NGHIÊN cứu THU NHẬN và ĐÁNH GIÁ một số đặc TÍNH hóa học của LECTIN từ RONG đỏ BETAPHYCUS GELATINUS

Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đếnnay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứngdụng của lectin từ rong b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC

TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ BETAPHYCUS

GELATINUS

Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Đình Hùng

Sinh viên thực hiện: Lê Nhật Bình

Mã số sinh viên: 56132355

Nha Trang – Năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC

TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ BETAPHYCUS

GELATINUS

Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Đình Hùng

Sinh viên thực hiện: Lê Nhật Bình

Mã số sinh viên: 56132355

Nha Trang – Năm 2018

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

-Trong quá trình nghiên cứu, cũng như trong quá trình làm bài luận văn tốtnghiệp, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báocáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp củaquý thầy cô.

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày tháng năm 2018

Sinh viên

Lê Nhật Bình

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo của thầy

cô hướng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh họcbiển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang - Viện hàn lâm khoa học vàcông nghệ Việt Nam Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưatừng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Nha Trang, ngày tháng năm 2018

Sinh viên

Lê Nhật Bình

MỤC LỤ

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN 4

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển 4

1.1.2 Phân loại rong biển 5

1.1.3 Rong Đỏ Betaphycus gelatinus 6

1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN 7

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin 7

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới 10

1.3 LECTIN TỪ RONG BIỂN 12

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài 12

1.3.2 Cấu tạo của lectin từ rong biển 14

1.3.3 Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển 16

1.4 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN 19

1.5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN 21

1.5.1 Các kĩ thuật chiết xuất lectin 21

1.5.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 22

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 24

2.2 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Vật liệu 24

2.2.2 Hóa chất 24

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu 26

2.3.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951) 27

2.3.3 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ rong biển 29

2.3.4 Phương pháp xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong B gelatinus 30

2.3.5 Khảo sát các tác nhân tủa Ethanol và nồng độ (%) thích hợp để thu chế phẩm lectin kỹ thuật 34

2.3.6 Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 35

2.3.7 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 36

2.3.8 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong đỏ B gelatinus 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 KẾT QUẢ CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT LECTIN TỪ RONG ĐỎ B GELATINUS 38

3.1.1 Ảnh hưởng của dung môi đến hoạt độ NKHC của lectin có trong rong đỏ B gelatinus 38

3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết đến hoạt độ NKHC của lectin có trong rong đỏ B gelatinus 39

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt độ NKHC của lectin có trong rong đỏ B gelatinus 40

3.2 KẾT QUẢ TINH SẠCH LECTIN TỪ RONG ĐỎ B GELATINUS 41

3.2.1 Khảo sát nồng độ Ethanol để kết tủa lectin 41

3.2.2 Tinh sạch lectin bằng sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose 42

3.2.3 Tinh sạch lectin bằng sắc kí lọc gel Sephacryl S-200 43

3.2.4 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ B gelatinus 44

3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ, HÓA VÀ SINH HỌC CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ B GELATINUS 47

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B gelatinus 47

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B gelatinus 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 53

Bảng 1.1: Phân loại lectin từ động vật và chức năng của chúng 11

Bảng 1.2 : Trình tự sắp xếp các axit amin đầu tận cùng N của các chuỗi α ở một số loài rong thuộc chi Eucheuma 15

Bảng 1.3: Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng 20

Bảng 2.1: Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm 25

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ % ethanolđến HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin 41

Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch lectin từ rong đỏ B gelatinus 44

Bảng PL 1: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) 53

Bảng PL 2: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 53

Bảng PL 3: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) đến HĐTS và HĐR của lectin 54

Bảng PL 4: Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến HĐTS và HĐR của lectin 54

Bảng PL 5: Kết quả đo A 280nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau sắc kí trao đổi ion DEAE-Sepharose 55

Bảng PL 6: Kết quả đo A 280nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau sắc kí lọc gel Sephacryl S-200 56

Bảng PL 7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B gelatinus 57

Bảng PL 8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B gelatinus

57

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Rong Đỏ Betaphycus gelatinus 6

Hình 2.1: Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry 28

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát thu nhận lectin từ rong biển 29

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết 31

Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) 32

Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ thời gian chiết (giờ) 33

Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ EtOH (%) 34

Hình 3.1: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 38

Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 39

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian chiết (giờ) đến HĐTS và HĐR của lectin 40

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ ethanol (%) đến HĐTS và HĐR của lectin 41

Hình 3.5: Đồ thị biễu diễn độ hấp thụ (A 280nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose 42

Hình 3.6: Đồ thị biễu diễn độ hấp thụ (A 280nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc kí lọc gel Sephacryl S-200 43

Hình 3.7: Sơ đồ quy trình công nghệ thu lectin từ rong B gelatinus 45

Hình 3.8 : Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B gelatinus 47

Hình 3.9 : Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ NKHC của lectin từ rong đỏ B gelatinus 48

Lectin được mô tả đầu tiên năm 1888 khi Stillmark tiến hành phân lập dịch chiếttrên cây thầu dầu (Ricinus communis L.) và phát hiện ra khả năng ngưng kết tế bàohồng cầu người của lectin, khi đó gọi là “ricin” [4, 72] Năm 1898, Elfstrand đã giớithiệu thuật ngữ “hemagglutinin” nghĩa là sự ngưng kết để chỉ tất cả protein thực vật cókhả năng gây ngưng kết tế bào Vào những năm 1940, Boyd và Renkonen đã tìm radịch chiết thô từ đậu Lima (Phaseolus limensis) và đậu tằm (Vicia cracca) có hoạt tínhngưng kết đặc hiệu với nhóm máu Đến năm 1954, Boyd và Shapleigh đã đặt chonhóm protein đó là “Lectin” [6]

Bản chất của lectin phần lớn là protein, nó có khả năng làm ngưng kết hồng cầu,liên kết thuận nghịch với cacbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch Phụ thuộcvào nguồn gốc thu nhận lectin, mỗi lectin cho thấy sự đa dạng trong cấu trúc phân tử,đặc tính liên kết carbohydrate và hoạt tính sinh học khác nhau

Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đếnnay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứngdụng của lectin từ rong biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [23,24] Các nghiên cứu

về lectin từ rong biển cho thấy đặc tính của những lectin này có nhiều khác biệt so vớilectin từ thực vật bậc cao Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp,tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực vớiglycoprotein (đặc biệt là các glycoprotein từ động vật), thuộc nhóm protein rất bềnnhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II [43] Vớinhững tính chất ưu việt trên, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trongcác nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng của chúng trong tương lai

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biểnkhoảng 3260 km, với hơn 1000 loài rong biển đã được tìm thấy Trong đó, đã xác địnhđược 151 loài thuộc ngành rong Lục (Chlorophyta), 269 loài thuộc ngành rong Đỏ

(Rhodophyta), 143 loài thuộc ngành rong Nâu (Phaeophyta) và 76 loài thuộc ngànhrong Lam (Cyanophyta) [58].Đây là nguồn vật liệu vô cùng phong phú cung cấp choviệc nghiên cứu, điều chế những hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lectin.

Với kết quả khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 80 loài rong biển thuộc vùngbiển Ninh Thuận và Khánh Hòa từ năm 2009 đến 2011 của TS Lê Đình Hùng và cộng

sự cho thấy: hơn 90% dịch chiết từ rong được khảo sát cho thấy sự hiện diện lectin.Chúng có khả năng làm ngưng kết với ít nhất một trong các loại hồng cầu được thử

nghiệm Trong đó, dịch chiết từ rong Hồng vân_Betaphycus gelatinus thuộc dòng rong Đỏ cho hoạt tính ngưng kết hồng cầu mạnh mẽ với cả hồng cầu thỏ và hồng cầu

cừu [44, 45] Đồng thời, loài rong này cũng đã và đang được trồng phổ biến ở cácvùng khác nhau thuộc tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận

Mục tiêu nghiên cứu.

- Sàng lọc lectin từ rong hồng vân và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng

- Xác định điều kiện thích hợp để tách chiết, tinh sạch lectin từ rong Hồng Vân

Betaphycus Gelatinus

- Xác định các tính chất hóa lý của lectin từ rong B gelatinus

Nội dung nghiên cứu.

Tách, chiết và tinh chế lectin

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết lectin từ rong B

gelatinus.

- Khảo sát hệ dung môi và nồng độ dung môi kết tủa lectin

- Tinh sạch sơ bộ lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose

- Tinh sạch sơ bộ lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200

Xác định độ tinh sạch của lectin

Nghiên cứu các đặc tính lý hóa của lectin.

- Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin

Ý nghĩa khoa học

- Thu nhận thêm thông tin khoa học về lectin từ rong B gelatinus.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Xây dựng được quy trình chiết, tách lectin thô từ rong và xác định được những

tính chất hóa lý đặc tính của lectin từ rong B gelatinus, từ đó có thể thu nhận lectin ở

quy mô lớn hơn để đưa ra khả năng ứng dụng thực tế

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển

Rong biển (marine algae) là một loài thực vật sinh sống ở biển, thuộc nhóm tảobiển Chúng phân bố ở vùng cửa sông, các đầm nước lợ, vùng triều hay các vùng biểnsâu Rong biển thường mọc trên các rạn san hô, vách đá hoặc có thể mọc dưới các tầngnước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp Sự có mặt củarong biển trong thủy vực không chỉ đóng hai vai trò quan trọng là mắt xích đầu tiêntrong chuỗi thức ăn của sinh vật biển mà còn là nguồn cung cấp thức ăn cho các loàiđộng vật ven biển khác [4]

Rong biển có kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước từhiển vi cho đến hàng chục mét; hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hìnhphiến lá hay nhiều hình thù rất đặc biệt Hằng năm, đại dương cung cấp cho con ngườikhoảng 200 tỷ tấn rong Hơn 90% lượng cacbon trên Trái Đất được tổng hợp hằngnăm là nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó 20% là từ rong biển [43, 46] và

hầu hết oxy của thế giới (khoảng 70%) đến từ rong biển và vi tảo khác

Thành phần rong biển rất giàu bộtđường, chất xơ, đạm, sinh tố và chất khoáng,

ngoài ra còn chứa rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lượng và vitamin Trong đó, nổibật là iốt yếu tố vi lượng tối cần thiết cho tuyến giáp, canxi với hàm lượng cao gấp 3lần so với sữa bò, vitamin A cao gấp 2-3 lần so với cà rốt, vitamin B2 gấp 7 lần trongtrứng, vitamin C, E cao gấp nhiều lần trong rau quả Ngoài ra, các hợp chất protein vàpolysaccharide từ rong biển còn là đối tượng nghiên cứu của rất nhiều lĩnh vực khácnhau như: công nghiệp thực phẩm, y dược, nông nghiệp và công nghệ sinh học…[4]

Những nghiên cứu khoa học trong thời gian gần đây cũng đã xác nhận, nhiềuloài rong biển có tác dụng phòng chống virus và ung thư [32] Theo báo Telegraphdẫn một cuộc nghiên cứu mới đây, các loài rong biển cũng chứa nhiều thành phần hoạtchất sinh học giúp giảm lượng cholesterol, hạ huyết áp, tăng cường sự ngon miệng vàthậm chí nó còn có khả năng loại bỏ những gốc phân tử tự do là tác nhân chính gâyung thư Trong khi đó, kết quả báo cáo được đăng tải trên chuyên san Hiệp hội Nghiên

cứu Ung thư Mỹ vào tháng 3/2011 cho biết, một số hợp chất từ rong biển có thể ngănchặn sự tăng trưởng của các tế bào ung thư dẫn đến ung thư hạch bạch huyết.

Việt Nam có nguồn lợi rong biển rất đa dạng và phong phú Theo các kết quảnghiên cứu gần đây, nước ta có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng biển miềnBắc 310 loài, miền Nam 484 loài và 156 loài tìm thấy ở cả hai miền Trong đó, có cácđối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong Mơ (Sargassum), rong Đông(Hypnea), rong Mứt (Porphyza), và rong Bún (Enteromorpha) [31]

1.1.2 Phân loại rong biển

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh sản màrong biển được chia làm 9 ngành sau đây [4]:

1 Ngành rong lục (Chlorophyta)

2 Ngành rong nâu (Phaeophyta)

3 Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

4 Ngành rong trần (Englenophyta)

5 Ngành rong giáp (Pyrophyta)

6 Ngành rong khuê (Bacillareonphyta)

7 Ngành rong kim (Chrysophyta)

8 Ngành rong vàng (Xantophyta)

9 Ngành rong lam (Cynophyta)

Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong lục, rong nâu và rong đỏ

Trong đó, rong đỏ được sử dụng phổ biến nhất với khối lượng lớn để phục vụ conngười Một số loài có hàm lượng cao về Agar, Carrageenan, Furcuellaran được sửdụng để chế biến keo rong

Thành phần hóa học của rong Đỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào trạng thái sinh lý,thời gian sinh trưởng và điều kiện sống như cường độ bức xạ, thành phần hóa học củamôi trường Thành phần chủ yếu của chất khoáng trong rong Đỏ là Canxi, Kali, Lưuhuỳnh và hàng loạt các nguyên tố khác, chiếm khoảng 20% trọng lượng khô Ngoài ra,rong Đỏ còn chứa các sắc tố như: diệp lục tố, sắc tố đỏ, sắc tố vàng, sắc tố xanh lam[4]

1.1.3 Rong Đỏ Betaphycus gelatinus

Rong Đỏ Betaphycus gelatinus (Esper) Doty ex P C Silva, 1996 hay còn có tên khác là Eucheuma gelatinae (Esper) J Agardh.

Rong B gekatinus được phân loài như sau

Giới Vegetable Ngành Rhodophyta Lớp Florideophyceae

Bộ Gigartinales

Họ Solieriaceae Chi Betaphycus

Loài Betaphycus gelatinus (Esper) Doty

Tên Việt Nam thường gọi là rong hồng vân

Hình 1.1: Rong Đỏ Betaphycus gelatinus

B gelatinus được phân bố tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Đông Á như

đông Indonesia, Philippines, Việt Nam, Nam Trung Quốc và Nam Nhật Bản

Rong sống nhiều năm, phát triển tốt nhất từ tháng 3 đến tháng 6 Mọc từ vùngtriều thấp đến phần trên của vùng dưới triều, trên đá san hô chết, độ sâu 1 - 3 m

Tản rong mọc thành bụi bò sát vật bám và bám chắc trên đá, tản rộng 10 – 15

cm, chia nhánh không qui tắc Các nhánh sát vật bám có nhiều mấu bám Nhánh dẹt

rộng 3-5 mm, hai bên mép có nhiều nhánh nhỏ dạng gai; phía mặt dưới nhánh dẹt cónhiều mụn, mặt trên nhẵn Các nhánh cài quấn dính vào nhau làm thành búi.

Phân bố trong nước: Thừa Thiên - Huế (Phú Lộc: Lộc Hải), Quảng Nam (NúiThành), Quảng Ngãi (đảo Lí Sơn), Khánh Hoà (vịnh Cam Ranh, vịnh Nha Trang),Ninh Thuận (Ninh Hải: Nhơn Hải, Thái An, Mĩ Hòa, Mĩ Hiệp; vịnh Phan Rang; NinhPhước: Vĩnh Tường)

Rong B gelatinus có thể dùng làm thức ăn cho động vật, mồi câu cá; dược liệu

( bệnh ho, chống khối u) hoặc làm thực phẩm (nấu chè, thạch, làm bánh kẹo)

Hiện nay rong hồng vân đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấpđánh giá “ bị đe doạ” (Bậc T)

1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin

Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứngđầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu Tuynhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏnguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng chocác mục đích y tế

Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của các hạt

Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein Những

protein như vậy, được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vìban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật Tuy nhiên, tất cả các nhà khoahọc sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin là từluận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường đại học Dorpat (nay

là trường đại học Tartu, Estonia), một trong những trường đại học lâu đời nhất dướithời nước Nga Sa Hoàng, vào năm 1888 Chất hemagglutinin được Stillmark tách chiết

từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là ricin, một độc tố mà sau

đó được xác định là có bản chất protein

Kể từ đó, có thể chia quá trình nghiên cứu lectin thành 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn đầu, từ cuối thế kỷ XIX đến nữa đầu thế kỷ XX: đây là giai đoạnmang tính điều tra cơ bản về lectin trong sinh giới Ngoài công trình nghiên cứu củaStillmark vào năm 1888 thì cũng tại trường đại học Tartu, Hellin cũng đã tách được

một độc tố khác có nguồn gốc từ thực vật, đó là dịch chiết từ hạt của cây Abrus precatororius, nó có khả năng làm ngưng kết tế bào hồng cầu người và được đặt tên là

abrin Ngoài ra, đã có một số nghiên cứu chuyển sang đối tượng là các loài động vậtnhư Edfstrand (1898), Meldel (1909), Kobert (1913)… Trong suốt những năm sau đó,các hợp chất có tính chất đặc biệt làm ngưng kết tế bào hồng cầu người và một số loàiđộng vật được phát hiện ngày một nhiều trong giới sinh vật từ virus đến con người

- Tiếp đến, trong những năm 1950 đến năm 1970: năm 1954, vì khả năng phânbiệt giữa các hồng cầu của các nhóm máu khác nhau của các agglutinin thực vật,Boyd

và Shapleigh đã sử dụng thuật ngữ “Lectin” (thuật ngữ “Lectin” bắt nguồn từ chữ

“Lectus”, dạng quá khứ của động từ “Legere” trong tiếng Latin có nghĩa là “Lựachọn”) để chỉ nhóm các “chất ngưng kết” thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệunhóm máu [18], đây có thể được coi là khái niệm đầu tiên về lectin Trong hai thập kỷnày, bên cạnh các công trình mang tính điều tra về sự hiện diện của lectin trong sinhgiới, phần lớn các nhà khoa học đã tập trung vào việc tinh chế lectin để nghiên cứu cấutrúc và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính của lectin, trên cơ sở đó tìmcách sử dụng lectin nhằm phục vụ cho đời sống con người

- Từ năm 1970 đến nay: Giai đoạn này, tiến độ nghiên cứu lectin được đẩynhanh, lectin thực vật được nghiên cứu rộng rãi theo hướng điều tra và thăm dò tínhđặc hiệu Nhiều kết quả thú vị đã được công bố như việc tìm thấy lectin ở nấm nhầy(Roise – 1974, Barondes và Haynood – 1979) và ở cơ thể người (Chilads Freizy –

1979, Franklin – 1980, Powell – 1980) Ở thời điểm đó người ta đã nghiên cứu đượcrất nhiều lectin mà chủ yếu tập trung ở họ Đậu Các lectin động vật ít thu hút được sựchú ý và chỉ có một số nghiên cứu về lectin ở chạch, sên và cua móng ngựa là đượcnghiên cứu kỹ Lectin quan trọng nhất ở động vật được khám phá chính là thụ thểasialoglycoprotein trong gan động vật có vú đặc hiệu với galactose được phát hiện bởi

G Ashwell và G Morell vào năm 1974

Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đưa ra định nghĩa “Lectin là những proteinhoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” Khái niệm này đồngnhất với định nghĩa về lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm 1982: “Lectin làprotein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tếbào hồng cầu”.

Năm 1991, Balzarini J.đã phát hiện ra lectin của một số loài thuộc họ thủy tiên(Amaryllidaceae) và họ lan (Orchidaceae) có tác dụng kìm hãm sự phát triển của virusHIV [12]

Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúcliên quan đến chức năng của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ítnhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạttính sinh học, Peuman và cộng sự đã phân chia lectin thành 3 loại:

 Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâmliên kết đường, do đó không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa cáchợp chất liên kết đường Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan(Orchidaceae)

 Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khảnăng gây ngưng kết tế bào và gây tủa, do tương tác với nhiều loại hợp chất cộng hợpđường Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ đượcphát hiện bởi vì khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi làhemmagglutinin

 Chimerolectin là những phân tử, trong đó có ít nhất một vị trí liên kết vớiđường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học).Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom type 2 (RIP, Type 2) có trong hạt thầu

dầu (Ricinus communis L.,) hoặc hạt cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.).

Song song với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâuvào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các lectin, để sử dụng chúng một cáchthiết thực và có hiệu quả hơn Hiện nay đã có tới hơn 200 lectin được giải đoán cấutrúc Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin như sau: “Lectin

là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kết thuận nghịch,phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được

liên kết Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc glycolipid bề mặt Sựhiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắnkết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi đểkiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau”.

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới

 Sự phân bố lectin trong giới thực vật

Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộngtrong các cơ quan như thân, lá và hạt Tác giả Allen và Brillantine (1969), đã tiến hànhđiều tra ở 2663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó cáccây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [9] Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loàilớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ(Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứalectin [12]

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang đượctrồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [6] Lectin từ họ

Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [2].

Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt củalectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y(Lichenes) và Rong (Algae) Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd vàcộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [18], từ đó đến nay đã cóhàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khácnhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam

Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệukhoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thựcvật [8]

 Sự phân bố lectin trong giới động vật

Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong

giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus, 1903) Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động

vật thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra Ở Việt Nam, khi khảo

sát 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang-Khánh Hòa xuất hiện 10loài có chứa lectin [8].

Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điềutra cơ bản Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia),lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) cũng có chứa lectin

Ngoài ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)…

Một kết quả nghiên cứu khá thú vị, là ở mô người như mô cơ và các cơ quancủa cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin Nhưvậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin Đó cũng là bằng chứng về tính phổbiến của lectin trong sinh giới [14]

Dựa vào cấu trúc và tính đặc hiệu với các loại đường khác người ta phân lectinđộng vật thành một số loại sau:

Bảng 1.1: Phân loại lectin từ động vật và chức năng của chúng

1 Calnexin Phân loại protein ở lưới nội sinh chất

2 M-type lectinss Phân hủy glycoprotein ở lưới nội sinh chất

3 L-type lectins Phân loại protein ở lưới nội sinh chất

4 P-type lectins Phân loại protein sau khi qua Colgi

5 C-type lectins

Kết dính tế bào (selectins)Loại bỏ GlycoproteinMiễn dịch tự nhiên (collectins)

6 Galectins Liên kết chéo glycan ở chất nền ngoại bào

7 I-type lectins Kết dính tế bào (siglecs)

Tái tạo hormone glycoprotein

 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật

Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện là vào năm 1942, khi Hirst và cộng

sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [8] Sau này, một

số công trình khoa học của Bruoly (1948), Stone (1949) và Bruet (1951) cũng đã pháthiện thấy lectin ở một số loài virus khác

Trên đối tượng là vi khuẩn E coli, Ofek (1987) đã cho biết: trên bề mặt của tế

bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào Hoạt tính này mất đikhi có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất amin của nó Đó chính làlectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn Dạng lectin này cũng đã được phát hiện ở một sốloài vi khuẩn khác như Houssto năm 1983 hay của Smit và cộng sự năm 1984

 Sự phân bố của lectin trong tế bào và cơ thể sinh vật

Nghiên cứu sự xuất hiện của lectin đã cho thấy, trong một cơ thể, lectin có thể

có ở bộ phận, cơ quan này nhưng lại không có ở bộ phận, cơ quan khác Hàm lượnglectin cũng biến đổi trong quá trình sinh trưởng của sinh vật

Với các cơ thể ở thực vật, sự định khu của lectin khá rộng: ở lá, hoa, thân vàđặc biệt là hạt, hầu hết các loài thực vật hạt kín, hạt thường chứa nhiều lectin nhất

Trong cơ thể động vật, lectin có trong huyết thanh ở một số mô và cơ quan đặcbiệt là mô cơ Ngoài ra, còn có ở giao tử hoặc tế bào trứng

Gần đây cũng đã chứng minh sự tồn tại của lectin ở trong nhân tế bào ở một sốloài bò sát và động vật có vú [8]

1.3 LECTIN TỪ RONG BIỂN

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài

 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Công trình khoa học đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vàonăm 1966, ông đã phát hiện rong biển cũng có khả năng gây ngưng kết tế bào hồngcầu ở người Kể từ đó có rất nhiều công trình công bố sự có mặt của lectin trong rongbiển

Năm 1988, Hori đã khảo sát hoạt tính ngưng kết hồng cầu của 31 loài rong biểntrên hồng cầu người và động vật Từ kết quả nghiên cứu đạt được ông đã cho rằng hoạttính ngưng kết hồng cầu đóng một vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tếbào rong biển Và hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loài rong biển khác nhau

Tại Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phongtrong việc nghiên cứu lectin từ rong biển Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự

đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loài rong biển thuộc 3 dòng rong: rong đỏ,rong nâu và rong xanh Trong đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu từ rong đỏ là phổ biếnnhất

Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ởnhiều địa điểm khác nhau trên thế giới với quy mô ngày càng lớn hơn: từ Nam Mỹ,Châu Âu, Châu Á cho đến các vùng Nam cực Hơn thế nữa, không chỉ dừng lại ở việckhảo sát sự có mặt của lectin trong rong biển mà những tính chất cơ bản của nó cũng

đã được chú tâm đến [15]

Tuy nhiên, cho đến nay số lượng lectin được tinh sạch cũng như khảo sát đặctính hóa sinh vẫn còn rất khiêm tốn, đặc biệt là khi so sánh với lectin từ thực vật bậccao Hầu hết trong số đó là các lectin từ rong biển mà chủ yếu là ở một số dòng rong

đỏ như: Bryothamnion seaforthii, B triquetrum; Solieria filiformis; Pterocladiella capillacea….Trong số đó, có một vài lectin từ dòng rong đỏ đã được làm sáng tỏ về cấu trúc bậc 1 như: H japonica và Vidalia obtusiloba.

Trong khi đó, mặc dù chức năng sinh học của lectin vẫn chưa được làm rõ,nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng lectin từ rong biển có khả năng điềuchỉnh hệ miễn dịch, kháng u, kháng ung thư…Đặc biệt, hàng loạt lectin có khả năngliên kết với glycoprotein N-glycan dạng high manose như: lectin ESA_2 của rong đỏ

Eucheuma serra , lectin từ rong đỏ Griffithsia sp. hay lectin KAA_2 của rong đỏ

Kappaphycus alvarezii…có khả năng gắn kết với bề mặt của các tế bào có

glycoprotein dạng high manose đặc biệt là trên lớp vỏ của virus HIV, HBV và một sốloài virus gây bệnh khác

Những kết quả đạt được cho thấy rằng, lectin từ rong biển mà đặc biệt là rong

đỏ là nguồn nguyên liệu hữu ích để sử dụng trong các nghiên cứu hóa sinh và y sinhtrong giai đoạn sắp tới

 Tình hình nghiên cứu trong nước

Khác với lectin từ thực vật cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ rongbiển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu của Viện nghiên cứu

và ứng dụng công nghệ Nha Trang Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiên

cứu tại đây đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau, thuộc 3 dòng: rong đỏ,rong nâu và rong xanh Kết quả cho thấy, hầu hết các loài rong biển đều có khả nănggây ngưng kết với ít nhất một loại hồng cầu từ động vật như thỏ, cừu, gà, ngựa và 3nhóm máu A, B, O của người Một số tính chất hóa sinh như liên kết carbohydrate,khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứng dụng của các lectin này cũng đangđược nghiên cứu.

1.3.2 Cấu tạo của lectin từ rong biển

 Khối lượng phân tử của lectin từ rong biển

Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện ditrên gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ionhóa phun điện tử (electron spray ionization-mass spectrometry) khối lượng phân tử củakhá nhiều dạng lectin đã được xác định Kết luận có thể dẫn ra ở đây là khối lượngphân tử của lectin từ rong biển cũng có sự dao động khá lớn và lectin có nguồn gốckhác nhau thì khối lượng có thể giống nhau hoặc khác nhau

Lectin có nguồn gốc từ rong biển có khối lượng phân tử bé nhất là lectin của

Hypnea japonica thuộc dòng rong Đỏ, khoảng 4,2 kDa Trong khi đó lectin có khối lượng phân tử lớn nhất cũng thuộc dòng rong Đỏ, Ptilota plumose, gồm một chuỗi

polypeptide khoảng 170 kDa

Năm 1986, Rogers đã tinh chế lectin từ rong xanh Codium fragile và đã xác

định khối lượng phân tử của nó là 60 kDa, bao gồm 4 chuỗi polypeptide có cùng khốilượng là 15 kDa cấu tạo nên Dạng lectin này có điểm đẳng điện trong khoảng từ 3,8đến 3,9 Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, Jong Won Han và các cộng sự (2011)

đã xác định khối lượng phân tử của Bryopsis plumosa là 11,5 kDa, lectin này ở dạng

đơn phân

Cho đến nay, có khá nhiều nghiên cứu công bố về khối lượng phân tử của lectin

và đã cho thấy mức độ biến đổi khá mạnh của chúng Tuy nhiên, so với khối lượng

phân tử của lectin từ thực vật bậc cao như lectin từ hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis L.,) là 108 kDa hay lectin từ động vật như sam biển Việt Nam (Tachpleus tridentatus)

có khối lượng phân tử lên đến trên 700 kDa thì khối lượng phân tử của lectin từ rongbiển lại khá thấp, phần lớn trong chúng dao động tập trung trong khoảng từ 15 đến 45kDa Các nhà khoa học cho rằng chưa thể tìm thấy được mối liên hệ nào giữa khối

lượng phân tử lectin và hoạt tính của chính nó Khối lượng phân tử của lectin khôngmang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóacủa loài hay cá thể đó [8]

Cấu tạo phân tử lectin từ rong biển

Khác với các lectin từ thực vật bậc cao, hầu hết lectin từ rong biển tồn tại ởdạng monomer Khi nghiên cứu cấu trúc bậc nhất chuỗi α của lectin ở 4 loài rong cùng

chi Eucheuma là Euchema denticulatum, Eucheuma serra, Eucheuma amakusaensis

và Eucheuma cottonii, Kawakubo và cộng sự đã cho biết: trình tự của 20 axit amin đầu

N của có tỷ lệ tương đồng rất cao, thành phần gốc axit amin chủ yếu giàu các gốc Glx,Asx, Gly và Ser

Bảng 1.2 : Trình tự sắp xếp các axit amin đầu tận cùng N của các chuỗi α ở một số loài rong thuộc chi Eucheuma

Loài Trọng lượng

(kDa)

Trình tự sắp xếp (20 axit amin đầu N)

thì cấu trúc bậc nhất của phân tử lectin càng giống nhau nhiều hơn Có thể đây là mộtdấu hiệu để phân loại sinh vật ở mức độ phân tử

Có khá nhiều công trình đã chỉ ra rằng hầu hết các dạng lectin từ rong biểnđược cấu tạo từ một mạch polypeptide Chỉ một số ít lectin có cấu tạo từ hai mạchpolypeptide trở lên, mỗi mạch polypeptide tạo thành một tiểu đơn vị, các tiểu đơn vịnày có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau Ví dụ như lectin từ rong đỏ

Vidalia obtusiloba có cấu trúc dimer, trọng lượng của 2 chuỗi polypeptide lần lượt là 59,6 và 15,2 Da, trong khi đó lectin từ rong xanh Codium fragile lại có cấu tạo

tetramer với khối lượng mỗi đơn phân đều là 15000 Da

Về cơ chế hoạt động của lectin từ rong biển nói riêng đến sinh vật tự nhiên nóichung, các nhà khoa học đều thống nhất như sau: “Các trung tâm hoạt động của cácphân tử lectin đều có khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận(receptor) trên bề mặt màng tế bào Các liên kết sẽ được hình thành giữa các receptortrên bề mặt màng tế bào với các trung tâm hoạt động của lectin Nhờ các liên kết này

mà lectin đã kết dính các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết tế bào

Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các receptor trên bề mặt tế bàocũng khác nhau Giống như enzyme, trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi

nó nằm trong một chỉnh thể thống nhất, hoàn chỉnh của cấu trúc phân tử Bất kỳ mộttác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân tử lectin cũng đều làm giảm hoặc mất khả năng hoạtđộng của trung tâm này Chính vì vậy, hoạt độ của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một

số tác nhân lý hóa của môi trường” [8]

1.3.3 Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển

Tính tan và kết tủa

Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển hòatan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng Lectin

có bản chất là protein nên chúng dễ bị kết tủa bởi một số tác nhân lý hóa của môitrường như: tác dụng của ethanol, acetone, của một số muối trung tính ở nồng độ caođặc biệt là ammonium sunphate

 Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của lecin

Qua các thí nghiệm về khả năng liên kết với các loại đường ở lectin được táchchiết từ rong biển, người ta nhận thấy lectin từ rong biển ít liên kết với các loại đườngđơn hay đường đa như ở thực vật bậc cao hay động vật mà ngược lại nó liên kết vớicác glycoprotein dạng N-glycan hay O-glycan như: porcine stomach mucin,lactotransferrin, asialofetuin….

Phương pháp xác định sự tương tác giữa đường và lectin đang được sử dụnghiện nay là xác định hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin khi có mặt một loại đườngnào đó Trường hợp hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn chứng tỏ đường đã kìmhãm hoạt tính lectin Ngược lại, hoạt độ lectin vẫn ổn định chứng tỏ đường không ứcchế

Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường của lectin vẫn còn khá phứctạp Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu vềlectin Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có thể sửdụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó Một

số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xácđịnh kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu Gần đây, dựa vào các loạiđường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế nhiềuloại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin để tinhchế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học

 Khả năng gây ngưng kết tế bào

Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật vàngười Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin Số lượng lectin có khả năngngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít vì chúng đồng thời có thểgây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, cừu, gà, dê hay ngựa… Theo tác giảAllen và Billantine, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loài chứalectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loài chứa lectin không đặc hiệu nhóm máu Lectin từ

rong biển Ptilota plumosa ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu A đã xử lý papain mà không thể

ngưng kết với các nhóm máu khác của người như O, B hay AB [50] Các lectin đặchiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng

Theo Sharon (1989), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người

và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tếbào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi…

Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ của lectin

 Ảnh hưởng của pH

Mỗi dạng lectin thường có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà

ở đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định Ở pH vùng axit vàkiềm mạnh, hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn So với lectin từ thực vật bậc caohay động vật, lectin từ rong biển có khoảng pH thích hợp rất rộng, hầu hết từ pH từ 5

đến 9, đặc biệt có một số loại rong như B composite, D versluysii hay V fastigiata

không bị giảm hoạt độ trong khoảng pH từ 3-9

 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Lectin có bản chất là protein và glycoprotein nên nhiệt độ có ảnh hưởng đếnhoạt độ của chúng Ở nhiệt độ thấp, hoạt độ lectin giảm Nhiệt độ tăng dần lên, hoạt độlectin cũng tăng lên và đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp Hầu hết các lectin đều bị mấthoạt độ ở nhiệt độ cao Ở nhiệt độ cao, protein lectin bị biến tính không thuận nghịch.Hiện tượng sốc nhiệt cũng có thể làm mất hoạt độ lectin

So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, hoạt độ của lectin từ rong biểnkhá ổn định với mức nhiệt độ khá cao Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt

tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong Pterocladiella capillacea cho thấy, hoạt độ

vẫn ổn định ở mức 600C trong 30 phút, 50% hoạt độ chỉ bị mất đi sau 30 phút ở mứcnhiệt là 700C và mất hoàn toàn ở 800C sau 10 phút [57] Thí nghiệm này cũng có kếtquả tương đồng với nhiều nghiên cứu của các tác giả khác khi khảo sát sự ảnh hưởngcủa nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển

 Ảnh hưởng của một số nhân tố khác

Enzyme có khả năng làm tăng hoạt độ lectin Trong nhiều thí nghiệm, các hồngcầu được xử lý bằng các enzyme như trypsin, chimotrypsin, papain… thì chúng dễ bịlectin làm ngưng kết Ví dụ, khi xử lý hồng cầu nhóm máu O bằng papain thì hoạt độ

của lectin từ dòng rong xanh Ulva lactuca tăng lên 7-8 lần Sở dĩ có hiện tượng này là

vì khi hồng cầu xử lý với enzyme thì chính enzyme đã thủy phân giới hạn một số

protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các nhóm carbohydrate của nó, vì vậylectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, dẫn đến hoạt độ lectin tăng lên.

1.4 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN

Lectin từ rong biển đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vựckhác nhau của đời sống Các ứng dụng đó có thể được tóm tắt như sau:

Lectin trong huyết học

Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫncòn được áp dụng rộng rãi Phương pháp xác định nhóm máu bằng lectin cho kết quảnhanh, chính xác mà không cần dùng huyết thanh mẫu Tuy nhiên, phương pháp nàyđòi hỏi lectin phải tinh khiết và có tính đặc hiệu cao

Việc sử dụng lectin từ rong biển để xác định nhóm máu cũng đã được sử dụng

trong nhiều năm nay Lectin từ rong Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết với hồng cầu máu A đã

xử lý papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác như A, B, O hay AB

Lectin trong tế bào học

Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tếbào và những biến đổi trên bề mặt màng tế bào trong quá trình biệt hóa bệnh lý thôngqua sự thay đổi thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào

Năm 1988, lectin được tinh sạch từ Codium tomentosum được sử dụng như một

công cụ để phát hiện sự có mặt của nhiều loại glycoprotein khác nhau mà phần lớn làN-acetyl-glucosamine

Lectin trong thuốc bảo vệ thực vật và ngũ cốc

Lectin mà đặc biệt là lectin từ rong biển có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ

và côn trùng có hại cho cây trồng vì chúng có khả năng liên kết với glycoproteinđường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tựchết

Bảng 1.3: Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng

Nguồn lectin Loại côn trùng Ảnh hưởng

Gracilaria cornea

(rong Đỏ) Boophilus microplus

Làm côn trùng chậm phát triển, giảm trọng lượng trứng và lượng trứng nở thành con…

Gracilaria ornate

(rong Đỏ)

Callosobruchus maculatus Làm côn trùng chậm phát triển…

 Lectin trong y học

Lectin có tiềm năng rất lớn trong nhiều lĩnh vực Lectin được sử dụng như mộtcông cụ chẩn đoán có hiệu quả Dựa vào khả năng phân biệt và ức chế sự phát triểncủa một số vi sinh vật, lectin từ rong biển được sử dụng kết hợp với các xét nghiệmthông thường khác để nâng cao giá trị chẩn đoán và điều trị bệnh trên sinh vật biển

Dịch chiết lectin từ rong Eucheua serra và Galaxaura marginata ức chế sự phát triển của vi khuẩn biển gây hại cho cá là Vibrio pelagius và Vobrio vulnificus, 2 loại vi

khuẩn này gây bệnh ở cá Lectin từ một số loài rong nâu như Fucus vesiculosus, Dictyopteris membranacea, Fucus serratus…có khả năng gây ngưng kết và ức chế sự phát triển của các chủng nấm nhầy gây bệnh như Candida guilliermondi

Lectin từ một số loài rong đỏ như Eucheuma serra, Oscillatoria agardhii hay Griffithsia sp Có khả năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein manose N-glycan ở nồng

độ rất thấp, đây là những glycoprotein có mặt chủ yếu trên bề mặt của màng tế bàoHIV, do đó có thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế được khả năng mắcbệnh

Như vậy có thể thấy, lectin đã và đang được nghiên cứu để sử dụng trong chuẩnđoán các bệnh truyền nhiễm và rối loạn trao đổi chất, trong nghiên cứu sinh học vàmiễn dịch, làm mitogen trong nuôi cấy tế bào với mục đích chữa bệnh, tăng năng suất

trong trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [8].

 Lectin trong virus học

Gần đây, lectin từ rong biển đang được xem là nguồn sản phẩm tự nhiên phong

phú, có khả năng kháng virus mạnh mẽ Ví dụ như Grifftithsin (GRFT), Oscillatoria agardhii (OAA) (Sato et al, 2007), Eucheuma serra (ESA-2) những lectin này đã cho

thấy hoạt tính rất mạnh kháng lại virus HIV và những virus khác Không giống nhưphần lớn các liệu pháp điều trị kháng virus hiện tại, những lectin có khả năng hoạtđộng qua sự ức chế chu kỳ sống của virus, ngăn chặn sự xâm nhập vào tế bào vật chủcủa virus Thêm vào đó, những lectin này thường chịu được nhiệt độ cao, pH thấp,không có mùi, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein trên bề mặt lớp vỏ củavirus Vì vậy, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu

cơ bản và những ứng dụng của chúng trong tương lai

1.5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN

1.5.1 Các kĩ thuật chiết xuất lectin

Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiếtxuất lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện dễ dàngbằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làmdung môi chiết xuất Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng cácdung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%; CaCl20,1M; dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl…

 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thểđược hòa tan trở lại Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị 1,anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2O4, Na2SO4….Các protein khác nhau được kết tủa

ở những nồng độ muối trung tính khác nhau Người ta sử dụng phương pháp này trongcác quy trình chiết xuất lectin để cô đặc dung dịch protein cần tách

 Kết tủa phân đoạn bằng dung môi

Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong nước như axetone,polyetylenglycol, ethanol…làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mứcchúng có thể bị kết tủa nhanh chóng Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất

dễ gây biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải đượctiến hành ở nhiệt độ thấp

 Thẩm tích

Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bánthấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn.Trong phương pháp này, màng bán thấm ở dạng túi chứa chất cần thẩm tích đặt trongmôi trường có pH nhất định, các phân tử nhỏ trong túi sẽ khuếch tán ra môi trườngngoài nhờ tác động của máy khuấy từ Thẩm tích thường dùng để loại muối và nhữngchất phân tử nhỏ không phải protein ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tích

1.5.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin

 Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích Tùy thuộc vào

pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm Lợi dụng tính chất nàyngười ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin Các chất nhựa gắn cácnhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi anion Các chất nhựa gắn các nhóm chứcion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…được sử dụng làmchất trao đổi cation

Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựavào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiệnmôi trường pH nhất định

 Sắc ký lọc gel

Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thướcphân tử Chất giá thường được sử dụng là Sephadex Mỗi hạt Sephadex có bản chất làpolysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp Có nhiều loạiSephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗxốp khác nhau Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất cókích thước phân tử khác nhau Để tinh chết lectin, người ta thường dùng loại SephadexG-75 và Sephadex G-100

Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân tử củachất cần tách