BÀI TIỂU LUẬN DỊCH THUẬT VÀ TÌM HIỂU VỀ CÔNG NGHỆ CRISPR – CAS9 VÀ CHẤT ỨC CHẾ PD1

BÀI TIỂU LUẬN DỊCH THUẬT VÀ TÌM HIỂU VỀ CÔNG NGHỆ CRISPR – CAS9 VÀ CHẤT ỨC CHẾ PD1 MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU 2 Bài báo: 4 Bài dịch 7 1. Khái quát chung về công nghệ chỉnh sửa gen 9 1.1. Chỉnh sửa bộ gen (GENOME EDITING) 9 1.2. Phân biệt chỉnh sửa gen và chuyển gen 9 1.3. Mục đích chỉnh sửa gen 9 1.4. Bản chất của kỹ thuật chỉnh sửa gen 10 1.4.1. Ghép nối không tương đồng (NHEJ) 10 1.4.2. Sự tái tổ hợp tương đồng (HR) 11 1.5. Các công nghệ chỉnh sửa gen 12 1.5.1. Công nghệ ZFNs 12 1.5.2. Công nghệ TALENs 12 1.5.3. Công nghệ CRISPRCas9 13 2. Các khái niệm, thuật ngữ và lịch sử ra đời của công nghệ CRISPRCas9 13 2.1. Khái niệm và các thuật ngữ 13 2.2. Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPRCas 14 2.2.1. Lịch sử ra đời của công nghệ chỉnh sửa gen 14 2.2.2. Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPRCas9 14 3. Công nghệ CRISPRCas9, ưu nhược điểm 14 3.1. Công nghệ CRISPRCas9 14 3.2. Ưu nhược điểm 18 4. Cơ chế tác động của công nghệ CRISPRCas9 19 4.1. Cơ chế hoạt động của CRISPRCas9 19 4.2. Cơ chế miễn dịch của CRISPRCas9 24 5. Ứng dụng và các thành tựu CRISPRCas9 đạt được: 26 6. Chất ức chế PD1 31 6.1. Khái niệm 31 6.2. Cấu trúc 31 6.3. Ý nghĩa lâm sàng 32 6.4. Ứng dụng 33 KẾT LUẬN 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA

***

BÀI TIỂU LUẬN DỊCH THUẬT VÀ TÌM HIỂU VỀ CÔNG NGHỆ CRISPR – CAS9 VÀ CHẤT ỨC CHẾ PD-1

Giảng viên hướng dẫn : Nhóm SV thực hiện :

Đà Nẵng, tháng 11 năm 2017.

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 2

Bài báo: 4

Bài dịch 7

1 Khái quát chung về công nghệ chỉnh sửa gen 9

1.1 Chỉnh sửa bộ gen (GENOME EDITING) 9

1.2 Phân biệt chỉnh sửa gen và chuyển gen 9

1.3 Mục đích chỉnh sửa gen 9

1.4 Bản chất của kỹ thuật chỉnh sửa gen 10

1.4.1 Ghép nối không tương đồng (NHEJ) 10

1.4.2 Sự tái tổ hợp tương đồng (HR) 11

1.5 Các công nghệ chỉnh sửa gen 12

1.5.1 Công nghệ ZFNs 12

1.5.2 Công nghệ TALENs 12

1.5.3 Công nghệ CRISPR-Cas9 13

2 Các khái niệm, thuật ngữ và lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas9 13

2.1 Khái niệm và các thuật ngữ 13

2.2 Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas 14

2.2.1 Lịch sử ra đời của công nghệ chỉnh sửa gen 14

2.2.2 Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas9 14

3 Công nghệ CRISPR-Cas9, ưu - nhược điểm 14

3.1 Công nghệ CRISPR-Cas9 14

3.2 Ưu - nhược điểm 18

4 Cơ chế tác động của công nghệ CRISPR-Cas9 19

4.1 Cơ chế hoạt động của CRISPR-Cas9 19

4.2 Cơ chế miễn dịch của CRISPR-Cas9 24

5 Ứng dụng và các thành tựu CRISPR-Cas9 đạt được: 26

6 Chất ức chế PD-1 31

6.1 Khái niệm 31

6.2 Cấu trúc 31

6.3 Ý nghĩa lâm sàng 32

6.4 Ứng dụng 33

KẾT LUẬN 35

LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay, với sự phát triển của công nghiệp và xã hội, các vấn nạn về bênh tật

do các vấn đề ô nhiễm môi trường gây ra ngày càng cao, một trong số đó là các cănbệnh về ung thư Theo thống kê gần nhất (4/2014) của tổ chức Y tế thế giới (WHO),hiện nay số người bị nhiễm ung thư ngày càng cao và không ngừng gia tăng, cũng theothống kê này Việt Nam là quốc gia thuộc top 2 về những quốc gia dẫn đầu về tỉ lệ mắccăn bệnh này

Việc nghiêm cứu tìm ra phương pháp chống lại sự gia tăng và chữa khỏi củacăn bệnh quái ác này là một vấn đề vô cùng khó khăn đặt racho các nhà khoa học, cácviện nghiên cứu và vấn đề này thu hút rất lớn sự quan tâm từ các nhà khoa học.Mộtnghiên cứu mới đây được đăng tải trên tạp chí Nature công bố một ứng dụng của công

nghệ CRISPR-Cas9 trong việc tìm kiếm các mục tiêu mới giúp nâng cao tính hiệu quả

(effectiveness) của chất ức chế PD-1 trong liệu pháp miễn dịch ung thư.Trong côngtrình này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để tìm ra các genegiúp tế bào ung thư “lẩn trốn” khỏi hệ miễn dịch của cơ thể Qua đó, việc phá huỷ cácgene này sẽ giúp làm tăng hiệu quả của các chất ức chế PD-1

Vậy công nghệ CRISPR-Cas9 là gì? Chất ức chế PD-1 là gì? Nó có những ưuđiểm và ứng dụng gì khiến nó thật đặc biệt đối với thế giới và các nhà khoa học? Bàithuyết trình dịch thuật từ một bài báo của Nature sau đây sẽ giúp mọi người hiểu thêm

về công nghệ CRISPR-Cas9, chất ức chế PD-1 cũng như những ứng dụng quan trọng

mà công nghệ này mang lại

Bài báo:

MAKING CANCER VULNERABLE TO IMMUNE

ATTACK

CRISPR-Cas9 is revealing new drug targets that could boost cancer immunotherapy

Anovel screening method developed by a team at Dana-Farber/Boston Children’s Cancer and Blood Disorders Center — using CRISPR-Cas9 genome editing

technology to test the function of thousands of tumor genes in mice — has revealed new drug targets that could potentially enhance the effectiveness of PD-1 checkpoint inhibitors, a promising new class of cancer immunotherapy

In findings published online today by Nature, the Dana-Farber/Boston Children’s team

— led by pediatric oncologist W Nick Haining — reports that deletion of the Ptpn2 gene in tumor cells made them more susceptible to PD-1 checkpoint inhibitors PD-1 blockade is a drug that “releases the brakes” on immune cells, enabling them to locate and destroy cancer cells

“PD-1 checkpoint inhibitors have transformed the treatment of many cancers, and opened the door to the possibility that immunotherapy will form part of the cure for cancer,” says Haining, senior author on the new paper, who is also associate professor

of pediatrics at Harvard Medical School and associate member of the Broad Institute

of MIT and Harvard

Yet despite the clinical success of this new class of cancer therapy, the majority of patients don’t reap a clinical benefit from PD-1 blockade That, Haining says, has triggered a rush of additional trials to investigate whether other drugs, when used in combination with PD-1 inhibitors, can increase the number of patients whose cancer responds to the treatment

“The challenge so far has been finding the most effective immunotherapy targets and prioritizing those that work best when combined with PD-1 inhibitors,” Haining says

“So, we set out to develop a better system for identifying new drug targets that might aid the body’s own immune system in its attack against cancer

“Our work suggests that there’s a wide array of biological pathways that could be targeted to make immunotherapy more successful,” Haining continues “Many of theseare surprising pathways that we couldn’t have predicted For instance, without this screening approach, it wouldn’t have been obvious that Ptpn2 is a good drug target for the immunotherapy of cancer.”

Sifting through thousands of potential targets

To cast a wide net, the paper’s first author Robert Manguso, a graduate student in Haining’s lab, designed a genetic screening system to identify genes used by cancer cells to evade immune attack He used CRISPR-Cas9, a genome editing technology that works like a pair of molecular scissors to cleave DNA at precise locations in the genetic code, to systematically knock out 2,368 genes expressed by melanoma skin cancer cells Manguso was then able to identify which genes, when deleted, made the cancer cells more susceptible to PD-1 blockade

Manguso started by engineering the melanoma skin cancer cells so that they all

contained Cas9, the “cutting” enzyme that is part of the CRISPR editing system Then,using a virus as a delivery vehicle, he programmed each cell with a different “single guide RNA” sequence of genetic code In combination with the Cas9 enzyme, the sgRNA codes — about 20 amino acids in length — enabled 2,368 different genes to beeliminated

By injecting the tumor cells into mice and treating them with PD-1 checkpoint

inhibitors, Manguso was then able to tally up which modified tumor cells survived Those that perished had been sensitized to PD-1 blockade as a result of their missing gene

Using this approach, Manguso and Haining first confirmed the role of two genes already known to be immune “evaders” — PD-L1 and CD47, drug inhibitors that are already in clinical trials They then discovered a variety of new immune evaders that,

if inhibited therapeutically, could enhance PD-1 cancer immunotherapy One such newly-found gene of particular interest is Ptpn2

“Ptpn2 usually puts the brakes on the immune signaling pathways that would

otherwise smother cancer cells,” Haining says “Deleting Ptpn2 ramps up those

immune signaling pathways, making tumor cells grow slower and die more easily under immune attack.”

Gaining more ground

With the new screening approach in hand, Haining’s team is quickly scaling up their efforts to search for additional novel drug targets that could boost immunotherapy

Haining says the team is expanding their approach to move from screening thousands

of genes at a time to eventually be able to screen the whole genome, and to move beyond melanoma to colon, lung, renal carcinoma and more He’s assembled a large team of scientists spanning Dana-Farber/Boston Children’s and the Broad Institute to tackle the technical challenges that accompany screening efforts on such a large scale

In the meantime, while more new potential drug targets are likely around the corner, Haining’s team is taking action based on their findings about Ptpn2.

“We’re thinking hard about what a Ptpn2 inhibitor would look like,” says Haining

“It’s easy to imagine making a small molecule drug that turns off Ptpn2

Bài dịch

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR-CAS9 TRONG VIỆC TỐI ƯU HÓA LIỆU PHÁP MIỄN DỊCH

Hình: Các tế bào T miễn dịch (màu đỏ) đang tiêu diệt các tế bào ung thư (nhiều màu

sắc) đã bị loại bỏ những gene giúp “lẩn trốn” khỏi hệ miễn dịch của cơ thể

Một nghiên cứu mới đây được đăng tải trên tạp chí Nature công bố một ứng dụng của công nghệ CRISPR-Cas9 trong việc tìm kiếm các mục tiêu mới giúp nâng cao tính hiệu quả (effectiveness) của chất ức chế PD-1 trong liệu pháp miễn dịch ung thư.

Nghiên cứu do nhóm tác giả tại Trung Tâm Nghiên Cứu Ung Thư Trẻ Em và Bệnh LýHuyết Học Dana-Farber/Boston thực hiện Trong công trình này, nhóm nghiên cứu đã

sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để tìm ra các gene giúp tế bào ung thư “lẩn trốn” khỏi

hệ miễn dịch của cơ thể Qua đó, việc phá huỷ các gene này sẽ giúp làm tăng hiệu quả

của các chất ức chế PD1 (programmed cell death 1: thụ thể gây chết tế bào theo

chương trình) CRISPR-Cas9, viết tắt của thuật ngữ “Clustered regularly interspaced

short palindromic repeats,” là một kỹ thuật mới được phát triển gần đây để chỉnh sửa

bộ gene.

Các nghiên cứu gần đây cho thấy chất ức chế PD-1 hứa hẹn những tiềm năng lớn trongđiều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch (cancer immunotherapy) Tuy nhiên, ở nhiềubệnh nhân, ứng chế PD-1 không hoàn toàn đem lại kết quả lâm sàng quan trọng Do

đó, nhiều nhóm nghiên cứu tìm cách kết hợp các loại thuốc khác với chất ức chế PD-1.Bài toán đặt ra là, làm thế nào để tìm thấy những mục tiêu (target) điều trị miễn dịchhiệu quả nhất

Để giải quyết vấn đề này, Robert Manguso và các cộng sự đã thiết kế một hệ thốngsàng lọc di truyền (genetic screening system) giúp xác định các gene được các tế bàoung thư sử dụng để trốn tránh sự tấn công của hệ thống miễn dịch Anh đã sử

dụng CRISPR-Cas9, công nghệ chỉnh sửa bộ gene, hoạt động giống như một cặp kéophân tử để cắt DNA tại các vị trí chính xác trong mã di truyền, để loại bỏ được 2.368gen biểu hiện bởi các tế bào ung thư hắc tố (melanoma skin cancer cell) Tiếp theo,Manguso xác định gene nào, khi bị xóa, làm cho các tế bào ung thư nhạy cảm hơn vớithuốc ức chế PD-1 Các tế bào ung thư hắc tố này được tiêm vào chuột rồi được điềutrị với thuốc ức chế PD-1 kết quả cho thấy các tế bào ung thư bị loại bỏ đi các gene kểtrên thực sự nhạy cảm hơn với thuốc ức chế PD-1 và bị tiêu diệt.

Nghiên cứu cũng đồng thời xác nhận được vai trò của 2 gene giúp các tế bào ung thư

“lẫn trốn” khỏi hệ miễn dịch mà con người đã biết, đó là PD-L1 và CD47 Đồng thời,nhóm nghiên cứu cũng tìm ra nhiều gene mới với chức năng tương tự, một trong số đó

là gene Ptpn2 Loại bỏ gene Ptpn2 sẽ làm tế bào ung thư phát triển chậm hơn và dễ bịcác tế bào miễn dịch tiêu diệt hơn

Từ các kết quả này, giáo sư W.Nick Haining và nhóm nghiên cứu sẽ cải tiến phươngpháp để có thể sàng lọc không chỉ hàng ngàn gene cùng một lúc mà là cả bộ gene Hơnnữa, nhóm sẽ mở rộng sang các loại tế bào ung thư khác như ruột kết, phổi, và thận.Đồng thời, nhóm nghiên cứu cũng sẽ tập trung phát triển một loại thuốc mới có khảnăng ức chế gene Ptpn2

1 Khái quát chung về công nghệ chỉnh sửa gen

1.1 Chỉnh sửa bộ gen (GENOME EDITING)

Là một kỹ thuật được sử dụng để sửa đổi một cách chính xác và hiệu quả DNAtrong một tế bào Nó bao gồm việc cắt giảm các trình tự ADN cụ thể với enzymeđược gọi là 'nucleases kỹ thuật' Có thể được sử dụng để thêm, xoá, hoặc sửa đổi DNAtrong bộ gen

1.2 Phân biệt chỉnh sửa gen và chuyển gen

Chỉnh sửa gen(Genome editing) Chuyển gen (Gene transformation)

Tạo ra những thay đổi trên trình tự gen

nội sinh theo cách có chủ đích, tại một vị

trí xác định (non-GMO)

Đưa DNA ngoại lai vào hệ gen tế bàochủ theo cách ngẫu nhiên, không có vị tríxác định (GMO)

 GMO (Genetically Modified Organism): sinh vật biến đổi gen, khi nói đến

GMO người ta thường đề cập đến các cơ thể sinh vật mang các gen của một loài khác

để tạo ra một dạng chưa hề tồn tại trong tự nhiên

1.3 Mục đích chỉnh sửa gen

- Tạo đột biến gen:

 Là tạo những biến đổi nhỏ xảy ra trong cấu trúc gen Những biến đổi nàythường liên quan đến 1 cặp nucleotit ( đột biến điểm) hoặc 1 số cặp nucleotit

 Các dạng đột biến: Mất, thêm và thay thế

-Bằng cách tạo đột biến gen có thể:

- Tạo SNP (single nucleotide polymorphisms) có nghĩa là các dạng đa hình củanucleotid đơn, được sử dụng để phân tích gen người và cho nhiều sinh vật khác nhờmột đột biến điểm trên gen

Ví dụ: Một đột biến điểm thay thế cặp nucleotit G-C bằng cặp A-T hoặc ngượclại sẽ tạo ra một SNP

 Tạo sản phẩm dung hợp với protein nội sinh.

1.4 Bản chất của kỹ thuật chỉnh sửa gen

- Chỉnh sửa gen là một loại kỹ thuật di truyền, trong đó sử dụng một loạienzyme “engineered nucleases” để cắt DNA tạo ra sự phá vỡ sợi đôi ( double-strandbreaks) (DSBs) của DNA cụ thể tại các vị trí mong muốn trong bộ gen

- Các sợi đôi này được sửa chữa thông qua sự ghép nối không tương đồng

(Non-homologous end joining) (NHEJ) hoặc tái tổ hợp tương đồng (Homologous

recombination) (HR), dẫn đến các đột biến có mục tiêu

- NHEJ sử dụng một loạt các enzyme để trực tiếp kết nối DNA kết thúc trongmột đứt gãy sợi đôi Ngược lại, trong HR, một trình tự DNA tương đồng được sử dụngnhư một khuôn mẫu để tái tạo chuỗi DNA bị mất ở điểm dừng

1.4.1 Ghép nối không tương đồng (NHEJ)

- Là một con đường để sửa chữa sự phá vỡ sợi đôi trong DNA NHEJ được gọi

là "không đồng nhất" bởi vì các đầu ngắt được trực tiếp ghép nối lại mà không cần mộtmẫu tương đồng làm khuôn mẫu

- NHEJ thường sử dụng các trình tự DNA ngắn gọi là microhomologies và cácenzyme để sửa chữa Những microhomologies hiện diện ở đầu của các sợi đơn trongđứt gãy sợi đôi Khi phần nhô ra hoàn toàn tương thích, tiến hành sửa chữa DNA Nếuphần nhô ra không tương thích có thể xảy ra mất hoặc thêm nucleotide dẫn đến việcsủa chữa không chính xác.

 NHEJ có thể dễ bị lỗi, và đã được chứng minh là gây ra đột biến ở khu vựcsửa chữa trong khoảng 50% Vì vậy, nếu người ta có thể tạo ra một DSB ở một genmong muốn trong nhiều mẫu, rất có thể các đột biến sẽ được tạo ra tại nhiều mẫu dolỗi của NHEJ Mặt khác, sự phụ thuộc của HR vào một trình tự tương đồng để sửachữa DSB có thể được khai thác bằng cách chèn thêm một dãy mong muốn trong mộtdãy DNA tương đồng để tạo ra sự thay đổi mong muốn trong vùng gen quan tâm

1.5 Các công nghệ chỉnh sửa gen

Có nhiều loại khác nhau của enzyme“engineered nucleases”được sử dụngtrong chỉnh sửa bộ gen.Tất cả chúng đều chứa một phần nuclease để cắt DNA và mộtphần xác định DNA để nhận dạng chuỗi DNA chúng cắt.Chúng khác nhau chủ yếutrong cách nhận ra DNA để cắt:

- Dựa vào RNA: chứa một đoạn ngắn của RNA liên kết với DNA mục tiêu sẽđược cắt

- Dựa vào Protein: chứa một protein nhận ra và liên kết với các DNA mục tiêu

sẽ được cắt

1.5.1 Công nghệ ZFNs

- ZFNs là viết tắt của 'zinc-finger nucleases' Phần gắn kết với DNA của ZFNs

được tạo ra từ các protein zinc-finger, mỗi zinc-finger liên kết với 3 nucleotid Sự kếthợp khác nhau của protein zinc-finger gắn kết với các chuỗi DNA khác nhau Phầnnuclease của ZFNs thường là Fokl Nuclease-enzyme dùng để cắt DNA Hai phân tửFokl bắt cặp với nhau để cùng tạo ra việc phá vỡ liên kết đôi trên DNA, do đó một cặpZFN được tạo ra, mỗi phân tử liên kết với một sợi DNA

1.5.2 Công nghệ TALENs

- TALENs là viết tắt của'Transcription activator-like effector nucleases'.

Miền liên kết với DNA của TALENs được tạo thành từ sự phiên mã các chất hoạt như cơ quan phản ứng lại kích thích (TALE) Có bốn miền TALE khác nha tương ứngvới bốn nucleotid, vì vậy chúng có thể được sắp xếp để liên kết với các trình tự DNA

hóa-cụ thể dễ dàng hơn ZFNs Giống như ZFNs, phần nuclease của TALENs thường làFokl Nuclease Hai phân tử FokI kết hợp với nhau để cắt DNA, do đó hai TALENđược tạo ra, một cho mỗi sợi

1.5.3 Công nghệ CRISPR-Cas9

- CRISPR-Cas9 là công nghệ phổ biến và hiệu quả nhất được sử dụng để chỉnhsửa bộ gen

- CRISPR là viết tắt của cụm từ "clustered regularly interspaced short

palindromic repeats".CRISPR là phần xác định DNA đích của hệ thống bao gồm một

phần tử RNA ‘hướng dẫn’, được thiết kế để liên kết với các nucleotid cụ thể thông qua

liên kết bổ sung Cas9 là viết tắt của ‘CRISPR-associated protein 9’, và là một phần

của nuclease có tác dụng cắt DNA

- Hệ thống CRISPR-Cas9 ban đầu được phát hiện trong vi khuẩn, chúng sửdụng hệ thống này để tiêu diệt các virut xâm nhập

2 Các khái niệm, thuật ngữ và lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas9

2.1 Khái niệm và các thuật ngữ

 CRIPS:

- CRISPR là viết tắt của Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats, là các đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên hay cụm đoạn lặp xuôi ngượcngắn phân cách đều Trong sự lặp lại của palindromic, trình tự nucleotide đều giốngnhau ở cả hai hướng

- CRISPR thường được tìm thấy trong hệ gen của vi khuẩn và các sinh vật khác.RNA được mã hóa từ CRISPR cùng với các enzyme thuộc họ

 Cas 9:

- Cas 9: là từ viết tắt của CRIPS-associated ([yếu tố] đi kèm với CRISPR),Protein Cas9 là một enzyme làm cắt DNA ngoại lai

- Protein này thường liên kết với hai phân tử RNA: crRNA và một loại khác gọi

là tracrRNA (hoặc "trans-activation crRNA") Cả hai hướng dẫn Cas9 đến vị trí mụctiêu nơi nó sẽ được cắt Sự mở rộng của DNA này bổ sung cho một đoạn dài 20nucleotide của crRNA Cas có vai trò như là hàng rào miễn dịch của tế bào chủ đối vớivirut

- Là từ viết tắt của Programmed cell death protein Là thụ thể bề mặt tế bào đóngmột vai trò quan trọng trong việc điều hoà hệ thống miễn dịch và thúc đẩy khả năng tựchịu đựng bằng cách ngăn chặn hoạt động viêm tế bào T PD-1 là một trạm kiểm soátmiễn dịch và bảo vệ chống lại tự miễn nhiễm thông qua cơ chế kép để thúc đẩy quátrình tự chết (apoptosis) trong tế bào T đặc hiệu kháng nguyên trong các hạch bạchhuyết đồng thời giảm apoptosis trong các tế bào T điều tiết.

 Gen PTPN2 là từ viết tắt của Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type

2, là một gen mã hóa ptrotein Protein mã hoá bởi gen này là một thành viên của họprotein tyrosine phosphatase (PTP) Các thành viên của họ PTP có cùng một xúc tác

có tính bảo thủ cao, điều này rất cần thiết cho hoạt động xúc tác Các PTP được biếtđến là các phân tử tín hiệu điều chỉnh nhiều quá trình di động bao gồm sự tăng trưởng

tế bào, sự phân biệt, chu kỳ phân bào và sự chuyển đổi gen

 Gen CD47:là từ viết tắt của Cluster of Differentiation 47 Gen này mã hóa mộtprotein màng, nó liên quan đến sự gia tăng nồng độ canxi nội bào xảy ra khi sự kếtdính tế bào với ma trận ngoại bào Protein mã hóa cũng là một thụ thể cho miền gắnkết tế bào C của thrombospondin, và nó có thể đóng một vai trò trong vận chuyểnmàng tế bào và truyền dẫn tín hiệu Giống này có sự phân bố của mô rộng và giảmbiểu hiện hồng cầu hồng

2.2 Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas

2.2.1 Lịch sử ra đời của công nghệ chỉnh sửa gen

- Năm 1989 Chỉnh sửa gen HR

- Năm 1992 Công nghệ Cr-Lox ra đời

- Năm 1998 Phát hiện protein ZF nhận biết DNA đặc hiệu

- Năm 2000 Phát hiện cơ chế phòng vệ CRISPR-Cas 9

- Năm 2009 Phát hiện cơ chế hoạt động của TAL effector

- Năm 2011 Tạp chí Nature bình chọn TALEN là phương pháp của năm

- Năm 2013 Công nghệ CRISPR-Cas9

2.2.2 Lịch sử ra đời của công nghệ CRISPR-Cas9

- Năm 1985-1986: Oliver Smithies và Mario Capecchi cùng lúc sử dụng tái tổ

hợp tương đồng để thay đổi trình tự DNA trên tế bào của động vật có vú

- Năm1987: Capecchi và Smithies kết hợp tái tổ hợp tương đồng với vector đích

để chỉnh sủa gen trên tế bào gốc từ phôi ở chuột

- Năm1990: Công bố rộng rãi trình tự gen chuột

- Năm1991: Các nhà khoa học đã xác định được cấu trúc tinh thể zinc finger tạo

nên một thời kì ZFNs- một công cụ chỉnh sửa gen

- Năm1994: Maria Jasin chứng minh các đứt gãy mạch đôi giúp tăng cao tỷ lệ tái

tổ hợp tương đồng

- Năm2010: TALEs với khả năng định hướng các nuclease tạo ra đứt gãy mạch

đôi ở vị trí mong muốn

- Năm2012: CRISPR với khả năng tạo ra các đứt gãy mạch đôi ở protein Cas9

- Năm2014: Sangamo Biosciences sử dụng ZFNs để chỉnh sửa gen CCRS trên tế

bào T ở bệnh nhân HIV

- Năm2016: Bệnh nhân đầu tiên sử dụng điều trị lâm sàng bằng CRISPR.

3 Công nghệ CRISPR-Cas9, ưu - nhược điểm

3.1 Công nghệ CRISPR-Cas9

CRISPR được phát hiện vào năm 1987 trong vi khuẩn E coli Sự ra đời của hệ

thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã khắc phục được những hạn chế của ZFN vàTALEN, tạo nên cuộc cách mạng đột phá trong công nghệ sinh học

Về bản chất, CRISPR là một phần hệ thống miễn dịch của vi khuẩn chống lạivirus xâm nhiễm Hệ thống này đã được ứng dụng trên các tế bào nhân thực Tính đặchiệu được điều khiển bởi “guide ARN” (thường gắn với một đoạn trình tự 18-20 cặpbase trên ADN mục tiêu) và có thêm một số motifs giúp hình thành một phức hợp vớiCas9 nuclease (CRISPR – associated nuclease) Để có thể gắn thành công Cas9, trongtrình tự bộ gen đích phải có một đoạn trình tự protospacer adjacent motif (PAM) ngaysau trình tự đích PAM là một motif NGG liền kề vị trí liên kết Đối lập với ZFN vàTALEN, hệ thống CRISPR giúp nuclease (enzyme cắt – Cas9) nhận biết trình tự cắtthông qua “guide ARN” Đặc tính này giúp ta dễ dàng thiết kế một “guide ARN” mớikhi cần cắt một trình tự mục tiêu mới và cũng cho phép cắt nhiều mục tiêu cùng lúc(khi kết hợp nhiều “guide ARN”)

Hệ thống CRISPR sử dụng RNA ngắn, được gọi là CRISPR RNAs (crRNAs),nhằm mục tiêu một phức hợp endonuclease hoặc endonuclease với các axit nucleicxâm nhập mà một prokaryote trước đây đã gặp phải Một khi một mảnh DNA nướcngoài đã được công nhận, nó sẽ bị phá hủy

Các hệ thống CRISPR được xác định cho đến ngày nay được chia thành ba lớp,loại I, II, và III Tất cả các hệ thống CRISPR bao gồm một locus CRISPR, mang thông

tin về các bệnh nhiễm trùng trong quá khứ, và các gien cas , mã hoá các protein trung

hòa miễn dịch dựa trên CRISPR Các locus CRISPR, bất kể loại, bao gồm các chuỗipalindromic ngắn (~ 30nt) bên cạnh các chuỗi spacer có kích thước tương tự có nguồn

gốc từ các axit nucleic xâm nhập Mặc dù các gien cas thường gắn với locus CRISPR,

trong một số trường hợp nó được tìm thấy ở những nơi khác trong bộ gen

Tất cả các hệ thống CRISPR chia sẻ cùng ba bước :

Khả năng thích nghi - kết hợp các chuỗi spacer mới với trung gian bởi Cas1 và Cas2

Biểu hiện - sao chép các chuỗi lặp lặp lại lặp lại lặp lại vào các RNA tiền CRISPR

(pre-crRNA) sau đó xử lý các trình tự này thành các crRNA trưởng thành bằng cácloại protein Cas cụ thể

Sự can thiệp -nhận dạng qua trung gian crRNA và tiêu hủy các axit nucleic xâm

chiếm

 Cấu trúc của CRISPR trong genome vi khuẩn

Nghiên cứu cho thấy tổ chức của CRISPR trong genome vi khuẩn rất đa dạng.Một locus (vị trí) CRISPR cấu thành từ các đoạn lặp (repeats) dài 21 đến 48 bp xen kẽbởi các trình tự dài 26 đến 72 bp gọi là các đoạn đệm (spacers) Trong một locus thìkích thước của đoạn lặp và đoạn đệm rất ổn định Mỗi locus CRISPR được đặc trưngbởi trình tự của đoạn lặp điển hình trong locus đó Một locus CRISPR chỉ chứa cácđoạn lặp và các đoạn đệm, không có khung đọc mở (open reading frame)

Đặc điểm thường thấy Các đoạn lặp (Repeats)

4 Có từ 2 – 375 đoạn lặp trong mỗi

Có thể có nhiều locus CRISPR trong hệ gene của sinh vật prokaryote Số lượnglớn nhất phát hiện được cho tới nay là 20 locus CRISPR trong hệ gene

của Methanococcus jannaschii Các đoạn lặp và đệm trong CRISPR có thể chiếm tới

1% tổng trình tự toàn hệ gene của vi khuẩn Có nhiều suy đoán về vai trò của CRISPRnhư vai trò trong tái sắp xếp nhiễm sắc thể, điều hòa biểu hiện của các gene lân cận,sửa chữa DNA… Năm 2005, ba nghiên cứu độc lập cho thấy sự tương đồng giữa trình

tự của các đoạn đệm (spacers) với các yếu tố ngoại nhiễm sắc thể như plasmid vàvirus Điều này dẫn tới giả thuyết rằng CRISPR có thể đóng vai trò miễn dịch thíchnghi (adaptive immunity) chống lại các yếu tố di truyền ngoại lai

3.2 Ưu - nhược điểm

 Ưu điểm: để nêu lên ưu điểm nổi bật của CRISPR-Cas9 ta có thể xem xét nó

với 2 công nghệ ZFNs và công nghệ TALENs qua bảng so sánh dưới đây

 Cắt 1 điểm trên DNA sợi đôi

 Thiết kế cấu trúc phức tạp

 Trìnhtự DNA đích:

20 – 22 Nucleotid

 Liên kết bổ sung giữaRNA-DNA

 Có thể cắt đồng thời nhiều vị trí

 Thiết kế cấu trúc đơn giản

Từ bảng so sanh phía trên ta có thể rút ra được nhưng ưu điểm nổi bật củaCRISPR-Cas9 như sau:

 Là công cụ đơn giản, đặc hiệu

 Không đòi hỏi các thí nghiệm protein tái tổ hợp phức tạp

 Tính đặc hiệu được quyết định bởi 20 Nu -> tổng hợp đơn giản

 Có thể chỉnh sửa đồng thời nhiều vị trí cùng lúc

 Có thể cắt được DNA bị methyl hoá

 Công nghệ CRISPR có chính sách mở trong giới khoa học

 Khi sử dụng CRISPR-Cas9 để loại bỏ HIV từ tế bào bạch cầu, các nhà khoa học

đã phát hiện ra vẫn có những virus trốn thoát, và thậm chí các đột biến bởi Cas9 còn khiến chúng mạnh hơn

CRISPR- Những chỉnh sửa gen chúng ta mong đợi đều gặp phải sự cạnh tranh từ các độtbiến thêm hay mất ngẫu nhiên thông qua cơ chế nối không tương đồng ở hai đầu cắt

 Bóc tách gen ở nhầm chỗ và có thể gây ung thư

 Phương pháp ZFN và TALEN có tính đắc hiệu cao hơn so với CRISPR và do

đó rủi ro gắn không đúng trình tự sẽ thấp hơn.Nguyên nhân đầu tiên là do các phươngpháp kia nhận biết trình tự ADN dài hơn và cần phải có 2 phân tử protein kết hợp vớinhau mới tạo thành nuclease có hoạt tính (dạng dimer) Để khắc phục điều này, mộtvài nhà nghiên cứu đã biến đổi CRISPR/Cas9 nuclease thành một “nickase” có thểđược sử dụng cùng với các cặp gARNs sense và antisense, do đó giúp tăng cường độđặc hiệu

 Việc sử dụng một enzyme Cas9 sẽ chỉ cắt một sợi đơn của DNA mục tiêu thay

vì sợi đôi Điều này có nghĩa là hai enzyme Cas9 và hai RNA hướng dẫn phải ở cùngmột vị trí để cắt được thực hiện Vì vậy làm giảm xác suất cắt được thực hiện ở nơikhông đúng