Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của ba loài thuộc chi gynostemma blume ở việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM TUẤN ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA BA LOÀI THUỘC CHI GYNOSTEMMA BLUME Ở VIỆT NAM Chu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM TUẤN ANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA BA LOÀI

THUỘC CHI GYNOSTEMMA BLUME Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền

Mã số: 62731001

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Hà Nội, năm 2019

Công trình được hoàn thành tại:

- Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Viện Hóa học, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y

- Khoa Dược lý - Viện Dược liệu

Người hướng dẫn khoa học:

vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội

A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Chi Gynostemma Blume có khoảng 19 loài phân bố từ vùng nhiệt đới

châu Á tới Đông Á: từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia, và New Guinea

Loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino (Cổ yếm, Thất diệp đởm, Giảo cổ

lam) đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian với các tác dụng chữa ho, chữa viêm phế quản, chống viêm và giải độc Thành phần chính của dược liệu Giảo cổ lam là các saponin dammaran (gọi là gypenosid) có nhiều tác dụng đáng chú ý như hạ lipid, hạ đường huyết, điều tiết chức năng miễn dịch, gây độc tế bào Các saponin này có cấu trúc đa dạng, khác nhau vị trí nhóm thế và các gốc đường

Tại Việt Nam, qua các khảo sát ban đầu chi Gynostemma Blume cũng

đa dạng về loài, dưới loài Về cảm quan và định tính sơ bộ thấy các mẫu dược liệu này có vị khác nhau, thành phần hóa học cũng không giống nhau Thực tế trong sản xuất vẫn dùng lẫn các dược liệu này với cùng công dụng

của loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino, ảnh hưởng tới chất lượng và độ

an toàn trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ dược liệu Giảo cổ lam Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng có hiệu quả hơn

các loài trong chi Gynostemma Blume ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của

ba loài thuộc chi Gynostemma Blume ở Việt Nam”

2 Mục tiêu của luận án

- Giám định tên khoa học của ba mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu

- Nghiên cứu thành phần hóa học ba loài Giảo cổ lam

- Đánh giá tác độc tính cấp và một số tác dụng sinh học (gây độc tế bào ung thư, ức chế NF-κB và chống viêm)

3 Những đóng góp mới của luận án

3.1 Về thực vật

Ba loài được giám định tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum (Giảo cổ lam năm lá), Gynostemma longipes (Giảo cổ lam cuống quả dài)

và Gynostemma laxum (Cổ yếm lá bóng) được mô tả chi tiết đặc điểm thực

vật, có ảnh chụp đầy đủ cơ quan dinh dưỡng và cơ quan sinh sản

3.1 Về hóa học

Từ loài G pentaphyllum đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học

của 8 saponin dammaran, trong đó có 1 hợp chất đã biết trihydroxydammar-24-en 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-21-O-β-D-glucopyranosid

3β,20S,21-(SAP2) và 7 hợp chất mới đặt tên là gypenosid VN1-7

Từ loài G longipes đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của

3 saponin dammaran, trong đó có 1 hợp chất đã biết trihydroxy-19-oxo-21,23-epoxydammar-24-en 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl

(23S)-3β,20ξ,21ξ-(1→2)][β-D-xylopyranosyl(1→3)]-α-L-arabinopyranosid và 2 hợp chất mới đặt tên là gylongiposid II và gylongiposid III

Từ loài G laxum đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 9

hợp chất là quercetin (E5), ombuin (E1), rhamnetin-3-O-rutinosid (GL-8), 2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid (GL-2), benzyl-O-β-D-glucopyranosid (GL-6), benzyl-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid (GL-9), ethyl-β-rutinosid (GL-1), acid vanillic (GL-10) và

3,4-dihydroxybenzoat ethyl (GL-7B) Trong đó α-L-rhamnopyranosid là hợp chất mới

2,4-dihydroxy-benzyl-O-3.3 Về độc tính và tác dụng sinh học

Lần đầu tiên công bố độc tính cấp của cao chiết nước từ loài G longipes

và G laxum Kết quả độc tính cấp của G longipes có LD50 là 119,49 g dược

liệu/kg ttc, còn G laxum chưa thấy độc khi dùng đến liều 150 g dược liệu/kg

ttc bằng đường uống

Saponin toàn phần chiết từ G pentaphyllum có tác dụng ức chế dòng tế

bào OVCAR8 mức độ yếu (112,09 µg/ml), Lu mức độ trung bình (87,62 µg/ml) và MCF-7 mức độ trung bình (50,88 µg/ml) Bảy saponin phân lập

từ G pentaphyllum là gypenosid VN1-7 đều có tác dụng ức chế các dòng

tế bào MCF-7, HT-29, A549, SK-OV-3 trong đó mạnh nhất là gypenosid VN2 đạt IC50 = 19,6 µM đối với dòng ung thư phổi A549 Các gypenosid VN1-7 ức chế yếu dòng tế bào HL-60

Phân đoạn GL3C chiết từ G longipes có tác dụng ức chế dòng tế bào

OVCAR8 mức độ yếu (109,04 µg/ml), Lu và MCF-7 mức độ trung bình

(86,33 và 72,65 µg/ml) Các saponin tinh khiết phân lập từ G longipes có

mạnh nhất là CGP7 đạt IC50 = 9,8 µM trên dòng tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-8

Ba hợp chất phân lập từ G laxum thể hiện tác dụng ức chế phụ thuộc

vào liều đối với NF-κB hoạt hóa bởi TNF-α là ethyl-β-rutinosid; dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid và rhamnetin-3-O-rutinosid với

2,4-IC50 lần lượt là 9,3 ± 0,3; 7,6 ± 0,4 và 9,2 ± 0,3 µM Hợp chất dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid có tác dụng ức chế đáng kể và ethyl-β-rutinosid; rhamnetin-3-O-rutinosid ức chế yếu đối với gen biểu hiện iNOS và COX-2 do TNF-α kích hoạt

2,4-4 Ý nghĩa của luận án

Luận án đã đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học, độc

tính cấp và tác dụng sinh học của 3 loài thực vật thuộc chi Gynostemma Blume

ở Việt Nam: G pentaphyllum, G longipes và G laxum

Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học đã phát hiện 10 chất mới lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên

Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp và tác dụng sinh học góp phần giải thích kinh nghiệm sử dụng của người dân địa phương và là cơ sở khoa học

mở ra triển vọng nghiên cứu đầy đủ hơn để có thể sử dụng rộng rãi dược liệu này trong cộng đồng

Luận án có 183 tài liệu tham khảo và 3 phụ lục (90 trang)

B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1 TỔNG QUAN

Tổng hợp và phân tích vị trí phân loại chi Gynostemma Blume, họ Bí

(Cucurbitaceae) Tập hợp và trình bày một cách hệ thống các kết quả nghiên cứu tới nay về thực vật, thành phần hóa học, tác dụng sinh học và công dụng

của một số loài trong chi Gynostemma Blume trên thế giới và ở Việt Nam

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Mẫu Giảo cổ lam năm lá (G pentaphyllum) thu hái tại tỉnh Cao Bằng

vào tháng 9 năm 2005 và thu hái tại Sapa, tỉnh Lào Cai vào tháng 3,4 và tháng 7,8 năm 2010

Mẫu Giảo cổ lam cuống quả dài (G longipes) thu hái tại Sapa, tỉnh Lào

Cai vào tháng 3,4 và tháng 7,8 năm 2010

Mẫu Cổ yếm lá bóng (G laxum) thu hái tại huyện Đà Bắc, tỉnh Hòa Bình

vào tháng 7,8 năm 2010

- Các hóa chất, thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam Các dòng tế bào, thuốc thử sinh học và chuột thí nghiệm đạt tiêu chuẩn nghiên cứu

2.2 Phương pháp giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Thẩm định tên khoa học của 3 mẫu nghiên cứu dựa trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, thực vật, đối chiếu với khóa phân loại và tiêu bản mẫu chuẩn lưu ở các phòng tiêu bản

2.3 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ của G longipes và G laxum

Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học đặc hiệu

2.3.2 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng các hợp chất trong dược liệu

Chiết xuất các chất trong dược liệu bằng phương pháp chiết nóng hồi lưu với methanol, thu hồi dung môi được cao thô

Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột nhiều lần

Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào độ chảy, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ tử ngoại (UV-Vis), phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) kết hợp đối chiếu với tài liệu đã công bố

Sơ đồ chiết xuất và phân lập của 3 loài theo hình 2.1, 2.2 và 2.3

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các chất từ G pentaphyllum

2.4 Đánh giá độc tính cấp và một số tác dụng sinh học

2.4.1 Độc tính cấp của G longipes và G laxum

Đánh giá độc tính cấp theo hướng dẫn của Đỗ Trung Đàm và tính giá trị

LD50 theo phương pháp của Litchfied – Wilcoxon (1949)

2.4.2 Tác dụng gây độc tế bào của G pentaphyllum và G longipes

Đánh giá tác dụng gây độc tế bào theo phương pháp MTT theo tác giả Mosmann (1983)

2.4.3 Tác dụng ức chế NF-κB và chống viêm của G laxum

Đánh giá tác dụng ức chế NF-κB thực hiện theo phương pháp đo hoạt

độ luciferase của Kim và cs (2010) Chứng minh tác dụng chống viêm thể hiện qua tác dụng ức chế phiên mã các enzym iNOS và COX-2 bằng kỹ thuật PCR phiên mã ngược

- Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống

kê sinh học, sử dụng công cụ R.

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các chất từ G longipes

Hình 2.3 Sơ đồ phân lập các chất từ G laxum

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Mô tả chi tiết và đầy đủ các bộ phận của cơ quan dinh dưỡng (thân, lá),

cơ quan sinh sản (hoa, quả, hạt), đối chiếu với các tiêu bản lưu và các khóa phân loại và đã giám định các mẫu nghiên cứu:

- Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino (Giảo cổ lam năm lá)

- Gynostemma longipes C Y Wu (Giảo cổ lam cuống quả dài)

- Gynostemma laxum (Wall.) Cogn (Cổ yếm lá bóng)

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ

Hai mẫu G longipes và G laxum đều có các nhóm chất flavonoid,

saponin, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, sterol và polysaccharid Đặc

biệt, mẫu G longipes chứa nhiều saponin ít flavonoid ngược lại với mẫu G laxum

3.2.2 Nhận dạng các chất phân lập từ Gynostemma pentaphyllum

Từ cao thô saponin (SP) của Giảo cổ lam năm lá (G pentaphyllum) đã

phân lập được 8 chất, ký hiệu là SAP1 – SAP8 Các hợp chất được nhận

dạng dựa vào các dữ liệu phổ MS, NMR một và hai chiều (bảng 3.1 và 3.2)

Tám hợp chất từ loài G pentaphyllum đều là saponin khung dammaran,

trong đó SAP2 là hợp chất đã biết, còn lại là 7 hợp chất mới đặt tên lần lượt

O-α-L-rham-nopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-ara-Chất rắn màu trắng; FTICR-MS:m/z 1247,63991 [M+Na]+ - C59H100O26

Hợp chất SAP4 (gypenosid VN2):

3β,20S,21-trihydroxydammar-24-en-12-on

3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabino-pyranosyl-21-O-β-D-glucopyranosid

1 9 18 20

30

29 28

17 24

O O

OH HO

30

29 28

17 24

O HO OH O

O OH HO HO

HO

O O HO

O O

OH HO HO

30

29 28

17 24

O O

OH HO

HO

H 3 C

O HO OH HO

6 ''''

1 9 18 20

30

29 28

17 24

O O O O

OH HO HO

H 3 C

O HO OH HO

30

29 28

17 24

O O

OH HO

HO

H 3 C

O HO HO OH HO

HO

O

O O

O OH HO HO

HO

O O HO

O O

OH HO HO

H 3 C

O

OH H

20 24 25

1''

2'' 3'' 4''

O

O

OH HO

HO

H3C

O

O H

20 21 25

1 9 18

30

29 28

17

1' 2' 3' 4' 5'

1''

2'' 3'' 4'' 5'' 6''

1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6''' O

OH HO HO

HO

O O HO

O

O

OH HO HO H3C

O

O HO HO OH

H

24 25

20 21

Hình 3.1 Các chất phân lập được từ G pentaphyllum

SAP2 SAP8 (gypenosid VN1)

O

OH HO

HO

H3C

O HO HO OH HO

HO

O

O O

OH

HO HO OH

O

OH HO HO

HO

O O HO

O

O

OH HO HO H3C

O

H HO

Hình 3.2 Tương tác HMBC và COSY của gypenosid VN4, VN5

Chất rắn màu trắng; [α]D25 = -8,4 (C 0,25; MeOH); ESI-MS m/z 1115

[M+Na]+; 1091 [M-H]; FTICR-MS: m/z 1115,56630 [M+Na]+ - C53H88O23

Hợp chất SAP5 (gypenosid VN5):

Hợp chất SAP6 (gypenosid VN7):

Gyp VN3

Gyp VN4

Gyp VN5

Gyp VN6

Gyp VN7

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR của các chất phân lập từ G pentaphyllum (Đo trong CD3 OD, 500 MHz)

C SAP2 Gyp VN1 Gyp VN2 Gyp VN3 Gyp VN4 Gyp VN5 Gyp VN6 Gyp VN7

3.2.3 Nhận dạng các chất phân lập từ Gynostemma longipes

Từ phân đoạn nước (GL3) của G longipes đã phân lập được 3 chất, ký

hiệu CGP1, CGP5 và CGP7 Các chất được nhận dạng dựa vào các dữ liệu phổ MS, NMR (bảng 3.3) Trong đó, CGP7 là chất đã biết Hai chất còn lại

là chất mới, đặt tên lần lượt gylongiposid II và III (hình 3.3)

25

17

28 29

30

18 9 1

O

O HO HO H

O HO

O OH

O HO

HO HO

25 26 27

22

O HO

O OH

O HO

HO HO

OH O

O HO

1 9 18

HO

O O HO

O O

OH HO HO

H 3 C

CHO

O

O HO HO H

24 25

20 21

Hình 3.3 Cấu trúc và tương tác HMBC, COSY của CGP1,5 và 7

Hợp chất CGP1 (gylongiposid II): 3β,20β,21β-trihydroxy-21,23α-epoxy

Hợp chất CGP5 (gylongiposid III): 3β,25-dihydroxy-20,24;21,24-diepoxy

23 74,24 4,94 (dd, 8,5;

16,0)

32,75 1,33 m; 1,63 m 73,66 4,94 m

*: tín hiệu chồng, đã được xác định bằng HMBC, HSQC, COSY

3.2.4 Nhận dạng các chất phân lập từ Gynostemma laxum

Từ phân đoạn EtOAc (GL2) của Cổ yếm lá bóng (G laxum) đã phân lập

được 5 chất, ký hiệu là E5, E1, GL-7B, GL-6 và GL-8 Từ phân đoạn nước

(GL3) của Cổ yếm lá bóng (G laxum) đã phân lập được 4 chất, ký hiệu là

GL-9, GL-1, GL-10 và GL-2 Các hợp chất được nhận dạng dựa vào các

dữ liệu phổ MS, NMR Trong các chất phân lập được có 3 flavonoid (E5, E1, GL-8), 4 glycosid (GL-2, GL-6, GL-9, GL-1), 1 acid hữu cơ (GL-10)

và 1 ester (GL-7B) (hình 3.4) Hợp chất GL-2

(2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid) là chất mới

13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 56,44 (OCH3); 113,87 (C-5); 115,88 (C-2); 123,14 (C-6); 125,41 (C-1); 148,77 (C-4); 152,79 (C-3); 170,18 (C=O)

(C-Hợp chất GL-6 (benzyl-O-β-D-glucopyranosid)

Chất rắn vô định hình, màu trắng

1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 3,69 (1H, dd, J=5,6; 12,0 Hz; H-6’);

3,89 (1H, dd, J=2,0; 12,0 Hz; H-6’); 4,34 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1’); 4,65 (1H, d,

13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 62,81 6’); 71,69 4’); 71,74 7); 75,15 (C-2’); 78,03 (C-3’); 78,10 (C-5’); 103,32 (C-1’); 128,78 (C-4); 129,28 (C-2); 129,28 (C-6); 129,36 (C-3); 129,36 (C-5); 139,16 (C-1)

H-13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 93,30 8); 98,13 6); 102,97 10); 115,03 (C-2’); 115,56 (C-5’); 119,93 (C-6’); 121,92 (C-1’); 135,67 (C-3); 145,01 (C-3’); 146,77 (C-2); 147,65 (C-4’); 156,10 (C-9); 160,68 (C-5); 163,83 (C-7); 175,79 (C-4)

H-(1H, s, 5-OH)

13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 55,61 (7-OCH3); 56,00 (4’-OCH3); 91,92 (C-8); 97,47 (C-6); 104,02 (C-10); 111,76 (C-5’); 114,73 (C-2’); 119,78 (C-6’); 123,30 (C-1’); 136,40 (C-3); 146,18 (C-3’); 146,75 (C-2); 149,44 (C-4’); 156,11 (C-5); 160,35 (C-9); 164,96 (C-7); 176,05 (C-4)

13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz)  (ppm): 17,85 (C-6’’’); 56,48 (7-CH3O); 68,62 (C-6’’); 69,71 (C-5’’’); 71,44 (C-4’’’); 72,08 (C-2’’’); 72,25 (C-3’’’); 73,97 (C-4’’); 75,77 (C-4’’); 77,21 (C-3’’); 78,19 (C-5’’); 93,26 (C-8); 99,16 (C-6); 102,5 (C-1’’’); 104,68 (C-1’’); 106,47 (C-10); 116,11 (C-2’); 117,88 (C-5’); 123,07 (C-6’); 123,73 (C-1’); 135,92 (C-3); 145,93 (C-3’); 150,02 (C-4’); 158,4 (C-2); 159,64 (C-9); 162,69 (C-5); 167,4 (C-7); 179,55 (C-4).

Hợp chất GL-1 (ethyl-β-rutinosid)

13C-NMR (DMSO-d 6, 125 Mhz): 15,77 (C-2); 18,31 (C-6’’); 66,05 (C-1); 68,30 (C-6’); 69,79 (C-5’’); 71,75 (C-4’); 72,16 (C-2’’); 72,33 (C-3’’); 73,91 (C-4’’); 75,03 (C-2’); 76,90 (C-5’); 78,11 (C-3’); 102,34 (C-1’’); 104,20 (C-1’)

E5

O OH O

OH OH

OH OH

10

GL-6

O HO

OH OH

OH

H3CO

O O HO OH HO

O HO HO

HO

OH HO

O HO

OH HO

O HO HO

HOCH3

GL-10

OH O

HO

H 3 CO

GL-7B

O O

HO OH

CH 2 CH 3

Hình 3.4 Các chất phân lập từ G laxum

3.3 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp

Đánh giá độc tính cấp của G longipes

Chuột bắt đầu chết ở liều 80 g/kg ttc đến 200 g/kg ttc thì số chuột chết