLPA sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai hóa vớiphân tử DNA đích đặc hiệu và vấn đề thiết kế các probe rất quan trọng

Mỗi đoạn dò gồm 2 chuỗi oligonucleotide có kích thước khác nhau (gọi

là đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược)

+ Đoạn dò xuôi: gồm Đầu 5’và đầu 3’, đoạn ngược gồm: Đầu 3’, đầu5’và phần nối giữa đầu 5’ với đầu 3’ Các đoạn probe sẽ gắn đặc hiệu vào cácexon của phân tử DNA đích, sau đó enzym ligase được thêm vào để nối haiđoạn probe này lại với nhau tạo thành đoạn probe hoàn chỉnh và được khuếchđại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Phân tích kết quả MLPA làbước quan trong trong kỹ thuật Phân tích được tiến hành dựa trên hành ảnh,

dữ liệu thô tương ứng với từng probe

Phân tích gián tiếp

Phân tích gián tiếp dựa trên việc phân tích di truyền sự đột biến dựa vào sự

đa hình thái của các alen Đa hình là những thay đổi dựa trên trình tự nucleotidcủa gen dẫn đến tính đa dạng tạo ra sự khác biệt giữa người này và người khácnhưng không ảnh hưởng tới chức năng của gen đó, đa hình phải nằm trên nhiễm

sắc thể X, di truyền cùng gen yếu tố VIII và mang thông tin Giá trị thông tin đahình là tần suất xuất hiện, tỷ lệ dị hợp tử và tương tác liên kết với đa hình khác.Giá trị này khác nhau giữa các chủng tộc người Người dị hợp tử về đa hình nào

là người có hai alen khác nhau về đa hình đó trên hai nhiễm sắc thể X của mình

và được gọi là có thông tin Tỷ lệ dị hợp tử đa hình càng cao thì khả năng chẩnđoán càng tốt Tỉ lệ dị hợp tử của các marker đa hình này rất thay đổi ở các tộcngười khác nhau Bên cạnh đó, có một số đa hình liên kết tương quan với nhau.Nói cách khác là có một alen của đa hình này liên kết với một alen của đa hìnhkhác vì vậy khi phối hợp 2 đa hình này với nhau sẽ ít làm tăng tỉ lệ có thông tin.Chính vì vậy, để đảm bảo hiệu quả cho việc chẩn đoán, việc chọn lựa sử dụng

đa hình nào cần căn cứ vào tỉ lệ dị hợp tử cũng như sự liên kết tương quan giữacác đa hình của quần thể người đó

1.4 PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) VÀ QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ (PGD)

1.4.1 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

Sự thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm được đánhdấu bằng sự ra đời của đứa trẻ đầu tiên theo phương pháp này vào năm 1978[43] Tính trung bình ở các nước như Thụy Điển, Úc và Hoa Kỳ thì cứ khoảng50-80 trẻ thì có một trẻ được sinh ra bằng phương pháp thụ tinh trong ốngnghiệm Hàng năm có khoảng hơn 120 nghìn cặp vợ chồng ở Hoa Kỳ thựchiện thụ tinh trong ống nghiệm [44] Trong tương lai, số trẻ ra đời bằngphương pháp này sẽ còn tăng cao bởi sự gia tăng độ tuổi trung bình khi kếthôn, độ tuổi trung bình khi mang thai lần đầu và sự gia tăng về tỷ lệ vô sinhcủa các cặp vợ chồng trên thế giới [45]

Quy trình thường quy của IVF được thực hiện theo trình tự bắt đầu từ

việc kích thích các nang noãn bằng FSH (Hình 1.13) Các bệnh nhân được

chọc hút trứng sau khi tiêm HCG từ 34-36 giờ [46] Tinh trùng của bệnh nhân

được lấy vào lọ vô trùng, không độc trong ngày chọc hút trứng Mẫu tinhtrùng được ly giải và xử lý theo quy trình chuẩn rồi đánh giá mật độ tinh trùng

và độ di động theo tiêu chuẩn của WHO-2010 Trứng được thụ tinh in vitro

bằng cách nuôi cấy với tinh trùng hoặc tiêm trực tiếp tinh trùng vào bào tươngcủa trứng (Intracytoplasmic sperm injection, ICSI) và nuôi cấy trong vòng 2-5ngày [47] Đánh giá chất lượng phôi vào ngày thứ 2, thứ 3 và thứ 5 dựa vàosố lượng, độ đồng đều của phôi bào, độ chiết quang, độ liên kết phôi bào,phần trăm mảnh vỡ và tốc độ phân chia của phôi bào Các phôi làm PGD cònđược đánh giá thêm số phôi bào thoái hóa và số phôi phân chia tiếp sau PGD[48] Phôi được chuyển vào tử cung bằng catheter chuyển phôi dưới siêu âmđường bụng, kỹ thuật chuyển phôi đạt tiêu chuẩn khi chuyển phôi dễ, cathetersau chuyển phôi sạch, không nhầy máu, không sót phôi, không kẹp cổ tử cung

và không nong cổ tử cung

Tỷ lệ trẻ sinh sống sau khi chuyển phôi ở các bà mẹ có độ tuổi 34 hoặctrẻ hơn dao động trong khoảng 30-49% Sau đó, khi độ tuổi của các bà mẹtăng thêm một tuổi thì tỷ lệ này giảm đi tương ứng từ 2-6% và đối với phụ nữ

có độ tuổi 43 trở lên thì tỷ lệ trẻ sinh sống sau chuyển phôi chỉ còn khoảng5% Như vậy, tỷ lệ thành công của phương pháp IVF liên quan chặt chẽ đến

độ tuổi của người mẹ, đến chất lượng trứng và nguyên nhân có thể do các bấtthường nhiễm sắc thể gia tăng đối với các bà mẹ lớn tuổi

Khi thực hiện IVF, thông thường các bác sỹ cùng lúc cấy chuyển nhiềuphôi vào tử cung để gia tăng tỷ lệ mang thai Điều này làm tăng tỷ lệ mangthai đôi và thai ba Bên cạnh đó việc mang thai đôi, thai ba cũng làm gia tăng

tỷ lệ sinh non và trẻ sinh ra bị thiếu cân [49-50] Tuy nhiên, cần phải nhấnmạnh rằng, thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm đã manglại hạnh phúc khi được làm cha mẹ cho rất nhiều cặp vợ chồng hiếm muộn.Đây thực sự là những thành tựu y học mà các bác sỹ và nhân viên y tế đãmang đến cho nhiều gia đình và cho xã hội

Hình 1.12 Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm

A, B: Kích thích nang noãn chín và theo dõi bằng siêu âm C: Chọc hút trứng dưới sự hướng dẫn của siêu âm D-F: Thụ tinh in vitro bằng cách tiêm trực tiếp tinh trùng vào bào tương của trứng G-I: Phôi tiếp tục được nuôi cấy và đánh giá chất lượng của phôi và chuyển vào tử cung (I).

1.4.2 Quy trình chẩn đoán gen trước làm tổ (PGD)

Kỹ thuật PGD (Preimplantation genetic Diagnosis) hay PGT (Preimplantationgenetic testing) hiện nay là một kỹ thuật hoàn chỉnh, cho phép các cặp vợchồng có nguy cơ truyền các bệnh lý di truyền cho con có thể có cơ hội sinhcon không mắc bệnh mà không phải chẩn đoán tiền sản sau khi mang thai và

bỏ thai khi phát hiện bệnh lý ở thai [51] Kỹ thuật PGT-M: chẩn đoán cácbệnh đơn gen, giúp các cặp vợ chồng xác định thai không bị bệnh về gen do

di truyền từ cha mẹ mang gen đột biến (bệnh thiếu máu tán huyếtThalassemia, bệnh máu khó đông Hemophilia ) Kỹ thuật này dựa trên việc

phát hiện các bất thường di truyền ở phôi (in-vitro) và chỉ cấy trở lại vào lòng

tử cung các phôi không có các bất thường về di truyền [52-54]

1.4.2.1 Lịch sử phát triển của kỹ thuật chẩn đoán trước làm tổ

PGD được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1990 [3],[55] Chỉđịnh chẩn đoán PGD áp dụng cho các trường hợp bệnh lý vùng Địa trung hảinhư Cystic Fibrosis (CF) và các bệnh lý di truyền liên kết với nhiễm sắc thể X

(X-linked disorders) [3] Trong báo cáo đăng trên tạp chí Nature, Handyside vàcộng sự đã báo cáo trường hợp có thai từ các phôi đã được sinh thiết và chẩnđoán di truyền bằng cách khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng trên nhiễm sắcthể Y thông qua kỹ thuật PCR Handyside và Cs đã thực hiện cho 5 cặp vợchồng có bệnh lý liên quan đến nhiễm sắc thể X, phôi gái được chọn và cấyvào tử cung, kết quả là có 2 trường hợp thai đôi và 1 thai đơn khỏe mạnh Tuynhiên, trong 3 năm đầu phát triển, chỉ có 1 số trường hợp sinh sống từ phôiPGD được báo cáo [55-56] Vào năm 1993-1994, kỹ thuật FISH (Fluorescent

in situ hybridization) bắt đầu được áp dụng trong PGD để chẩn đoán các bất

thường nhiễm sắc thể FISH được sử dụng để phân tích các rối loạn nhiễm sắc

thể, chủ yếu các lệch bội thể (aneuploids) và cho phép chẩn đoán chính xác hơn

và giảm tỷ lệ sai sót so với phương pháp PCR [57] PGD đã phát triển nhanhchóng và số trường hợp sinh sống từ phôi PGD trên thế giới bắt đầu tăng mạnh.Chỉ trong vòng 2 năm sau đó, hơn 100 trường hợp sinh sống từ phôi PGD đãđược báo cáo trên thế giới Vào năm 1996, PGD tiếp tục một bước phát triểnmới khi người ta bắt đầu xác định được chuyển đoạn nhiễm sắc thể và ứngdụng vào PGD Kỹ thuật chẩn đoán di truyền này giúp xác định các phôi không

có bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể trước khi cấy vào tử cung [58] Từnăm 1999, PGD lại được mở rộng chỉ định để chẩn đoán phôi có mang các genliên quan đến các bệnh lý sau này ở đứa trẻ Đây là một chỉ định mới so với cácchỉ định trước đây của chẩn đoán tiền sản Chỉ định này cho phép bố mẹ cómang gen tiềm ẩn một bệnh lý được dự báo trước có thể sinh ra một trẻ hoàntoàn không mang gen bệnh Điều này mang đến khả năng ứng dụng rất lớn củaPGD khi các nhà khoa học ngày càng phát hiện nhiều bệnh lý ở người có liênquan đến di truyền [59] Cho đến nay PGD được sử dụng như một phương tiệnchẩn đoán lâm sàng trong điều trị và áp dụng một cách rộng rãi hơn Hàng nămsố trường hợp PGD tăng gần gấp đôi, hàng chục ngàn trẻ ra đời từ các trungtâm IVF trên thế giới sau chẩn đoán PGD và không có ảnh hường xấu nào

1.4.2.2 Quy trình kỹ thuật chẩn đoán trước làm tổ

Quy trình PGD được thực hiện bằng cách lấy tế bào từ mỗi phôi trongIVF để phân tích [60] Tế bào được lấy ngày thứ 3, ngày thứ 5 sau thụ tinhtrong giai đoạn phát triển phôi [61],[62] Phôi ngày thứ 3 có hiện tượng lệchbội nhiễm sắc thể và tỷ lệ thể khảm khá cao [63], đến giai đoạn phôi nang thì tỷ

lệ này giảm và phôi ngày thứ 3 có khả năng tự sửa chữa được [64] Hiện tượngnày là do ngày thứ 3 hệ thống gen của phôi chưa hoàn toàn biệt hóa [65] Mặtkhác ở những phôi có khả năng tự sửa chữa này thì các phôi bào có số lượngNST bình thường có khả năng phân chia tốt hơn có xu hướng di chuyển biệthóa thành mầm phôi, các phôi bào bất thường sẽ ngừng phát triển [66] Mặc dùcác nghiên cứu cho thấy sinh thiết phôi nang chẩn đoán chính xác cao hơn, vìsinh thiết được nhiều phôi bào hơn, thể khảm ít hơn, nhưng sinh thiết phôi ngày

3 vẫn được áp dụng ở nhiều trung tâm trên thế giới Bên cạnh đó, sinh thiếtphôi nang cũng gặp khó khăn như nguy cơ phôi thoái hóa sau sinh thiết caohơn, phôi nang không còn tính phát triển toàn năng như phôi ngày 3 Hơn nữa,phôi nang sau sinh thiết xong thường phải đem đông lạnh chờ đến chu kỳ saumới tiến hành chuyển phôi, như vậy nguy cơ thoái hóa phôi sau đông phôi sẽtăng lên Trong khi đó, sinh thiết phôi ngày 3 khả năng sống sót cao hơn, cảithiện khả năng làm tổ cũng như tỷ lệ có thai Hạn chế chính của sinh thiết phôingày 3 là tỷ lệ khảm của phôi cao dẫn đến bỏ sót chẩn đoán Việc sử dụng haiphôi bào cho sàng lọc, chẩn đoán sẽ cho kết quả chính xác hơn Số liệu chothấy tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang tương đương giữa 2 nhómphôi sinh thiết một phôi bào hay sinh thiết hai phôi bào

Dùng kim sinh thiết lấy phôi bào nguyên vẹn và bảo quản trong điềukiện thích hợp để thực hiện các bước tiếp theo của chẩn đoán trước làm tổ[67] Dựa vào kết quả chẩn đoán trước làm tổ và khả năng phân chia tiếp của

phôi để chọn các phôi có nhiễm sắc thể bình thường, không mang bệnh lý di

truyền cho việc chuyển phôi Việc chuyển phôi vào buồng tử cung được tiếnhành vào ngày thứ 5 ở giai đoạn phôi nang Sau đó bệnh nhân được thực hiệncác test để đánh giá khả năng mang thai và các xét nghiệm chuẩn đoán theodõi sự hình thành và phát triển của thai nhi trong buồng tử cung [68].

Hình 1.13 Sinh thiết phôi bào giai đoạn blastomere cho chẩn đoán PGD [69]

PGD có nhiều ưu điểm so với chẩn đoán tiền sản thông thường Thứnhất, có thể tránh được việc phải chấm dứt thai kỳ, bỏ thai Thứ hai, đây làmột kỹ thuật thích hợp với các cặp vợ chồng bị chuyển đoạn nhiễm sắc thể,giúp loại trừ các khả năng chuyển đoạn không cân xứng (unbalancedtranslocations) xuất hiện ở thai nhi, thường dẫn đến sảy thai liên tiếp Thứ ba,thích hợp cho các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh ra trẻ bị các bệnh lý thườnggặp có nguyên nhân di truyền gen lặn hay trội, đặc biệt là các bệnh di truyềnliên kết với NST giới tính Thứ 4, các cặp vợ chồng không chỉ có nhu cầu sinhcon không bị bệnh mà còn có thể lựa chọn hệ HLA phù hợp để sử dụng máucuống rốn để điều trị cho anh hoặc chị lớn đã có bệnh lý di truyền

1.4.2.3 Chỉ định của chẩn đoán trước làm tổ

Ngày nay PGD được áp dụng để chẩn đoán cho khoảng 170 bệnh lý khácnhau Càng ngày các nhà khoa học càng xác định được nhiều gen liên quan đếncác bệnh lý và xác định các dạng đột biến gây bệnh của các gen này Điều nàycho phép PGD chẩn đoán xác định các phôi không có các gen bệnh để chọn lọc

và cấy các phôi này vào tử cung [70] Các đối tượng khi thực hiện thụ tinh

trong ống nghiệm được khuyến khích sử dụng quy trình này bao gồm: i) Các cặp vợ chồng mang gen gây bệnh di truyền trên nhiễm sắc thể thường hoặc liên kết với nhiễm sắc thể giới tính ii) Những người có sự bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể như mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn và chuyển đoạn iii) Phụ

nữ lớn tuổi, phụ nữ tiếp xúc với hóa chất, phóng xạ… để tránh những bất thường về nhiễm sắc thể có thể xảy ra và di truyền cho con của họ iv) Phụ nữ có tiền sử xảy thai, thai lưu nhiều lần v) Các cặp vợ chồng đã được thực hiện phương pháp IVF trước đó nhưng không thành công mà không rõ nguyên nhân Ngoài ra, PGD hiện nay không chỉ giới hạn ở việc loại trừ các bệnh lý di

truyền thể hiện ngay lúc sinh mà còn được mở rộng để loại trừ các bệnh lý ditruyền khởi phát muộn do các yếu tố di truyền tiềm ẩn Những gen này tuykhông chắc chắn gây bệnh nhưng người có gen này có thể có nguy cơ cao bịmột số bệnh lý nhất định, ví dụ như tầm soát gen gây ung thư vú BRCA1 [71].Gần đây PGD còn được áp dụng trong các chỉ định không liên quan đến bệnh,như chọn lọc các phôi có hệ HLA phù hợp với trẻ bị bệnh đã sinh trước đó Kỹthuật này được áp dụng để tìm phôi khỏe mạnh, đồng thời có HLA tương thíchvới trẻ bị bệnh cùng bố mẹ Điều này cho phép sử dụng liệu pháp tế bào gốc đểđiều trị bệnh cho các trẻ bệnh với nguồn tế bào gốc có hệ HLA tương thích

Có thể thấy rằng, phương pháp chẩn đoán trước làm tổ giúp cho cáccặp vợ chồng mang bệnh lý di truyền có khả năng sinh ra được những đứacon hoàn toàn khỏe mạnh, tuy nhiên đây là một kỹ thuật tốn kém và khôngthể sàng lọc hoàn toàn các đột biến gen và bất thường NST ở phôi Để chẩnđoán, bệnh nhân phải thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) để có phôibào cung cấp cho chẩn đoán mặc dù họ không phải là bệnh nhân vô sinh Hơnnữa tỷ lệ có thai lâm sàng sau IVF ở Việt Nam chỉ khoảng 30% Việc chẩnđoán xác định đột biến gen và các bất thường NST chỉ từ một tế bào đượcsinh thiết rõ ràng sẽ có những hạn chế nhất định, thể hiện bởi tỷ lệ thành công,

mức độ rõ ràng và chính xác của kết quả chẩn đoán Chính vì vậy trong nhữngnăm gần đây, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như FISH,microsatellite DNA, microarray… đã được ứng dụng vào quy trình chẩn đoántrước làm tổ để nâng cao tính chính xác và hiệu quả của chẩn đoán Cần phảinhấn mạnh rằng, việc xác định chính xác đột biến trên bệnh nhân và ngườimang gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử là rất cần thiết để định hướng vàkhu trú các tổn thương trước khi thực hiện chẩn đoán trước làm tổ Do vậyphương pháp này chỉ định chẩn đoán có chọn lọc cho nhóm nguy cơ cao như

đã trình bày ở trên

1.4.3 Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng trong việc chẩn đoán trước làm tổ

Với sự phát triển nhanh chóng của các kỹ thuật phân tích, chẩn đoán

gen như: PCR, Multiplex-PCR, Fluorescent in-situ Hybridization (FISH),

Microsatellite DNA … và ứng dụng vào quy trình PGD đã giúp cho việc chẩnđoán và sàng lọc được thực hiện nhanh hơn và cho kết quả chính xác hơn

1.4.3.1 PCR và Multiplex-PCR

PCR và Multiplex-PCR là kỹ thuật nhân đoạn DNA thực nghiệm sửdụng một cặp mồi hay cùng lúc nhiều cặp mồi khác nhau Sản phẩm của phảnứng khuếch đại sau đó được kiểm tra bằng cách điện di trên agarose gel để xácđịnh sự có mặt hay vắng mặt của đoạn DNA cần phân tích [72] PCR là kỹthuật đầu tiên được áp dụng vào PGD bởi Handyside và cộng sự vào năm 1990khi xác định các đoạn trình tự lặp lại trên nhiễm sắc thể Y để xác định giới tínhcủa phôi trong chẩn đoán các bệnh di truyền liên kết với NST giới tính vàchuyển các phôi không mắc bệnh vào tử cung Cho đến nay, kỹ thuật PCR đãđược áp dụng rộng rãi trong PGD với độ chính xác ngày càng cao để xác địnhnhiều bệnh di truyền khác nhau [69] Hơn nữa, với việc phát triển kỹ thuậtmultiplex-PCR trong PGD các nhà di truyền học có thể xác định cùng lúc

nhiều đột biến có khả năng di truyền từ phôi [73] Tuy nhiên, kỹ thuật PCR còn

có nhiều hạn chế Việc khuếch đại đoạn gen mong muốn chỉ từ một tế bào đòihỏi một số lượng lớn chu kỳ khuếch đại để có thể xác định được hình ảnh đoạngen cần phân tích trên agarose gel Điều này dẫn tới nguy cơ nhiễm DNA ngoạilai hay DNA từ chính cặp vợ chồng thực hiện PGD và IVF Khi DNA bị nhiễmvào mẫu PCR cần phân tích có thể làm sai lệch kết quả chẩn đoán Để khắcphục tình trạng này, các nhà di truyền học đã thiết lập một quy trình PCR sửdụng trong PGD với việc khuếch đại đồng thời đoạn DNA cần phân tích vàđoạn DNA đặc hiệu không có nguồn gốc từ phôi thai Như vậy, các mẫu phântích bị nhiễm DNA sẽ bị loại trừ và cho kết quả chẩn đoán PGD một cách chínhxác Vấn đề khác của việc ứng dụng PCR vào chẩn đoán PGD là chỉ khoảng80% các đoạn gen cần được phân tích được khuếch đại thành công khi phảnứng được thực hiện với lượng DNA từ một phôi bào sinh thiết [73-74] Các kỹthuật PCR khác như multiplex-PCR, Fluorescent PCR đều có thể làm gia tăng

tỷ lệ thành công của chẩn đoán Tuy nhiên, giá thành của các kỹ thuật này caohơn so với kỹ thuật PCR tiêu chuẩn kể trên

1.4.3.2 Fluorescence in situ hybridization (FISH)

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là kỹ thuật di truyền tế bào –phân tử, sử dụng đầu dò DNA gắn huỳnh quang lai với trình tự DNA đặc hiệuđích trên nhiễm sắc thể của tế bào ở gian kỳ hoặc các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa,qua đó phát hiện được sự có mặt hay vắng mặt của một đoạn gen nào đó bằngkính hiển vi huỳnh quang [75] Với kỹ thuật FISH, các nhà di truyền có khảnăng phát hiện những bất thường do một đoạn gen nhỏ gây ra với độ phângiải cao mà không còn bị lệ thuộc quá nhiều vào các kỹ thuật nhuộm băng

Kỹ thuật này đã được nghiên cứu và ứng dụng để chẩn đoán các bất thườngnhiễm sắc thể trong PGD từ những năm 1993-1994 của thế kỷ trước [76].Hiện nay, ứng dụng rộng rãi nhất của kỹ thuật FISH trong PGD là loại 5 DNA

dò (13, 18, 21, X, Y) đối với lai 1 vòng và 9 DNA dò 13, 15, 16, 17, 18, 21,

22, X và Y đối với lai 2 vòng Ngoài ra kỹ thuật FISH trong PGD còn đượcdùng để chẩn đoán ung thư do mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể [76] Kỹ thuậtFISH trong PGD là một kỹ thuật mang lại hiệu quả thành công cao cho IVF

Hình 1.14 Ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán xác định

giới tính và số lượng nhiễm sắc thể [68]

Trong trường hợp này, các bác sỹ sử dụng tổ hợp DNA gắn huỳnh quang phát ra 5 loại màu sắc khác nhau (NST 13: màu cam NST 18: màu xanh, NST 21: màu xanh lá cây, NST X: màu tím và NST Y: màu xanh sáng) để chẩn đoán giới tính

và số lượng NST (A) phôi có giới tính là nam, (B) có giới tính là nữ và đều có số lượng NST bình thường: 2 cặp NST số 13, 18 và 21.

Theo nghiên cứu của H.Malmgren và cộng sự năm 2006 sử dụng kỹthuật FISH phân tích từ phôi bào để xác định sự xóa đoạn exon trong gendystrophin gây bệnh Duchenne Nhóm nghiên cứu đã sử dụng đầu dò exon 45,exon 46, exon 47 kết hợp với đầu dò trên trục X, Y Kết quả bệnh nhân thựchiện chu kỳ đầu tiên 10 phôi được 8 phôi trong đó 02 phôi nam bình thường, 2phôi nam bất thường, 3 phôi nữ mang gen, 01 phôi nữ không bình thường 02phôi nam bình thường được cấy vào buồng tử cung người mẹ trong ngày thứ 4nhưng không mang thai Chu kỳ thứ 2 được 01 phôi nữ bình thường, kết quảsinh ra bé gái khỏe mạnh Với nghiên cứu này cho thấy việc sử dụng kỹ thuậtFISH trong PGD để xác định sự xóa đoạn gen dystrophin trên một tế bào đơngen bằng cách sử dụng mảng lai gen là sự lựa chọn tốt [77]