Nghiên cứu thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vawcsxin dại trên nuôi cấy tế bào vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm

12 Hình 1.6: Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng để sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào.. Tuy nhiên, theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước, trên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY

TẾ BÀO VERO SẢN XUẤT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHÁT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO SẢN XUẤT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Tuấn Đạt, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong công việc cũng như trong suốt quá trình học tập, và thực hiện các nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu, ban lãnh đạo Khoa, các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Sau Đại Học, Trường Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị em, các bạn đồng nghiệp phòng Công nghệ Cao, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, đã nhiệt tình giúp đỡ, cùng chia sẻ các kinh nghiệm và kiến thức trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi muốn được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên khích lệ, động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua

Học Viên

Mạc Văn Trọng

i

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bệnh dại 3

1.1.1 Sơ lược về lịch sử bệnh dại 3

1.1.2 Virút dại 5

1.1.3 Dịch tễ học bệnh dại 8

1.2 Vắcxin phòng bệnh dại 13

1.2.1 Các vắcxin thế hệ thứ nhất 13

1.2.2 Các vắcxin thế hệ thứ hai 16

1.2.3 Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại được đề cập nghiên cứu sử dụng trên thế giới 22

1.3 Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại VABIOTECH 27

1.3.1 Tế bào Vero dùng trong sản xuất vắcxin dại 27

1.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại VABIOTECH 29

1.3.3 Căn cứ và cơ sở thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 31

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36

2.1 Đối tượng nghiên cứu 36

2.2 Vật liệu nghiên cứu 36

2.2.1 Hóa chất 36

2.2.2 Vắcxin, sinh phẩm, động vật thí nghiệm 38

2.2.3 Trang thiết bị 38

2.2.4 Dụng cụ 40

2.3 Phương pháp nghiên cứu 41

2.3.1 Các phương pháp kiểm tra hóa lý 41

2.3.1.1 Kiểm tra tính chất vật lý 41

2.3.1.2 Kiểm tra pH 41

2.3.1.3 Kiểm tra hàm lượng Thimerosal 42

2.3.1.4 Kiểm tra hàm lượng Protein 44

2.3.1.5 Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư 44

2.3.1.6 Kiểm tra hàm lượng nhôm 47

2.3.2 Các phương pháp kiểm tính an toàn và công hiệu 48

2.3.2.1 Kiểm tra vô khuẩn 48

2.3.2.2 Chuẩn độ hiệu giá virút dại trên chuột (LD50/ml) 48

2.3.2.3 Chuẩn độ hiệu giá virút dại bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsid của virút dại ( FFD50/0,05ml) 49

2.3.2.4 Chuẩn độ hiệu giá virút dại bằng phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên Glycoprotein của virút dại ( EL.U/ml) 52

2.3.2.5 Kiểm tra chất gây sốt 54

2.3.2.6 Kiểm tra an toàn chung chuột nhắt và chuột lang 54

2.3.2.7 Kiểm tra an toàn đặc hiệu 55

2.3.2.8 Kiểm tra công hiệu 56

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 60

3.1 Kết quả kiểm tra các thành phần hóa lý trong kiểm định vắcxin dại tế bào 60

3.1.1 Kiểm tra tính chất vật lý 60

3.1.2 Kiểm tra pH 61

Tiến hành kiểm tra pH vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào ở các giai đoạn chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.1 dưới đây 61

3.1.3 Kiểm tra hàm lượng Thimerosal 62

3.1.4 Kiểm tra hàm lượng protein tổng số 63

3.1.5 Kiểm tra hàm lượng nhôm 65

3.1.6 Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư 66

3.2 Kết quả kiểm tra tính an toàn và công hiệu trong kiểm định vắcxin dại tế

iii

bào 68

3.2.1 Kiểm tra vô khuẩn 68

3.2.2 Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dại 70

3.2.3 Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên glycoprotein virút dại 74

3.2.4 Kết quả kiểm tra chất gây sốt 75

3.2.5 Kết quả kiểm tra an toàn chung 77

3.2.6 Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu 79

3.2.7 Kết quả kiểm tra công hiệu 81

3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin dại tế bào 82

3.3.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về thành phần hóa học 82

3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về tính an toàn và công hiệu 85

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91

4.1 Kết luận 91

4.2 Kiến nghị 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ABLV Australian Bat Lyssavirus

ADN Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic ARN Ribonucleic Acid Axit Ribonucleic

ASEAN Association of South East Asian

CPE Cytopathic effect Huỷ hoại tế bào

CVS Challenge Virus Strain Chủng virút thử thách

DĐVN Dược điển Việt Nam

EBLV European Bat Lyssavirus

ED50 Effective Dose 50 Liều bảo vệ 50%

EIA Enzyme Immunoassay

ELISA Enzyme - linked Immunosorbent

Assay FAT Fluorescent antibody test

FAVN Fluorescent antibody virus

neutralization FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bê

v

Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

FFD50 Focus Forming Dose 50%

GMP Good Manufacturing Practices Thực hành sản xuất tốt HGKT Hiệu giá kháng thể

IU International Unit Đơn vị Quốc tế

kDa KiloDalton

LD50 Lethal Dose Liều gây chết 50%

mARN Messenger RNA ARN thông tin

MCB Master Cell Bank Ngân hàng tế bào giống gốc MEM Minimum Essential Media

NICVB National Institute for Coltrol of

Vaccine and Biological

Viện Kiểm định quốc gia vắcxin và sinh phẩm y tế

NIH National Institute Of Health Viện sức khỏe quốc gia Hoa

Kỳ PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

PV Pasteur virus

RFFIT Rapid fluorescent focus inhihition

test

RT-PCR Reverse Transcription polymerase

chain reaction PCR phiên mã ngược

SRID Single Radial Immunodiffusion Phương pháp miễn dịch

khuếch tán đơn SSC Saline - sodium citrate

Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

TCA Trichloroacetic acid

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Số người tiêm vắcxin dại và số ca tử vong do bệnh dại tại Việt Nam

1991-2016 10

Bảng 1.2: Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y 13

Bảng 1.3: Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất 19

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra pH vắcxin dại tế bào 61

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng Thimerosal 63

Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra hàm lượng nhôm 65

Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư BTP tinh khiết vắcxin dại tế bào 67

Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra vô khuẩn 68

Bảng 3.6: Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dại 71

Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra chất gây sốt 76

Bảng 3.8: Tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu hoá lý 83

Bảng 3.9: Tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu an toàn và công hiệu 85

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc hạt virút dại 7

Hình 1 2: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virút dại 8

Hình 1.3: Lưu hành bệnh dại trên thế giới năm 2017 9

Hình 1.4: Phân bố tỷ lệ chết do dại/100000 dân theo khu vực giai đoạn 1996-2017 12

Hình 1.5: Phân bố số ca bệnh dại theo tỉnh năm 2017-2018 12

Hình 1.6: Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng để sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào 18

Hình 1.7: Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Vabiotech 29

Hình 3.1: Kết quả kiểm tra tính chất vật lý Vắcxin dại tế bào ở các giai đoạn 60

Hình 3.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng Protein tổng số vắcxin dại tế bào BTP tinh khiết 644

Hình 3.3:Hình ảnh kiểm tra hàm lượng AND tồn dư loạt sản xuất 0314 67

Hình 3.4: Hình ảnh ống thử nghiệm vô khuẩn vắcxin loạt 0215 trước và sau 14 ngày theo dõi 69

Hình 3.5: Hình ảnh chuột liệt do virus dại và hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào vero dưới kính hiển vi huỳnh quang trong các thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá 73

Hình 3.6: Kết quả xác định hàm lượng glycoprotein 75

Hình 3.7: Đồ thị phân tích tổng nhiệt tăng của các loạt 77

Hình 3.8: Kết quả kiểm tra an toàn chung vắcxin dại tế bào thành phẩm 78

Hình 3.9: Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu BTP sau bất hoạt và BTP tinh khiết vắcxin dại tế bào 80

Hình 3.10: Kết quả kiểm tra công hiệu vắcxin dại tế bào 81

1

MỞ ĐẦU

Bệnh dại là bệnh nhiễm virút cấp tính của hệ thống thần kinh trung ương do virút thuộc họ Rhabdoviridae, giống Lyssavirus từ động vật lây sang người bởi chất tiết, thông thường là nước bọt của chó bị nhiễm virút dại Hầu hết các trường hợp bị nhiễm virút dại đều qua vết cắn, vết liếm trên da, niêm mạc bị tổn thương Kể cả người và động vật khi đã bị bệnh dại đều dẫn tới tử vong Bệnh dại thuộc nhóm B trong Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm [2], [5], [6] Bệnh dại phổ biến trên toàn cầu, cả ở châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Mỹ La tinh, trừ một số vùng không

có bệnh dại như Vương quốc Anh, Nhật Bản, vùng Bắc cực, châu Đại Dương được gọi là những vùng đất “biệt lập” Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) hàng năm có khoảng 55000 - 70000 người chết vì bệnh dại, trong đó hơn 90% được thông báo từ các nước đang phát triển ở châu Phi và châu Á Ở Đông Nam Á (ASEAN) bệnh dại đang có xu hướng diễn biến phức tạp và có chiều hướng gia tăng trong những năm gần đây [2], [6] Bệnh dại chưa có thuốc điều trị đặc hiệu,

do đó biện pháp tiêm vắcxin phòng bệnh dại để chủ động gây miễn dịch là phương thức hữu hiệu nhất trong phòng và điều trị bệnh dại hiện nay

Tại Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu

là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple) Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch

tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp) Tuy nhiên, theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước, trên 80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida có các phản ứng không mong muốn, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10000 mũi tiêm, nên từ năm

2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của Hãng Aventis Pasteur Tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm

loại vắcxin này rất đắt do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế Do vậy, phát triển các vắcxin dại cho người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp bách hiện nay

Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật

và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin dại, công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã nghiên cứu phát triển thành công quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm Theo yêu cầu của các cơ quan quản lý, các nhà sản xuất thuốc và dược phẩm sinh học nói chung phải kiểm soát tối đa các sản phẩm, đảm bảo được chất lượng và các tiêu chuẩn kĩ thuật. Nhằm quản lý và đảm bảo chất lượng tốt tất cả các công đoạn trong quy trình sản xuất cũng như đảm bảo

về an toàn và công hiệu cho người sử dụng vắcxin dại sản xuất trên nuôi cấy tế bào Vero thì yêu cầu cấp bách đặt ra là cần thiết lập được các phương pháp cũng như đưa ra các tiêu chuẩn trong kiểm định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên tế bào Vero, do vậy chúng tôi thực hiện đề tài

"Nghiên cứu thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm"

Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài

1 Thiết lập được các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm bằng cách tiến hành các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại đã được khuyến cáo bởi các tổ chức (WHO, DĐVN4) ở điều kiện kiểm tra thực tế

2 Xây dựng được bảng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh dại

1.1.1 Sơ lược về lịch sử bệnh dại

Bệnh dại là một trong những căn bệnh cổ xưa nhất của động vật có thể truyền sang người một cách rủi ro khi có tiếp xúc với virút dại qua da hoặc niêm

mạc bị tổn thương Bệnh dại (rabies) xuất phát từ chữ Latin có nghĩa là “cuồng

bạo, điên rồ” Những người Hy Lạp cổ đã mô tả bệnh dại bằng từ lyssa nghĩa là

“chứng điên khùng, rồ dại” Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ cấp và viêm màng não

nguyên phát của động vật có vú Bệnh có thể truyền sang người qua niêm mạc hoặc

da bị tổn thương Từ hàng nghìn năm trước công nguyên, những người thầy thuốc

cổ phương Đông đã viết về căn bệnh tương tự bệnh dại – bệnh sợ nước, sợ gió mà chó và người mắc phải Bệnh dại cũng được người da đỏ, người Ả rập và người Do Thái cổ đề cập trong y văn với 5 dấu hiệu bệnh dại ở chó: mõm há, chảy nước dãi, tai rủ, đuôi cụp, giọng khàn và khuyến cáo nếu gặp các con vật có biểu hiện này phải tiêu diệt ngay bằng cung tên Ở Ai Cập, Hy Lạp, La Mã người ta coi bệnh dại là sự trừng phạt của thượng đế vì sự bí mật của căn nguyên gây bệnh cũng như sự khủng khiếp của các triệu chứng lâm sàng [2], [5], [6]

Một trăm năm sau công nguyên, Celse đã biết rằng độc tố đã được truyền từ chó sang người và muốn loại bỏ độc tố này cần phải đốt vết thương bằng que sắt nung đỏ Hai trăm năm sau công nguyên, Galien đã đề ra phương pháp phẫu thuật cắt bỏ phần cơ thể bị vết cắn để ngăn ngừa sự phát bệnh dại Đầu thế kỷ 19, Zinke đã chứng minh được tính lây nhiễm có trong nước dãi của chó dại Tại viện Lion, Galtier đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm trên thỏ và thử nghiệm gây miễn dịch cho cừu bằng cách tiêm nước bọt của con vật bị bệnh dại vào tĩnh mạch cón vật lành Năm 1884, Louis Pasteur đã thành công trong việc nghiền não tuỷ của chó mắc bệnh dại sau đó gây nhiễm dưới màng cứng não thỏ Tiếp tục nghiền não thỏ đã gây nhiễm truyền cho thỏ tiếp theo

và cứ tiếp tục như vậy sau hơn 100 lần tiêm truyền liên tiếp trên não thỏ ông đã thu được chủng virút có thời gian ủ bệnh thu ngắn và cố định 6 - 7 ngày, ông gọi đó là

“virút dại cố định” Pasteur cũng đã phát minh ra phương pháp bất hoạt virút dại gây nhiễm não tuỷ thỏ bằng cách làm khô dưới KOH tinh thể Ông đã dùng não tuỷ thỏ bất hoạt này tiêm cho chó, sau đó dùng virút dại sống thử thách cho những con chó này và kết quả thí nghiệm đã giúp Pasteur tìm ra cách sản xuất vắcxin dại Ngày 6 tháng 7 năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vắcxin não thỏ bất hoạt tiêm cho cậu bé 9 tuổi Joseph Meister, bị một con chó lên cơn dại cắn nhiều vết Sau khi được tiêm 13 mũi vắcxin dại của Pasteur, cậu bé đã được cứu thoát khỏi bệnh dại Trong vòng một năm sau đó có khoảng 2500 người bệnh đã được điều trị bằng vắcxin này và chỉ có 12 người bị chết [5], [6]

Vào những năm 80, ứng dụng tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và sự phát triển của công nghệ sinh học người ta đã sử dụng kỹ thuật kháng thể đơn dòng để chẩn đoán các chủng virút dại gây bệnh ở người và động vật Bằng kỹ thuật PCR, sequencing người ta đã có thêm nhiều hiểu biết về trật tự sắp xếp các gen và trình tự nucleotide của virút dại Hiện nay, chẩn đoán bệnh dại trên người chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh và tiền sử phơi nhiễm với virút dại Chẩn đoán xác định bệnh dại bằng các kỹ thuât xét nghiệm: phát hiện kháng nguyên (FAT), phân lâp virút, kỹ thuât sinh học phân tử (RT-PCR), phát hiện kháng thể (ELISA, RFFIT, FAVN) Tuy nhiên, trên thực tế do tính nguy hiêm của bệnh dại, nên khi bị động vât nghi dại cắn, ngươi bệnh phải được giám sát

và điều trị dự phòng khẩn cấp mà không chờ chẩn đoán xác định bệnh dại ở động vât bằng xét nghiệm [2], [6]

Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và vết cào xuyên da của động vật nhiễm Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất lây nhiễm thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn thương da mới của nạn nhân Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết có chứa virút hoặc cấy ghép phủ tạng nhiễm bệnh

Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến vài

5

tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm Thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn thương và vị trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập [17], [59]

Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ư ơng qua các dây thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ virút nhân lên và phát tán ngược trở ra hệ thống thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt Virút dại lan truyền đến toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên lúc đó cơ thể không

có được đáp ứng miễn dịch với virút [56]

Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ dựa trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình dịch tễ của bệnh trên động vật Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng thở ngừng tim Bệnh dại gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến triển ít trầm trọng hơn tuy nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong Dạng bệnh dại này thường bị chẩn đoán nhầm là bệnh lý khác [59]

Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh được nguy cơ tử vong Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ dơi được cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc kháng virút nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng trên một số bệnh nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [56]

1.1.2 Virút dại

Virút dại thuộc họ Rhabdoviridae, chi Lyssavirus, có vât liệu di truyền

là ARN, vỏ ngoài là lipid Có hơn 100 chủng phân bố trong tự nhiên có thể gây nhiễm cho động vật và thực vật Virút dại có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ; dễ bị phá hủy bởi các chất hòa tan lipid (xà phòng, ether, chloroform,

acetone); rất nhạy cảm với tia cực tím và bị bất hoạt nhanh chóng trong dung dịch

cồn và cồn iốt [2], [5], [6] Trong chi Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút

hoang dại ở chó, mèo… và các chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên trong 7 genotype của nhóm Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh

ở động vật, tuy nhiên đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở

người như nhiễm Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu

(EBLV) [50], [56]

Hình thái:

Virút dại có hình viên đạn một đầu tròn, đầu kia dẹt với đường kính trung bình 75 nm, chiều dài dao động từ 100 - 300 nm Sự thay đổi về độ dài phản ánh sự hiện diện các hạt trung gian có cấu trúc không hoàn chỉnh với độ dài ngắn hơn khoảng từ 20 - 50% so với hạt virút hoàn chỉnh Các hạt trung gian có bộ gen bị cắt xén và vì thế thiếu hụt một số chức năng của virút, chúng nhân lên một cách nhanh chóng và cạnh tranh tích cực với các virút có bộ gen bình thường trong quá trình tạo thành lớp vỏ bao [6]

Cấu trúc:

Cấu trúc virút dại gồm lõi bên trong là chuỗi xoắn ribonucleoprotein, bao bọc bên ngoài là một lớp vỏ lipoprotein gồm 2 màng mỏng phospholipid Trên bề mặt có những protein G tạo những chồi gai có chiều dài 10 nm (Hình 1.1) Đây là kháng nguyên chủ yếu kích thích cơ thể tạo ra kháng thể trung hoà và là ngưng kết

tố hồng cầu Thành phần hoá học của virút dại gồm có 67% protein, 26% lipid, 1% ARN và 3% cacbonhydrat [6]

7

Hình 1.1: Cấu trúc hạt virút dại

Các protein cấu trúc của virút dại:

Mỗi hạt virút dại gồm có ARN sợi đơn và 5 protein [6]

1 Protein L (180 kDa) là ARN polymerase phụ thuộc ARN, hoạt động như một emzym trong quá trình tổng hợp ARN

2 Glycoprotein: Protein G (62-67 kDa) có hai đoạn kỵ nước tạo khả năng xuyên màng của virút, chịu trách nhiệm tiếp xúc, nhận biết và gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào cảm thụ Protein G có vai trò sinh bệnh học của virút dại, chúng tạo nên khả năng ái tính với tế bào thần kinh, kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể trung hoà và ngưng kết hồng cầu

3 Nucleoprotein N: (54 Da) Protein N đóng vai trò cấu trúc chính trong quá trình tạo vỏ cho ARN gen và bảo vệ bộ gen Ngoài ra, nó còn có thể điều hoà sự cân bằng giữa phiên mã và sao mã Protein N là protein có tính bảo tồn nhất trong các protein của virút dại, trình tự nucleotide của gen mã hoá cho protein N có độ tương đồng cao trong cùng một genotype, nhưng lại rất khác nhau giữa các genotype khác nhau Chính vì vậy mà gen N được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh dại bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đồng thời cũng được sử dụng để nghiên cứu sự

tiến hoá cũng như dịch tễ học phân tử của nhóm Lyssavirrus

4 Phosphoprotein NS hay M1 (37 kDa): Protein M có vai trò điều hoà ARN polymerase phụ thuộc ARN trong quá trình polymer hoá

5 Protein màng M2: (24 kDa) protein M2 chịu trách nhiệm về hình thái và tiếp xúc qua lại với protein của tế bào

Cấu trúc hệ gen:

Hệ gen của virút dại là một chuỗi ARN sợi âm, không phân nhánh có hằng số lắng 45S và trọng lượng phân tử 4,6 x 106 Dalton, chứa khoảng 12000 nucleotide Sợi ARN chứa 5 gen có trật tự sắp xếp được bắt đầu từ 3’-N-M1-M2-G-L-5’ ARN sợi âm không có khả năng trực tiếp dịch mã tổng hợp protein của virút

mà phải thông qua việc tổng hợp ARN sợi dương bổ trợ (mARN)

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virút dại

ARN của virút dại không có khả năng lây nhiễm ARN genome của chủng

PV (Pasteur virus) có 11932 nucleotide, 58 nucleotide đầu tiên từ vị trí 3’ của toàn

bộ genome là vùng không mã hóa và cũng chính là vùng mở đầu sao chép Vùng

mở đầu sao chép này được hoạt hóa bởi bộ ba N, P và L protein Ngay sau khi vùng

mở đầu sao chép được phiên mã thì 5 mARN mã hóa cho 5 protein cấu trúc của virút là N, M1, M2, G và L lần lượt được tổng hợp và cuối cùng là vùng đuôi không

mã hóa gồm 70 nucleotide tận cùng ở phía đầu 5’ [6], [50], [56]

9

Bắc Cực, Úc hay châu Đại Dương là những vùng đất “biệt lập” Theo thống kê của

TCYTTG, hàng năm có khoảng 60000 người chết vì bệnh dại (99% trường hợp tử

vong này là do lây truyền virút dại từ chó, cứ 10 người chết vì bệnh dại thi có tới 4 trẻ em dưới 15 tuổi, 95% ca tử vong là ở châu Á và châu Phi) và 15 triệu người bị

phơi nhiễm bệnh dại phải đi điều trị dự phòng (trong đó 40% là trẻ em từ 5-14 tuổi

ở các nước châu Á và châu Phi), gây tổn thất kinh tế toàn cầu ước tính là 8,6 tỷ đô

la Mỹ mỗi năm Cũng theo TCYTTG, nếu không được điều trị dự phòng, con số tử vong có thể lên tới hơn 330 nghìn ngươi mỗi năm chiếm tới 80% số ca tử vong vì

bệnh này trên toàn thế giới Số ca tử vong tâp trung ở các nước đang phát triển thuộc khu vực Châu Phi (40%), Châu Á (55%) Các nước có số ca tử vong do bệnh dại cao là Ấn Độ (20000 ngươi), Trung Quốc (3300), Băng-la-đét (1500), Nê-pan (200) Trong khu vực Đông Nam Á, 8/11 nước có lưu hành bệnh dại (trừ Sing-ga-

po, Ma-lai-xi-a và Brunei) Từ năm 2004 đến nay bệnh dại tại các nước Châu Á, đặc biệt khu vực Đông Nam Á đang có chiều hướng gia tăng, diễn biến phức tạp Ở Châu Á, mỗi năm có khoảng 26 triệu người được điều trị dự phòng sau phơi nhiễm,

trong đó riêng Trung Quốc là 15 triệu

Hình 1.3: Lưu hành bệnh dại trên thế giới năm 2017

Tại châu Âu số lượng người đi điều trị dự phòng hằng năm chỉ khoảng

71500 người, bệnh dại chủ yếu xảy ra ở các nước CHLB Đức, Áo, Thuỵ Sĩ, Pháp,

Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Tiệp Khắc, Hung Ga Ry Các quốc gia này mặc dù thường

xuyên liên tục thực hiện chương trình giám sát ổ dịch bệnh dại tự nhiên và dự phòng bằng vắcxin cho động vật hoang dã, súc vật nuôi, nhưng hàng năm vẫn có tới hàng chục nghìn người phải tới khám và phải sử dụng 1,2 triệu liều vắcxin tại các

trung tâm phòng dại [2], [6]

Trong nước

Ở Việt Nam, bệnh dại chủ yếu tập trung ở đồng bằng sông Hồng và sông

Mê Kông Hàng năm có khoảng 350000 – 650000 người phải tiêm phòng vắcxin Mặc dù công tác điều trị dự phòng dại cho người sau phơi nhiễm với động vât nghi mắc bệnh dại đã được tổ chức thực hiện ở nhiều địa phương, tuy nhiên hàng năm vẫn còn nhiều người tử vong do bệnh dại Kết quả giám sát bệnh dại của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (VSDTTƯ), Bộ Y tế (Bảng 1.1) cho thấy liên tục trong 25 năm qua, năm nào cũng có người chết do bệnh dại và số người chết do bệnh dại hàng năm luôn giữ vị trí cao nhất so với số ca tử vong của các bệnh truyền nhiễm

gây dịch ở Việt Nam [2]

Bảng 1.1: Số người tiêm vắcxin dại và số ca tử vong do bệnh dại tại Việt Nam

1991-2016 Năm Số người

tiêm vắcxin

Số ca tử vong

Ghi chú

1991 87.625 282 - Chết vì bệnh dại: tổng 5 năm có: 2001

người chết; trung bình 400 ca/năm

- Tiêm vắcxin dại: 1.167.238 người; trung bình: 233.448 người/năm

người chết; trung bình 152 ca/năm

- Tiêm vắcxin dại: 2.649.757 người; trung bình: 529.951 người/ năm

1997 537.228 160

1998 487.680 129

1999 569.558 94

2000 568.166 90

11

Năm Số người

tiêm vắcxin

Số ca tử vong

Ghi chú

2001 552.653 65 - Chết vì bệnh dại: Tổng 5 năm có: 314

người chết; trung bình 63 ca/năm

- Tiêm vắcxin dại: 3.018.624 người; trung bình: 603.725 người/ năm

người chết; trung bình 90 ca/năm

- Tiêm vắcxin dại: 1.981.249 người; trung bình: 396.250 người/ năm

người chết; trung bình 92 ca/năm

- Tiêm vắcxin dại: 1.900.409 người; trung bình: 380.082 người/ năm

Tỷ lệ tử vong do bệnh dại tính trên 100000 dân, cao nhất ở giai đoạn

1991-1995 là 0,43 Giai đoạn 1996-2003, thực hiện chỉ thị 92/TTg của Thủ tướng Chính phủ công tác phòng chống bệnh dại được quan tâm hơn nên tỷ lệ tử vong

giảm xuống còn 0,04/100000 dân (Hình 1.4) Tuy nhiên từ năm 2004 đến nay, tỷ lệ

tử vong do bệnh dại có xu hướng gia tăng trở lại Mỗi năm có khoảng 100 ca tử vong và trên nửa triệu người phải tiêm phòng mỗi năm, gây tổn thất to lớn về

tính mạng, sức khỏe nhiều người [2]

Hình 1.4: Phân bố tỷ lệ chết do dại/100000 dân theo khu vực

giai đoạn 1996-2017

Trong năm 2017, cả nước có 74 trường hợp người bị tử vong do bệnh dại Báo cáo tình hình bệnh dại những năm gần đây cho thấy bệnh dại gây tử vong trên người nhiều nhất ở các tỉnh miền núi phía Bắc và Bắc Trung bộ Các tỉnh có số

ca bệnh dại cao nhất từ 2004-2017 là các tỉnh: Phú Thọ, Tuyên Quang, Yên Bái,

Thái Nguyên, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Hà Giang, Nghệ An, Bình Thuận, Hà Nội (khu vực Hà Tây cũ), Đắc Lắc, Gia Lai, [2], [6]

Hình 1.5:Phân bố số ca bệnh dại theo tỉnh năm 2017-2018

Kết quả theo dõi và giám sát bệnh dại trên người trong các năm gần đây cho thấy: trong số người đến tiêm vắcxin dại có 89,2% là do chó nhà cắn người;

13

8,7% do mèo cắn, 1,6% do tiếp xúc với chó và 0,5% là do các con vật khác như chuột, khỉ cắn Bệnh dại có thể xảy ra quanh năm, tuy nhiên bệnh thường tăng cao vào mùa nắng nóng từ tháng 5 đến tháng 8 hàng năm Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, nhưng nhiều nhất là ở trẻ em dưới 15 tuổi (chiếm trên 40%) và hầu hết các trường hợp chết do bệnh dại đều không tiêm vắcxin và 98% số ca mắc bệnh này

là do bị chó nhà cắn hoặc do tiếp xúc như chăm sóc chó ốm, mổ chó Số còn lại

là do mèo dại cắn và cho đến nay chưa phát hiện được trường hợp tử vong nào do

động vật hoang dã gây nên [2]

1.2 Vắcxin phòng bệnh dại

Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi bị cắn dựa trên việc bất hoạt virút trên mô thần kinh Từ đây trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng trên thế giới

1.2.1 Các vắcxin thế hệ thứ nhất

Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn dịch chứa virút Các vắcxin này đều đã được sử dụng rộng rãi cho cả người và động vật Các loại vắcxin dại chủ yếu thuộc thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y được trình bày trong Bảng 1.2 [31], [40]

Bảng 1.2: Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y

Mô được sử

dụng

Chủng virút

Loại vắcxin

Phương pháp bất hoạt

Sử dụng cho người

Dạng vắcxin

Mô được sử

dụng

Chủng virút

Loại vắcxin

Phương pháp bất hoạt

Sử dụng cho người

Dạng vắcxin

Giảm độc lực -

Không (chỉ

sử dụng cho chó)

Đông khô

Phôi gà FluryHEP Giảm

độc lực -

Không (sử dụng cho gia súc, mèo)

Đông khô

Dựa trên các loại mô được sử dụng để sản xuất khác nhau, các vắcxin thế hệ thứ nhất có thể được xếp loại theo:

15

Vắcxin sản xuất từ mô thần kinh động vật trưởng thành

Các vắcxin này có rất nhiều các nhược điểm như:

Còn virút sống tồn dư: các vắcxin như vắcxin Fermi thường có chứa virút sống do chưa được bất hoạt hoàn toàn bởi phenol nên được coi như là vắcxin hỗn hợp có cả virút sống tồn dư và virút đã bất hoạt, do vậy vắcxin này nguy hiểm khi

sử dụng

Phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin: một số vắcxin thuộc nhóm này như vắcxin Semple và vắcxin Hempt tuy đã được bất hoạt hoàn toàn và đáp ứng được yêu cầu về mặt công hiệu nhưng những phản ứng não tủy nghiêm trọng do tiêm vắcxin vẫn xảy ra trong hoặc sau khi tiêm phòng Phản ứng do yếu tố gây phản ứng trong não (một protein cơ bản liên quan đến myelin) tăng cao khi sử dụng các mô thần kinh động vật trưởng thành Những phản ứng này là các tai biến liệt thần kinh từ liệt nhẹ thoáng qua đến các thương tổn thần kinh vĩnh viễn và thậm chí là tử vong

Hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp: đặc tính này đòi hỏi phải

có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm Các vắcxin này thường được đóng dưới dạng dung dịch nên có tính ổn định thấp chỉ trong vòng gần

6 tháng [31]

Vắcxin sản xuất trên trứng có phôi

Thích ứng các chủng vắcxin dại trên trứng có phôi (chủng Pitman Moore)

đã phát triển được các vắcxin dại sử dụng cho người an toàn hơn, giảm thiểu các phản ứng não tủy sau tiêm vắcxin Tỷ lệ có các phản ứng thần kinh thấp hơn (dưới 3/100000 mũi tiêm) ở các vắcxin dùng cho người được sản xuất trên phôi vịt

so với các vắcxin được sản xuất trên mô thần kinh Tuy nhiên các phản ứng tại chỗ lại rất hay gặp như có đến 70% gặp ở các liệu trình tiêm vắcxin dự phòng và 100% ở các liệu trình tiêm điều trị với 14 liều tiêm Tính sinh miễn dịch của loại vắcxin này cần được xem xét thêm do trong một số trường hợp lượng kháng thể đạt được rất thấp Các chủng virút cố định Flury và Kelev đã thích ứng trên phôi gà

được cấy chuyển nhiều đời (180 đối với Flury và 70 đối với Kelev) tạo ra các chủng virút giảm độc lực Các vắcxin sản xuất với các chủng giảm độc lực trên phôi gà đã được sử dụng cho chó, mèo và bò

Trứng có phôi sử dụng trong sản xuất vắcxin đòi hỏi một chất lượng rất cao, phải đảm bảo loại trừ được tất cả virút ngoại lai (bệnh đốm trắng ở gia cầm) và

vi khuẩn (Salmonella) [31], [40]

Vắcxin sản xuất từ não động vật chưa dứt sữa

Yếu tố gây phản ứng trong não là nguyên nhân của các tai biến thần kinh sau tiêm vắcxin có trong mô thần kinh động vật trưởng thành nhưng có không đáng kể hoặc không có ở trong các mô thần kinh của một số động vật chưa dứt sữa Thêm vào đó, một lượng lớn hơn virút có được khi nhân nuôi trên các mô thần kinh của động vật sơ sinh, do đó vắcxin dại đã được phát triển trên những động vật này Vắcxin đầu tiên thuộc loại này được phát triển bởi Fuenzalida và Palacios trên não chuột ổ với việc sử dụng 3 chủng virút dại cố định (CVS, 51 và 91) Dù đã

có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể có các phản ứng thần kinh không mong muốn Khoảng 0,3-0,8 trên

1000 cá thể được tiêm vắcxin có biểu hiện viêm não tủy nặng do trong vắcxin vẫn tồn dư các protein thần kinh Thêm vào đó, các vắcxin trên mô thần kinh có hiệu lực thấp hơn so với vắcxin trên nuôi cấy tế bào nên đòi hỏi một liệu trình tiêm phòng dài hơn Trong những năm gần đây, Ấn Độ và Nepal đã dần thành công trong việc ngừng sản xuất và sử dụng vắcxin trên mô thần kinh Tuy nhiên, với giá thành rẻ và điều kiện kinh tế còn khó khăn, vắcxin trên mô thần kinh hiện vẫn được sử dụng tại một số nước chủ yếu là tại vùng Đông Nam châu Á [40], [60]

1.2.2 Các vắcxin thế hệ thứ hai

Đây là các vắcxin được sản xuất trên nuôi cấy tế bào Vắcxin chứa virút bất hoạt sau khi được nhân nuôi trên các dòng tế bào như tế bào lưỡng bội người, tế bào thận khỉ phôi thai, tế bào thận chuột đất vàng tiên phát, tế bào Vero, tế bào phôi gà… Các vắcxin này sử dụng tiêm phòng trước và sau phơi nhiễm [26], [38]

17

Vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người là vắcxin được đưa vào sử dụng đầu tiên vào năm 1967 Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau khi phơi nhiễm với virút [15] Với cố gắng tìm ra các vắcxin có giá thành thấp hơn và những đặc tính lại tương đương với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người, trong những năm gần đây vắcxin tinh khiết trên tế bào phôi gà và vắcxin tinh khiết trên

tế bào Vero đã được phát triển [34] Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào đều sử dụng các virút cố định thuộc genotype 1 [40] Nguồn gốc của các chủng virút dại cố định chính được sử dụng để sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào được trình bày trong Hình 1.6

Đáp ứng miễn dịch và hiệu quả của vắcxin trên nuôi cấy tế bào được chứng minh qua các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm và các đánh giá lâm sàng trên người Đối với cả phòng trước và sau khi phơi nhiễm, vắcxin cho đáp ứng kháng thể ở trên 99% người được tiêm Sử dụng đúng thời điểm vắcxin mới kết hợp với việc xử trí vết thương đúng cách và tiêm huyết thanh kháng dại cho hiệu quả phòng dại gần 100%, thậm chí đối với cả các trường hợp phơi nhiễm nguy cơ cao Tuy nhiên, việc tiêm phòng muộn hoặc không tiêm phòng đủ mũi đặc biệt với các tổn thương ở đầu, cổ, tay hoặc đa vết cắn có thể vẫn bị tử vong do mắc bệnh dại [60]

Các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào cũng được cho là các vắcxin có độ an toàn cao Sau khi tiêm bắp vắcxin trên nuôi cấy tế bào lưỡng bội người, các phản ứng tại chỗ nhẹ và tự khỏi như đau, sưng tấy, đỏ tại chỗ tiêm xảy ra ở 21-74% số người được tiêm Các phản ứng toàn thân nhẹ như sốt, đau đầu, chóng mặt, rối loạn tiêu hóa gặp ở 5-40% trường hợp Phản ứng quá mẫn xảy ra ở 6% người được tiêm liều nhắc lại và rất ít gặp ở tiêm liều ban đầu [47] Khi thêm bước tinh chế, các phản ứng toàn thân đã hiếm gặp hơn Với vắcxin trên nuôi cấy tế bào Vero và tế bào phôi gà, tỷ lệ gặp các phản ứng tại chỗ và toàn thân nhẹ tương đương với vắcxin sử dụng tế bào lưỡng bội người, tuy nhiên không gặp các phản ứng quá mẫn hệ thống [38], [60]

Hình 1.6: Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng để sản xuất

vắcxin trên nuôi cấy tế bào

Hiện nay, các vắcxin trên nuôi cấy tế bào được chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào hệ thống tế bào được sử dụng trong sản xuất [40]:

Nhóm 1: Nhóm này gồm các vắcxin sử dụng các dòng tế bào động vật có vú nguyên phát như thận chuột đất vàng, thận chó, thận bê bào thai hoặc các dòng tế bào của gia cầm như phôi gà, phôi chim cút dựa theo phương pháp của Kissling

Nhóm 2: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào lưỡng bội chủ yếu có nguồn gốc từ người (W138, MRC5) và một số có nguồn gốc

động vật như bào thai khỉ Rhesus

Nhóm 3: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào thường trực như tế bào Vero

Các loại tế bào, các quy trình được sử dụng trong sản xuất và các phác đồ tiêm phòng đối với từng loại vắc xin được trình bày trong Bảng 1.3

Tiêm phòng sau khi bị cắn

WI 38 PM 1503 Siêu ly tâm TNBP/tween-80 - 0, 7, 21, 28 0, 3, 7, 14,30,

VERO PM 1503 Siêu ly tâm - Ly

tâm phân vùng

-propiolactone - 0, 7, 28 0, 3, 7, 14, 30,

90 HKC Vnukovo-2 Ly tâm Tia cực tím - 0, 3, 7, 28 0, 3, 7, 14, 30,

90

Loại tế

bào

Chủng virút

Tiêm phòng sau khi bị cắn

HKC Beijing-31 Ly tâm Formol/Phenol Al(OH)3 0, 3, 7 28 0, 3, 7, 14, 30,

tâm phân vùng -propiolactone - 0, 21 Thử nghiệm

PCEC Flury HEP Siêu ly tâm - Ly

tâm

-propiolactone hoặc tia cực tím - 0, 28, 180

21

Kinh nghiệm 20 năm (1985-2005) sử dụng một trong các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào, vắcxin Verorab, đã cho thấy vắcxin an toàn và cho hiệu quả phòng bệnh dại cao [49] Trên 40 triệu liều vắcxin Verorab đã được tiêm tại trên

100 quốc gia, không có phản ứng không mong muốn nghiêm trọng nào do vắcxin Verorab được báo cáo trong thử nghiệm lâm sàng trên 3937 đối tượng, và vắcxin này được cho là dung nạp tốt hơn so với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người Tiêm phòng sau phơi nhiễm đã khẳng định khả năng sinh miễn dịch trên

1437 đối tượng bằng tất cả các đường tiêm với đáp ứng sớm sau liều nhắc lại; Verorab cho đáp ứng nhắc lại có hiệu quả ở các đối tượng đã được tiêm trước với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bộ người Không như dạng vắcxin sử dụng

tế bào lưỡng bội người, Verorab không gây ra các phản ứng quá mẫn huyết thanh

ở người được tiêm nhắc lại 2183 đối tượng tại nhiều quốc gia ở châu Âu và châu

Á, trong đó có 874 đối tượng có nguy cơ cao, đã được tiêm phòng sau phơi nhiễm và cho hiệu quả bảo vệ Việc tiêm phòng vắcxin Verorab sau phơi nhiễm cho 251 phụ nữ có thai đã cho thấy hiệu quả, an toàn và không làm tăng các dị tật bẩm sinh hoặc sảy thai tự nhiên Đối với trẻ em, tính an toàn và hiệu quả cũng được thấy trên 759 trẻ (từ 0-15 tuổi) [49] Liệu trình sử dụng Verorab tiêm trong da sau phơi nhiễm cho hiệu quả tốt và giảm giá thành tại các nước đang phát triển Từ các kết quả nghiên cứu lâm sàng sử dụng Verorab tiêm bắp và tiêm trong da, trước và

sau phơi nhiễm cho thấy vắcxin có hiệu quả bảo vệ tốt và an toàn trên người [7]

Với việc ra đời và sử dụng vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã làm giảm đáng kể các trường hợp tử vong ở người trên toàn thế giới, mà phần lớn là tại các nước mà bệnh dại trên chó vẫn còn lưu hành phổ biến Một ví dụ điển hình nhất là tại Thái Lan, việc triển khai tiêm phòng vắcxin trên nuôi cấy tế bào, cùng với việc giảm liều lượng tiêm bằng liệu trình tiêm trong da đã làm cho tỷ lệ mắc dại mới ở người giảm đến 80% trong vòng 15 năm Các kết quả tương tự cũng được báo cáo tại nhiều nước khác khi vắcxin trên mô thần kinh được thay thế bằng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết, các nước cần sớm có

các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp việc tiêm phòng loại vắcxin tiên tiến và có hiệu quả cao này [26], [60]

1.2.3 Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại được đề cập

nghiên cứu sử dụng trên thế giới

Trong sản xuất vắcxin, kiểm tra chất lượng vắcxin là rất quan trọng bởi vì vắcxin là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật sống có cấu trúc phân tử phức tạp,

dễ bị biến tính bởi nhiệt độ, thời gian Và cùng một lúc nó được dùng cho nhiều người khỏe mạnh nên nếu vắcxin không đạt yêu cầu về chất lượng sẽ gây ảnh hưởng, thậm chí để lại hậu quả vô cùng tai hại cho hàng triệu người TCYTTG có các quy định riêng cho từng loại vắcxin về các tiêu chuẩn tối thiểu trong sản xuất và kiểm tra chất lượng Tuy nhiên do mỗi sản phẩm có một đặc điểm riêng trong quá trình sản xuất cũng như trong thành phần của vắcxin thành phẩm, do vậy mỗi nhà sản xuất đều phải xây dựng những yêu cầu và tiêu chuẩn riêng cho sản phẩm của mình dựa vào các khuyến cáo chung có tính nguyên tắc của TCYTTG [59]

Quy trình kiểm tra chất lượng sản phẩm sẽ đươc tiến hành trong quá trình sản xuất và cho thành phẩm cuối cùng Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào hiện nay trên thế giới được nghiên cứu ứng dụng bao gồm các nội dung kiểm tra chính như:

Kiểm tra chất lượng nguyên vật liệu gốc

 Kiểm tra các điều kiện cho nhân nuôi virút

 Tế bào để sản xuất vắcxin dại cần dựa trên hệ thống tế bào giống và được kiểm tra Giống tế bào cũng như số lần cấy chuyển tối đa cần đạt các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia [54] Thử nghiệm nhận dạng tế bào được tiến hành chủ yếu với ngân hàng tế bào giống gốc Các thử nghiệm đươc tiến hành bao gồm thử nghiệm sinh hóa (phân tích isoenzyme), miễn dịch và xác định trình tự gen tế bào

 Môi trường nuôi cấy tế bào: Huyết thanh sử dụng để nhân nuôi tế bào phải đươc thử nghiệm để xác định không nhiễm vi khuẩn, nấm, mycoplasma và các virút lây nhiễm từ động vật Bất kỳ thành phẩn nào có nguồn gốc từ bò,

23

cừu hoặc dê sử dụng cho nuôi cấy tế bào cần đạt các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia Các thành phần này phải đáp ứng đươc các hướng dẫn hiện tại của TCYTTG liên quan đến tác nhân gây bệnh lý não lây truyền ở động vật Huyết thanh người đươc sử dụng cũng phải kiểm soát về chất lương và quy trình sản xuất Các kháng sinh penicillin và thuộc họ beta-lactam khác không đươc sử dụng ở bất kỳ giai đoạn sản xuất nào Nồng độ tối thiểu của các kháng sinh như kanamycin hay neomycin cũng phải đạt theo các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia Trypsin có nguồn gốc động vật sử dụng để chuẩn bị nuôi cấy

tế bào cũng cần phải thử nghiệm và không đươc có vi khuẩn, nấm, mycoplasma và các virút lây nhiễm khác

 Kiểm tra chủng virút dùng trong sản xuất

Chủng virút dại sử dụng trong sản xuất các loạt giống cần đươc xác định đặc tính Chủng cần có hồ sơ lý lịch ghi chép các thông tin và nguồn gốc đáp ứng đươc yêu cầu đối với việc sản xuất vắcxin bất hoạt an toàn và có hiệu quả miễn dịch Chủng giống virút sản xuất không được cấy chuyển quá 5 đời từ chủng giống gốc Vắcxin cần được sản xuất từ loạt giống sản xuất mà không cấy chuyển thêm Chủng giống virút cần được bảo quản âm hoặc đông khô [54] Các thử nghiệm đối với chủng giống virút bao gồm:

 Thử nghiệm về vi khuẩn, nấm và mycoplasma

 Thử nghiệm về tác nhân ngoại lai trên chuột sữa, chuột trưởng thành và nuôi cấy tế bào

 Xác định hàm lương virút bằng phương pháp gây nhiễm vào não chuột Hiệu giá tối thiểu của chủng giống đươc xác định tùy theo nhà sản xuất tùy thuộc vào sản phẩm, tế bào và chủng virút

Kiểm tra chất lượng quá trình sản xuất vắcxin

 Kiểm tra nuôi cấy tế bào

Các thử nghiệm kiểm tra nuôi cấy tế bào bao gồm:

 Thử nghiệm về virút hấp phụ hồng cầu

 Thử nghiệm về tác nhân ngoại lai trong dung dịch nuôi cấy tế bào

 Thử nghiệm nhận dạng (dòng tế bào)

 Kiểm tra mẻ gặt virút đơn và bán thành phẩm tinh chế

 Thử nghiệm vô khuẩn trên các mẻ gặt virút đơn

 Nhận dạng: mẻ gặt đơn chứa virút cần đươc xác định là virút bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu

 Hiệu giá virút: mỗi mẻ gặt đơn cần đươc xác định đặc tính lây nhiễm bằng thử nghiệm có độ nhạy cao Nhà sản xuất cần đặt ra các tiêu chuẩn đối với hiệu giá của các mẻ gặt đơn

 Xác định hàm lượng kháng nguyên: thử nghiệm xác định kháng nguyên glycoprotein đươc thiết lập để xác định lượng kháng nguyên trong bán thành phẩm cuối cùng Thử nghiệm này đươc sử dụng để theo dõi tính ổn định của sản xuất Các thử nghiệm đươc tiến hành theo phương pháp khuếch tán miễn dịch đơn (SRID) hoặc miễn dịch gắn men (EIA)

 Thử nghiệm về ADN tế bào tồn dư: đối với virút phát triển trên dòng tế bào thường trực, bán thành phẩm tinh khiết cần đươc thử nghiệm về ADN tế bào tồn dư Quá trình tinh chế cần làm giảm được lượng ADN tế bào của vật chủ Theo quy định, lượng ADN tế bào tồn dư cần phải đạt dưới 10 ng cho 1 liều tiêm cho người [21], [56]

 Thử nghiệm về huyết thanh động vật tồn dư: nếu huyết thanh động vật đươc

sử dụng trong quá trình sản xuất, nồng độ albumin huyết thanh bò (BSA) được sử dụng làm chỉ số đối với huyết thanh động vật trong bán thành phẩm tinh khiết và giá trị này không được vượt quá 50 ng cho một liều tiêm cho người [54]

 Thử nghiệm về các nguyên vật liệu tồn dư: nhà sản xuất phải cho thấy các nguyên vật liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá trình tinh chế đến mức có thể chấp nhận được theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia [54]

 Kiểm tra quá trình bất hoạt

25

Mỗi bán thành phẩm tinh khiết cần phải thử nghiệm theo những phương pháp thích hợp để đánh giá hiệu quả bất hoạt virút trước khi cho thêm chất bảo quản và các chất khác Độ nhạy của các thử nghiệm cần đươc xác định tùy theo chủng virút dại đươc sử dụng trong sản xuất và thử nghiệm có độ nhạy cao nhất sẽ được áp dụng Thử nghiệm cần tiến hành ngay sau khi kết thúc quá trình bất hoạt Các thử nghiệm được tiến hành để đánh giá sự có mặt của virút sống bao gồm thử nghiệm tiêm gây nhiễm trực tiếp vào não chuột và thử nghiệm nhân

virút dại (amplification test) trên nuôi cấy tế bào [28] Bán thành phẩn đạt kết

quả về bất hoạt nếu đáp ứng được yêu cầu không có các virút sống tồn lưu [54]

 Kiểm tra bán thành phẩm cuối cùng

 Thử nghiệm xác định kháng nguyên glycoprotein trong bán thành phẩm cuối cùng đươc tiến hành theo phương pháp khuếch tán miễn dịch đơn (SRID) hoặc miễn dịch gắn men (EIA)

 Thử nghiệm vô khuẩn: xác định tính vô khuẩn theo phương pháp cấy trực tiếp

Kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm

 Thử nghiệm nhận dạng: thử nghiệm nhận dạng đươc thực hiện với ít nhất 1 lọ cho mỗi loạt sản xuất Thử nghiệm công hiệu có thể đươc coi là

một thử nghiệm nhận dạng

 Thử nghiệm vô khuẩn: thành phẩm cuối cùng cần đươc thử nghiệm vô

khuẩn đối với nấm và vi khuẩn bằng phương pháp cấy trực tiếp

 Thử nghiệm an toàn chung: mỗi loạt thành phẩm cần đươc thử nghiệm về độc tính không mong muốn (độc tính bất thường) sử dụng các thử

nghiệm an toàn chung theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia

 Hàm lượng kháng nguyên: nếu không hoặc chưa đươc làm đối với bán thành phẩm cuối cùng, hàm lương kháng nguyên cần đươc xác định và

giá trị nằm trong giới hạn yêu cầu

 Thử nghiệm công hiệu vắcxin thành phẩm:

Công hiệu của các loạt vắcxin thành phẩm cần đươc xác định Trước khi

tiến hành thử nghiệm, vắcxin đông khô cần đươc hồi chỉnh dưới dạng có thể sử dụng đươc cho người Thử nghiệm NIH đươc trình bày trong tài liệu Kỹ thuật phòng thí nghiệm chẩn đoán dại [58], sử dụng để đánh giá độ ổn định sản xuất của vắcxin thử nghiệm Thử nghiệm này cũng được sử dụng để đánh giá mức

độ ổn định sản phẩm với mục đích xác định hạn sử dụng cũng như hiệu chỉnh chế phẩm chuẩn Trong thử nghiệm này, chuột đươc tiêm miễn dịch sau đó thử thách vưới virút dại Thử nghiệm đươc tiến hành bởi các nhóm chuột tiêm 2 mũi vắcxin cách nhau 7 ngày với độ pha loãng thích hợp của vật liệu chuẩn đã được hiệu chỉnh với mẫu vắcxin dại chuẩn quốc tế và vắcxin thử nghiệm 7 ngày sau liều tiêm cuối, chuột đươc tiêm miễn dịch và nhóm chuột chứng đươc thử thách theo đươc tiêm não vưới > 5 LD50 chuẩn virút thử thách (CVS) Hiệu giá của virút thử thách cũng cần đươc khẳng định bằng cách gây nhiễm ít nhất ở 3 độ pha loãng 10 lần trên chuột Chuột được theo dõi 14 ngày và liều hiệu quả 50% (ED50) của mẫu chuẩn và mẫu thử đươc xác định dựa trên tỷ lệ chuột sống sót Công hiệu của vắcxin thử nghiệm tính theo IU đươc xác định bằng cách so sánh ED50 của mẫu vắcxin thử so với mẫu vắcxin chuẩn đã được hiệu chỉnh tính theo IU với mẫu vắcxin dại chuẩn quốc tế sử dụng phương pháp thống kê thích hợp

Thử nghiệm với tiêu chuẩn đươc xác định cho quy trình thử nghiệm và thẩm định, phương pháp thống kê cùng với số lương tối thiểu các thử nghiệm đươc tiến hành để phân tích kết quả và xác định độ tin cậy của thử nghiệm (25-400%) đạt theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia Đặc biệt, hiệu chỉnh mẫu chuẩn vắcxin theo chuẩn quốc tế cũng như việc sử dụng, bảo quản và vận chuyển chủng CVS cũng cần đươc xác định trong quy trình thử nghiệm

Số lương thử nghiệm đối với mỗi mẻ sản xuất phụ thuộc vào độ ổn định của thử nghiệm tại mỗi phòng thí nghiệm Nếu độ ổn định của t hử nghiệm trong phòng thí nghiệm tốt, chỉ cần một thử nghiệm là đủ Tuy nhiên, thử nghiệm bổ sung có thể làm tăng tính chính xác của công hiệu ước tính Công hiệu cần đạt ít nhất là 2,5 IU cho một liều tiêm ở ngời

27

 Kiểm tra độ ẩm tồn dư trong vắcxin đông khô: độ ẩm tồn dư trong mẫu của mỗi loạt vắcxin đông khô cần được xác định theo các phương pháp thích hợp Nói chung, lương độ ẩm tồn dư cần thấp dưới 3%

 Kiểm tra chất gây sốt: mỗi loạt thành phẩm cần thử nghiệm về chất gây sốt Thử nghiệm này cần đươc chấp thuận bởi kiểm định Quốc gia

 Kiểm tra về protein huyết thanh động vật: mẫu của loạt thành phẩm đươc thử nghiệm về albumin huyết thanh bò trong vắcxin hồi chỉnh cuối cùng vưới lương dưới 50 ng cho một liều tiêm cho ngời

 Kiểm tra chất bổ trợ: nếu một chất bổ trợ đươc cho vào vắcxin, hàm lương chất này cần đươc xác định bằng phơng pháp thích hươp Nếu các phức hươp nhôm đươc sử dụng thì nồng độ nhôm không đươc vươt quá 1,25 mg cho một liều tiêm ở ngời Nếu các chất khác đươc sử dụng nh chất bổ trươ hoặc có tác dụng nh chất bổ trợ, tiêu chuẩn về hàm lương cần đươc

đa ra Khi nhôm hydroxide đươc sử dụng làm chất bổ trươ, lương hấp phụ trong bán thành phẩm cuối cùng không đươc ít hơn 95%

 Kiểm tra chất bảo quản: nếu chất bảo quản đươc cho vào vắcxin, hàm lương chất này cần đươc xác định bằng phơng pháp thích hươp Lương chất bảo quản cho vào vắcxin không đươc làm mất đi hiệu quả của kháng nguyên hoặc không làm giảm tính an toàn của vắcxin

 Kiểm tra cảm quan: mỗi lọ trong các loạt văc xin sau khi đóng lọ cần đươc kiểm tra cảm quan để loại bỏ các lọ bất thường

 Kiểm tra ADN tế bào tồn dư: thử nghiệm ADN tế bào tồn dư được tiến hành với thành phẩm vắcxin nếu thử nghiệm này chưa đươc làm với bán thành phẩm cuối cùng

1.3 Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại VABIOTECH

1.3.1 Tế bào Vero dùng trong sản xuất vắcxin dại

Dòng tế bào thường trực Vero được thiết lập từ năm 1962 do hai tác giả người Nhật Bản là Yasumura và Kawakita, có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu Phi trưởng thành, tế bào này được giữ dưới dạng tế bào gốc MCB đời P122 Sau đó dưới sự điều hành của TCYTTG, hệ thống tế bào (WHO seed lot) có mã số CCL81

Mỹ giữ quyền kinh doanh hệ thống tế bào này Ngân hàng tế bào Vero CCL81 đời

123 của Mỹ tiếp tục được nhân truyền đến đời 131 để thiết lập ngân hàng tế bào sản xuất (WCB)

Tế bào Vero rất an toàn và giá thành thấp hơn so với tế bào lưỡng bội người hay tế bào thận khỉ tiên phát Dòng tế bào Vero đã được nghiên cứu và chứng minh:

an toàn và tinh khiết, không gây u bướu, không biến đổi gen qua nhiều đời cấy chuyển đến WCB Các mẫu thử MCB và WCB đều đạt tất cả các yêu cầu: vô trùng, không nhiễm Mycoplasma, mẫu kiểm tra trên kính hiển vi điện tử không quan sát

thấy thành phần giống virút, thử nghiệm in vitro, không phát hiện virút ngoại lai,

không phát hiện các mầm bệnh từ bò, không phát hiện thấy Porcine Parvovirus, không phát hiện tạo u đến đời cấy chuyển 169, xác định nguồn gốc từ thận khỉ xanh Phi châu

Tại Việt Nam, công ty VABIOTECH đã mua dòng tế bào Vero CCL81 của TCYTTG để thiết lập Hệ thống Ngân hàng tế bào Vero của VABIOTECH (Ngân hàng tế bào gốc và Ngân hàng tế bào sản xuất) dùng cho nghiên cứu sản xuất nhiều loại vắcxin, trong đó có vắcxin dại Vắcxin dại bất hoạt trên tế bào Vero đã được nghiên cứu hoàn hiện quy trình và sản xuất thành công ở quy mô phòng thí nghiệm tại VABIOTECH

Tế bào Vero mà VABIOTECH mua về đã được kiểm tra chất lượng đầy đủ các thử nghiệm an toàn đối với dòng tế bào thường trực Tế bào Vero trước khi đưa vào sản xuất đều được kiểm tra và phải đạt yêu cầu đối với các thử nghiệm như:

- Kiểm tra vô khuẩn: Không có sự phát triển của nấm và vi khuẩn

- Kiểm tra virút hấp phụ hồng cầu: Không có virút hấp phụ hồng cầu

- Kiểm tra Mycoplasma: Không có sự phát triển của Mycoplasma

Các bước chính của quy trình sản xuất bao gồm:

Nhân nuôi tế bào: Tế bào Vero đời 137 từ điều kiện bảo quản củangân hàng

tế bào sản xuất được cấy chuyển đến đời141 bằng môi trường MEM có chứa huyết