BÀI TÌM HIỂU TỔNG HỢP VI SINH NANO BẠC

CHUYÊN ĐỀ: SINH TỔNG HỢP NANO BẠC BẰNG VI KHUẨN E.COLI HỌC PHẦN: TỔNG HỢP SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ 1. Tổng quan 3 1.1 Giới thiệu 3 1.2 Tìm hiểu chung 3 1.2.1 Cái khái niệm liên quan tới nano 3 1.2.2 Hạt nano bạc 4 1.3 Chủng vi khuẩn Escherichia Coli 7 1.3.1.Hình thái 7 1.3.2 Nuôi cấy 7 1.3.3 Tính chất hoá sinh 8 2. Nguyên liệu và phương pháp 9 2.1 Nguồn vi sinh vật 9 2.2.1 Khái quát 9 2.3 Cách tiến hành 10 2.3.1 Tạo sinh khối 10 2.3.2 Tổng hợp các hạt nano bạc 10 2.3.3 Đặc tính của hạt nano bạc 11 2.3.4 Đo kích thước hạt 11 3. Kết quả và thảo luận 11 3.1 Ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp hạt nano bạc 11 3.2 Đặc tính của hạt nano bạc 14 3.3 Máy phân tích cỡ hạt 16  

``` ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA HOÁ HỌC

--BÀI BÁO CÁO

CHUYÊN ĐỀ: SINH TỔNG HỢP NANO BẠC BẰNG VI KHUẨN E.COLI

HỌC PHẦN: TỔNG HỢP SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ

Họ và tên sinh viên:

Nhóm 2

Lớp 14CHD

NĂM HỌC 2016 – 2017

M c l c ụ ụ

1 Tổng quan 3

1.1 Giới thiệu 3

1.2 Tìm hiểu chung 3

1.2.1 Cái khái niệm liên quan tới nano 3

1.2.2 Hạt nano bạc 4

1.3 Chủng vi khuẩn Escherichia Coli 7

1.3.1.Hình thái 7

1.3.2 Nuôi cấy 7

1.3.3 Tính chất hoá sinh 8

2 Nguyên liệu và phương pháp 9

2.1 Nguồn vi sinh vật 9

2.2.1 Khái quát 9

2.3 Cách tiến hành 10

2.3.1 Tạo sinh khối 10

2.3.2 Tổng hợp các hạt nano bạc 10

2.3.3 Đặc tính của hạt nano bạc 11

2.3.4 Đo kích thước hạt 11

3 Kết quả và thảo luận 11

3.1 Ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp hạt nano bạc 11

3.2 Đặc tính của hạt nano bạc 14

3.3 Máy phân tích cỡ hạt 16

MỞ ĐẦU

Phương pháp sinh học về khả năng nghiên cứu hình dạng của các hạt được tạo nên do

đó rất được mọi người chú ý trong công nghệ nano hiện đại Các chuẩn vi khuẩn Escherichia coli, được dùng trong tổng hợp vi sinh hạt nano bạc đã được tìm hiểu Những hạt nano bạc này được phân tích bằng phương pháp quang phổ UV-VIS, phân tích kích thước hạt Các hạt nano có độ hấp thụ tối đa ở bước sóng 400nm trong quang phổ UV-VIS tương ứng với sự cộng hưởng plasmon của hạt nano bạc

1 Tổng quan

1.1 Giới thiệu

Công nghệ nano là một lĩnh vực đang nổi lên trong liên ngành nghiên cứu, đặc biệt là trong công nghệ sinh học Sự tổng hợp các nguyên liệu nano bạc/ hạt nano bạc được nghiên cứu rộng rãi bằng các phương pháp hóa lý, nhưng sự phát triển của công nghệ đảm bảo để sản xuất ra hạt nano là một khía cạnh quan trọng trong công nghệ nano Tiến trình tổng hợp sinh học có thể cung cấp nhiều phương pháp có thể chấp nhận được về mặt môi trường, chi phí sản xuất thấp và thời gian cần thiết là tối thiểu Đồng thời các hạt nano bạc được tổng hợp bằng con đường sinh học có nhiều ứng dụng như: xúc tác trong phản ứng hóa học, chất đánh dấu sinh học, chất kháng khuẩn, pin điện hóa, quang thụ thể Nguồn vi sinh để tạo ra các hạt nano bạc cho thấy mối quan tâm lớn đối với sự kết tụ của các hạt nano là do độ hoạt động trao đổi chất của nó Tất nhiên sựkết tụ các hạt nano trong môi trường bên ngoài của tế bào, cho thấy các hoạt động ngoại bào của sinh vật Sự tổng hợp ngoại bào của các hạt nano sử dụng màng lọc tế bào có thể có lợi hơn tổng hợp nội bào, nấm là đối tượng rất tốt cho quá trình ngoại bào và cũng thân thiện với môi trường Có rất ít báo cáo được công bố thành tài liệu về tổng hợp sinh học các hạt nano bạc đi từ nấm Sử dụng vi khuẩn trong quá trình sản xuất sinh học có lợi thế hơn, vì dễ dàng xử lý hơn nấm

Trong nghiên cứu này, sản xuất vi sinh các hạt nano bạc đã được tìm hiểu bằng cách

sử dụng chủng vi khuẩn E.coli Nghiên cứu này bao hàm các thành phần trung bình khác nhau để sản xuất hạt nano bạc và mô tả các đặc tính của hạt bằng phương pháp phổ UV và phân tích nhiễu xạ laser kích thước hạt Theo hiểu biết của chúng tôi, tổng hợp ngoại bào hạt Ag bằng chuẩn vi khuẩn E.coli với hai thành phần trung bình cơ bản khác nhau đã chưa được báo cáo cho đến nay

1.2 Tìm hiểu chung

1.2.1 Cái khái niệm liên quan tới nano

1.2.1.1 Công nghệ nano

Là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên qui mô nanomet Đối tượng của công nghệ nano là vật liệu nano

1.2.1.2 Vật liệu nano

Là loại vật liệu có cấu trúc các hạt, các sợi, các ống, các tấm mỏng, có kích thước đặc trưng khoảng từ 1 nanômét đến 100 nanômét

1.2.1.3Hạt nano kim loại

Là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được tạo thành từ các kim loại Người ta biết rằng hạt nano kim loại như hạt nano vàng, nano bạc được sử dụng từ hàng nghìn năm nay

Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã thiết lập các phương pháp chế tạo và hiểu được các tính chất thú vị của hạt nano Một trong những tính chất đó là màu sắc của hạt nano phụ thuộc rất nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng

1.2.2 Hạt nano bạc

1.2.2.1 Khái niệm

Bạc nano là những hạt bạc có kích thước nằm trong khoảng 0,1 đến 100nm

Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer(polyvinylalcol PVA, polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP)

để cáchạt nano bạc không bị kết tụ

1.2.2.2 Đặc điểm

 Diệt trên 650 loại vi khuẩn

 Hiệu quả cao

 Tác dụng nhanh

 Không độc

 Không kích thích

 Không gây dị ứng

1.2.2.3 Ứng dụng

Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như:

- Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt

nano bạc có tác dụng khử trùng Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi khuẩn

Bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc

- Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử

mùi

Tất làm bằng sợi nilon có pha nano bạc

- Các thiết bị điện tử: Điều hòa, tủ lạnh, máy giặt

Điều hòa sử dụng bộ lọc nano bạc

- Y tế:

+ Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệt virus, lọc không khí rất tốt Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi

Khẩu trang nano bạc do viện môi trường sản xuất

+ Sản xuất thuốc chữa bệnh

Các dược phẩm sử dụng nano bạc

+ Màng hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước qua nhưng không thể cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại trong tấm film Các hạt nano bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn rất tốt

- Trong nông nghiệp

Sản phẩm thuốc trừ bệnh cây MIFUM 0,6 DD được sản xuất với nồng độ hạt nano bạc 1000 ppm và Chitosan 5000 ppm MIFUM 0,6 DD được khảo nghiệm trừ bệnh đạo ôn, lem lép hạt trên lúa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng và đã chứng tỏ ưu việt của mình, cà 2 liều lượng, 0,5 lít MIFUM 0,6 DD và 1 lít MIFUM 0,6 DD/ha đều cho đạt hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh đạo ôn cổ bông, lem lép hạt trên lúa, nhất là trong giai đoạn 3 – 7 ngày sau khi phun

- Trong công nghệ xử lýnước

Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano đã sử dụng vật liệu polyurethane mút xốp tẩm

nano bạc (PU/Ag) để xử lý nước uống nhiễm khuẩn E.coli Nước qua hệ lọc PU/Ag

khôngcònvi khuẩn và uống được theo tiêu chuẩncủa WHO

1.3 Chủng vi khuẩn Escherichia Coli

nghiên cứu một cách chi tiết từ năm 1886 Bình thường E coli sống trong đại tràng của người và động vật, chiếm 80% tổng số vi khuẩn ưa khí ở ruột và không gây bệnh

E coli tổng hợp ra một số vitamin B, C, K và tạo nên một trạng thái cân bằng vi khuẩn tại ruột

1.3.1.Hình thái

E coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước 0.5-3 um, thường đứng

riêng rẽ, có thể từng đôi hoặc chuỗi ngắn Vi khuẩn có lông ở xung quanh thân nên di động được, một số chủng có vỏ, không có bào tử

1.3.2 Nuôi cấy

E coli là vi khuẩn dễ nuôi cấy, ưa, kỵ khí tùy ngộ, phát triển tốt trên môi trường dinh

dưỡng thông thường Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tuỳ tiện Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 40°c

Trong những điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 – 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trưòng có váng mỏng Những ngày sau dưới đáy ống có thể thấy cặn

Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 – 10 giò, dùng kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc Sau 24 giờ khuẩn lạc khoảng 1,5 mm Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng II nhưng cũng có thể gặp dạng R, hoặc M

1.3.3 Tính chất hoá sinh

E coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi, khử nitrate thành nitrite Tất cả E coli đều lên men lactose và sinh hơi trừ ngoại lệ E coli loại EIEC

E coli có khả năng sinh indol, Không sinh H2S Không sử dụng được nguồn carbon của citrat trong môi trường Simmons Có decarboxylase vì vậy có khả náng khử carboxyl của lysin, ornitin, arginin và acid glutamic Betagalactosidase dương tính

2 Nguyên liệu và phương pháp

2.1 Nguồn vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, được lấy từ trung tâm thu mẫu vi khuẩn, Chandigarh, Ấn Độ Kết quả cho thấy môi trường nuôi cấy tinh khiết thu được ở môi trường thạch môi trường dinh dưỡng (HiMedia, Mumbai, Ấn Độ) ở 27 ° C cũng như nuôi cấy ở từng thời điểm để điều chỉnh tính khả thi của nó trong phòng thí nghiệm vi sinh học (Bộ Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Manipal, Manipal Đại học, Manipal, Ấn Độ) trong thời gian nghiên cứu

2.2 Tổng hợp bằng phương pháp sinh học

Có nhiều phương pháp để chế tạo hạt nano Ag như phương pháp hóa học, sinh học, vật lý…Nhiều phương pháp vật lý và hóa học được sử dụng rộng rãi để tạo các hạt nano Ag đơn phân tán Nhưng độ ổn định và sử dụng hóa chất độc hại là vấn đề được quan tâm Việc sử dụng hóa chất độc hại trên bề mặt hạt nano và dung môi không phân cực trong quá trình tổng hợp đã giới hạn ứng dụng vào lâm sàng

Do vậy, việc phát triển các phương pháp sạch, tương hợp sinh học, không độc hại, và thân thiện với môi trường luôn được công nhận Quá trình tổng hợp sinh học có thể mang lại lợi ích về mặt môi trường, chi phí sản xuất thấp, thời gian tối thiểu cần thiết, tiết kiệm năng lượng và không độc hại Các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm đã được nghiên cứu trong tổng hợp các hạt nano kim loại Sinh tổng hợp các hạt nano giúp tiến tới “hóa học xanh” và kết nối giữa công nghệ nano và công nghệ vi sinh

2.2.1 Khái quát

2.2.1.1 Cơ chế

Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở vi sinh vật vẫn chưa được tìm hiểu tường tận nhưng đa số giả thuyết cho rằng quá trình này liên quan đến hoạt động của enzyme khử nitrate (nitrate reductase) do vi sinh vật tiết ra Quá trình khử bắt đầu bởi

sự vận chuyển electron từ các chất cho electron đến Ag+ để khử các ion Ag+ tạo thành các nguyên tử Ag Các enzyme phụ thuộc NADH như nitrate reductase đóng vai trò chất vận chuyển điện tử Bên cạnh các enzyme này, một số naphthoquinone và

anthraquinone tìm thấy ở nấm Fusarium oxysporum cũng có thể đóng vai trò chất

truyền điện tử trong quá trình khử kim loại bởi tính chất oxi hóa khử đặc trưng của chúng

2.2.1.2 Phân loại

Dựa vào vị trí của các đám nguyên tử nano bạc được tổng hợp mà người ta chia quá trình tổng hợp sinh học thành hai dạng:

* Tổng hợp nội bào:

- Sản phẩm nano bạc tạo ra nằm bên trong tế bào

- Các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc nội bào là Psedomonas

stutzeri, Rhodococcus sp, Verticillium sp, Bacillus licheniformis

- Vì sản phẩm nano bạc tạo ra nằm trong tế bào nên để nhận được sản phẩm cần phải phá vỡ màng tế bào bằng hóa chất hoặc sóng siêu âm, sau đó ly tâm tách bỏ các mãnh

vỡ tế bào

- Ưu điểm của quá trình này là có thể kiểm soát được kích thước hạt nanobạc

* Tổng hợp ngoại bào:

- Sản phẩm được tạo ra nằm bên ngoài tế bào vi sinh vật

- Các chủng Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Aspergillus fumigatus ,

Aspergillus flavus , Phaenerochaete chrysosporium, Lactobacillus sp, Thermomonospora, Penicillium fellutanum,Pleurotus sajor caju

- Để thu sản phẩm nano bạc ngoại bào cần dùng các phương pháp tách tế bào ra khỏi dịch nuôi cấy như ly tâm, lọc… sau đó thu lấy phần dịch nổi

- Ưu điểm của quá trình này là không cần đến các phương pháp phá màng tế bào để thu nhận sản phẩm

2.3 Cách tiến hành

2.3.1 Tạo sinh khối

Các chủng vi khuẩn Escherichia coli được nuôi cấy, để sinh khối sinh tổng hợp trong hai môi trường lỏng khác nhau là môi trường nước dinh dưỡng và môi trường LB Các lọ nuôi cấy được ủ trên máy lắc quỹ đạo ở 27oC và khuấy ở 220 rpm Sinh khối được thu hoạch sau 24 giờ tăng trưởng và ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút Các vật liệu trên bề mặt đã được thu thập để tiếp tục phản ứng để tổng hợp các hạt nano

2.3.2 Tổng hợp các hạt nano bạc

Các chủng vi khuẩn Escherichia coli được nuôi cấy, để sinh khối sinh tổng hợp trong hai môi trường lỏng khác nhau là môi trường nước dinh dưỡng và môi trường LB Mẫu được bổ sung riêng vào bình phản ứng có chứa bạc nitrat (AgNO3) ở nồng độ 10-3 (1% v / v) và sự kiểm soát (không có sinh khối silentitrate, chỉ có sinh khối) cũng được chạy cùng với điều kiện thực nghiệm Phản ứng giữa các ion nổi trên và

Ag + được thực hiện trong điều kiện sáng trong 24 giờ

2.3.3 Đặc tính của hạt nano bạc

Việc xử lý các ion Ag + trong dung dịch được theo dõi và mẫu 2ml đã được thu hồi ở các khoảng thời gian khác nhau và độ hấp thụ được đo ở độ phân giải 1 nm sử dụng quang phổ quang phổ UV (PHARMASPEC UV-1700, SHIMADZU CORPORATION Ltd., KYOTO , JAPAN) với các mẫu trong cuvet thạch anh

2.3.4 Đo kích thước hạt

Các thí nghiệm phân tích kích thước hạt được thực hiện bằng phương pháp đo độ nhiễu laser (máy phân tích kích thước hạt laser); sử dụng một chiếc băng quang học cực kỳ nhỏ gọn, CILAS 1064 tích hợp 2 nguồn laser có trình tự chỉ với 0º và 45º Các phép đo được thực hiện trong khoảng từ 0,04 đến 500 μm Thông qua phần mềm, đường cong phân phối được thể hiện bằng 100 lớp trên phạm vi đã đề cập

3 Kết quả và thảo luận

Hệ thống nghiên cứu sinh học hoạt động trong môi trường nuôi cấy và các điều kiện hoá lý để tổng hợp các vật liệu vô cơ Phương pháp sinh học tổng hợp các hạt nano bạc biểu hiện sự hấp thụ mạnh mẽ của sóng điện từ trong phạm vi khả kiến do tính cộng hưởng quang học của chúng, được gọi là cộng hưởng bề mặt Plasmon (SPR), xảy ra do sự dao động tập hợp của các electron dẫn, kết hợp với ánh sáng tới SPR được ảnh hưởng lớn bởi hình dạng và kích thước hạt nano Tương tự như vậy, các vi sinh vật có sự tương tác giữa kim loại và vi khuẩn để sản xuất ion kim loại vô cơ và

có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh học, bao gồm xử lý sinh học, biomineralization, ngâm chiết sinh học và ăn mòn vi sinh vật

3.1 Ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp hạt nano bạc

Các chủng vi khuẩn của E coli đã được tiêm vào các môi trường cơ bản khác nhau như LB và môi trường Broth Nutrient (canh nuôi cấy) Cả hai môi trường cho thấy cùng một lượng sinh khối, nhưng sự tổng hợp của các hạt nano bạc trong môi trường

LB tối đa hơn so với môi trường chứa chất dinh dưỡng (dữ liệu không được hiển thị) Thể cấu tạo chính của sự tổng hợp các hạt nano trong môi trường được đặc trưng bởi sự thay đổi màu sắc từ trắng ngà sang nâu Khi thêm ion Ag+ vào trên bề mặt môi trường nuôi cấy thì kết quả là mẫu hình thành màu nâu, cường độ màu tăng lên trong thời gian lên men do sự giảm Ag0 (Hình 2a và 2b) Kiểm soát (không có bạc nitrat) cho thấy không có sự hình thành màu sắc trong nuôi cấy khi trong cùng thời gian và điều kiện nuôi cấy Trong sự thay đổi màu sắc trên bề mặt môi trường nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian lên men, nhưng môi trường nuôi cấy cần thời gian lâu hơn để tạo màu Tổng hợp các hạt nano bạc cũng phụ thuộc vào thời kỳ lên men của môi trường nuôi cấy