THUỐC TRỪ sâu VI SINH BACILLUS THURINGENSIS hoàn chỉnh docx

7. Tổng quan Nhiều thập kỷ qua, thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV) là những hợp chất clo và photpho hữu cơ đã phát huy được tác dụng tích cực trong việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ cây trồng, tuy nhiên nó lại gây ra những tác dụng không mong muốn như xảy ra hiện tượng nhờn thuốc , tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng nhiều, ảnh hưởng xấu đến môi trường sống, ô nhiễm lương thực, thực phẩm, gây ngộ độc chết người và sinh ra nhiều bệnh tật. Do vậy, việc sử dụng các tác nhân sinh học như virut, vi khuẩn, vi nấm hay các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh để phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng là rất hữu ích và cần thiết, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh đã và đang được lựa chọn. 2. Thuốc trừ sâu vi sinh vật 2.1 Khái niệm

DANH SÁCH PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ

Sinh viên thực hiện:

Nhiệm vụ:

1 Đoàn Thiện Duy: Tổng quan, các thiết bị trong công nghệ sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu Bacillus thunrigensis, làm power point

2 Nguyễn Nhật Tuyến: Phân loại thuốc trừ sâu sinh học vi sinh, làm powerpoint

3 Mai Thị Hoàng Yến: Tìm hiểu về vi khuẩn Bacillus thunrigensis, làm powerpoint

4 Ngô Thị Thanh Ý: Tìm hiểu về quy trình sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu Bacillus thunrigensis, edit bài

5 Nguyễn Xuân Huyền Diệu: Tìm hiểu ưu, nhược điểm của chế phẩm Bt, thực trạng

sử dụng chế phẩm hiện nay, kết luận, làm power point

1.

2.

3.

5.

6.

7 Tổng quan

Nhiều thập kỷ qua, thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV) - là những hợp chất clo

và photpho hữu cơ đã phát huy được tác dụng tích cực trong việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ cây trồng, tuy nhiên nó lại gây ra những tác dụng không mong muốn như xảy ra hiện tượng nhờn thuốc , tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng nhiều, ảnh hưởng xấu đến môi trường sống, ô nhiễm lương thực, thực phẩm, gây ngộ độc chết người và sinh ra nhiều bệnh tật Do vậy, việc sử dụng các tác nhân sinh học như virut, vi khuẩn, vi nấm hay các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh để phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng là rất hữu ích và cần thiết, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh đã và đang được lựa chọn

2 Thuốc trừ sâu vi sinh vật

2.1 Khái niệm

Thuốc trừ sâu sinh học vi sinh là những chế phẩm sinh học được sản xuất

ra từ các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp lên men công nghiệp để tạo ranhững chế phẩm có chất lượng cao,

có khả năng phòng trừ được các loại sâu, bọ gây hại cây trồng nông, lâm nghiệp mà không gây ô nhiễm môi trường và sức khỏe con người

2.2 Phân loại

 Chế phẩm vi khuẩn trừ sâu: sử dụng các loại vi khuẩn có tinh thể protein độc, khi nuốt phải bào tử có tinh thể protein độc này, cơ thể sâu bọ bị tê liệt và chết như vi khuẩn Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, Clostridium malacosomae,…

 Chế phẩm virus trừ sâu: sử dụng các loại virus như nhóm Baculovirus,… gây bệnh cho sâu bọ Khi bị mắc bệnh, sâu bọ bị mềm nhũn do các cơ bị tan rã, màu sắc và độ căng của cơ thể bị biến đổi làm cho chúng suy yếu và chết

 Chế phẩm vi nấm trừ sâu: sử dụng các nhóm nấm gây bệnh cho sâu như nấm túi và nấm phấn trắng Sau khi bị nhiễm nấm, cơ thể bị trương lên và dẫn đến chết

2.3 Ưu điểm và nhược điểm

 Ưu điểm:

 Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây

 Có tác dụng cân bằng hệ sinh thái ( vi sinh vật, dinh dưỡng …) trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

 Ứng dụng các chế phẩm sinh học không làm ảnh hưởng đến kết cấu đất, không làm chai đất, thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

 Có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông sản phẩm

 Có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các lọai thuốc BVTV có nguồn gốc hóa học khác

 Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu cơ bền vững, các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

 Nhược điểm:

 Thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so với thuốc hóa học

 Sự bảo quản của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều kiện chặt chẽ hơn

3 Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis

3.1 Giới thiệuvi khuẩn Bacillus thuringiensis

3.1.1 Lịch sử

Năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp đã phát hiện một loại vi khuẩn gây bệnh cho tằm và đặt tên là Bacillus bombycis Năm 1901, Ishiwata phân lập ra một loại vi khuẩn từ ấu trùng tằm bị bệnh và đặt tên là Bacillus sotto Năm 1911, Berliner đã phân lập được một loại vi khuẩn tương tự từ xác ẩu trùng bướm Địa Trung Hải Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức được mang tên là Bacillus thuringiensis

3.1.2 Đặc điểm

 Bacillus thuringenis là trực khuẩn sinh bào tử, thuộc nhóm tế bào nhuộm Gram dương Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi

 Hô hấp: hiếu khí hoặc tùy tiện

 Sinh sản: dị dưỡng hoại sinh, sinh trưởng ở 15ºC- 45 ºC

 Khi trưởng thành tế bào sinh bào tử trứng và tinh thể độc (paraposal body):

- Tinh thể độc: có bản chất protein, hình quả trám và có kích thước khoảng 0,6 - 2 µm

- Bào tử trứng: dài 1,6 – 2 µm, có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng Mỗi tế bào có kích thước dài từ 3 – 6 µm, có phủ tiêm mao không dày, chuyển động được

3.1.3 Độc tính và cơ chế gây độc của vi khuẩn Bacillus thuringenis

 Độc tố: có 4 loại độc tố khác nhau:

 Ngoại độc tố α exotoxin (phospholipaza ): Một loại men liên quan đến đến sự phân hủy phospholipid dẫn đến chết sâu bọ

 Ngoại độc tố β exotoxin (ngoại độc tố bền nhiệt): Có khối lượng phân tử thấp Sau 15 phút ở 1200C vẫn còn hoạt tính Chúng làm cản trở việc tổng hợp ARN thông tin của sâu bọ và xâm nhiễm nhanh vào huyết tương đến các cơ quan làm thay đổi quá trình trao đổi chất, sâu bọ mau chết

 Ngoại độc tố γ exotoxin (độc tố tan trong nước): Gồm một số axit amin tự do, tan trong nước, mẫn cảm với ánh sáng

 Nội độc tố δ exotoxin (tinh thể độc):

- Bản chất: protein kết tinh từ 1180 gốc axit amin trong đó 2 loại axit amin chiếm tỷ lệ cao là axit glutamic và axit asparaginic

- Hoạt tính của tinh thể độc: tinh thể độc là tiền độc tố, nó được hoạt hóa trong ruột một số loại côn trùng với pH thích hợp và hình thành những phân tử độc có phân tử lượng lớn Nội độc tố δ exotoxin quan trọng nhất và quyết định hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringenis

Hình: Bào tử Bt và tinh thể độc

Có 2 yếu tố thúc đẩy tinh thể độc gây độc:

- pH: Tinh thể độc sẽ bị phân giải trong đường ruột sâu bọ khi pH tăng lên trên 8,9 và khi nó bị phân giải thì sẽ thể hiện tính độc

- Khả năng sản sinh enzyme phân giải protein: vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme proteinase trong đường ruột của côn trùng, chuyển hóa tiền độc tố thành dạng độc tố đối với cơ thể côn trùng

 Cơ chế tác động chung:

- Vi khuẩn Bt xâm nhập vào các ấu trùng của sâu bọ qua đường tiêu hóa

- Tinh thể độc được hoạt hóa dưới tác động của môi trường kiềm trong ruột sâu bọ

- Chọc thủng ruột giữa gây ra sự tổn thương hệ điều hòa trao đổi chất, gây tê liệt đường ruột, khoang miệng, có thể toàn thân, làm chúng ngừng ăn và chết

Tùy theo mỗi loại côn trùng mà xuất hiện 3 cơ chế tác động của tinh thể độc:

- Sau khi ăn phải tinh thể độc từ 3-20phút, ruột giữa của côn trùng

bị liệt, pH trong máu và của tế bào bạch huyết tăng, pH của ruột giữa giảm do chất kiềm của máu thấm vào máu Các tế bào biểu

mô ruột bị phá hủy Sau 1 giờ, toàn bộ cơ thể sâu bị tê liệt

- Sau khi ăn phải tinh thể độc, sâu ngừng ăn vì ruột bị tê liệt nhưng

pH trong máu và của tế bào bạch huyết không tăng

Sau 2-4 ngày, sâu chết mặc dù sâu non không bị tê liệt hoàn toàn

Nguyên liệu Xử lý nguyên liệu Chuẩn bị môi trường

Thanh trùng ở 1210C/30’

Nuôi mở rộng (lên men) Giống VK thuần chủng B.thuringiensis Nhân giống (cấp 1, 2, 3)

Bán thành phẩm Thành phẩm

- Côn trùng ăn phải tinh thể độc kèm theo bào tử sau 2-4 ngày sẽ chết, mặc dù không thấy hiện tượng tê liệt

thurginensis

3.2.1 Chọn giống sản xuất

 Chọn chủng tự nhiên có độc lực cao:

Phân lập từ đất và côn trùng, mỗi chủng VSV chỉ chứa một hoặc một vài gene tổng hợp protein độc hại với một loài sâu nhất định

 Tạo giống bằng gây đột biến và công nghệ gene:

Để sản xuất được chế phẩm diệt được nhiều loại sâu, tiến hành xác định có chọn lọc những đoạn gene đó rồi dùng kỹ thuật chuyển gene để đưa vào một chủng Bt

Chủng giống Bt này sẽ được cấy vào bình lên men, ở nhiệt độ 28-300C Sau khoảng 52-54h có thể thu được dịch thể chưa các tinh thể protein độc tố đối với sâu hại

3.2.2 Nguyên liệu và môi trường nuôi cấy

Do vi khuẩn Bt có thể tiết ra enzyme amylaza, proteaza ngoại bào nên sử dụng các sản phẩm thủy phân là tinh bột và protein trong các sản phẩm nông nghiệp hoặc

phế thải khi chế biến nông sản để làm môi trường nuôi cấy, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, giúp vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt

 Thành phần môi trường:

- pH=7,8

 Thanh trùng ở 1210C trong 30 phút

3.2.3 Lên men (nuôi cấy mở rộng thu sinh khối)

 Phương pháp lên men bề mặt

Là phương pháp mà vi khuẩn sẽ mọc lên trên bề mặt cơ chất là các hạt, sợi, mảng nguyên liệu và tiếp nhận oxy của không khí để sinh trường

 Quy trình:

o Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có độ thoáng tốt, các nguyên liệu không nên nghiền quá nhỏ mà xay vỡ thành các mảnh 1-3mm, trộn thêm trấu hay mùn cưa, sau đó trải mỏng ra các khay Nước làm ẩm môi trường có pH= 6,5-7,5 hấp vô khuẩn ở 1210C khoảng 1h

o Các khay được phun dịch nhân giống vào môi trường được đặt trong các phòng nuôi cấy có quạt hút, nhiệt độ là 28-350C sau 4-5 ngày, vi khuẩn phát triển và sinh bào tử cũng như hình thành tinh thể độc

 Phương pháp lên men chìm

Là phương pháp vi khuẩn phát triển trong môi trường lỏng được nuôi cấy trong các nồi lên men

 Quy trình:

o Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thường là dạng lỏng

o Nồi lên men được thổi khí qua máy nén trong điều kiện vô trùng, có thể điều chỉnh nhiệt độ, pH thích hợp

o Vi khuẩn được nuôi cấy trong các nồi lên men với thời gian 2-3 ngày Thu gom dịch nuôi cấy

 Ưu điểm và nhược điểm:

Phương pháp lên men chìm Phương pháp lên men bề mặt

Đòi hỏi trang thiết bị kĩ thuật cao, độ vô

trùng tuyệt đối Thiết bị đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi vô trùng tuyệt đối

Khó xử lý khi bị nhiễm, hư hỏng toàn bộ

và bỏ đi hoàn toàn

Dễ xử lý khi bị nhiễm, loại bỏ phần nhiễm, phần còn lại sử dụng được Tiết kiệm diện tích bề mặt Tốn diện tích bề mặt

Dễ cơ giới hóa, tự động hóa Khó cơ giới hóa, tự động hóa

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát triển tạo bào tử và tinh thể độc

- Nhiệt độ thích hợp: 25-350C

- pH thích hợp: 7,0; pH quá cao hoăc quá thấp làm biến tính tinh thể

- Lượng oxy đưa vào môi trường phải tùy theo từng giai đoạn:

 Giai đoạn sinh trưởng thiếu oxy: tích lũy sinh khối giảm dần

 Giai đoạn tạo bào tử và hình thành tinh thể độc: thừa oxy lượng bào tử không thay đổi nhưng lượng tinh thể tạo thành đã giảm mạnh

3.2.4 Thu hồi sản phẩm và tạo chế phẩm kỹ thuật

 Với phương pháp lên men bề mặt

Sau khi kết thúc nuôi cấy, thu gom môi trường ở các khay và sấy ở không khí nóng

 Với phương pháp lên men chìm có thể tạo thành ba loại chế phẩm

- Chế phẩm dạng lỏng: dịch lên men sau khi kết thúc được bổ sung các chất phụ gia, chất bảo quản rồi đóng chai

- Chế phẩm dạng nhão: Sau khi ly tâm dịch lên men ta thu được sinh khối ướt có

độ ẩm khoảng 85%, không cần sấy khô mà trộn với dầu thành dạng nhũ tương

- Chế phẩm dạng bột: ly tâm thu được dạng dịch đặc nhão, sau đó trộn với các chất phụ gia như tinh bột, xenlulozo, Rồi đem sấy bằng các thiết bị sấy phun hoặc sấy thăng hoa Bột khô đóng gói bao PE hoặc giấy thiếc

3.3 Các thiết bị sản xuất

a Thiết bị lên men bề mặt có khay được phân bố đứng

Dây chuyền gồm các công đoạn: chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, nuôi cấy, trích ly, lắng , tách và sấy, tiêu chuẩn hoá và gói chế phẩm Giai đoạn quan trọng nhất của dây chuyền là chuẩn bị môi trường dinh dưỡng và nuôi cấy giống nấm mốc, gồm hai băng chuyền công nghệ độc lập nhau

b Thiết bị lên men chìm

Thiết bị lên men với bộđảo trộn cơ học dạng sủi bọt cósức chứa 63 m3

1- Động cơ; 2- Hộp giảm tốc; 3- Khớp nối; 4- Ổ bi; 5- Vòng bít kín; 6- Trục; 7- Thành thiết bị ; 8- Máy khuấy trộn tuabin; 9- Bộ trao đổi nhiệt kiểu ống xoắn; 10- Khớp nối; 11- Ống nạp không khí; 12- Máy trộn kiểu cánh quạt; 13- Bộ sủi bọt; 14- Máy khuấy dạng vít; 15- Ổ đỡ; 16- Khớp để tháo; 17- Áo; 18- Khớp nạp liệu; 19- Khớp nạp không khí

 Nguyên lý hoạt động:

Động cơ - bộ truyền động làm quay trục 6 và các cơ cấu đảo trộn 8, 12, 14 Sử dụng bộ giảm tốc và bộ dẫn động có dòng điện không đổi để điều chỉnh vô cấp số vòng quay trong giới hạn 110  200 vòng/ phút.Thiết bị lên men được trang bị áo

17, gồm từ 6  8 ô Mỗi ô có 8 rãnh được chế tạo bằng thép Thiết bị lên men được tính toán để hoạt động tiệt trùng ở nhiệt độ 130  140 oC, cũng như để hoạt động dưới chân không Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, áp suất bên trong thiết bị 50 kPa; tiêu hao không khí tiệt trùng đến 1(m3 /phút) Chiều cao cột chất lỏng trong thiết bị 5  6 m khi chiều cao của thiết bị hơn 8 m.Để đảm bảo tiệt trùng trong suốt quá trình (giữ được hơi), các trục của cơ cấu chuyển đảo phải có vòng bít kín Các vòng bít kín được tính toán để hoạt động ở áp suất 0,28 MPa và áp suất dư không nhỏ hơn 2,7 kPa, nhiệt độ 30  250 oC và số vòng quay của trục đến 500 vòng/ phút Nhờ các vòng đệm này mà ngăn ngừa được sự rò rỉ môi trường hay sự xâm nhập không khí vào khoang thiết bị ở vị trí nhô ra của trục.Vòng bít kín khi tiếp xúc với môi trường làm việc được chế tạo bằng thép cũng như bằng titan BT-10 Thời gian hoạt động ổn định của các vòng này không nhỏ hơn 2000 h khi tuổi thọ

8000 h Độ đảo hướng kính cho phép của trục trong vùng đệm kín không lớn hơn 0,25 mm, độ đảo chiều trục của trục không lớn hơn 0,250

c Thiết bị ly tâm

Máy ly tâm lọc làm việc liên tục có piston đẩy pha rắn

d Thiết bị lọc vi sinh

e Thiết bị thanh trùng

Thiết bị thanh trùng dạng nằm ngang

f Thiết bị sấy

Hệ thống sấy phun tổ hợp

3.4.1 Ưu điểm

Kết quả thử nghiệm cho thấy các chế phẩm Bt diệt được gần 90% sâu hại, so với gần 80% của thuốc hóa học

- Tạo ra các sản phẩm sạch cho con người

- Không gây ô nhiễm môi trường

- Bt có hiệu lực cao đối với sâu đã kháng các loại thuốc gốc lân, carbamat,…

- Không gây tính kháng thuốc với sâu hại

- Tinh thể độc do Bt tạo ra không thể hòa tan trong dịch dạ dày của người nên thuốc trừ sâu sinh học Bt hoàn toàn vô hại đối với người, cũng như các sinh vật khác

- Không làm mất đi một quần thể thiên địch có ích trong tự nhiên và vi simh vật có lợi cho con người

- Không cần phun nhiều lần mà vẫn duy trì được hiệu quả

- Thời gian cách ly ngắn

- Mang lại hiệu quả kinh tế cao nếu sử dụng hợp lý, đúng phương pháp, đúng kỹ thuật trong điều kiện nhiệt độ thích hợp

3.4.2 Nhược điểm

- Chỉ diệt được sâu non khi chúng ăn lá, không diệt được trứng, nhộng và bướm

- Dễ bị phân hủy bởi tia cực tím có trong ánh mặt trời

- Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn, thường 1-2 năm, trong những điều kiện lạnh, khô

- Hạn chế lớn nhất là phát tác chậm, 48 tiếng sau khi ăn độc tố thì sâu mới chết Tác động của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm bởi vì thuốc trừ sâu vi sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâu thì thời gian ủ bệnh phải mất 1-3 ngày

- Thuốc vi sinh có công nghệ sản xuất phức tạp thủ công nên giá thành cao ở Việt Nam

Cách khắc phục:

 Nên chú ý phun sớm từ khi sâu non từ 1-3 ngày tuổi

 Nên phun vào lúc chiều mát

 Cần phun ướt đều hai mặt lá nhất là mặt dưới và các bộ phận của cây mà sâu thích ăn; có thể thêm một ít rỉ đường để tặng sự bám dính thì hiệu quả diệt sâu

sẽ cao hơn

3.5 Hiện trạng sử dụng chế phẩm

 Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt đã chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới cũng như ở Việt Nam: chế phẩm Bt đã được sử dụng trong sản xuất nông nghiệp và diệt được nhiều loại côn trùng gây hại cho cây trồng như: