định đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩnđoán trước sinh bệnh hemophilia A đã được nghiên cứu khá nhiều ở ViệtNam.Việc quản lý bệnh nhân và người mang gen của
Trang 1ĐẶT VẤN ĐỀ
1 Tính cấp thiết của đề tài
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày cànggia tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng Ra đời vào những năm 1970của thế kỷ trước, có thể nói phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm “invitro fertilization - IVF” đã trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vôsinh mong muốn có đứa con Phương pháp này đã mang lại niềm vui,niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy nhiênkhông phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh được những đứa conmong muốn bằng phương pháp này Tỷ lệ thành công của phương phápnày chỉ đạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia Có rất nhiều yếu tố ảnhhưởng đến sự thành công của phương pháp này như: tuổi bố mẹ, tìnhtrạng sức khỏe, tinh thần tâm lý, chất lượng tinh trùng và trứng… và đặcbiệt chất lượng phôi sau khi thụ tinh Các phôi có thể bất thường nhiễmsắc thể (NST) thường hay NST giới tính đều làm giảm khả năng mangthai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung, có thể gây sảy thai hoặc sinh ranhững đứa con không khỏe mạnh Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứacon không khỏe mạnh và làm tăng tỷ lệ thành công của phương pháp thụtinh trong ống nghiệm, thời gian gần đây các nhà khoa học đã áp dụngquy trình sàng lọc phôi “Pre-Implantion Genetic Diagnosis, PGD” còngọi là “chẩn đoán di truyền trước làm tổ” nhằm có được những phôi tốtnhất cho quá trình chuyển phôi
Hemophilia A (bệnh ưa chảy máu) là bệnh di truyền do thiếu hụthoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu VIII Hemophilia
A là bệnh di truyền alen lặn trên NST X không có alen trên NST Y, nênngười mẹ mang gen bệnh sẽ di truyền cho con trai và biểu hiện bệnhtrên lâm sàng Theo thống kê của tổ chức hemophilia A thế giới, hiệnnay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A và chỉ cókhoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu Tại Việt Nam, ước tính cókhoảng 6000 người bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000 ngườimang gen bệnh hemophilia Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy máu ởbất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảymáu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độbiểu hiện trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII tronghuyết tương
Việc tầm soát trước sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quantrọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh Việc xác
Trang 2định đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩnđoán trước sinh bệnh hemophilia A đã được nghiên cứu khá nhiều ở ViệtNam.Việc quản lý bệnh nhân và người mang gen của bệnh lý này là tiền
đề vững chắc để triển khai thành công quy trình chẩn đoán trước làm tổtrong sàng lọc phôi Phương pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và dichứng cho người mẹ khi mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ dophát hiện bệnh ở thai nhi khi chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnhphúc cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắcbệnh ở cộng đồng Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, đã có rấtnhiều kỹ thuật được áp dụng để phát hiện các đột biến gây bệnhhemophilia A như multiplex polymerase chain reaction (PCR), kỹ thuậtlai huỳnh quang tại chỗ (FISH) Kỹ thuật microsatellite DNA là kỹ thuật
sử dụng các primer gắn huỳnh quang của short tandem repeat (STR)marker và phân tích kích thước của chúng thông qua điện di mao quảntrên máy giải trình tự gen để xác định các bất thường về nhiễm sắc thể
Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm do tính bền vững cao, dễ dàng phát hiện
dị hợp tử mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ giảmđược chi phí cho gia đình bệnh nhân Hiện nay kỹ thuật này còn khá mới
mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền
2 Mục tiêu của đề tài
1 Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.
2 Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Bệnh lý di truyền là nhóm bệnh mặc dù không phổ biến như một sốnhóm bệnh khác nhưng thực tế cho thấy hàng năm có lượng lớn những
đứ trẻ sinh ra bị dị tật hoặc mắc các bệnh lỹ di truyền Hemophilia A làbệnh khó điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sức khỏe, tinh thầncũng như chất lượng cuộc sống Vì vậy vấn đề đặt ra là phải giải quyếtsớm nhất nhằm giảm tỷ lệ sinh con bị bệnh Bệnh hemophilia A di truyềnqua nhiều thế hệ và nhiều người mắc bệnh trong cùng gia đình.Việc xácđịnh đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh là cần thiết để
có tư vấn thích hợp giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh Chẩnđoán trước sinh là biện pháp được thực hiện phổ biến ở Việt Nam chobệnh lý di truyền nói chung, bệnh hemophilia A nói riêng giúp cho các bà
mẹ có khả năng sinh những đứa con khỏe mạnh, kỹ thuật này rẻ tiền, tuynhiên việc sinh con khỏe mạnh còn phụ thuộc vào xác suất ngẫu nhiên
Trang 3của những lần mang thai, trong trường hợp thai nhi bị bệnh phải đình chỉthai nghén ở những tuổi thai lớn hơn 17 tuần vì vậy ảnh hưởng đến tâmsinh lý và sức khỏe người mẹ Chẩn đoán trước làm tổ sẽ giúp chủ độngchọn phôi không bị bệnh để cấy vào buồng tử cung Nghiên cứu này đã
sử dụng kỹ thuật microsatellite DNAtrong chẩn đoán trước làm tổ bệnhhemophilia A Đây là kỹ thuật gián tiếp phát hiện các alen đột biến dị hợp
tử mà không cần xác định các đột biến trực tiếp
4 Cấu trúc luận án
- Luận án được trình bày trong 139 trang (không kể tài liệu thamkhảo và phần phụ lục) Luận án được chia làm 6 phần:
+ Đặt vấn đề: 3 trang
+ Chương 1: Tổng quan tài liệu 42 trang
+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 18 trang+ Chương 3: Kết quả nghiên cứu 45 trang
+ Chương 4: Bàn luận 30 trang
+ Kết luận: 1 trang
+ Kiến nghị: 1 trang
Luận án gồm 4 bảng, 35 hình Sử dụng 107 tài liệu tham khảo gồm tiếng Việt và tiếng Anh Phần phụ lục gồm: Bảng mã acid amin, Bảng
tổng kết sử dụng 4 marker khuếch đại cho 112 thành viên ( bệnh nhân +
người nhà bệnh nhân) và danh sách 35 bệnh nhân hemophilia A và 77
thành viên nữ gia đình hemophilia A
Trang 4Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A
1.1.1 Định nghĩa
Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bấtthường chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương - thiếuhụt yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây bệnhhemophilia B, thiếu hụt yếu tố XI gây bệnh hemophilia C Bệnhhemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất
1.1.2 Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán xác định
- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu
- Dựa vào tiền sử gia đình
- Dựa vào xét nghiệm máu:
+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (Prothrombin Time: thời gianprothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (ActivatedPartial Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạthóa) kéo dài > 1,5 giá trị bình thường
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40% + Yếu tố Von Willebrand bình thường
+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.
Trung bình
(Chiếm 15%) 1-5% (0,01-0,05)
Chảy máu tự nhiên hoặc liênquan đến chấn thương nhỏ.Chảy máu nặng sau chấnthương, phẫu thuật
Nhẹ
(Chiếm 15%) > 5-40% (0,04-0,4)
Chảy máu sau chấn thươnglớn hoặc phẫu thuật
Trang 51.2 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A 1.2.1 Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A
Đây là một bệnh di truyền liên kết với giới tính: Ở nam chỉ có mộtNST giới tính X nên nếu NST giới tính X mang gen bệnh thì lượng yếu
tố VIII tạo ra không đủ và người đó bị bệnh hemophilia A Đối với nữgiới nhờ có hai NST X nên nếu một NST X mang gen bệnh thì genbình thường trên NST còn lại vẫn tổng hợp yếu tố VIII bình thường.Người phụ nữ không bị bệnh nhưng mang một gen bị bệnh sẽ truyềncho con trai và người con trai sẽ bị bệnh, nếu truyền cho con gái thìngười con gái sẽ trở thành người mang gen bệnh
Hình 1.1: Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường
Hình 1.2: Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh 1.2.2 Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A
Trang 6Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho thấy nhữnghiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein yếu tốVIII, mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh Hemophilia
A và các dạng đột biến gen F8 gây bệnh
Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò làđồng yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca2+ vàphospholipid tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sựhình thành thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố địnhfibrin từ fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng vớitiểu cầu và yếu tố thành mạch.Việc thiếu hụt hoặc bất thường chức năngyếu tố VIII làm ngừng trệ dòng thác đông máu theo con đường nội sinh,dẫn đến tình trạng chảy máu kéo dài, không cầm ở bệnh nhânhemophilia A
1.3 NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A
Hemophilia A là bệnh rối loạn di truyền do gen lặn nằm trên nhiễmsắc thể giới tính X, gây nên do đột biến yếu tố VIII Việc chẩn đoánngười lành mang gen bệnh là rất quan trọng để ngằn ngừa sự ra đờicủa những đứa trẻ bị bệnh hemophilia A
1.3.1 Đặc điểm chung người mang gen bệnh
Người lành mang gen bệnh là người mang một nhiễm sắc thể X cóđột biến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình thường Biểu hiện lâmsàng có thể nặng hoặc nhẹ
Vì vậy người phụ nữ chắc chắn mang gen bệnh khi có một trong cácđiều kiện: Có bố bị bệnh hemophilia A; Có ít nhất hai con trai bị bệnhhemophilia A; Có một con trai bị bệnh hoặc có câu hoặc em trai bịbệnh hoặc một người đàn ông có quan hệ huyết thống bị bênhhemophilia A; Có một người con trai bị bệnh và trong gia đình chắcchắn có một người phụ nữ mang gen bệnh
Người phụ nữ có khả năng mang gen bệnh khi có ít nhất một ngườibên họ ngoại bị bệnh nhưng không có con bị bệnh, hoặc có một con trai
bị bệnh Hemophilia A mà không có thành viên nào khác bị bệnh 1.4 PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)
VÀ QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ (PGD)
1.4.1 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)
Sự thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm đượcđánh dấu bằng sự ra đời của đứa trẻ đầu tiên theo phương pháp này vàonăm 1978 Tính trung bình ở các nước như Thụy Điển, Úc và Hoa Kỳ
Trang 7thì cứ khoảng 50-80 trẻ thì có một trẻ được sinh ra bằng phương phápthụ tinh trong ống nghiệm Hàng năm có khoảng hơn 120 nghìn cặp vợchồng ở Hoa Kỳ thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm Trong tương lai,
số trẻ ra đời bằng phương pháp này sẽ còn tăng cao bởi sự gia tăng độtuổi trung bình khi kết hôn, độ tuổi trung bình khi mang thai lần đầu và
sự gia tăng về tỷ lệ vô sinh của các cặp vợ chồng trên thế giới
1.4.2 Quy trình chẩn đoán gen trước làm tổ (PGD)
Kỹ thuật PGD hiện nay là một kỹ thuật hoàn chỉnh, cho phép cáccặp vợ chồng có nguy cơ truyền các bệnh lý di truyền cho con có thể có
cơ hội sinh con không mắc bệnh mà không phải chẩn đoán tiền sản saukhi mang thai và bỏ thai khi phát hiện bệnh lý ở thai Kỹ thuật PGD
dựa trên việc phát hiện các bất thường di truyền ở phôi (in-vitro) và chỉ
cấy trở lại vào lòng tử cung các phôi không có các bất thường về ditruyền
1.4.2.3 Chỉ định của chẩn đoán trước làm tổ
Ngày nay PGD được áp dụng để chẩn đoán cho khoảng 170 bệnh lýkhác nhau Càng ngày các nhà khoa học càng xác định được nhiều genliên quan đến các bệnh lý và xác định các dạng đột biến gây bệnh củacác gen này Điều này cho phép PGD chẩn đoán xác định các phôi không
có các gen bệnh để chọn lọc và cấy các phôi này vào tử cung Các đốitượng khi thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm được khuyến khích sử
dụng quy trình này bao gồm: i) Các cặp vợ chồng mang gen gây bệnh di truyền trên nhiễm sắc thể thường hoặc liên kết với nhiễm sắc thể giới tính ii) Những người có sự bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể như mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn và chuyển đoạn iii) Phụ nữ lớn tuổi, phụ
nữ tiếp xúc với hóa chất, phóng xạ… để tránh những bất thường về nhiễm sắc thể có thể xảy ra và di truyền cho con của họ iv) Phụ nữ có tiền sử xảy thai, thai lưu nhiều lần v) Các cặp vợ chồng đã được thực hiện phương pháp IVF trước đó nhưng không thành công mà không rõ nguyên nhân
1.4.3 Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng trong việc chẩn đoán trước làm tổ
1.4.3.1 PCR và Multiplex-PCR
PCR là kỹ thuật đầu tiên được áp dụng vào PGD bởi Handyside vàcộng sự vào năm 1990 khi xác định các đoạn trình tự lặp lại trên nhiễmsắc thể Y để xác định giới tính của phôi trong chẩn đoán các bệnh di
Trang 8truyền liên kết với NST giới tính và chuyển các phôi không mắc bệnhvào tử cung.
1.4.3.2 Fluorescence in situ hybridization (FISH)
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là kỹ thuật di truyền tế bào– phân tử, sử dụng đầu dò DNA gắn huỳnh quang lai với trình tự DNAđặc hiệu đích trên nhiễm sắc thể của tế bào ở gian kỳ hoặc các nhiễmsắc thể ở kỳ giữa, qua đó phát hiện được sự có mặt hay vắng mặt củamột đoạn gen nào đó bằng kính hiển vi huỳnh quang
1.4.3.3 Microsatellite DNA
Microsatellite DNA được phát triển dựa trên kỹ thuật PCR tiêu chuẩnvới việc sử dụng các primer có gắn huỳnh quang và máy giải trình tự gen(automated DNA sequencer) để xác định các sản phẩm PCR Với cácđầu dò huỳnh quang đặc hiệu cùng với kỹ thuật tăng cường hình ảnhthông qua máy vi tính nên các đoạn DNA khuếch đại gắn huỳnh quang
có thể được phát hiện ở nồng độ thấp hơn rất nhiều so với việc xác địnhDNA trên gel điện di agarose hay acrylamide Kỹ thuật này có độ chínhxác và độ tin cậy cao kể cả khi thực hiện phản ứng để xác định các genmang đột biến ở thể dị hợp tử Trong những năm gần đây, kỹ thuật nàyđược phát triển thêm một bước nữa khi sử dụng các marker đa hình(polymorphic marker) trên các nhiễm sắc thể để xác định sự có mặt củacác alen khác nhau Kỹ thuật này dựa trên các thông tin đa hình của cácđoạn trình tự lặp ngắn (short tandem repeat: STRs)
Trang 9CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu: 35 gia đình bệnh nhân hemophilia A:
- 35 bệnh nhân hemophilia A đã được xác định đột biến gen tạiTrung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
* Tiêu chuẩn chẩn đoán hemopphilia A:
+ Lâm sàng:
- Chảy máu: Chảy máu khó cầm sau chấn thương, va chạm hay chảymáu tự nhiên
- Vị trí: Chảy máu trong khớp, cơ hoặc một số vị trí khác
- Tính chất: Thường chảy máu tái phát
- Tiền sử: có tiền sử chảy máu kéo dài hoặc trong gia đình có ngườithân bị chảy máu khó cầm
+ Cận lâm sàng:
- APTT kéo dài
- Định lượng FVIII, IX giảm dưới 30%
- Thời gian máu chảy bình thường
- Số lượng tiểu cầu và độ tập trung tiểu cầu bình thường
- Prothrombin bình thường
- Yếu tố von Willebrand bình thường
* Tiêu chuẩn loại trừ:
+ Bệnh nhân mắc bệnh Von-Willebrand
+ Các bệnh lý di truyền gây kéo dài APTT: giảm yếu tố XI, XII, prekallikrelin.+ Bệnh lý lưu hành kháng FVIII: bệnh tự miễn (lupus)
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang
2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu
+ Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.+ Thời gian từ 12/2015 – 5/2018
Trang 102.4 Đạo đức trong nghiên cứu
Đề tài đã được thông qua Hội đồng đạo đức của Trường Đại học Y HàNội học theo Quyết định số số 187/HĐĐĐHYHN, ngày 20/02/2016
2.5 Kinh phí thức hiện đề tài
Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài nhánh
cấp nhà nước “Xây dựng quy trình chẩn đoán trước làm tổ bằng kỹ
thuật microsatellte DNA để sàng lọc một số bệnh lý di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính” thuộc thuộc chương trình KC04.17/11-15.
2.6 Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Thu thập thông tinbệnh nhân theo bệnh án nghiên cứu Kỹ thuật tách chiết DNA từ cácmẫu máu ngoại vi Kỹ thuật giải trình tự xác định đột biến gen, quytrình phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatelliteDna, Quy trình chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹthuật microsatellite DNA Quy trình nghiên cứu theo sơ đồ
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
Trang 11* Thiết kế nghiên cứu trên những gia đình làm PGD
Trang 12Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN F8 BỊ ĐỘT BIẾN BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA
3.1.1 Kết quả xác định marker dị hợp tử gen F8 trên bệnh nhân
và người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite DNA
FXS1108 DXS9897 F8int22 DXS9901 0.00%
Biểu đồ 3.1: Kết quả đồng hợp tử và đồng hợp tử của STR
Nhận xét: Kết quả cho thấy với việc sử dụng 4 marker FXS 1108,
DXS 9897, F8int22, DXS9901 thì hai marker DXS9897 và DXS9901 cho tỷ lệ dị hợp tử cao hơn 55,2% Vì vậy trong nghiên cứu sẽ ưu tiên sử dụng marker này trước.
3.1.2 Kết quả phát hiện người lành mang gen F8 bị đột biến bằng
kỹ thuật microsatellite DNA
Kết quả đối chiếu hai phương pháp xác định người lành mang genbệnh hemophilia A
Bảng 3.1 So sánh kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh
bằng 2 phương pháp